【発明の詳細な説明】[Detailed description of the invention]
本発明は発酵法によるＬ−リジンの製造法に関
し、さらに詳しくは、コリネバクテリウム属また
はブレビバクテリウム属に属し、Ｌ−リジン生産
能を有し、かつ、バチルス属細菌の生産するサー
モライシンに対し抵抗性を有する菌株を栄養培地
に培養し、培養物中にこれを生成せしめ、生成蓄
積したＬ−リジンを該培養物から採取することを
特徴とする発酵法によるＬ−リジンの製造法に関
する。その目的は、医薬品あるいは飼料や食品へ
の添加剤として需要の大きいＬ−リジンを工業的
安価に製造する方法を提供することにある。
リジン生産における雑菌汚染は大きな問題で特
に、連続発酵においては汚染による収率低下の解
決が要望されている。その原因について検討の結
果、多くは耐熱性胞子を有するバチルス属の細菌
の混入によつてリジン生産菌の生育が阻害される
ためであることがわかつた。この対策としてバチ
ルス属の生産するサーモライシンに対して抵抗性
を有する変異株を用いることにより被害を大幅に
軽減できることを見出した。
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明方法では、コリネバクテリウム属または
ブレビバクテリウム属に属し、バチルス属細菌の
生産するサーモライシンに対して抵抗性を有する
Ｌ−リジン生産菌株であれば、いかなる菌株をも
用いることができる。
かかる変異株は、Ｌ−リジン生産株に前記性質
を付与することによつて得ることもできるし、逆
に前記性質を有する菌にリジン生産性を付与する
ことによつても得ることができる。本発明に用い
る菌株は上記のごとき性質の他にＬ−リジン生産
に寄与するいかなる性質を備えていてもよい。
本発明で用いられる菌株としては、コリネバク
テリウム・グルタミクムＨ−3386（FERMP−
6822）をあげることができる。
該菌株は、リジン生産能を有するコリネバクテ
リウム・グルタミクムFERM BP−158（チアジ
リン、ストレプトマイシン、リフアンピシン及び
６−アザウラシルに抵抗性）の細胞を0.1規定ト
リス・マレイン酸緩衛液（pH6.0）中に
108Cells／mlの濃度に懸濁し、ここにＮ−メチル
−N´−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジンを最終濃
度0.2mg／mlになるように添加し、室温で30分間
静置した後、サーモライシン（TL）500μｇ／ml
を含む下記のごとき組成を有する最少寒天平板培
地に塗布し、生育するコロニーの中から選択され
た変異株であり、TL抵抗性を有する点で、第１
表に示すようにと親株と明らかに区別できる。
The present invention relates to a method for producing L-lysine by a fermentation method, and more specifically, to thermolysin produced by bacteria belonging to the genus Corynebacterium or Brevibacterium and having the ability to produce L-lysine and belonging to the genus Bacillus. The present invention relates to a method for producing L-lysine by a fermentation method, which comprises culturing a resistant bacterial strain in a nutrient medium, producing L-lysine in the culture, and collecting L-lysine produced and accumulated from the culture. The purpose is to provide a method for industrially and inexpensively producing L-lysine, which is in great demand as an additive to pharmaceuticals, feeds, and foods. Bacterial contamination is a major problem in lysine production, and there is a need for a solution to the reduction in yield due to contamination, especially in continuous fermentation. As a result of examining the cause, it was found that the majority of the problems were due to the growth of lysine-producing bacteria being inhibited by contamination with bacteria belonging to the genus Bacillus having heat-resistant spores. As a countermeasure against this problem, we have found that the damage can be significantly reduced by using a mutant strain that is resistant to thermolysin produced by Bacillus. The present invention will be explained in detail below. In the method of the present invention, any L-lysine producing strain that belongs to the genus Corynebacterium or Brevibacterium and is resistant to thermolysin produced by bacteria of the genus Bacillus can be used. Such a mutant strain can be obtained by imparting the above properties to an L-lysine producing strain, or conversely, by imparting lysine productivity to a bacterium having the above properties. In addition to the above properties, the strain used in the present invention may have any properties that contribute to L-lysine production. The strain used in the present invention is Corynebacterium glutamicum H-3386 (FERMP-
6822). This strain consists of cells of Corynebacterium glutamicum FERM BP-158 (resistant to thiaziline, streptomycin, rifampicin, and 6-azauracil) having lysine-producing ability in a 0.1N Tris-maleic acid buffer solution (pH 6.0). to
The cells were suspended at a concentration of 10 8 cells/ml, N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine was added thereto to a final concentration of 0.2 mg/ml, and after standing at room temperature for 30 minutes, thermolysin was added. (TL) 500μg/ml
It is a mutant strain selected from the colonies that grow on a minimal agar plate medium with the following composition including
As shown in the table, it can be clearly distinguished from the parent strain.
【表】
上記最少寒天平板培地の組成：グルコース10
ｇ／、塩化アンモニウム４ｇ／、KH2PO41
ｇ／、K2HPO43ｇ／、MgSO4・7H2O0.4
ｇ／、FeSO4・7H2O0.01ｇ／、MnSO4・
4H2O0.01ｇ／、尿素２ｇ／、ビオチン50μ
ｇ／、寒天20ｇ／、Ｌ−ロイシン200μｇ／
ml（pH7.2）
本発明に使用する培地組成としては使用菌株の
利用しうる炭素源、窒素源、無機物、その他の必
要な栄養素を程よく含有するものであれば合成培
地、天然培地のいずれも使用できる。すなわち炭
素源としてはグルコース、フラクトース、ソルビ
トール、グリセロール、蔗糖、澱粉、澱粉加水分
解物、糖蜜、果汁などの各種炭水化物、酢酸、フ
マール酸、乳酸、コハク酸などの有機酸、さらに
エタノール、メタノールなどのアルコール類も使
用できる。窒素源としては、アンモニア、塩化ア
ンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウ
ム、リン酸ンアンモニウム等の各種無機酸のアン
モニウム塩、尿素、アミン類、その他含窒素化合
物、ならびにペプトン、肉エキス、酵母エキス、
コーン・スチープ・リカー、カゼイン加水分解
物、大豆粕酸加水分解物、各種発酵菌体およびそ
の消化物などが使用できる。さらに無機物として
は、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、
リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナ
トリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、炭酸カル
シウムなどが使用される。本発明に使用する微生
物が生育のために特定の栄養素を必要とする場合
には、その栄養素を適当量培地中に存在させなけ
れはならないが、これらの物質は窒素源として例
示した天然物に含まれて添加される場合がある。
また培地中に各種の添加物、例えは各種抗生物
質、α−アミノ酪酸、システイン、ロイシン、ロ
イシン発酵液あるいはアスパラギン酸、グルタミ
ン酸などを添加することによりＬ−リジン生産量
を増加させうる場合がある。培養は振盪培養ある
いは深部通気撹拌培養などの好気的条件下で行
う。培養温度は通常20〜40℃の範囲で、培地の
pHは３〜９の範囲で、好ましくは中性付近に保
持することが望ましいが、これ以外の条件下でも
使用菌株が生育すれば実施できる。培地のpH調
節は炭酸カルシウム、酸あるいはアルカリ溶液、
pH緩衛剤などによつて行う。通常１〜６日間で
培養液中にＬ−リジンが生成蓄積する。
培養終了後、培養液より菌体などの沈澱物を除
去し、公知のイオン交換処理法、濃縮法、吸着
法、塩析法などを併用することにより、培養液か
らＬ−リジンを回収することができる。
本発明を実施することによる効果としては雑菌
汚染が発生した場合の被害を大幅に軽減できるこ
とは言うまでもなく、従来、雑菌汚染を防ぐため
過剰な殺菌を行つていたのを最少限にすることが
でき、蒸気、エネルギーの大幅な節約も可能とな
る。
以下、実施例をあげて本発明を具体的に示す。
実施例
第１表に示す菌株をグルコース40ｇ／、尿素
３ｇ／、KH2PO41.5ｇ／、K2HPO40.5ｇ／
、MgSO4・7H2O0.5ｇ／、ビオチン50μｇ／
、ペプトン20ｇ／および酵母エキス５ｇ／
からなる種培地（pH7.2）20mlを含む300ml容三
角フラスコに120℃、30分間オートクレーブ殺菌
後接種し、30℃、24時間培養する。
この培養液２mlを廃糖蜜90ｇ／（グルコース
換算）、大豆粕酸加水分解物10ｇ／（大豆粕重
量換算）、硫安20ｇ／、尿素３ｇ／、
MgSO4・7H2O0.5ｇ／、K2HPO40.7ｇ／お
よびCaCO330ｇ／からなる発酵培地（pH7.2）
20mlを含む300ml容三角フラスコ（120℃、30分間
オートクレーブ殺菌）に接種し、30℃で３日間振
盪培養する。培養液中にＬ−リジン（塩酸塩とし
て、以下同様）が41ｇ／生成蓄積する。対照と
してFERM BP−158を用いる他は上記と同様に
実施して41ｇ／のリジンを得る。
生産培地のオートクレーブ殺菌を100℃20分に
して同様に培養したときの結果も第１表に併せて
示す。[Table] Composition of the above minimal agar plate medium: Glucose 10
g/, ammonium chloride 4 g/, KH 2 PO 4 1
g/, K 2 HPO 4 3g/, MgSO 4・7H 2 O0.4
g/, FeSO 4・7H 2 O0.01g/, MnSO 4・
4H 2 O 0.01g/, urea 2g/, biotin 50μ
g/, agar 20g/, L-leucine 200μg/
ml (pH 7.2) As for the medium composition used in the present invention, both synthetic and natural media can be used as long as they contain appropriate amounts of carbon sources, nitrogen sources, inorganic substances, and other necessary nutrients that can be utilized by the bacterial strain used. Can be used. In other words, carbon sources include various carbohydrates such as glucose, fructose, sorbitol, glycerol, sucrose, starch, starch hydrolysates, molasses, and fruit juice, organic acids such as acetic acid, fumaric acid, lactic acid, and succinic acid, and ethanol and methanol. Alcohol can also be used. Nitrogen sources include ammonium salts of various inorganic acids such as ammonia, ammonium chloride, ammonium sulfate, ammonium acetate, and ammonium phosphate, urea, amines, and other nitrogen-containing compounds, as well as peptone, meat extract, yeast extract,
Corn steep liquor, casein hydrolyzate, soybean meal acid hydrolyzate, various fermented microbial cells and digested products thereof, etc. can be used. Furthermore, as inorganic substances, primary potassium phosphate, dibasic potassium phosphate,
Magnesium phosphate, magnesium sulfate, sodium chloride, ferrous sulfate, manganese sulfate, calcium carbonate, etc. are used. If the microorganisms used in the present invention require specific nutrients for growth, the nutrients must be present in appropriate amounts in the culture medium, but these substances are not included in the natural products exemplified as nitrogen sources. It may be added as a result.
Additionally, L-lysine production may be increased by adding various additives to the culture medium, such as various antibiotics, α-aminobutyric acid, cysteine, leucine, leucine fermentation solution, aspartic acid, and glutamic acid. . Cultivation is performed under aerobic conditions such as shaking culture or deep aeration agitation culture. The culture temperature is usually in the range of 20-40℃,
It is desirable to keep the pH in the range of 3 to 9, preferably near neutrality, but it can be carried out under other conditions as long as the strain used grows. The pH of the medium can be adjusted using calcium carbonate, acid or alkaline solutions,
This is done using pH laxatives, etc. Usually, L-lysine is produced and accumulated in the culture solution in 1 to 6 days. After the cultivation is completed, precipitates such as bacterial cells are removed from the culture solution, and L-lysine is recovered from the culture solution by using a combination of known ion exchange treatment methods, concentration methods, adsorption methods, salting-out methods, etc. Can be done. It goes without saying that the effect of implementing the present invention is that damage in the event of bacterial contamination can be significantly reduced, and that conventional excessive sterilization to prevent bacterial contamination can be minimized. This also enables significant savings in steam and energy. Hereinafter, the present invention will be specifically illustrated by giving Examples. Example The strains shown in Table 1 were prepared using glucose 40g/, urea 3g/, KH 2 PO 4 1.5g/, K 2 HPO 4 0.5g/
, MgSO 4 7H 2 O 0.5g/, biotin 50μg/
, peptone 20g/and yeast extract 5g/
After sterilizing by autoclaving at 120°C for 30 minutes, the mixture was inoculated into a 300ml Erlenmeyer flask containing 20ml of seed medium (pH 7.2), and cultured at 30°C for 24 hours. 2 ml of this culture solution was mixed with 90 g of blackstrap molasses/(converted to glucose), 10 g of soybean meal acid hydrolyzate/(converted to soybean meal weight), 20 g of ammonium sulfate/, 3 g of urea/,
Fermentation medium (pH 7.2) consisting of MgSO 4 7H 2 O 0.5g/, K 2 HPO 4 0.7g/ and CaCO 3 30g/
Inoculate into a 300 ml Erlenmeyer flask containing 20 ml (autoclave sterilized at 120°C for 30 minutes) and culture with shaking at 30°C for 3 days. L-lysine (as hydrochloride, the same shall apply hereinafter) was produced and accumulated in the culture solution at a rate of 41 g. The same procedure as above is carried out except that FERM BP-158 is used as a control, yielding 41 g/lysine. Table 1 also shows the results when the production medium was autoclaved at 100°C for 20 minutes and cultured in the same manner.
【表】【table】