JPH0469128B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

糖尿病は重要な症候として血糖レベルの上昇を
示す代謝障害である。これは膵臓ホルモンである
インシユリンが充分量で放出されないことにより
惹起される。天然ホルモンの置換は今日では大
抵、虐殺動物の腺から単離される動物インシユリ
ンによりまたは豚インシユリンから半合成的にま
たは遺伝子工学的方法により入手しうるヒトイン
シユリンにより置き代えられている。 遺伝子工学的方法を用いる場合、従来２種の基
本的に異なる方法が用いられていた。すなわちＡ
鎖およびＢ鎖を別々に合成しそしてそれらを後か
ら化学的に再び組み合わさせるもので、インシユ
リンの天然の前駆物質であるプレプロインシユリ
ンの合成と同様である。プロインシユリン分子に
おいてはＡ鎖およびＢ鎖は結合片であるＣ−ペプ
チドにより結合している。その重要な機能は現在
の概念によれば２個の鎖を相対的に相互に空間的
に固定して正しいたたみ込み（folding）が行わ
れうるようにすることである。たたみ込みが行わ
れた後、３個のジスルフイツド橋を結合させそれ
によりインシユリンの天然の三次元構造が安定化
される。Ｃ−ペプチドの除去はトリプシン活性お
よびカルボキシペプチダーゼＢ活性を有する酵素
により遂行される。解裂位置はLys−Arg順列
（Ａ鎖のＮ−末端の前）またはArg−Arg（Ｂ鎖の
Ｃ−末端）により予め与えられる。遊離インシユ
リンのみが完全な生物学的活性を有する。何故な
らＣ−ペプチドの存在下においては分子平面での
生物学的認知領域のおそらく一部分が遮蔽されて
いるからである。 インシユリンの特別の化学的性質ゆえに治療は
大抵非経口的に遂行される。すなわちこのホルモ
ンは例えばまだ作用を及ぼし得ないうちに胃腸管
通過に際して完全に分解されるからである。しか
しながら本質的に種々の比較的非特異的な蛋白分
解酵素による分解反応はまた注射部位および循環
においても起る。それにより惹起されるほんの約
７分間という短い生体内半減期は生理学的に動的
平衡の意味において全く重要である。しかしなが
ら治療はそれにより非常に困難となる。何故なら
糖尿病患者は典型的には１日４回、大抵食時直前
に注射しなければならないからである。 従つてインシユリンに持続性作用を付与する試
みがすでに早期からなされている。その際これま
でに最も成功したのはデポ助剤の添加によりイン
シユリンを難溶性状態に変換する方法であつた。
これにはなかんずく２価亜鉛イオンがあげられ、
その存在下にインシユリンは中性媒体中で結晶状
または無定形で存在しうる。塩基性蛋白質例えば
硫酸プロタミンまたはヒトグロビンの添加は、イ
ンシユリンが等電点P_I＝5.4を有する酸性分子な
ので同じ効果がある。塩基性蛋白質とインシユリ
ンは中性範囲において結晶性または無定形の塩様
の難溶性複合体として存在する。 これら徐放性製剤からのインシユリンの緩徐な
放出は、想像されるように、希釈すなわち個々の
結晶または無定形沈澱を構成している成分を拡散
することによるか、または塩基性蛋白質とのイン
シユリン複合物の場合はデポ担体の蛋白分解的崩
壊により行われる。 最近なおヒトのプロインシユリンが単独でかま
たは慣用のデポ添加剤と組み合せて遅延作用成分
として論議された（BE−Ａ−3232036号参照）。
その考えは、Ｃ−ペプチドの蛋白分解的除去が生
体内で遅延して遂行され、そしてそれゆえに生物
学的にそれ自体あまり活性でないプロインシユリ
ン（蛋白量基準でインシユリン活性の約1/8）か
ら完全に活性なホルモンが放出されるということ
である。その順列においてヒトのそれと同一であ
る（明らかに数種ある）かまたは非常に類似した
プロインシユリンのみが人間での使用に受容され
うる。一般に知られているように、豚または牛プ
ロインシユリンは免疫原である。しかしながらプ
ロインシユリンの正確な作用機序は現在のところ
まだ明らかでない。特殊なインシユリンが放出さ
れるという証明は全くない。反対に、生体内にお
ける崩解は大抵は不活性な断片の生成を伴つて多
数の方法で遂行される。従つてプロインシユリン
の治療上の利用は一般的である場合はむしろ受容
体レベルにおいて見出され得た。 今や糖尿病治療は食事時の利用可能性における
相異、皮下組織の特性における相異、それと並ん
でまた詳細な食事習慣、身体の活性およびその他
多数のような個々の影響因子により特徴ずけられ
る。従つて個々の要求に適合された異なる作用特
性を有する一連のインシユリン製剤を入手しうる
ことは血糖を良好に調整するためには絶対に必須
要件である。至適でない調整に関連して高血糖症
または低血糖症のような直接的な主観的および客
観的効果と並んで特に糖尿病性の遅れた損傷につ
いての論題が論議された。これにはなかんずく巨
大脈管病および細管異常、腎臓病症、神経病およ
び網膜症が挙げられる。 患者の要求に最適に適合する製剤として純枠な
遅延性インシユリンと並んでかんずくいわゆる中
間作用性インシユリンが証明された。これらは遅
延作用性および即効性ならびに短時間作用性成分
からなる混合物である。かかる混合物は一般に比
較的狭く限定された混合比においてのみ長時間に
わたつて安定である複雑な多層系である。従つて
例えば豚の２−亜鉛−インシユリン結晶の懸濁液
は溶解された豚インシユリンとは自由に混合でき
ない。混合され溶解されたインシユリンは直ちに
かまたは時間の経過中に結晶の安定化に必要な比
較的高い亜鉛含量ゆえに沈澱してくる。かかる混
合物は溶解されたインシユリンとして牛インシユ
リン（しかしながらこれにより種の純度、医学的
に所望される性質が失われる）または溶解された
豚インシユリンとフエニルアラニン（B1）−豚イ
ンシユリンとの混合物が使用される場合は狭い限
界内で安定である（DE−Ａ−2418218号および同
2459515号明細書参照）。遅延成分としてプロタミ
ンおよびインシユリンの結晶がイソフアン比
（isophaneratio）で使用される場合、溶解された
インシユリンとの混合可能性に関して好都合なの
はプロタミン−インシユリン製剤である。これら
製剤を用いてNPHに代表的な作用プロフイルが
調製されうる。異種のしかしながら比較的受容し
うる蛋白質として硫酸プロタミの存在が添加剤と
して代表的であると思われる。 本発明の目的は個々の糖尿病患者の個々の要求
に適合された作用特性を有する安定な薬剤を提供
することにある。 この目的は今や本発明によりそのＢ鎖Ｃ−末端
が塩基特性を有する有機基を担持するインシユリ
ン誘導体、および天然インシユリンまたはそのデ
ス−Phe_B31類似体からなる作用物質組み合せによ
り解決された。 Ｂ鎖のＣ−末端に基Arg−OHまたはArg−
Arg−OHを担持するインシユリン誘導体は既に
記載されている。知られているようにこれら誘導
体は生体内におけるインシユリンへのプロインシ
ユリンの酵素的変換に際して天然の中間生成物と
して生成しそしてまた膵臓抽出物中にも少量に検
出されうる。前記した基は通常トリプシンおよ
び／またはカルボキシペプチダーゼＢまたは類似
特異性を有する酵素により分解されて天然のイン
シユリンが放出される。 他のこれらＣ−末端が塩基性に修飾されたイン
シユリン誘導体、それらの製法およびそれらの使
用は特願昭59−149748号出願の目的である。 本発明は、作用物質の組み合せとして (a) 等電点5.8〜8.5を有する式

【表】 （式中R¹はＨまたはＨ−Pheであり、R³⁰は
Ala、ThrまたはSerであり、そしてR³¹は式−
X_oＳを有する基であり、ここでｎは０、１ま
たは２であり、ＸはArgまたはLysであり、そ
してＳはOH、（C₁〜C₆）アルコキシまたはコ
リル基である）を有するインシユリン誘導体、
および (b₁) 前記式(1)（式中R¹はＨまたはＨ−Pheであ
り、R³⁰はAla、ThrまたはSerであり、R³¹
はOHである）を有するインシユリン、また
は (b₂) 上記b₁の生理学的に受容しうる塩、または (b₃) プロインシユリン、または (b₄) Ｃ−ペプチド、または (b₅) 成分(a)が少なくとも１重量％存在する上記
化合物の組み合せ を含有することを特徴とする、糖尿病の治療用薬
剤に関する。 B1位にフエニルアラニンを担持する式のイ
ンシユリン誘導体が特に好ましい。さらにB30位
にAla、ThrまたはBerを有する化合物が好まし
い。そのＡ鎖および（B2〜29）鎖は牛インシユ
リンまたは豚インシユリン、しかし特にヒトイン
シユリンの順列を有するのが好都合である。 式を有する本発明による一連のインシユリン
誘導体から例えば下記化合物があげられうるが、
本発明はそれらに限定されるものではない。 ヒトインシユリン−Arg^B31−OH 豚インシユリン−Arg^B31−OH 牛インシユリン−Arg^B31−OH ヒトインシユリン−Arg^B31−Arg_B32−OH 豚インシユリン−Arg^B31−Arg_B32−OH 牛インシユリン−Arg_B31−Arg_B32−OH デス−Phe_B1−豚インシユリン−Arg_B31−OH デス−Phe_B1−ヒトインシユリン−Arg^B31−OH デス−Phe^B1−豚インシユリン−Arg^B31−Arg_B32
−OH デス−Phe^B1−ヒトインシユリン−Arg^B31−
Arg_B32−OH 豚インシユリン−Arg^B31OCH₃ ヒトインシユリン−Arg^B31−OCH₃ 牛インシユリン−Arg^B31−OCH₃ 豚インシユリン−Arg^B31−Arg_B32−OCH₃ ヒトインシユリン−Arg^B31−Arg_B32−OCH₃ デス−Thr^B30−ヒトインシユリン−Val^B30−
Arg_B32−OCH₃ デス−Thr^B30−ヒトインシユリン−Val^B30−
Arg_B31−OH デス−Thr^B30−ヒトインシユリン−Val^B30−
Alg_B31−Arg_B32−OH ヒトインシユリン−Lys^B31−OH ヒトインシユリン−Ｄ−Arg_B31−OH ヒトインシユリン−Ｄ−Arg^B31−Arg_B32−OH ヒトインシユリン−Arg^B31−Ｄ−Arg_B32−OH ヒトインシユリン−Lys^B31−Arg_B32−OH ヒトインシユリン−Arg^B31−Lys_B32−OH ヒトインシユリン−Lys_B31−Arg_B32−Arg_B33−
OH ヒトインシユリン−（B30）−Ｏ−CH₂−CH₂−
⁺N（CH₃）₃ 式を有するインシユリン誘導体は (a) 式

【表】 （式中、R¹はPheまたは結合でありそしてS¹は
プロトンソルボリシス的にかまたはβ−離脱に
より除去できるアミノ保護基例えば第３ブチル
オキシカルボニル（Boc）、第３アミルオキシ
カルボニル（Aoc）またはメチルスルホニルエ
チルオキシカルボニル（Msc）基を表わす）を
有するデス−オクタペプチド（B23〜30）−イ
ンシユリンを式 Ｈ−Gly−Phe−Phe−Tyr（S²）−Thr（S²）−P
ho−Lys（S³）−R³⁰−R³¹（） （式中R³⁰およびR³¹は前記定義のとおりであ
り、S²は水素、BzlまたはBu^tでありそしてS³
はウレタン保護基例えばBoc、MocまたはＺを
表わし、その際基R³⁰およびR³¹に場合により
存在する遊離のCOOH−、OH−、SH−、ω
−NH₂−、グアニジノおよび／またはイミダ
ゾール基は必要な場合にはそれ自体既知の方法
で保護された状態で存在する）を有するペプチ
ドと縮合させ、そして場合により存在する保護
基をそれ自体既知方法で除去するか、 (b) 式（式中R¹はＨまたはＨ−Pheでありそし
てＣ−末端R³⁰−R³¹は一緒になつてOHを表わ
す）を有するデス−B30−インシユリンをトリ
プシンまたはトリプシン類似エンドペプチダー
ゼの存在下に式 Ｈ−R³⁰−R³¹ （） （式中R³⁰およひR³¹は前記定義のとおりであ
りそしてその中に存在する遊離のCOOH−、
OH−、SH、−ω−NH₂−、グアニジノおよ
び／またはイミダゾ官能分は必要ならばそれ自
体既知方法で保護されて存在する）を有する化
合物と反応させそして次に場合により存在する
保護基をそれ自体既知方法で除去するか、また
は (c) R³¹基中にＬ−配置アミノ酸残基を有するイ
ンシユリン誘導体を調製するためにプロインシ
ユリン、プロインシユリン類似体またはプレプ
ロインシユリン類似体またはこれら化合物の中
間体を化学的および／または酸素的に解裂させ
る ことにより調製される。 方法(b)において出発化合物として使用されるデ
ス−B30−インシユリンは例えばEP−Ａ−46979
号または「Hoppe−Seyler′s Z.Physiol.Chem.」
第359巻第799頁（1978年）の記載により知られて
いる。方法(b)で使用される式の出発物質はそれ
自体既知方法でペプチド化学の方法に従い調製さ
れる。について使用しうる保護基はM.
Bodanzky氏地により「Peptide Sythesis」第２
版（1976年）中に詳細に記載されている。 遺伝子工学的方法により方法(c)の出発物質とし
てのヒトまたは霊長類プロインシユリンを入手し
うる。そのものからArg（B31）およびジ−Arg
（B31〜32）誘導体はトリプシンまたはトリプシ
ン類似酵素を用いる簡単な消化により入手しう
る。しかしまたそれと並んで新規なインシユリン
誘導体を生ずる比較的簡単なプラスミドを構成す
ることもできる。何故ならこれらは天然のB31ま
たはB32に存在するアルギニンの代りに他の中性
または塩基性アミノ酸をコード化するからであ
る。 組換えDNA技術を用いるプロインシユリンの
調製はプロインシユリンのアミノ酸順列をコード
化するDNA順列の形成を必要とし、このことは
単離、構成またはこれら両者の組み合せにより達
成されうる。次にプロインシユリン−DNAを読
み取り相（reading phase）中で適当なクローニ
ングおよび発現（expression）担体中に挿入す
る。担体は適当な微生物の形質転換に役立てら
れ、そしてその際得られる形質転換された微生物
を次にプロインシユリン含有ベクターをさらにコ
ピーさせそしてプロインシユリン誘導体またはプ
ロインシユリン前駆物質またはプレプロインシユ
リン誘導体からプロインシユリンを発言させるに
至る発酵条件にかける。 発現生成物がプロインシユリン前駆物質である
場合、かかる生成物は一般に、プロインシユリン
またはプロインシユリン誘導体が挿入された遺伝
子順列により通常表示される蛋白質の断片にその
末端アミノ基で結合しているプロインシユリンア
ミノ酸順列を含有する。プロインシユリンアミノ
酸順列は例えばメチオニンである特異的に解裂さ
れうる位置を介して蛋白質断片に結合している。 得られるプロインシユリンアミノ酸順列は例え
ばDE−Ａ−3232036号に記載されるような融合さ
れた遺伝子生成物から解裂されそしてプロインシ
ユリンは精製後単離される。 この方法で得られるプロインシユリンまたはプ
ロインシユリン誘導体の酵素的解裂は
「Excerptia Medica International Congress
Series」第231号第292頁以下または特開昭58−
190398号明細書記載の方法と同様にして遂行され
る。 従つて記載された半合成的方法を用い、既知ア
ルギニン（B30）およびジアルギニン（B31〜
32）誘導体ならびに遺伝子工学的方法により入手
できそしてR³¹に天然のＬ−アミノ酸を担持する
誘導体に加え、特徴として１個または数個の塩基
性基および／または遊離カルボキシル基の非存在
を示し従つて分子の正味荷電が天然のインシユリ
ンに対してかまたはデス−Phe^B1−インシユリン
に対して少くとも陽性荷電１個増大している一連
の新規なインシユリン誘導体が入手できる。 これには例えばB31位に天然のアミノ酸Ｌ−リ
ジン、Ｌ−ヒスチジンまたはＬ−アルギニンの代
りにそのＤ−鏡像異性体または側鎖中に塩基性基
（例えばオルニチン、ヒドロキシリジン）を有す
る通常のＤ−またはＬ−アミノ酸類似体を有する
誘導体を包含される。アミノ酸の代りB31位の位
置に例えばコリンエステル基が存在でき、それに
より正味２個の陽電荷が得られる。B31位でのア
ミノ酸またはアミノ酸類似体は遊離のカルボキシ
ル末端を有しうるかまたは簡単なアルコール（例
えばメタノール、エタノール）でエステル化する
かまたは簡単な窒素塩基（例えばアンモニア、モ
ノーまたはジーメチルアミン）でアミド化されう
る。それと並んで例えばコリンでもエステル化さ
れうる。B31位には例えば中性または他の天然の
塩基性アミノ酸または前記アミノ酸誘導体の１種
が続いてあげられうる。同様の方法でそのカルボ
キシル基は遊離であるかまたはエステル化または
アミド化されうる。ここでもまた例えばコリンエ
ステル基または他の中性または塩基性アミノ酸ま
たはアミノ酸類似体が続いてあげられうる。 これらインシユリン誘導体すべては分子表面に
存在する付加的な陽性荷電が分子の等電点をして
中性範囲に移動せしめられる点で共通している。
誘導体に応じて5.8〜8.5特に6.2〜8.2なる等電点
が電気泳動によつて測定される。従つて誘導体
は、その等電点従つて最大不溶性範囲がPH5.4に
あり、一方中性範囲で通常溶解されて存在する天
然のインシユリンまたはプロインシユリンよりも
中性範囲において溶解し難い。 従つてこれら式のインシユリン誘導体は亜鉛
または硫酸プロタミンのようなデポ助剤を用いる
ことなく作用開始しうる完全に新規な遅延作用性
成分である。デポ作用は固有の蛋白化学的条件か
ら生ずる物理的原理、すなわち等電点での難溶性
に帰せられる。生理学的条件下での再溶解は、仮
定されるように、誘導体に応じてトリプシン性ま
たはトリプシン類似性活性および／またはカルボ
キシペプチダーゼＢまたはカルボキシペプチダー
ゼＢ類似活性および／またはエステラーゼ活性に
よつて付加的な塩基性基を除去することにより達
成される筈である。除去されるそれぞれの基はア
ミノ酸、オルニチンまたはコリンのような純粋な
生理学的代謝産物であるかまたは生理学的に受容
されかつ容易に代謝されうる物質である。 豚インシユリン−Arg^B31−OHおよび相当する
ジアルギニン誘導体はChance氏による
「Excerpta Medica International Congress
Series」第231号第292〜293頁記載の研究によれ
ば天然の豚インシユリンの62％または66％の活性
しか示さない。 今や驚くべきことに、（プロインシユリンと異
なり）誘導体の生物学的活性が天然インシユリン
のそれとおよそ同じ高さであることが見出され
た。これらはまた、異型Ｃ−ペプチドの一部分を
なお含有する文献記載の中間体と異なり対応する
インシユリン自体より免疫原性が強くない。おそ
らく前記のChance氏の低すぎる値はそのペプチ
ドが純枠に提供されなかつたかまたは測定に系統
的誤差があつたことが原因であろう。 前記誘導体を単独かまたは純枠な遅延インシユ
リンとして混合物でかまたは既知デポ担体と組み
合せて使用する他に、今や速かに入手しうるイン
シユリン例えば溶解された成分との安定な混合物
を多数の方法で調製することが可能である。従つ
て非常に微細に調整された作用プロフイルが得ら
れうる。 特にあげられるのは徐放性成分として作用する
１種またはそれ以上の誘導体と溶解された好まし
くは同じ種類の天然インシユリンとの中性混合物
である。しかしまたそれと並んでプロインシユリ
ンおよび／またはＣ−ペプチドもそれぞれ単独で
かまたはインシユリンと組み合せて溶解された成
分として用いられうる。これらの製剤に特徴的な
のはそれらがあらゆる混合比において安定である
ことである。このことは現在治療において汎用さ
れる中間的に作用するインシユリン製剤の調製に
とつての前提条件である。 本発明による薬剤はまた数種の異なる式のイ
ンシユリン誘導体および／または数種の異なる式
のインシユリンを含有しうる。その上例えば溶
解された形態またNPH結晶の形態または他の慣
用の遅延形態における誘導体およびインシユリン
および／またはプロインシユリンおよび／または
デス−Phe^B1−インシユリンおよび／またはＣ−
ペプチドの混合物のような他の治療上興味のある
組み合せも使用できる。この方法でなかんずく分
化された基本的プロフイルを有する極めて長時間
作用性の製剤が調製されうる。ヒトインシユリン
においてはこれはまさに望ましい。何故なら従来
の経験によれば、その作用期間は亜鉛結晶の形態
においてもまたNPH結晶の形態においても例え
ば類似の牛インシユリン製剤でそうであるように
真に超遅延プロフイルを有しないからである。 インシユリンおよび／またはプロインシユリン
および／またはデス−phe^B1−インシユリンおよ
び／またはＣ−ペプチドおよび式のインシユリ
ン誘導体はまたアルカリ塩またはアンモニウム塩
の形態でも使用されうる。 天然インシユリンおよび／またはプロインシユ
リンおよび／またはデス−Phe^B1−インシユリン
および／またはＣ−ペプチドおよびインシユリン
誘導体の間の混合比は（これらペプチドの総量に
基いて）インシユリン０〜99％およびプロインシ
ユリン０〜99％およびデス−Phe^B1−インシユリ
ン０〜99％およびＣ−ペプチド０〜99％およびイ
ンシユリン誘導体１〜100％の範囲で変動しうる。 本発明による使用形態はまた例えばインシユリ
ン誘導体およびインシユリンまたはインシユリン
の等電点以下のPHを有するプロインシユリンの酸
溶液である。 好ましい薬剤はPH2.5〜8.5を有しそしてその際
溶液または懸濁液として存在する。 代表的には前記の使用形態は、適当な等張剤例
えばグリセリンまたは食塩および微生物汚染に対
する適当な薬剤例えばフエノール、ｍ−クレゾー
ルまたはｐ−ヒドロキシ安息香酸エステルを適当
な配合量で付加的に含有する水性媒体中に溶解ま
たは懸濁される。これら生理学的に受容しうる担
体はPH5.0〜8.5で緩衝物質例えば酢酸ナトリウ
ム、クエン酸ナトリウム、燐酸ナトリウムまたは
トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンをさら
に含有しうる。溶解およびPH値の調整には稀酸代
表的には塩酸、または希アルカリ代表的には水酸
化ナトリウムが使用されうる。 インシユリン部分および／またはプロインシユ
リン部分および／またはデス−Phe^B1−インシユ
リン部分および／またはＣ−ペプチド部分および
式のインシユリン誘導体部分は相互に独立して
それぞれ溶解された形態、無定形および／または
結晶形態で存在しうる。インシユリン部分およ
び／またはプロインシユリン部分および／または
デス−Phe−インシユリン部分および／またはＣ
−ペプチド部分および式のインシユリン誘導体
部分のそれぞれ任意の一部分が結晶形態で存在で
き、インシユリン部分および／またはプロインシ
ユリン部分および／またはデス−Phe−インシユ
リン部分および／またはＣ−ペプチド部分および
式のインシユリン誘導体部分のそれぞれ他の任
意の一部分が無定形で存在でき、ならびにインシ
ユリン部分および／またはプロインシユリン部分
および／またはデス−Phe−インシユリン部分お
よび／またはＣ−ペプチド部分および式のイン
シユリン誘導体部分のそれぞれの残分が溶解され
た形態で存在しうる。 製剤は例えば硫酸プロタミン、グロビンまたは
亜鉛（０〜100μｇ／100IU）のような遅延作用を
有する適当量の助剤（デポ助剤）を含有しうる。 この遅延作用成分は前作用物質部分またはその
一部分と組み合せて使用されうる。数種の異なる
遅延作用性助剤も含有されうる。 本発明による製剤に、種々の物質と接触に際し
て熱または機械的負荷における蛋白質の沈澱を阻
止する適当量の適当な安定剤を添加することが
往々にして好ましい。かかる安定剤は例えばEP
−Ａ−18609号、DE−Ａ−3240177号またはWO
−83／00288号により知られている。 下記の例により本発明をさらに説明するが本発
明はそれらに限定されるものではない。 例 １ 本例は40IU／mlを有する中性処方剤中におけ
る豚プロインシユリンからトリプシン消化により
調製された豚インシユリン−Arg^B31−Arg_B32−
OH、および溶解された豚インシユリン（40IU／
ml）20％または40％とのその混和性を示す。 下記すなわち 豚インシユリンArg^B31−Arg_B32−OH（27.0IU／
mg） 14.8mg 燐酸二水素ナトリウム二水化物 21.0mg グリセリン 160.0mg フエノール 6.0mg ｍ−クレゾール 15.0mg を水を用いて合計量10mlに溶解させる。 1NHClまたは1NNaOHの添加によりPHを7.3に
調整する。類似かまたは同じ媒体中の豚インシユ
リン40IU／mlの溶液を混合してその容量割合を
20％または40％となす。HPLCを用いて調製直後
および４℃において３か月貯蔵後に総含量ならび
に上澄み液中における含量をそれぞれ測定する。

【表】 豚インシユリン−Arg^B31−Arg_B32−OHは豚イ
ンシユリンからHPLCにより分離される。上澄み
液には誘導体は何ら検出されない。すなわち不溶
性部分は溶解していない。逆に沈澱洗浄後は何ら
インシユリンが検出されない。すなわちインシユ
リンは沈澱していない。 例 ２ 本例40IU／mlを有する中性処方剤中の溶解さ
れた豚プロインシユリン25％（活性）と混合され
た、豚−プロインシユリンからトリプシン消化に
より調製された豚インシユリン−Arg^B31−OHお
よびそのデポ作用を示す。 下記すなわち 豚インシユリンArg^B31−OH（27.5IU／mg）10.9mg 豚プロインシユリン（3.3IU／mg） 30.3mg 酢酸ナトリウム 14.0mg ｐ−ヒドロキシ安息香酸メチルエステル 10.0mg 食 塩 80.0mg を水を用いて合計量10mlに混合する。 1N HClまたは1N NaOHの添加によりPH7.0に
調整する。 かかる懸濁液はデポ比較製剤（Optisulin デ
ポCS）と類似したデポ作用を犬において示す。 例 ３ 本例は40IU／mlを有する中性処方剤中の、豚
インシユリンからエドマン（Edman）崩解によ
り調製されたデス−Phe^B1−豚インシユリン25％
と混合した、NPH結晶の形態の、豚プロインシ
ユリンからトリプシン消化により調製された豚イ
ンシユリン−Arg^B31−Arg_B32−OHおよびその遅
延作用を示す。 下記すなわち 豚インシユリン−Arg^B31−Arg_B32−OH
（27.0IU／mg） 11.1mg デス−Phe^B1−豚インシユリン（28.0IU／mg）
3.6mg 硫酸プロタミン 1.0mg 燐酸二水素ナトリウム二水化物 21.0mg フエノール 6.0mg ｍ−クレゾール 16.0mg グリセリン 160.0mg を水を用いて合計量10mlに混合する。 1N HClたは1N NaOHの添加によりPH7.3に調
整する。 かかる懸濁液は犬においてデポ様作用経過を示
す。 例 ４ 本例は40IU／mlを有する中性処方剤中の、ヒ
トインシユリン40％およびヒト−Ｃ−ペプチド20
％と混合した、豚インシユリンから半合成により
調製されたヒトインシユリン−（B30）−コリンエ
ステルおよびその中程度の長さの作用特性を示
す。 下記すなわち ヒトインシユリン−（B30）−コリンエステル
（28IU／mg） 7.2mg ヒトインシユリン（28IU／mg） 7.2mg ヒト−Ｃ−ペプチド 3.6mg 燐酸二水素ナトリウム二水化物 21.0mg ｍ−クレゾール 27.0mg グリセリン 160.0mg を水を用いて合計量10mlに混合する。 1N HClまたは1N NaOHの添加によりPHを7.3
に調製する。 かかる懸濁液は犬において組み合せ製剤（例え
ばヘキスト社製品Komb−Ｈ−Insulin に匹敵す
る作用プロフイルを示す。 例 ５ 本例は40IU／mlを有する調製物中における亜
鉛−ヒトインシユリン結晶50％と混合した、豚イ
ンシユリンからの半合成により調製されたヒトイ
ンシユリン−Arg^B31−Lys_B32−OCH₃およびその
遅延作用を示す。 下記すなわち ヒトインシユリン−Arg^B31−Lys_B32−OCH₃
（27.0IU／mg） 7.4mg ヒトインシユリン（28.0IU／mg） 7.4mg 無水塩化亜鉛 0.23mg 酢酸ナトリウム 14.0mg ｐ−ヒドロキシ安息香酸メチルエステル 10.0mg 食 塩 80.0mg を水を用いて合計量10ml中に混合する。 1N HClまたは1N NaOHの添加によりPH7.0に
調整する。 かかる製剤は家兎において顕著な徐放作用を示
す（0.4IU／Kg）。 例 ６ 本例は40IU／mlを有する製剤中における結晶
NPH−ヒトインシユリン40％と混合した、大腸
菌において発現された霊長類プレプロインシユリ
ンからのトリプシン消化により調製されるヒトイ
ンシユリン−Arg^B31−Arg_B32−OH30％と混合し
たヒトインシユリン−Arg^B31−OHおよびその徐
放作用を示す。 下記すなわち ヒトインシユリン−Arg^B31−OH（27.5IU／mg）
4.4mg ヒトインシユリン−Arg^B31−Arg_B32−OH
（27.0IU／mg） 4.4mg ヒトインシユリン（28IU／mg） 5.7mg 硫酸プロタミン 0.5mg 燐酸二水素ナトリウム二水化物 21.0mg ｍ−クレゾール 15.0mg フエノール 6.0mg グリセリン 160.0mg を水を用いて合計量10mlに混合する。 1N NaOHまたは1N HClの添加によりPH7.3に
調整する。 かかる懸濁液は顕著に遅延された長期持続性の
作用を家兎において示す。 前記実施例１〜６で使用されたインシユリン誘
導体（）の等電点は、それぞれ下記の表１の通
りである。等電点は電気泳動によつて測定された
ものであり、標準偏差は±0.1である。

【表】

【表】 薬理比較試験 前記実施例２〜６で調製された薬剤をイヌに投
与して血中グルコースの濃度変化（投与時に対す
る％）を経時的に測定した。動物は全ての試験例
において６匹使用し、インシユリン誘導体0.3国
際単位／Kg投与した。結果を表２に示す。

【表】 ウサギ７匹を使用し、インシユリン誘導体0.2
国際単位／Kgを投与する以外は上記と同様にして
血中グルコースの濃度変化を測定した。結果を表
３に示す。

【表】 上記の試験結果から、本発明の薬剤を投与した
場合には従来の薬剤に比較して、血中グルコース
の減少が遅延されることがわかる。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 生理学的に受容しうる担体および活性成分と
   して (a) 等電点5.8〜8.5を有する式 【表】 （式中R¹はＨまたはＨ−Pheであり、R³⁰は
   Ala、ThrまたはSerであり、そしてR³¹は式−
   XnSを有する基であり、ここでｎは０、１また
   は２であり、ＸはArgまたはLysであり、そし
   てＳはOH、（C₁〜C₆）アルコキシまたはコリ
   ル基である）を有するインシユリン誘導体、お
   よび (b₁) 前記式(1)（式中R¹はＨまたはＨ−Pheであ
   り、R³⁰はAla、ThrまたはSerであり、R³¹
   はOHである）を有するインシユリン、また
   は (b₂) 上記b₁の生理学的に受容しうる塩、または (b₃) プロインシユリン、または (b₄) Ｃ−ペプチド、または (b₅) 成分(a)が少なくとも１重量％存在する上記
   化合物の組み合せ を含有することを特徴とすると、糖尿病の治療用
   薬剤。 ２ 式のインシユリン誘導体およびインシユリ
   ンにおいてR¹がＨ−Pheであることを特徴とする
   前記特許請求の範囲第１項記載の薬剤。 ３ インシユリン−B31−Arg−OHまたはイオ
   ンシユリン−B31−Arg−Arg−OHを含有する
   ことを特徴とする前記特許請求の範囲第１または
   ２項に記載の薬剤。 ４ 数種の異なる式のインシユリン誘導体およ
   び／または数種の異なる式のインシユリンを含
   有することを特徴とする前記特許請求の範囲第１
   〜３項のいずれかの項に記載の薬剤。 ５ プロインシユリンまたはプロインシユリン類
   似体および／またはヒトＣ−ペプチドを含有する
   ことを特徴とする前記特許請求の範囲第１〜４項
   のいずれかの項に記載の薬剤。 ６ 天然インシユリンおよび／またはプロインシ
   ユリンおよび／またはデス−Phe−インシユリン
   および／またはＣ−ペプチドおよびインシユリン
   誘導体の間の混合比率が（これらペプチドの総量
   に基いて）インシユリン０〜99％およびプロイン
   シユリン０〜99％およびデス−Phe^B1−インシユ
   リン０〜99％およびＣ−ペプチド０〜99％および
   式のインシユリン誘導体１〜100％の間で変動
   することを特徴とする前記特許請求の範囲第１〜
   ５項のいずれかの項に記載の薬剤。 ７ PH2.5〜8.5を有しそして溶液または懸濁液と
   して存在しそして慣用量の適当な等張剤ならびに
   適当量の適当な防腐剤を含有することを特徴とす
   る前記特許請求の範囲第１〜６項のいずれかの項
   に記載の薬剤。 ８ PH値が5.0〜8.5にある場合には適当量の適当
   な緩衝物質を付加的に含有することを特徴とする
   前記特許請求の範囲第１〜７項のいずれかの項に
   記載の薬剤。 ９ 種々の物質と接触した場合に熱または機械的
   負荷に際して蛋白質の沈澱を阻止する適当な安定
   剤の適当量をその製剤が含有することを特徴とす
   る前記特許請求の範囲第１〜８項のいずれかの項
   に記載の薬剤。 １０ 100単位当り０〜100μｇでありうる適当量
   の亜鉛を含有することを特徴とする前記特許請求
   の範囲第１〜９項のいずれかの項に記載の薬剤。 １１ インシユリンおよび／またはプロインシユ
   リンおよび／またはデス−Phe^B1−イシユリンお
   よび／またはＣ−ペプチドおよび式のインシユ
   リン誘導体がアルカリ塩またはアンモニウム塩の
   形態で使用されることを特徴とする前記特許請求
   の範囲第１〜１０項のいずれかの項に記載の薬
   剤。 １２ インシユリン部分および／またはプロイン
   シユリン部分および／またはデス−Phe^B1−イン
   シユリン部分および／またはＣ−ペプチド部分お
   よび式のインシユリン誘導体の部分が相互に独
   立してそれぞれ溶解されたか、無定形かそして／
   または結晶形態で存在しうることを特徴とする前
   記特許請求の範囲第１〜１１項のいずれかの項に
   記載の薬剤。 １３ インシユリン部分および／またはプロイン
   シユリン部分および／またはデス−Phe−インシ
   ユリン部分および／またはＣ−ペプチド部分およ
   び式のインシユリン誘導体部分のそれぞれ任意
   の一部分が結晶形態であり、インシユリン部分お
   よび／またはプロインシユリン部分および／また
   はデス−Phe−インシユリン部分および／または
   Ｃ−ペプチド部分および式のインシユリン誘導
   体部分のそれぞれ他の任意の一部分が無定形であ
   りならびにインシユリン部分および／またはプロ
   インシユリン部分および／またはデス−Phe−イ
   ンシユリン部分および／またはＣ−ペプチド部分
   および式のインシユリン誘導体部分のそれぞれ
   残分が溶解された形態で存在することを特徴とす
   る前記特許請求の範囲第１〜１２項のいずれかの
   項に記載の薬剤。 １４ 製剤が適当量の遅延作用を有する既知助剤
   の１種を含有することを特徴とする前記特許請求
   の範囲第１〜１３項のいずれかの項に記載の薬
   剤。 １５ 遅延作用成分が作用物質全部分またはその
   一部分と組み合せて用いられることを特徴とする
   前記特許請求の範囲第１４項に記載の薬剤。 １６ インシユリンおよび／またはプロインシユ
   リンおよび／またはデス−Phe−インシユリンお
   よび／またはＣ−ペプチドおよび式のインシユ
   リン誘導体を数種の異なる遅延作用性助剤と組み
   合せて含有することを特徴とする前記特許請求の
   範囲第１４または１５項に記載の薬剤。