【発明の詳細な説明】[Detailed description of the invention]
〔技術分野〕
本発明は、細胞を培養し、増殖させる際に用い
られる細胞培養床に関するものである。
〔従来技術〕
一般に、哺乳類動物を始めとする生物の細胞は
浮遊状態では増殖せず、固体表面に付着してのみ
増殖する性質を有している。このような付着状態
で増殖する性質をもつ細胞を培養し、増殖させる
ためには細胞を多量に付着する固体表面、つまり
培養床が必要となる。
従来、多糖類のような天然高分子物質、ポリス
チレン等の合成高分子物質などが培養床として用
いられているが、必らずしも効率的に細胞培養を
行うことができないため、新しい細胞培養床の出
現が強く望まれている。
また、絹タンパク質の１つであるフイブロイン
をグルタルアルデヒド、ホルムアルデヒドなどの
化学的架橋剤により架橋させる方法、または紫外
線照射により架橋する方法を用いて水に不溶化
し、培養床として用いる方法（特開昭61−52280
号）がある。この場合、細胞に対して毒性の強い
アルデヒドや紫外線によるフイブロインの分解生
成物が培養床に存在し、細胞の付着及び増殖に悪
影響を与えるという問題がある。
〔目的〕
本発明の目的は、効率的に細胞培養を行うため
に、細胞付着性の高い固体表面を有する細胞培養
床を提供することにある。
〔構成〕
本発明は、絹タンパク質膜により表面が形成さ
れており、かつ該絹タンパク質膜は水溶性絹タン
パク質膜を結晶化させて水不溶性化させたもので
あることを特徴とする細胞培養床である。
本発明者は、細胞の付着、増殖しやすい性質を
有する材料の開発について種々研究を重ねた結
果、絹タンパク質の結晶化度を増し、不溶化させ
ることにより、付着液存性細胞に対して著しい増
殖性を有する細胞培養床を作製できることを見出
し、本発明を完成するに到つた。
本明細書における細胞培養床としては、細胞を
培養する際に細胞を付着させて増殖をはかるため
に用いられる固体表面を有する物質を意味し、シ
ート状、繊維状、ビーズ状、中空糸状、プレート
状、シヤーレ状等の形状を有するものである。
本発明の細胞培養床は、絹タンパク質水溶液か
ら所望の形状に成形するか、又は支持体の表面に
絹タンパク質をコーテイングすることによつて製
造することができる。ただし、このままでは非晶
質で水溶性を示す。本発明では、この絹タンパク
質を結晶化し、絹タンパク質成形体あるいは絹タ
ンパク質のコーテイング層中に結晶質を含有さ
せ、水不溶性のものとする。絹タンパク質を結晶
化させるにはエタノールやメタノール等の絹タン
パク質に対する貧溶媒を用いて行うことができ
る。支持体としてはポリスチレンなどの高分子物
質やガラス、マイカ等の無機物も使用され、シー
ト状、発泡状、ビーズ状、繊維状、中空糸状、シ
ヤーレ状、プレート状等の形状を有するものであ
る。
原料として用いる絹タンパク質はフイブロイ
ン、セリシン、及びそれらの混合物であり、家蚕
あるいは野蚕由来のものでもよい。また絹タンパ
ク質溶液は、熟蚕体内の絹糸腺より取出した液状
絹タンパク質を用いることができるし、吐糸繊維
から再生した絹タンパク質を溶液化したものでも
よい。
絹タンパク質の結晶化処理は、溶媒と水からな
る混合溶液中で、絹タンパク質成形体あるいは絹
タンパク質コーテイング層を浸漬処理した後、乾
燥することによつて実施することができる。この
場合、混合溶液の組成、温度、処理時間によつて
その結晶化度は異なるが、少なくとも10％、好ま
しくは15〜80％の範囲に規定するのがよい。乾燥
温度は５〜80℃である。
本発明の細胞培養床は、種々の細胞の培養に用
いることができる。細胞の種類は、特に限定され
るものではないが、その例をあげると、マウス結
晶組織由来繊維芽細胞L929、ヒト子宮癌由来上
皮性細胞HeLaなどがある。
また本発明の細胞培養床は、種々の細胞培養液
を用いて種々の条件下で細胞を培養できる。細胞
培養液および培養条件は特に限定されるものでは
なく、従来公知の方法に従つて実施される。培養
対象となる細胞は、血清を含む培地に添加し、炭
酸ガスインキユベーター（２〜５％の炭酸ガスが
好ましい）中で温度35〜40℃で培養される。この
培養において、細胞は、固体表面によく付着し、
効率的に増殖される。
〔実施例〕
次に本発明を実施例によりさらに詳細に説明す
る。
実施例 １
桑葉で飼育した家蚕（日137号×支137号）の熟
蚕体内より、液状絹タンパク質が多量に蓄積され
ている中部絹糸腺を取り出し、蒸留水で充分膵洗
いした後、絹糸腺細胞を除去した。そして絹糸内
液状絹タンパク質を所定の時間、25℃で蒸留水に
分散させた。すなわち、30分、1.5時間、2.5時
間、並びに４時間の分散時間に対応して得られた
絹タンパク質水溶液をそれぞれＡ、Ｂ、Ｃ及びＤ
とした。これらの絹タンパク質水溶液の濃度を
0.2〜0.3％になるように蒸留水で希釈あるいは濃
縮させて調製した。
実施例 ２
実施例１で得た新鮮な絹タンパク質水溶液
（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ）中に、エタノールで洗浄し乾
燥したポリスチレンフイルム（９×９×0.02mm）
を浸漬した。25℃で１時間経過後そのポリスチレ
ンフイルムをその溶液から引き上げ、過剰の液滴
を除去して25℃で乾燥した。このようにして絹タ
ンパク質を表面に被覆させたポリスチレンフイル
ムを25℃の50体積％メタノール水溶液中に１時間
浸漬して結晶化処理し、その後温度25℃で乾燥し
た。
次に、この絹タンパク質を表面に被覆させたフ
イルム上に、マウス由来の繊維芽細胞L929を含
む培養液（約10万個／ml）を接触させたまま、炭
酸ガス濃度５％、湿度100％、37℃のインキユベ
ータ内に静置した。培養液は10％の牛胎児血清を
含むEagleMEMを用いた。17時間後及び50時間
後、そのフイルム上に付着している細胞の量をク
リスタルバイオレツトを用いた核染色法により定
量した。
比較のため、ポリスチレンフイルムを用いて、
同様の細胞付着試験を行つた。
これらのフイルムに付着した細胞の量を標準試
料（和光純薬工業株式会社製組織培養用プラスチ
ツクシート）に付着した細胞の量で割ることによ
り、細胞付着率を求めた。その結果を第１表に示
す。
[Technical Field] The present invention relates to a cell culture bed used for culturing and proliferating cells. [Prior Art] In general, cells of living organisms such as mammals do not grow in a suspended state, but have the property of growing only when attached to a solid surface. In order to culture and proliferate cells that have the property of proliferating in such an attached state, a solid surface, that is, a culture bed, to which a large amount of cells can adhere is required. Traditionally, natural polymeric substances such as polysaccharides and synthetic polymeric substances such as polystyrene have been used as culture beds, but since they are not always efficient in culturing cells, new cell culture methods have been developed. The appearance of the floor is highly desired. In addition, fibroin, which is one of the silk proteins, is made insoluble in water using a method of cross-linking with a chemical cross-linking agent such as glutaraldehyde or formaldehyde, or a method of cross-linking with ultraviolet irradiation, and a method of using it as a culture bed (Japanese Patent Application Laid-open No. 61−52280
No.). In this case, there is a problem in that aldehydes that are highly toxic to cells and products of decomposition of fibroin caused by ultraviolet light are present in the culture bed, which adversely affects the attachment and proliferation of cells. [Object] An object of the present invention is to provide a cell culture bed having a solid surface with high cell adhesion in order to efficiently culture cells. [Structure] The present invention provides a cell culture bed whose surface is formed of a silk protein film, and the silk protein film is made by crystallizing a water-soluble silk protein film to make it water-insoluble. It is. As a result of various research into the development of materials with properties that allow cells to easily adhere and proliferate, the present inventor has found that by increasing the crystallinity of silk protein and making it insolubilized, cells residing in adherent fluids can significantly proliferate. The present inventors have discovered that it is possible to create a cell culture bed with the following properties, and have completed the present invention. In this specification, the term "cell culture bed" refers to a material having a solid surface that is used for adhering cells to measure their growth when culturing cells, such as sheets, fibers, beads, hollow fibers, plates, etc. It has a shape such as a shape or a shear shape. The cell culture bed of the present invention can be manufactured by molding an aqueous silk protein solution into a desired shape or by coating the surface of a support with silk protein. However, as it is, it remains amorphous and water-soluble. In the present invention, this silk protein is crystallized and crystalline material is contained in a silk protein molded article or a coating layer of silk protein to make it water-insoluble. Silk protein can be crystallized using a poor solvent for silk protein, such as ethanol or methanol. As the support, polymeric substances such as polystyrene and inorganic substances such as glass and mica are also used, and the support has a shape such as a sheet, a foam, a bead, a fiber, a hollow fiber, a shear, a plate, etc. Silk proteins used as raw materials are fibroin, sericin, and mixtures thereof, and may be derived from domestic silkworms or wild silkworms. Further, the silk protein solution may be a liquid silk protein extracted from the silk gland in a mature silkworm body, or may be a solution of silk protein regenerated from spun fibers. The crystallization treatment of silk protein can be carried out by immersing a silk protein molded article or a silk protein coating layer in a mixed solution consisting of a solvent and water, and then drying. In this case, the degree of crystallinity varies depending on the composition, temperature, and treatment time of the mixed solution, but it is preferably at least 10%, preferably in the range of 15 to 80%. Drying temperature is 5-80°C. The cell culture bed of the present invention can be used for culturing various cells. The type of cells is not particularly limited, but examples thereof include mouse crystal tissue-derived fibroblast L929 and human uterine cancer-derived epithelial cells HeLa. Furthermore, the cell culture bed of the present invention allows cells to be cultured under various conditions using various cell culture media. The cell culture medium and culture conditions are not particularly limited, and the culture is carried out according to conventionally known methods. Cells to be cultured are added to a medium containing serum and cultured in a carbon dioxide incubator (preferably 2 to 5% carbon dioxide) at a temperature of 35 to 40°C. In this culture, cells adhere well to solid surfaces and
Efficiently multiplied. [Example] Next, the present invention will be explained in more detail with reference to Examples. Example 1 The middle silk gland containing a large amount of liquid silk protein was removed from the mature silkworm body of domestic silkworms (Japanese No. 137 x Shi No. 137) reared on mulberry leaves, and after thoroughly washing the pancreas with distilled water, the silk thread was removed. Glandular cells were removed. The liquid silk protein in the silk thread was then dispersed in distilled water at 25°C for a predetermined period of time. That is, silk protein aqueous solutions obtained corresponding to dispersion times of 30 minutes, 1.5 hours, 2.5 hours, and 4 hours were added to A, B, C, and D, respectively.
And so. The concentration of these silk protein aqueous solutions is
It was prepared by diluting or concentrating it with distilled water to a concentration of 0.2 to 0.3%. Example 2 A polystyrene film (9 x 9 x 0.02 mm) washed with ethanol and dried was placed in the fresh silk protein aqueous solution (A, B, C, D) obtained in Example 1.
Soaked. After 1 hour at 25°C, the polystyrene film was removed from the solution, excess droplets removed, and dried at 25°C. The polystyrene film whose surface was coated with silk protein in this manner was immersed in a 50 volume % aqueous methanol solution at 25°C for 1 hour for crystallization treatment, and then dried at a temperature of 25°C. Next, a culture solution containing mouse-derived fibroblasts L929 (approximately 100,000 cells/ml) was kept in contact with the film coated with silk protein at a carbon dioxide concentration of 5% and humidity of 100%. , and placed in an incubator at 37°C. EagleMEM containing 10% fetal bovine serum was used as the culture medium. After 17 and 50 hours, the amount of cells adhering to the film was quantified by nuclear staining using crystal violet. For comparison, using polystyrene film,
A similar cell adhesion test was conducted. The cell attachment rate was determined by dividing the amount of cells attached to these films by the amount of cells attached to a standard sample (plastic sheet for tissue culture manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). The results are shown in Table 1.
〔効果〕〔effect〕
以上説明したように、本発明の細胞培養床は、
極めて多量の細胞を付着し、増殖させることがで
き、その産業的意義は大きい。
As explained above, the cell culture bed of the present invention is
It is capable of attaching and proliferating extremely large amounts of cells, and has great industrial significance.