JPH043501B2

JPH043501B2 -

Info

Publication number: JPH043501B2
Application number: JP58103248A
Authority: JP
Priority date: 1983-06-09
Filing date: 1983-06-09
Publication date: 1992-01-23
Also published as: JPS59228158A

Description

[Detailed description of the invention]

本発明は、簡単に血清等に含まれる中性脂質の
濃度を測定することができる固定化酵素を利用し
た中性脂質センサーに関する。従来、固定化酵素を利用した中性脂質分析に
は、固定化酵素カラムとPH電極を組合せたシステ
ム、固定化酵素膜と酵素電極あるいは過酸化水素
（H₂O₂）電極とを組合せたシステムが利用されて
いる。前者のシステムは、PH電極を使用してお
り、測定がポテンシヨメトリツクであるために測
定精度が充分でなく、又、カラムを用いるため、
ポンプや検出のためフローセルが必要となり、シ
ステムが大型となる。一方後者のシステムは、被
測定溶媒中に溶け込んでいる酸素分子あるいは過
酸化水素を電解し、その時の電解電流を測定する
ようにしており、アンペロメトリツクな測定であ
るために高い精度で測定を行うことができる。し
かしながら、中性脂質から過酸化水素を生成する
までの反応系が複雑であり、測定の途中で多数の
試薬を溶液中に添加しなければならず、複雑な作
業が要求される。本発明は、上述した点に鑑みてなされたもの
で、簡単に高い精度で中性脂質を測定することが
できる中性脂質センサーを提供することを目的と
する。本発明者は、中性脂質がリポプロテインリパー
ゼ（Lipoprotein lipase）を触媒として水
（H₂O）と反応し、グリセロール（Glycerol）と
脂肪酸が生成されること、該生成されたグリセロ
ールがグリセロールオキイダーゼ
（Glyceroloxidase）を触媒として酸素分子（O₂）
と反応し、グリセルアルデハイド
（Glyceraldehyde）と過酸化水素（H₂O₂）を生
成すること、及びこの２番目の反応による溶液中
の酸素量の減少あるいは、過酸化水素量の増加を
検出することにより、該中性脂質の量（濃度）を
簡単に測定することができることを見出した。従つて、本発明に基づく中性脂質センサーは、
第１と第２の電極を有し、その一方の電極近傍に
固定化酵素を配置し、該電極間に流れる電流に基
づいて、被測定溶液中に含まれる中性脂質を測定
するようにしたセンサーにおいて、該固定化酵素
として、リポプロテインリパーゼとグリセロール
オキシダーゼを用いたことを特徴としている。以下本発明の一実施例を添付図面に基づき詳述
する。第１図は、本発明に基づく中性脂質センサーと
しての酸素電極を示しており、１はガラス製の内
管、２は同じくガラス製の外管であり、該内管１
の底部には、白金製のカソード（第１電極）３が
設けられ、又、該外管２の底部には、酸素分子を
透過するテフロン（商標名）膜４が取付けられて
いる。該内管１と該外管２との間には、内部液
（30％NaOH）５が入れられ、該内部液中には、
鉛製のアノード（第２電極）６が配置されてい
る。該カソード３、アノード６には夫々白金のリ
ード線１０が取付けられている。該酸素分子透過
性のテフロン（商標名）膜の外側には、中性脂質
が透過できる透析膜７が設けられ、その中にはリ
ポプロテインリパーゼとグリセロールオキシダー
ゼとが混合された固定化酵素８が入れられてい
る。尚、９はＯリングである。第２図は、上述したセンサーとしての酸素電極
１１を用いた中性脂質測定システムの一例を示し
ている。該酸素電極１１は、30℃に維持された水
槽１２中に配置されているビーカ１３内に挿入さ
れる。該ビーカ１３内の溶液中には、テフロン
（商標名）がコーテイングされた磁性体１４が入
れられており、該ビーカ１３の下部に設けられた
回転磁場発生装置１５による回転磁場により、該
磁性体１４は回転し、その結果、該ビーカ１３中
の溶液は撹拌される。該酸素電極１１の第１と第
２の電極間に流れた電流は、Ａ−Ｖ変換器１６に
よつて電圧信号に変換され、レコーダ１７に供給
される。尚、１８は測定試料をビーカ１３内に注
入するためのマイクロシリンジである。上述した如き構成において、ビーカ１３内に酸
素電極１１を挿入し、磁性体１４を回転させて該
ビーカ内の溶液の撹拌を行う。該撹拌により、該
ビーカ１３内部の溶液中の酸素濃度はプラトーの
状態となり、その後、マイクロシリンダ１８より
血清が該溶液中に注入される。該血清中に含まれ
る中性脂質は、該酸素電極１１底部に設けられて
いる固定化酵素のリポプロテインリパーゼを触媒
として該溶液中の水と反応する。この反応によ
り、グリセロールと脂肪酸が生成されるが、該生
成されたグリセロールは、固定化酵素の内のグリ
セロールオキシダーゼを触媒として該溶液中の酸
素分子と反応し、グリセルアルデハイドと過酸化
水素を生成する。この結果、酸素電極底部のカソ
ード３周辺の酸素分子の量（濃度）は、該２番目
の反応によつて少くなり、該カソード３とアノー
ド１との間に流れる電流は低くなる。数分の後、
該電流値はプラトーの状態となり、グリセロール
との反応に寄与する酸素の量に比例した該電流値
の変化から、中性脂質の量（濃度）を測定するこ
とができる。次に実験例を示す。実験例１人コントロール血清の希釈系列を試料として、
本発明に基づくセンサーの特性を調べた。コント
ロール血清は、栄研化学(株)製リピツドセーラム
を用いた。分析条件は、衝撃液：0.1M、PH8.0リ
ン酸緩衝液（トリトン×100 ４％）、反応温度：
30℃、試料量：50μであつた。各濃度における
応答曲線を第３図に示すが、この図において、縦
軸は検出電流値（μA）、横軸は時間（分）であ
る。第４図は、第３図の測定結果に基づいて得ら
れた電流値差と濃度との関係を示すグラフであ
り、このグラフを用い、未知試料中の中性脂質の
濃度を求めることができる。尚、この試験の同時
再現性は、５回の測定で相対標準偏差値6.6％で
あつた。試験例２代表的中性脂質の１つであるトリオレインを試
料として本発明に基づくセンサーの特性を調べ
た。トリオレインは東京化成(株)製のものを使用し
た。分析条件（緩衝液、反応温度、試料量）は、
上述した試験例１と同じであり、この試験の結果
得られた検量線を第５図に示す。尚、この時の同
時再現性は、５回の測定で相対標準偏差値5.7％
であつた。試験例３試料としての人血清を本発明に基づくセンサー
と従来法によつて分析し、比較した。分析条件
（緩衝液、反応温度、試料量）は、上記試験例１
と同じであり、検量線は、試験例１で得られたも
のを使用した。この分析結果を表１に示すが、表
の単位は、mg／dlである。尚、従来法とは、自動
化学分析装置を用い、試料と酵素試薬とを混合し
て反応させ、反応溶液を比色測定したものであ
る。 The present invention relates to a neutral lipid sensor using an immobilized enzyme that can easily measure the concentration of neutral lipids contained in serum or the like. Conventionally, for neutral lipid analysis using immobilized enzymes, there have been systems that combine an immobilized enzyme column and a PH electrode, systems that combine an immobilized enzyme membrane and an enzyme electrode, or a hydrogen peroxide (H ₂ O ₂ ) electrode. is being used. The former system uses a PH electrode, and because the measurement is potentiometric, the measurement accuracy is not sufficient, and because it uses a column,
A pump and a flow cell for detection are required, making the system large. On the other hand, the latter system electrolyzes oxygen molecules or hydrogen peroxide dissolved in the solvent to be measured, and measures the electrolytic current at that time.As it is an amperometric measurement, it is possible to measure with high accuracy. It can be carried out. However, the reaction system for producing hydrogen peroxide from neutral lipids is complex, and many reagents must be added to the solution during the measurement, which requires complicated operations. The present invention has been made in view of the above-mentioned points, and an object of the present invention is to provide a neutral lipid sensor that can easily measure neutral lipids with high accuracy. The present inventor discovered that neutral lipids react with water (H ₂ O) using lipoprotein lipase as a catalyst to generate glycerol and fatty acids, and that the generated glycerol is a glycerol oxygen compound. Oxygen molecules (O ₂ ) are catalyzed by glyceroloxidase.
It reacts with glyceraldehyde (Glyceraldehyde) and hydrogen peroxide (H ₂ O ₂ ), and detects the decrease in the amount of oxygen in the solution or the increase in the amount of hydrogen peroxide due to this second reaction. It has been found that the amount (concentration) of the neutral lipid can be easily measured by this method. Therefore, the neutral lipid sensor according to the present invention is
It has first and second electrodes, an immobilized enzyme is placed near one of the electrodes, and neutral lipids contained in the solution to be measured are measured based on the current flowing between the electrodes. The sensor is characterized in that lipoprotein lipase and glycerol oxidase are used as the immobilized enzymes. An embodiment of the present invention will be described below in detail with reference to the accompanying drawings. FIG. 1 shows an oxygen electrode as a neutral lipid sensor based on the present invention, 1 is an inner tube made of glass, 2 is an outer tube also made of glass, and the inner tube 1 is an outer tube made of glass.
A cathode (first electrode) 3 made of platinum is provided at the bottom of the outer tube 2, and a Teflon (trade name) membrane 4 that transmits oxygen molecules is attached to the bottom of the outer tube 2. An internal liquid (30% NaOH) 5 is placed between the inner tube 1 and the outer tube 2, and the internal liquid contains:
An anode (second electrode) 6 made of lead is arranged. Platinum lead wires 10 are attached to the cathode 3 and anode 6, respectively. A dialysis membrane 7 through which neutral lipids can permeate is provided on the outside of the oxygen molecule permeable Teflon (trade name) membrane, and an immobilized enzyme 8 containing a mixture of lipoprotein lipase and glycerol oxidase is provided therein. It is included. Note that 9 is an O-ring. FIG. 2 shows an example of a neutral lipid measuring system using the oxygen electrode 11 as the sensor described above. The oxygen electrode 11 is inserted into a beaker 13 placed in a water tank 12 maintained at 30°C. A magnetic material 14 coated with Teflon (trade name) is placed in the solution in the beaker 13, and a rotating magnetic field generated by a rotating magnetic field generator 15 provided at the bottom of the beaker 13 causes the magnetic material to be removed. 14 rotates, so that the solution in the beaker 13 is stirred. The current flowing between the first and second electrodes of the oxygen electrode 11 is converted into a voltage signal by the AV converter 16 and supplied to the recorder 17 . Note that 18 is a microsyringe for injecting a measurement sample into the beaker 13. In the above-described configuration, the oxygen electrode 11 is inserted into the beaker 13, and the magnetic body 14 is rotated to stir the solution in the beaker. Due to the stirring, the oxygen concentration in the solution inside the beaker 13 reaches a plateau state, and then serum is injected into the solution from the micro cylinder 18. The neutral lipids contained in the serum react with the water in the solution using lipoprotein lipase, an immobilized enzyme provided at the bottom of the oxygen electrode 11, as a catalyst. This reaction produces glycerol and fatty acids, and the produced glycerol reacts with oxygen molecules in the solution using glycerol oxidase, an immobilized enzyme, as a catalyst, producing glyceraldehyde and hydrogen peroxide. do. As a result, the amount (concentration) of oxygen molecules around the cathode 3 at the bottom of the oxygen electrode decreases due to the second reaction, and the current flowing between the cathode 3 and the anode 1 decreases. After a few minutes,
The current value reaches a plateau state, and the amount (concentration) of the neutral lipid can be measured from the change in the current value that is proportional to the amount of oxygen contributing to the reaction with glycerol. Next, an experimental example will be shown. Experimental example 1 A dilution series of human control serum was used as a sample.
The characteristics of the sensor based on the present invention were investigated. As the control serum, Lipid Serum manufactured by Eiken Chemical Co., Ltd. was used. The analysis conditions were: shock solution: 0.1M, PH8.0 phosphate buffer (Triton x 100 4%), reaction temperature:
The temperature was 30°C and the sample amount was 50μ. The response curve at each concentration is shown in FIG. 3, in which the vertical axis is the detected current value (μA) and the horizontal axis is the time (minutes). Figure 4 is a graph showing the relationship between the current value difference and concentration obtained based on the measurement results in Figure 3. Using this graph, the concentration of neutral lipids in an unknown sample can be determined. . The simultaneous reproducibility of this test was 6.6% relative standard deviation in 5 measurements. Test Example 2 The characteristics of the sensor based on the present invention were investigated using triolein, which is one of the representative neutral lipids, as a sample. Triolein manufactured by Tokyo Kasei Co., Ltd. was used. The analysis conditions (buffer solution, reaction temperature, sample amount) are as follows:
This is the same as Test Example 1 described above, and the calibration curve obtained as a result of this test is shown in FIG. In addition, the simultaneous reproducibility at this time was 5.7% relative standard deviation after 5 measurements.
It was hot. Test Example 3 Human serum as a sample was analyzed and compared using the sensor based on the present invention and the conventional method. The analysis conditions (buffer solution, reaction temperature, sample amount) were as described in Test Example 1 above.
The calibration curve was the same as that obtained in Test Example 1. The results of this analysis are shown in Table 1, and the units in the table are mg/dl. The conventional method is one in which a sample and an enzyme reagent are mixed and reacted using an automatic chemical analyzer, and the reaction solution is measured colorimetrically.

【表】以上詳述した如く、本発明によれば、固定化酵
素としてリポプロテインリパーゼとグリセロール
オキシダーゼを用いる簡単な構成で、中性脂質の
検出をアンペロメトリツクに高精度で行うことが
できる。尚、本発明は上述した実施例に限定され
ることなく幾多の変形が可能である。例えば、酸
素電極を使用せず、グリセロールと酸素との反応
によつて生成される過酸化水素を検出するための
過酸化水素電極を用いても良い。又、測定システ
ムは第２図の構成に限定されないもので、溶液の
撹拌手段、試料の注入手段等は、他の機構を用い
ることができる。[Table] As detailed above, according to the present invention, neutral lipids can be detected amperometrically with high precision using a simple configuration using lipoprotein lipase and glycerol oxidase as immobilized enzymes. Note that the present invention is not limited to the embodiments described above, and can be modified in many ways. For example, instead of using an oxygen electrode, a hydrogen peroxide electrode for detecting hydrogen peroxide produced by the reaction between glycerol and oxygen may be used. Further, the measurement system is not limited to the configuration shown in FIG. 2, and other mechanisms may be used for the solution stirring means, sample injection means, etc.

[Brief explanation of drawings]

第１図は、本発明に基づくセンサーの一実施例
を示す図、第２図は中性脂質測定システムの一例
を示す図、第３図は時間と検出電流との関係を示
すグラフ、第４図及び第５図は検出電流値差と中
性脂質濃度との関係を示すグラフである。１……内管、２……外管、３……カソード、４
……酸素ガス透過性膜、６……アノード、７……
透析膜、８……固定化酵素、１１……酵素電極、
１２……水槽、１３……ビーカ、１４……磁性
体、１５……回転磁場発生装置、１６……Ａ−Ｖ
変換器、１７……レコーダ、１８……マイクロシ
リンジ。 FIG. 1 is a diagram showing an example of a sensor based on the present invention, FIG. 2 is a diagram showing an example of a neutral lipid measuring system, FIG. 3 is a graph showing the relationship between time and detected current, and FIG. 4 is a diagram showing an example of a neutral lipid measurement system. The figure and FIG. 5 are graphs showing the relationship between the detected current value difference and the neutral lipid concentration. 1... Inner tube, 2... Outer tube, 3... Cathode, 4
...Oxygen gas permeable membrane, 6... Anode, 7...
Dialysis membrane, 8...immobilized enzyme, 11...enzyme electrode,
12...Water tank, 13...Beaker, 14...Magnetic material, 15...Rotating magnetic field generator, 16...A-V
Converter, 17...Recorder, 18...Microsyringe.

Claims

[Scope of Claims] 1 It has a first and a second electrode, and an immobilized enzyme is placed near one of the electrodes, and based on the current flowing between the electrodes, the neutrality contained in the solution to be measured is determined. 1. A neutral lipid sensor for measuring lipids, characterized in that lipoprotein lipase and glycerol oxidase are used as the immobilized enzymes. 2. The neutral lipid sensor according to claim 1, wherein the current flowing between the two electrodes changes depending on the amount of oxygen near the one electrode. 3. The neutral lipid sensor according to claim 1, wherein the current flowing between the two electrodes changes depending on the amount of hydrogen peroxide near the one electrode.