JPH0441995B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

〔産業上の利用分野〕 本発明は、菌体外に高い活性のプロテアーゼを
産生し、かつ多量の粘質物を産生するバチルス・
ズブチリス（Bacillus subtilis）NN−１（以下、
本菌株という。）に関するものである。 本菌株は菌体外にプロテアーゼを分泌する。た
んぱく質分解酵素であるプロテアーゼは、たんぱ
く質を分解し、アミノ酸やペプチドを遊離する。
これらの物質は、呈味成分としてよく知られてお
り、特にグルタミン酸は、旨味成分として知ら
れ、実際に調味料として利用されている。 また、本菌株は菌体外に粘質物を産生する性質
を有している。したがつて、本菌株を利用するこ
とより、粘性の高い、曳糸性のある調味料や味噌
などを製造することが可能となり、また、従来の
食品素材に添加することにより、そのテクスチヤ
ーの改善を行うことができるなどの広い用途があ
る。さらに、工業的にも糊料として利用されう
る。 〔従来の技術〕 従来、発酵産業、特に味噌の製造において、バ
チルス・ズブチリスは製品に混入、繁殖し、商品
価値を下げる有害な細菌と見做されてきた。した
がつて、調味料や味噌のような液状の発酵食品に
バチルス・ズブチリスを積極的に利用するという
発想はなく、この方面の研究、技術開発は皆無と
言つてよい。 〔発明が解決しようとする課題〕 原料たんぱく質を効率よく、有効に分解してア
ミノ酸やペプチドを得るには、使用微生物のプロ
テアーゼ活性が強くなければならない。 現在、粘質物を生産する菌株としてバチルス・
ナツトー（Bacillus natto）が知られている。そ
の粘質物は水による希釈によつて、著しくその粘
性および曳糸性は低下する。これを液体培養して
粘性と曳糸性が強い溶液を得るには、何らかの方
法により培養液を濃縮する行程が必要である。し
かし、それは煩雑で、かつ経済的にコスト増大に
つながるので、このような工程を要しない、より
多くの粘質物を生産する菌株を得るのが有利であ
る。したがつて、プロテアーゼ活性が高く、同時
に粘着物の生産も行うという菌株に何らかの方法
で取得する必要がある。 〔課題を解決するための手段〕 そこで、本発明者らは上記の性質を有する菌株
をスクリーニングすることを試みた。すなわち、
土壌、稲わら、枯れ草等より耐熱生胞子を形成す
る菌株を分離し、そのうちコロニーの形態がバチ
ルス・ズブチリスと思われるものについて、プロ
テアーゼ活性と粘質物生産能の高い菌株を選択し
た。 その結果、これら二つの特徴を兼ね備えた菌株
を稲わらより分離した。得られた菌株は３株で、
プロテアーゼ活性は100〜121単位／ml、相対粘度
は26〜60（４倍希釈）の範囲にあつた。粘質物の
生産は、酵素γ−グルタミルトランスペプチダー
ゼ（γ−GTP）の活性と相関があることが知ら
れている。本菌株のγ−GTP活性は940〜1508国
際単位／の範囲にあつた。 バージーズ・マニユアル・オブ・シクテマチツ
ク・バクテリオロジー（Bergey's Manual of
Systematic Bacteriology）第２巻に準拠して性
質を調べたところ、本菌株（３株共）は分類学上
バチルス・ズブチリスに属するものと同定され
た。 本菌株以外のバチルス・ズブチリスであつて本
菌株と同程度もしくはより多くのプロテアーゼを
産生する菌株が報告されているが、この菌株が同
時に粘質物を生産するという記述はない。一方、
粘質物を生産する菌株としては、現在バチルス・
ナツトーが知られている。そこで、本発明におけ
る対照菌株として市販納豆菌より純枠分離した菌
株、バチルス・ズブチリスMAFF10−08103を用
いた。実施例に示したように、プロテアーゼ活性
と粘着物生産について本菌株と対照菌株を比較し
たところ、いずれも本菌株の方が高い値を示し
た。 以上の結果から、本菌株は新菌株であると結論
付けられる。そこで、本発明者らにより分離され
た新菌株をバチルス・ズブチリスNN−１と命名
した。本菌株は通商産業省工業技術院微生物工業
技術研究所に寄託されており、その受託番号は
FERM Ｐ−11319である。以下に、本菌株の菌
学的性質を示す。 Ａ 形態学的性質 グラム染色 陽性 大きさ 0.8x2.0〜3.0μｍ 形態 短悍菌 運動性 あり 胞子 菌体は膨らまない Ｂ 培養的性質 代用肉汁寒天培地上での生育 コロニーの形態周縁は不規則形であるが、コロ
ニー全体としては円形である コロニーの色 白色 コロニーの光沢 鈍光である。艶がない 代用肉汁培地での生育 菌体の沈澱 あり 中間部 濁りは内ない 菌膜 生成する。厚い Ｃ 生理的性質 カラターゼ反応 陽性 嫌気的条件下では生育しない。 フオーゲス・プロスカウエル試験 陽性 酸の生成グルコース、マンニトールからは陽
性、アラビノース、キシロースからは陰性 ガスの生成 グルコースからは陰性 カゼインの加水分解 陽性 ゼラチンの加水分解 陽性 でんぷんの加水分解 陽性 クエン酸資化性 陽性 チロシン分解 陰性 卵黄のレシチナーゼ反応 陰性称賛塩の還元性
陽性 食塩水での生育 ２、５、７％では生育する。 10％では生育しない。 生育温度５、10、30、40、50℃で生育する。 55、65℃で生育しない。 Ｄ 0.01％リゾチーム存在下での生育 陰性 〔実施例〕 次に、本実施例により本発明を詳しく説明
する。 実施例 １ 本菌株NN−１の菌株外プロテアーゼ活性
を測定した。 本菌株１白金耳を普通ブイヨン培地（0.5
％肉エキス、1.5％ペプトン、0.5％塩化ナト
リウム、0.5％リン酸一水素カリウム、PH
7.0）5.0mlに接種した。37℃で26時間培養し
た後、遠心分離（10000xG、10分間、５℃）
して上澄液を得た。プロテアーゼ活性の測定
は以下の方法により行なつた。 使用した試薬は次の通りである。 １ 基質溶液 1.0％酸沈澱大豆たんぱく質
（不二製油(株)製、フジイピユアSP−300）と
0.1N塩化ナトリウムの混合液、PHは水酸化ナ
トリウム溶液で7.3に調節した。 ２ 反応停止液 0.1Mトリクロロ酢酸、0.22N酢
酸ナトリウムおよび0.33N酢酸の混合液 上述の上澄液0.1mlを基質溶液1.0mlに加え、37
℃で60分間反応させた。次いで、反応停止液を
4.0ml添加し、室温にて60分間放置して未分解の
たんぱく質の沈澱を生じさせた。反応液を遠心分
離（1600xG、15分間、室温）して上澄液を得た。
この上澄液の275nｍにおける吸光度を測定した。
なお、ブランクは反応液添加後に上澄液を加えた
ものとした。酵素１単位は、１分間に1μグラム
のチロシンに相当するトリクロロ酢酸可溶性物質
を遊離させる酸素量である。得られた結果を表１
に示した。 表 １菌 株 活性（単位／ml） 本菌株 121 対照菌株 83 表から明らかなように、本菌株は対照菌株より
も高いプロテアーゼ活性を有している。 実施例 ２ 本菌株をグルタミン酸を含有する培地で培養
し、生成した粘質物による粘度を測定した。すな
わち、粘質物生産培地（1.5％グルタミン酸ナト
リウム・一水和物、３％しよ糖、1.5％フイトン
（BBL製）、0.25％KH₂PO₄、0.17％Na₂PO₄、
0.005％NaCl、0.005％MgCl₂・H₂O、100μｇ／
ビオチン、PH7.0）に本菌株を接種し、37℃で３
日間振盪培養した。培養終了後、培養液を遠心
（8000xG、30分間、５℃）し、上澄液を得た。こ
の上澄液に重量で３倍量の蒸留水を加え、よく混
合した。次いで、この液を脱気した後、オストワ
ルド相対粘度計（柴田科学器工業株式会社製、粘
度計番No.２）により流下時間を測定した。その値
を蒸留水の流下時間で除した値を相対粘度とし
た。結果を表２に示した。 表 ２菌 株 相対粘度 本菌株 60.1 対照菌株 16.7 表から明らかなように、本菌株の培養液の粘度
は対照菌株のそれよりも高い値を示した。 実施例 ３ 粘質物合成には、酸素γ−グルタミルトランス
ペプチダーゼ（γ−GTP）が関与していること
が知られている。そこで、本菌株の培養液中の該
酵素活性を測定した。すなわち、実施例２に示し
たものと同一組成の粘質物生産培地に本菌株１白
金耳を接種し、37℃で16時間振盪培養した。培養
終了後、培養液200μを100mlの粘質物生産培地
に接種し、37℃で３日間振盪培養した。培養終了
後、培養液を遠心分離（17℃、600xG、10分間、
５℃）して上澄液を得た。得られた上澄液中のγ
−GTP活性を測定した。活性の測定は、和光純
薬工業株式会社製のγ−GTPの測定キツト（γ
−GTP Ｃテスト ワコー）を用いて行つた。活
性の１国際単位はＬ−γ−グルタミル−ｐ−ジエ
チルアミノアニリドを基質として、37℃、１分間
でｐ−ジエチルアミノアニリンを遊離する酵素量
である。得られた結果を表３に示す。

〔発明の効果〕

本発明の微生物は、プロテアーゼ活性が高く、
且つ粘質物生産も高い微生物である。従つて、本
菌株を用いることにより、たんばく質を成分とす
る原料を水系で発酵させ、従来とは物理的性質の
異なる調味料、味噌などの発酵食品の生産が可能
となる。食品産業において、製品の差別化が望ま
れている現状を考えると、本菌株は粘性、曳糸性
の付与が可能な製品に広く添加在として利用され
うる。 また、本菌株は、耐熱性の胞子を形成し、非常
に保存性に優れている。従つて、本菌株を流通さ
せるのに、特殊な方法を取る必要がなく、非常に
取扱い易い。また、液体培養にも特別困難な問題
はなく、容易に増殖させうる。 従つて、本菌株は、取り扱う際に障害となるよ
うな問題はなく、広く一般に利用され易いと考え
られる。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ 普通ブイヨン培地で培養した場合、100単
   位／ml以上のプロテアーゼを分泌し、かつ粘質物
   生産培地で相対粘度25以上（４倍希釈）の粘質物
   を生産するという、２つの性質を兼ね備えたバチ
   ルス・ズブチリスNN−１。