JPH0456807B2 - - Google Patents
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- JPH0456807B2 JPH0456807B2 JP59280689A JP28068984A JPH0456807B2 JP H0456807 B2 JPH0456807 B2 JP H0456807B2 JP 59280689 A JP59280689 A JP 59280689A JP 28068984 A JP28068984 A JP 28068984A JP H0456807 B2 JPH0456807 B2 JP H0456807B2
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- physiologically active
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- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
Description
〔産業上の利用分野〕
本発明は安定で、かつ、非特異的吸着が少な
く、親水性のスペーサーを有し、さらに、高いリ
ガンド（目的物質とアフイニテイーを有する物
質）濃度を有する生理活性物質の製造法に関す
る。 リガンドとしては、タンパク質、ペプチド、ア
ミノ酸、および生体アミン等、すべてのアミノ基
を有する生理活性物質に適応される。 〔従来の技術〕 従来、固定化生理活性物質を製造するために用
いられる固定化用高分子担体としては、非特異的
吸着がなく、活性化されうる官能基を有するもの
が好適とされている。 特に、アフイニテイー吸着剤として使用する場
合は、多孔性で吸着容量を大きくでき、物理的、
化学的に安定で、球状成型された高分子担体が好
ましい。このような高分子担体としてアガロース
ゲル、ポリビニルアルコール系樹脂等が実用化さ
れている。 〔発明が解決しようとする問題点〕 共有結合による固定化方法として臭化シアンを
用いる方法がある〔Nature、第215巻、1491〜
1492頁（1967年）〕。 この方法は、反応ステツプが短く、容易に調製
できるため、アミノ基、リン酸基の固定化に汎用
されているが、反面、活性化に使用する臭化シ
アンが有毒である、アミノ基とカツプリングし
た場合、架橋部を形成しているイソウレア結合は
不安定で、アフイニテイークロマトグラフイーを
行う緩衝液がアルカリ性になると、固定化された
リガントが漏出してくる危険性がある、イミド
基のPKaが約10であるので、中性付近において
は陽電荷をもつため、非特異的吸着が起こる、と
いう欠点を有する。 アミノ基を有する物質を固定化する方法とし
て、多糖類の過ヨウ素酸酸化法がある
〔Immunology、第20巻、1061〜1065頁（1971
年）〕。これは、多糖類の構成糖残基のジオール構
造を過ヨウ素酸酸化し、酸化開裂により生成した
アルデヒド基にアミノ基を反応させ、さらに、水
素化ホウ素ナトリウムで還元し、不溶性固定化物
質を作る方法である。 しかし、この方法では、スペーサー（リガン
ドと担体の間に導入する任意の長さの分子）が導
入できない、リガンド濃度が低い、というアフ
イニテイー吸着体としては決定的欠陥を有する。 〔問題点を解決するための手段〕 本発明は、前述の臭化シアン法、多糖類の過ヨ
ウ素酸酸化法等の欠点を大幅に改良したもので、
エポキシ基を有する不溶性高分子担体あるいはエ
ポキシ基を有するスペーサーを導入した水酸基、
アミノ基、カルボキシル基、または／およびアミ
ド基を持つ不溶性高分子担体を、アルカリ性下
で、１級水酸基と過ヨウ素酸酸化により開裂可能
なジオール基を有する単糖または２糖と反応さ
せ、得られた糖結合不溶性高分子を過ヨウ素酸に
て酸化開裂することにより生ずるアルデヒド基
に、アミノ基を有する生理活性物質を反応させ、
両者の間にシツフ塩基を形成させて固定化し、さ
らに要すれば、この反応物を通常行われている水
素化ホウ素ナトリウムまたはシアノ水素化ホウ素
ナトリウムで還元する方法によつて結合を安定化
したものである。 本発明方法において使用するエポキシ基を有す
る不溶性高分子としては、予めエポキシ基を有す
るあるいは化学反応によつてエポキシ基を導入た
水に不溶で安定なポリマーであればいずれでもよ
い。 エポキシ基を有する不溶性高分子担体の例とし
ては、ポリグリシジルメタクリレートまたはその
共重合体およびエポキシ樹脂等があり、これらの
担体を使用する場合は、そのままの状態で反応に
供する。また、水酸基を有する不溶性高分子担体
の例としては、アガロース、ポリビニルアルコー
ル系樹脂、ヒドロキシエチル（またはメチル）ア
クリレートまたはその共重合体、ヒドロキシエチ
ル（またはメチル）メタクリレートまたはその共
重合体、Ｎ−メチロールアクリルアミドまたはそ
の共重合体等があり、アミノ基を有する不溶性高
分子担体の例としては、アミノエチルアガロー
ス、アミノヘキシルアガロース、アミノエチルポ
リアクリルアミド等があり、カルボキシル基を有
する不溶性高分子担体の例としては、マレイン酸
のポリマーまたはその共重合体、アクリル酸のポ
リマーまたはその共重合体、メタクリル酸のポリ
マーまたはその共重合体、イタコン酸のポリマー
またはその共重合体等があり、アミド基を有する
不溶性高分子担体の例としては、ポリアクリルア
ミド系ポリマー等があるが、これらの担体を使用
する場合は、既知の方法によりエピクロルヒドリ
ン、エピブロムヒドリン等のエピハロヒドリンま
たはビスオキシラン化合物を用いてエポキシ基を
導入した後、反応に供することが必要である。 糖結合不溶性高分子担体の作成は、吸引濾過し
たエポキシ基を有する担体に、該担体１ｇ当り、
アルカリ水溶液（PH11〜13）を３〜50ml添加した
後、１級水酸基と過ヨウ素酸酸化による開裂可能
なジオール基を有する単糖または２糖を添加し、
20℃〜40℃で振盪する。反応時間は５〜30時間が
好ましい。 添加する単糖または２糖はエポキシ基〔エポキ
シ基の量はL.Sundbergら（J.Chromatogr.，第90
巻、87〜98頁、1974年）の方法により測定〕のモ
ル数に対して10〜50倍が好ましい。 生成した単糖または２糖結合不溶性高分子担体
において単糖または２糖はエポキシ基と一番反応
性の高い第１アルコールの水酸基を介して結合さ
れる。 本発明方法において使用する１級水酸基と過ヨ
ウ素酸酸化により開裂可能なジオール基とを有す
る単糖としては、グルコース、マンノース、ガラ
クトース、タロース等のアルドヘキソース、Ｎ−
アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルガラクトサ
ミン等のアミノ糖等があり、また、１級水酸基と
過ヨウ素酸酸化により開裂可能なジオール基とを
有する２糖としては、ラクトース、マルトース、
シヨ糖等がある。 単糖または２糖結合不溶性高分子担体の酸化開
裂は、過ヨウ素酸またはその塩、好ましくは0.04
〜0.2N過ヨウ素酸ナトリウム水溶液を吸引濾過
した糖または２糖結合不溶性高分子担体に、該担
体１ｇ当り３〜100ml添加し、０℃〜20℃、30分
〜５時間という範囲内で反応させて行うことが好
ましい。 １級水酸基と過ヨウ素酸酸化により開裂可能な
ジオール基を有する単糖として、グルコースを用
いた場合は主に構造式〔１〕のスペーサーが導入
される。 （式中、Ｇは不溶性高分子担体を示し、〜〜は
過ヨウ素酸ナトリウムにより酸化開裂する個所を
示す。以下の式も同様である。） 他に構造式〔２〕〔３〕〔４〕〔５〕のスペーサ
ーが導入されるが、いずれのスペーサーもアルデ
ヒド基を有し、生理活性物質を固定化する場合有
効となる。 １級水酸基と過ヨウ素酸酸化により開裂可能な
ジオール基を有する２糖として、ラクトースを用
いた場合は主に構造式〔６〕、〔７〕のスペーサー
が導入される。 他にグルコースの場合と同様、数種のアルデヒ
ド基を有するスペーサーと酸化開裂されない糖を
有するスペーサーが導入される。アルデヒド基を
有するスペーサーは生理活性物質を固定化する場
合有効であり、また、糖を有するスペーサーは安
定であり、アフイニテイークロマトグラフイーに
おいて何ら妨げとならない。 上記反応により得られたアルデヒド活性化不溶
性高分子担体とタンパン質、ペプチド、アミノ
酸、および生体アミン等アミノ基を有する生理活
性物質を反応させて固定化することにより、固定
化生理活性物質を得ることができる。 アミノ基を有する生理活性物質の例としては、
レクチン、ウシ血清アルブミン、γ−グロプリン
（抗体）、酵素、フイプロネクチン、プロテインＡ
等のタンパク質、色素タンパク質、糖タンパク
質、リンタンパク質等の複合タンパク質、キニ
ン、副腎皮質刺激ホルモン放出因子（CRF）、カ
ルシトニン、グルカゴン等のプペチド、種々のア
ミノ酸、およびヒスタミン、ドーバ、トリブタミ
ン等の生体アミン等がある。 この時用いる溶媒としては、リン酸緩衝液、酢
酸緩衝液等の緩衝液を使用し、固定化される生理
活性物質の活性がPH依存性の場合は適応するPH
で、一般の場合はPH５〜PH10の範囲内で反応を行
う方法が好ましい。 生理活性物質を溶解した緩衝液の量は、吸引濾
過したアルデヒド活性化不溶性高分子担体１ｇ当
り２ml〜10mlの範囲内にあることが好ましい。 反応温度は固定化する生理活性物質の活性安定
領域で行う。好ましくは０℃〜40℃で行う。 反応時間は固定化反応途中の残存生理活性物質
量を測定することにより決定されるが、通常５時
間〜72時間で十分である。 上記反応後、シアノホウ素化水素ナトリウムま
たはホウ素化水素ナトリウムを添加し、生成した
シツフ塩基を還元し安定化する。 還元剤に対して不安定な生理活性物質の場合
は、シアノホウ素化水素ナトリウムを使用する方
が好ましい。 還元剤の量は吸引濾過担体１ｇ当り30mg以上あ
れば十分であり、還元反応は０℃〜40℃の範囲内
で２〜24時間反応すれば十分である。 得られた生理活性物質固定化不溶性高分子担体
にシアノホウ素化ナトリウムを吸引濾過担体１ｇ
当り30mg以上含む任意量の0.5〜2Mトリス−塩酸
緩衝液（PH7.4）を入れ、０℃〜40℃の範囲内で
30分〜２時間放置する。これにより担体に残存す
るアルデヒド基を不活性基へと導びくことができ
る。 以上の反応によつて高濃度のリガンド導入が可
能となり、また、過ヨウ素酸の反応条件を変更さ
せることにより、またはリガンドとなる生理活性
物質の量を変更させることにより、自由にそのリ
ガンド濃度を変更することができる。固定化収率
も約90％とすぐれている。 〔発明の効果〕 本発明方法によれば、従来の生理活性物質の固
定化法の欠点を大幅に改良することができる。す
なわち、スペーサーに関しては、電荷を持た
ず、非特異的吸着が少ない、導入されたスペー
サーは化学的に安定であり、臭化シアン法にみら
れるリガンドの漏出が少ない、親水性のスペン
サーを有する、等の特長がある。 また、リガンドに関しては、高いリガンド濃
度が得られ、かつ、、リガンド量は自由に変更で
きる、リガンドの反応収率が非常に高い、等の
特長がある。 その他に、エポキシ基の導入により、架橋が
形成され、担体が強化されている、担体に糖を
結合した状態で長期保存ができ、固定化反応を行
う直前、過ヨウ素酸酸酸化を行い、固定化に供す
ることができる、という特長も有する。 〔実施例〕 次に本発明の実施例を示し、本発明をさらに説
明する。 実施例 １ (1)グルコース固定化アガロースの調製 アガロースゲルとしてフマルマシア社セフア
ロース4Bを用いた。 グラスフイルター上で、水で十分に洗浄後、エ
ポキシ化は吸引濾過したアガロースゲル30ｇに50
％ジメチルスルホキシド45ml、2M NaOH20ml、
エピクロルヒドリン4.5mlを添加し、40℃で２時
間振盪した。反応後、グラスフイルターに移し、
水で十分に洗浄してエポキシ活性化セフアロース
4Bを得た。導入されたエポキシ基はNa2S2O3を
使用するL.Sundbengらの方法により測定したと
ころ、吸引濾過セフアロース4B1ｇ当り約
40μmolのエポキシ基が導入された。 このエポキシ活性化アガロースゲル20ｇにグル
コース３ｇを溶解した80mlの0.1N NaOH溶液を
添加し、37℃で20時間振盪した。反応後、グラス
フイルター上で、水で十分洗浄し、グルコース結
合アガロースを得た。 (2) レクチンの固定化 グルコース固定化アガロース15ｇに0.1N過ヨ
ウ素酸ナトリウム水溶液150mlを加え、４℃で１
時間振盪した。反応後、グラスフイルターに移
し、酸性水溶液（PH３）で十分に洗浄後さらに水
で十分に洗浄し、アルデヒド活性化アガロースを
得た。 アルデヒド活性化アガロース３ｇに対し、コン
カナバリンＡ（以下「ConA」という）、0.2Mα−
メチルマンノシドを含む0.1M酢緩衝液（PH6.0）
10mlを添加した。ConA量は58mg、110mg、156
mg、236mg、と変え、４℃で48時間振盪した。 反応後、各条件のものにシアノホウ素化水素ナ
トリウムを100mg添加し、さらに、４℃で12時間
振盪した。 反応物をグラスフイルターに移し、0.1M酢酸
緩衝液（PH6.0）で十分に洗浄し、ConA−アガロ
ースをを得た。 得られたConA−アガロース３ｇにシアノホウ
素化水素ナトリウム100mgを含む1Mトリス−塩酸
緩衝液（PH7.4）15mlを加え、室温で１時間放置
後、グラスフイルター上で、水で十分に洗浄し
た。 固定化量はもとのConAの280nmの吸光度と残
存していたConAの280nmの吸光度の差より固定
化量とした。その結果を表１に示す。
く、親水性のスペーサーを有し、さらに、高いリ
ガンド（目的物質とアフイニテイーを有する物
質）濃度を有する生理活性物質の製造法に関す
る。 リガンドとしては、タンパク質、ペプチド、ア
ミノ酸、および生体アミン等、すべてのアミノ基
を有する生理活性物質に適応される。 〔従来の技術〕 従来、固定化生理活性物質を製造するために用
いられる固定化用高分子担体としては、非特異的
吸着がなく、活性化されうる官能基を有するもの
が好適とされている。 特に、アフイニテイー吸着剤として使用する場
合は、多孔性で吸着容量を大きくでき、物理的、
化学的に安定で、球状成型された高分子担体が好
ましい。このような高分子担体としてアガロース
ゲル、ポリビニルアルコール系樹脂等が実用化さ
れている。 〔発明が解決しようとする問題点〕 共有結合による固定化方法として臭化シアンを
用いる方法がある〔Nature、第215巻、1491〜
1492頁（1967年）〕。 この方法は、反応ステツプが短く、容易に調製
できるため、アミノ基、リン酸基の固定化に汎用
されているが、反面、活性化に使用する臭化シ
アンが有毒である、アミノ基とカツプリングし
た場合、架橋部を形成しているイソウレア結合は
不安定で、アフイニテイークロマトグラフイーを
行う緩衝液がアルカリ性になると、固定化された
リガントが漏出してくる危険性がある、イミド
基のPKaが約10であるので、中性付近において
は陽電荷をもつため、非特異的吸着が起こる、と
いう欠点を有する。 アミノ基を有する物質を固定化する方法とし
て、多糖類の過ヨウ素酸酸化法がある
〔Immunology、第20巻、1061〜1065頁（1971
年）〕。これは、多糖類の構成糖残基のジオール構
造を過ヨウ素酸酸化し、酸化開裂により生成した
アルデヒド基にアミノ基を反応させ、さらに、水
素化ホウ素ナトリウムで還元し、不溶性固定化物
質を作る方法である。 しかし、この方法では、スペーサー（リガン
ドと担体の間に導入する任意の長さの分子）が導
入できない、リガンド濃度が低い、というアフ
イニテイー吸着体としては決定的欠陥を有する。 〔問題点を解決するための手段〕 本発明は、前述の臭化シアン法、多糖類の過ヨ
ウ素酸酸化法等の欠点を大幅に改良したもので、
エポキシ基を有する不溶性高分子担体あるいはエ
ポキシ基を有するスペーサーを導入した水酸基、
アミノ基、カルボキシル基、または／およびアミ
ド基を持つ不溶性高分子担体を、アルカリ性下
で、１級水酸基と過ヨウ素酸酸化により開裂可能
なジオール基を有する単糖または２糖と反応さ
せ、得られた糖結合不溶性高分子を過ヨウ素酸に
て酸化開裂することにより生ずるアルデヒド基
に、アミノ基を有する生理活性物質を反応させ、
両者の間にシツフ塩基を形成させて固定化し、さ
らに要すれば、この反応物を通常行われている水
素化ホウ素ナトリウムまたはシアノ水素化ホウ素
ナトリウムで還元する方法によつて結合を安定化
したものである。 本発明方法において使用するエポキシ基を有す
る不溶性高分子としては、予めエポキシ基を有す
るあるいは化学反応によつてエポキシ基を導入た
水に不溶で安定なポリマーであればいずれでもよ
い。 エポキシ基を有する不溶性高分子担体の例とし
ては、ポリグリシジルメタクリレートまたはその
共重合体およびエポキシ樹脂等があり、これらの
担体を使用する場合は、そのままの状態で反応に
供する。また、水酸基を有する不溶性高分子担体
の例としては、アガロース、ポリビニルアルコー
ル系樹脂、ヒドロキシエチル（またはメチル）ア
クリレートまたはその共重合体、ヒドロキシエチ
ル（またはメチル）メタクリレートまたはその共
重合体、Ｎ−メチロールアクリルアミドまたはそ
の共重合体等があり、アミノ基を有する不溶性高
分子担体の例としては、アミノエチルアガロー
ス、アミノヘキシルアガロース、アミノエチルポ
リアクリルアミド等があり、カルボキシル基を有
する不溶性高分子担体の例としては、マレイン酸
のポリマーまたはその共重合体、アクリル酸のポ
リマーまたはその共重合体、メタクリル酸のポリ
マーまたはその共重合体、イタコン酸のポリマー
またはその共重合体等があり、アミド基を有する
不溶性高分子担体の例としては、ポリアクリルア
ミド系ポリマー等があるが、これらの担体を使用
する場合は、既知の方法によりエピクロルヒドリ
ン、エピブロムヒドリン等のエピハロヒドリンま
たはビスオキシラン化合物を用いてエポキシ基を
導入した後、反応に供することが必要である。 糖結合不溶性高分子担体の作成は、吸引濾過し
たエポキシ基を有する担体に、該担体１ｇ当り、
アルカリ水溶液（PH11〜13）を３〜50ml添加した
後、１級水酸基と過ヨウ素酸酸化による開裂可能
なジオール基を有する単糖または２糖を添加し、
20℃〜40℃で振盪する。反応時間は５〜30時間が
好ましい。 添加する単糖または２糖はエポキシ基〔エポキ
シ基の量はL.Sundbergら（J.Chromatogr.，第90
巻、87〜98頁、1974年）の方法により測定〕のモ
ル数に対して10〜50倍が好ましい。 生成した単糖または２糖結合不溶性高分子担体
において単糖または２糖はエポキシ基と一番反応
性の高い第１アルコールの水酸基を介して結合さ
れる。 本発明方法において使用する１級水酸基と過ヨ
ウ素酸酸化により開裂可能なジオール基とを有す
る単糖としては、グルコース、マンノース、ガラ
クトース、タロース等のアルドヘキソース、Ｎ−
アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルガラクトサ
ミン等のアミノ糖等があり、また、１級水酸基と
過ヨウ素酸酸化により開裂可能なジオール基とを
有する２糖としては、ラクトース、マルトース、
シヨ糖等がある。 単糖または２糖結合不溶性高分子担体の酸化開
裂は、過ヨウ素酸またはその塩、好ましくは0.04
〜0.2N過ヨウ素酸ナトリウム水溶液を吸引濾過
した糖または２糖結合不溶性高分子担体に、該担
体１ｇ当り３〜100ml添加し、０℃〜20℃、30分
〜５時間という範囲内で反応させて行うことが好
ましい。 １級水酸基と過ヨウ素酸酸化により開裂可能な
ジオール基を有する単糖として、グルコースを用
いた場合は主に構造式〔１〕のスペーサーが導入
される。 （式中、Ｇは不溶性高分子担体を示し、〜〜は
過ヨウ素酸ナトリウムにより酸化開裂する個所を
示す。以下の式も同様である。） 他に構造式〔２〕〔３〕〔４〕〔５〕のスペーサ
ーが導入されるが、いずれのスペーサーもアルデ
ヒド基を有し、生理活性物質を固定化する場合有
効となる。 １級水酸基と過ヨウ素酸酸化により開裂可能な
ジオール基を有する２糖として、ラクトースを用
いた場合は主に構造式〔６〕、〔７〕のスペーサー
が導入される。 他にグルコースの場合と同様、数種のアルデヒ
ド基を有するスペーサーと酸化開裂されない糖を
有するスペーサーが導入される。アルデヒド基を
有するスペーサーは生理活性物質を固定化する場
合有効であり、また、糖を有するスペーサーは安
定であり、アフイニテイークロマトグラフイーに
おいて何ら妨げとならない。 上記反応により得られたアルデヒド活性化不溶
性高分子担体とタンパン質、ペプチド、アミノ
酸、および生体アミン等アミノ基を有する生理活
性物質を反応させて固定化することにより、固定
化生理活性物質を得ることができる。 アミノ基を有する生理活性物質の例としては、
レクチン、ウシ血清アルブミン、γ−グロプリン
（抗体）、酵素、フイプロネクチン、プロテインＡ
等のタンパク質、色素タンパク質、糖タンパク
質、リンタンパク質等の複合タンパク質、キニ
ン、副腎皮質刺激ホルモン放出因子（CRF）、カ
ルシトニン、グルカゴン等のプペチド、種々のア
ミノ酸、およびヒスタミン、ドーバ、トリブタミ
ン等の生体アミン等がある。 この時用いる溶媒としては、リン酸緩衝液、酢
酸緩衝液等の緩衝液を使用し、固定化される生理
活性物質の活性がPH依存性の場合は適応するPH
で、一般の場合はPH５〜PH10の範囲内で反応を行
う方法が好ましい。 生理活性物質を溶解した緩衝液の量は、吸引濾
過したアルデヒド活性化不溶性高分子担体１ｇ当
り２ml〜10mlの範囲内にあることが好ましい。 反応温度は固定化する生理活性物質の活性安定
領域で行う。好ましくは０℃〜40℃で行う。 反応時間は固定化反応途中の残存生理活性物質
量を測定することにより決定されるが、通常５時
間〜72時間で十分である。 上記反応後、シアノホウ素化水素ナトリウムま
たはホウ素化水素ナトリウムを添加し、生成した
シツフ塩基を還元し安定化する。 還元剤に対して不安定な生理活性物質の場合
は、シアノホウ素化水素ナトリウムを使用する方
が好ましい。 還元剤の量は吸引濾過担体１ｇ当り30mg以上あ
れば十分であり、還元反応は０℃〜40℃の範囲内
で２〜24時間反応すれば十分である。 得られた生理活性物質固定化不溶性高分子担体
にシアノホウ素化ナトリウムを吸引濾過担体１ｇ
当り30mg以上含む任意量の0.5〜2Mトリス−塩酸
緩衝液（PH7.4）を入れ、０℃〜40℃の範囲内で
30分〜２時間放置する。これにより担体に残存す
るアルデヒド基を不活性基へと導びくことができ
る。 以上の反応によつて高濃度のリガンド導入が可
能となり、また、過ヨウ素酸の反応条件を変更さ
せることにより、またはリガンドとなる生理活性
物質の量を変更させることにより、自由にそのリ
ガンド濃度を変更することができる。固定化収率
も約90％とすぐれている。 〔発明の効果〕 本発明方法によれば、従来の生理活性物質の固
定化法の欠点を大幅に改良することができる。す
なわち、スペーサーに関しては、電荷を持た
ず、非特異的吸着が少ない、導入されたスペー
サーは化学的に安定であり、臭化シアン法にみら
れるリガンドの漏出が少ない、親水性のスペン
サーを有する、等の特長がある。 また、リガンドに関しては、高いリガンド濃
度が得られ、かつ、、リガンド量は自由に変更で
きる、リガンドの反応収率が非常に高い、等の
特長がある。 その他に、エポキシ基の導入により、架橋が
形成され、担体が強化されている、担体に糖を
結合した状態で長期保存ができ、固定化反応を行
う直前、過ヨウ素酸酸酸化を行い、固定化に供す
ることができる、という特長も有する。 〔実施例〕 次に本発明の実施例を示し、本発明をさらに説
明する。 実施例 １ (1)グルコース固定化アガロースの調製 アガロースゲルとしてフマルマシア社セフア
ロース4Bを用いた。 グラスフイルター上で、水で十分に洗浄後、エ
ポキシ化は吸引濾過したアガロースゲル30ｇに50
％ジメチルスルホキシド45ml、2M NaOH20ml、
エピクロルヒドリン4.5mlを添加し、40℃で２時
間振盪した。反応後、グラスフイルターに移し、
水で十分に洗浄してエポキシ活性化セフアロース
4Bを得た。導入されたエポキシ基はNa2S2O3を
使用するL.Sundbengらの方法により測定したと
ころ、吸引濾過セフアロース4B1ｇ当り約
40μmolのエポキシ基が導入された。 このエポキシ活性化アガロースゲル20ｇにグル
コース３ｇを溶解した80mlの0.1N NaOH溶液を
添加し、37℃で20時間振盪した。反応後、グラス
フイルター上で、水で十分洗浄し、グルコース結
合アガロースを得た。 (2) レクチンの固定化 グルコース固定化アガロース15ｇに0.1N過ヨ
ウ素酸ナトリウム水溶液150mlを加え、４℃で１
時間振盪した。反応後、グラスフイルターに移
し、酸性水溶液（PH３）で十分に洗浄後さらに水
で十分に洗浄し、アルデヒド活性化アガロースを
得た。 アルデヒド活性化アガロース３ｇに対し、コン
カナバリンＡ（以下「ConA」という）、0.2Mα−
メチルマンノシドを含む0.1M酢緩衝液（PH6.0）
10mlを添加した。ConA量は58mg、110mg、156
mg、236mg、と変え、４℃で48時間振盪した。 反応後、各条件のものにシアノホウ素化水素ナ
トリウムを100mg添加し、さらに、４℃で12時間
振盪した。 反応物をグラスフイルターに移し、0.1M酢酸
緩衝液（PH6.0）で十分に洗浄し、ConA−アガロ
ースをを得た。 得られたConA−アガロース３ｇにシアノホウ
素化水素ナトリウム100mgを含む1Mトリス−塩酸
緩衝液（PH7.4）15mlを加え、室温で１時間放置
後、グラスフイルター上で、水で十分に洗浄し
た。 固定化量はもとのConAの280nmの吸光度と残
存していたConAの280nmの吸光度の差より固定
化量とした。その結果を表１に示す。
【表】
固定化量はConAで示した通り、反応に使用する
レクチン量を変更すれば、それに応じて固定化量
の変更が可能ある。 得られた固定化ConA−アガロースについて固
定化されたConAと相互作用を有するパラアミノ
フエニルマンノシドを用いて吸着容量を前端分析
により検定した。 ゲルは１ml〔カラム（直径４mm×長さ８cm）〕
を使用し、対照としてConAと相互作用を有しな
いパラアミノフエニルガラクトシドを使用した。
その結果を表２に示す。
レクチン量を変更すれば、それに応じて固定化量
の変更が可能ある。 得られた固定化ConA−アガロースについて固
定化されたConAと相互作用を有するパラアミノ
フエニルマンノシドを用いて吸着容量を前端分析
により検定した。 ゲルは１ml〔カラム（直径４mm×長さ８cm）〕
を使用し、対照としてConAと相互作用を有しな
いパラアミノフエニルガラクトシドを使用した。
その結果を表２に示す。
【表】
さらに、ハイマンノースタイプの糖鎖を有する
大豆レクチン（以下「SBA」という）を用いて
吸着量を検定した。ConA−アガロース１ml（18
mgConA／mlゲル）当りSBAが34mg吸着された。 固定化ConAアガロースは十分な吸着能力を有
し、くりかえし使用によつても吸着能の低下は見
られなかつた。 実施例 ２ (1) ラクトース固定化アガロースの調製 アガロースゲルとしてフアルマシア社セフアロ
ース4Bを用いた。 グラスフイルター上で、水で十分に洗浄後、エ
ポキシ化は吸引濾過したアガロースゲル30ｇに50
％ジメチルスルホキシド45ml、2M NaOH20ml、
エピクロルヒドリン4.5mlを添加し、40℃で２時
間振盪した。反応後、グラスフイルターに移し、
水で十分に洗浄してエポキシ活性化セフアロース
4Bを得た。導入されたエポキシ基はNa2S2O3を
使用するL.Sundbengらの方法により測定した。
吸引濾過セフアロース4B1ｇ当り約40μmolのエ
ポキシ基が導入された。 このエポキシ活性化アガロースゲル20ｇにラク
トース６ｇを溶解した80mlの0.1N NaOH溶液を
添加し、37℃で20時間振盪した。反応後、グラス
フイルター上で、水で十分洗浄し、ラクトース結
合アガロースを得た。 (2)牛血清アルブミン（以下「BSA」という）の
固定化 ラクトース固定化アガロース15ｇに0.1N過ヨ
ウ素酸ナトリウム水溶液150mlを加え、４℃で１
時間振盪した。反応後、、グラスフイルターに移
し、酸性水溶液（PH３）で十分に洗浄後、さらに
水で十分に洗浄し、アルデヒド活性化アガロース
を得た。 アルデヒド活性化アガロース３ｇにBSA250mg
を溶解した0.1Mリン酸緩衝液（PH7.2）10mlを加
え、25℃で24時間振盪した。その後、ホウ素化水
素ナトリウム90mgを加え、１時間振盪した。反応
終了後、上清を除き0.1Mリン酸緩衝液で十分に
洗浄し、固定化BSAアガロースを得た。固定化
量はConAと同様280nmの吸光度の差より求め
た。 その結果を実施例１の固定化ConAと併せて表
３に示す。 なお、参考までに、アガロースを直接過ヨウ素
酸酸化する従来法〔Methods in Enzymology、
38巻、PartB、82頁、1974）〕によるアルブミン
の固定化量を併記した。
大豆レクチン（以下「SBA」という）を用いて
吸着量を検定した。ConA−アガロース１ml（18
mgConA／mlゲル）当りSBAが34mg吸着された。 固定化ConAアガロースは十分な吸着能力を有
し、くりかえし使用によつても吸着能の低下は見
られなかつた。 実施例 ２ (1) ラクトース固定化アガロースの調製 アガロースゲルとしてフアルマシア社セフアロ
ース4Bを用いた。 グラスフイルター上で、水で十分に洗浄後、エ
ポキシ化は吸引濾過したアガロースゲル30ｇに50
％ジメチルスルホキシド45ml、2M NaOH20ml、
エピクロルヒドリン4.5mlを添加し、40℃で２時
間振盪した。反応後、グラスフイルターに移し、
水で十分に洗浄してエポキシ活性化セフアロース
4Bを得た。導入されたエポキシ基はNa2S2O3を
使用するL.Sundbengらの方法により測定した。
吸引濾過セフアロース4B1ｇ当り約40μmolのエ
ポキシ基が導入された。 このエポキシ活性化アガロースゲル20ｇにラク
トース６ｇを溶解した80mlの0.1N NaOH溶液を
添加し、37℃で20時間振盪した。反応後、グラス
フイルター上で、水で十分洗浄し、ラクトース結
合アガロースを得た。 (2)牛血清アルブミン（以下「BSA」という）の
固定化 ラクトース固定化アガロース15ｇに0.1N過ヨ
ウ素酸ナトリウム水溶液150mlを加え、４℃で１
時間振盪した。反応後、、グラスフイルターに移
し、酸性水溶液（PH３）で十分に洗浄後、さらに
水で十分に洗浄し、アルデヒド活性化アガロース
を得た。 アルデヒド活性化アガロース３ｇにBSA250mg
を溶解した0.1Mリン酸緩衝液（PH7.2）10mlを加
え、25℃で24時間振盪した。その後、ホウ素化水
素ナトリウム90mgを加え、１時間振盪した。反応
終了後、上清を除き0.1Mリン酸緩衝液で十分に
洗浄し、固定化BSAアガロースを得た。固定化
量はConAと同様280nmの吸光度の差より求め
た。 その結果を実施例１の固定化ConAと併せて表
３に示す。 なお、参考までに、アガロースを直接過ヨウ素
酸酸化する従来法〔Methods in Enzymology、
38巻、PartB、82頁、1974）〕によるアルブミン
の固定化量を併記した。
Claims (1)
- １ エポキシ基を有する不溶性高分子を、アルカ
リ性の条件下で、１級水酸基と過ヨウ素酸酸化に
より開裂可能なジオール基とを有する単糖または
２糖と反応させ、得られた糖結合不溶体高分子を
過ヨウ素酸にて酸化開裂することにより生じるア
ルデヒド基に、アミノ基を有する生理活性物質を
反応させて固定化し、さらに要すれば、この反応
物を水素化ホウ素ナトリウムやシアノ水素化ホウ
素ナトリウムで還元して結合を安定化することを
特徴とする固定化生理活性物質の製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59280689A JPS61152634A (ja) | 1984-12-27 | 1984-12-27 | 固定化生理活性物質の製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59280689A JPS61152634A (ja) | 1984-12-27 | 1984-12-27 | 固定化生理活性物質の製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61152634A JPS61152634A (ja) | 1986-07-11 |
| JPH0456807B2 true JPH0456807B2 (ja) | 1992-09-09 |
Family
ID=17628566
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59280689A Granted JPS61152634A (ja) | 1984-12-27 | 1984-12-27 | 固定化生理活性物質の製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS61152634A (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS62155300A (ja) * | 1985-12-27 | 1987-07-10 | Sugiyama Sangyo Kagaku Kenkyusho | 固定化生理活性物質の製造法 |
| JPH0784481B2 (ja) * | 1991-02-21 | 1995-09-13 | 株式会社デイ・デイ・エス研究所 | カルボキシメチルマンノグルカン及びその誘導体 |
-
1984
- 1984-12-27 JP JP59280689A patent/JPS61152634A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS61152634A (ja) | 1986-07-11 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |