JPH047466B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔技術分野〕 本発明は、超純水のサンプル中のバクテリア等
の微生物量を定量するに適した水中微小不純物の
検定方法に関するものである。

〔従来技術〕

半導体工業等に使用する水は、無粒子の超純水
レベルであることが必要である。その水質を管理
するために従来から直接顕微鏡検定法（以下「直
顕法」という。）という方法が用いられている。

直顕法の原理は、バクテリア等水中の微粒子を
測定するために、サンプル水を特殊なフイルタに
より濾過して、そのフイルタ上に検定対象の微粒
子を補集し、この微粒子に適当な染色を施して観
察をしやすくするようにしたものである。

第１図は、その直顕法を実施するための構成を
示したもので、１は加圧用窒素ボンベ、２は加圧
調整用のレギユレータ、３はガス管、４および６
は開閉バルブ、５は窒素ガス圧力計である。７は
加圧用窒素ボンベ１からサンプルチユーブ８に流
入する窒素ガス中の粒子を、そのサンプルチユー
ブ８内のサンプル水中に混入させないために濾過
捕集するエアーフイルタ装置で、たとえば孔径が
0.2μの多数の微小孔を有するフイルタ素子９をＯ
リング１０により容器内に保持した構成を有し、
これにより窒素ガス中の全てのバクテリア等微小
不純物を捕捉することができる。

サンプル水１１を注入したサンプルチユーブ８
は、エアー抜きバルブ１２を具えたふた１３によ
つて密封される構成を有し、そのふた１３の流入
孔１４から流入する窒素ガスによつてサンプル水
１１が加圧されて、サンプル捕集用フイルタ装置
１５内のフイルタ素子１６に導かれる。また、そ
のフイルタ素子１６は、当該フイルタ素子１６上
でむらなくサンプル水が濾過されるように、その
背面に設けたスペーサ１７とプレート１８ととも
に一体的にＯリング１９によつて着脱可能なよう
に装着されている。なお、２０はサンプル捕集用
フイルタ装置１５をサンプルチユーブ８に連結す
るためのクランプ、２１はサンプル濾過後のサン
プル水を収容するための廃液タンクである。

上述の構成において、サンプル用フイルタ作成
部はサンプルチユーブ８とサンプル捕集用フイル
タ装置１５とから成つている。サンプル捕集にあ
たつては、サンプル捕集用フイルタ素子１６を図
示のようにサンプル捕集用フイルタ装置１５内に
装着し、気泡のないように無塵水で内部を満たし
た後、クランプ２０によつてサンプルチユーブ８
にセツトする。そのサンプルチユーブ８内には、
被検対象とするたとえば超純水のサンプル水を定
量満たし、ふた１３を閉める。このふた１３の流
入孔１４は、エアーフイルタ装置７を介して窒素
ボンベに連結してあり、当初はレギユレータ２、
開閉バルブ４，６およびエアー抜きバルブ１２と
も、閉め切つた状態にある。

以上のような密閉系を確認のうえ、レギユレー
タ２および開閉バルブ４を開放して窒素ガスを流
し、圧力計５を読んで所定の加圧力となるように
レギユレータ２によりガス圧を調整した後、開閉
バルブ６を開く。窒素ガスはエアーフイルタ装置
７により無塵ガスとなつてサンプルチユーブ８内
に流入し加圧する。サンプル水１１はその加圧力
によりサンプル捕集用フイルタ装置１５に入り、
着脱可能にＯリング１９により保持したフイルタ
素子１６によつて濾過され、サンプル水中の微生
物等微小不純物２２はそのフイルタ素子１６上に
捕集される。

このようにして、フイルタ素子１６上によつて
濾過捕集した後、エアー抜きバルブ１２を開いて
サンプルチユーブ８内の気圧を大気圧に戻す。し
かる後クランプ２０を外してサンプル捕集用フイ
ルタ装置１５を外し、その中に装着したフイルタ
素子１６をピンセツト等により静かに取り出し、
染色工程に移る。

染色工程は、フイルタ素子１６上に捕捉された
サンプル水中の微小不純物を、顕微鏡下で測定し
やすいように染色する工程である。この工程は、
また乾燥、染色、水洗、再乾燥およびスライドグ
ラス作成の順序の各工程からなつている。

第２図は、その染色工程の説明図である。同図
ａに示すようにまず、シヤーレ等適当な容器２３
内に、乾いた濾紙２４を敷いて、その上に、前記
サンプル捕集用フイルタ装置１５から取り外した
サンプル捕集済のフイルタ素子１６を、濾過捕集
面を上にして静置し乾燥させる。しかる後、同様
に同図ｂの如くシヤーレ等適当な容器２５内に、
染色液を含浸させた濾紙２６を敷き、その乾燥さ
せた上記フイルタ素子１６を載せて５〜６分放置
することにより、そのフイルタ素子１６上の捕集
微小不純物を染色する。染色を終えたフイルタ素
子１６は、同図ｃに示したようにピンセツトを使
つてたとえばシヤーレ２７内の水に浸した濾紙２
８により、染色液の付着した側を清拭法によつて
洗浄した後、別のシヤーレ等に戻して再乾燥す
る。

このようにして染色処理したフイルタ素子１６
を、同図ｃに示したようにイマージヨンオイル２
９を一滴載せたスライドグラス３０上に移し、さ
らにフイルタ素子１６上にもイマージヨンオイル
を一滴たらし、その上にカバーガラス３１を被せ
て、顕微鏡３２で観察し、同図ｅに示した視野中
の染色された微小不純物２２を検定する。

このような直顕法に用いるサンプル捕集用のフ
イルタ素子１６は、透明なポリカーボネートを素
材としたものを用いることによつて、その透明性
のほかに一般のセルローズ系メンブレンの約1/10
の厚さであることなどから、特殊な透明化手段を
用いる必要がなく、そのままで光学顕微鏡により
容易に観察可能であり、また、染色液に浸した場
合、前記素材によるフイルタ素子そのものは全く
染色されず、捕捉された菌体のみが染色されると
いう好都合な性性を有している。

従来の直顕法は、上述のような好都合な特性を
有するサンプル捕集用フイルタ素子を用いること
によつて、確実に微生物等を検出し得る方法では
あるが、つぎのような難点がある。

(1) サンプル捕集後に面倒な染色工程が必要であ
り、検鏡までに手間がかかりすぎる。

(2) 微小不純物を捕集した状態での染色では、染
色むらの恐れがあるため、微小不純物の測定精
度が低下する。

〔目的〕

本発明の目的は、上記したような従来の直顕法
における難点を解消するために、サンプル捕集後
の染色を省略し得るとともに、容易かつ正確に検
鏡測定の可能な水中微小不純物の検定方法を提供
しようとするものである。

〔概要〕

本発明方法は、水中の微生物等微小不純物を検
定するにあたり、検出対象の微生物等微小不純物
に主として結合する染色剤をサンプル水に加える
ことにより、あらかじめサンプル水中に存在する
微生物等微小不純物に前記染色剤を反応させて蛍
光染色した後、濾過捕集して検鏡することを特徴
とする。

これを要約すると、サンプル水中の微生物等微
小不純物をあらかじめ染色した後、従来の方法と
同様に濾過捕集するものである。このようにして
作成したサンプルは、すでに染色処理されている
ので、サンプル水中に微生物等があればその存在
を精度よく検出することができ、しかも従来必要
であつた捕集後の染色工程が不要になる。

〔実施例〕

第３図は、本発明を実施するためのサンプルチ
ユーブ３３の構成の一例を示す外観図である。こ
の実施例では、第１図の従来の構成において、第
１図に８で示したサンプルチユーブに代え、第３
図に示したサンプルチユーブ３３を用いる。

また、この実施例では、染色剤として蛍光物質
を用いた場合について述べる。

第３図に示したサンプルチユーブ３３は、第１
図により説明した従来法に用いるサンプルチユー
ブ８とほぼ同様の構成を有するが、ふた３４に薬
液注入口３５を設けた点で第１図のサンプルチユ
ーブ８と相違している。なお、３６はエアー抜き
穴、３７は薬液注入口のふたである。

実施するにあたつては、従来と同様にサンプル
チユーブ３３内に被検対象のサンプル水１１を適
量満たしてふた３４を閉めた後、注入器３８等に
よつて蛍光物質、たとえばＯ−フタルアルデヒト
−２メルカプトエタノール溶液３９を、薬液注入
口３５より微量滴下してからふた３７を閉める。
その他の操作は、さきに説明した従来の方法と全
く同じでよい。すなわち、第１図に示したエアー
フイルタ装置７を介して窒素ガスを加圧口４０か
ら送給し、これにより加圧されたサンプル水１１
を第１図のように設けたサンプル捕集用フイルタ
装置１５内のフイルタ素子１６に受けて濾過捕集
する。しかる後に従来方法と同様これをサンプル
捕集用フイルタ装置１５内から取り出し、シヤー
レ等適当な容器内に敷いた乾燥用濾紙上に、サン
プル捕集面を上にして静置し乾燥させる。

なおサンプル水加圧からサンプル捕集済フイル
タ素子１６を取り出すまでの操作についても、さ
きの従来方法と同じでよいので説明を省略する。

このようにして作成したサンプルは、サンプル
水中に存在する微生物が蛍光物質と結合した形で
フイルタ素子１６上に捕集されているので、あら
ためて染色作業を行なうまでもなく、ただちに検
鏡測定することができる。

周知のように、この実施例の蛍光物質として用
いたＯ−フタルアルデヒドは、 なる構造式を有し、通常、成分分析の分野におい
ては第一級アミンの定量等に用いる試薬であつ
て、アミノ基と２−メルカプトエタノールの存在
下においては、 のような反応式により反応し、340nm前後の励起
波長光によつて蛍光波長455nm前後の強い青色蛍
光を発するという性質を有する。この実施例で
は、上述のようなＯ−フタルアルデヒドのアミノ
基の定量性を、微生物の蛋白質の検出に応用し、
サンプル水中の微生物を中心とする微粒子を高感
度に検出するようにしたものである。

すなわち、上記の本発明の実施例において、フ
イルタ素子１６上に捕集された微生物は、サンプ
ルチユーブ３３内でその微生物の細胞質である蛋
白質のアミノ酸に、蛍光物質のＯ−フタルアルデ
ヒドがすでに結合している。したがつて、サンプ
ル捕集後のサンプル素子１６上に捕集された微生
物は、むらなく蛍光染色されているので、さきに
説明したように、これを乾燥させて、たとえば蛍
光顕微鏡により観察すれば、微生物の蛍光発光に
よつて極めて容易にその存在を検出し得るのみな
らず、検定精度も一段と向上する。

なお、上記実施例においては、サンプル水中の
微生物を主として検定する場合について説明した
が、本発明はこれに限定されるものではなく、そ
の他の微小不純物を検出する場合には、その検出
対象の微小不純物に主に反応する蛍光物質を染色
剤として用い、これをサンプルチユーブ内のサン
プル水中に微量滴下して反応させた後、濾過捕集
するようにすればよいことは勿論である。

〔発明の効果〕

以上詳細に説明したように本発明方法によれ
ば、第２図ａないしｃにより説明したサンプル水
の濾過捕集後の微生物等微小不純物の染色工程が
不要となるのでこの種の検定における作業が簡単
になる。しかも微生物等の濾過捕集時には、微生
物等微小不純物の全てがすでに染色処理されてい
るので、染色むらの恐れもなく、従つて測定精度
が一段と向上する等の効果もある。

【図面の簡単な説明】

第１図は、従来の直顕法のサンプル作成のため
の装置の構成を示す図、 第２図は、従来の直顕法のサンプル染色工程説
明図、 第３図は、本発明法を実施するためのサンプル
チユーブの構成例を示す外観図。 ７……エアーフイルタ装置、８，３３……サン
プルチユーブ、１１……サンプル水、１３，３
４，３７……ふた、１５……サンプル捕集用フイ
ルタ装置、１６……サンプル捕集用フイルタ素
子、２３，２５，２７……シヤーレ、２４……乾
燥用濾紙、２６……染色液含浸濾紙、２８……含
水濾紙、２９……イマージヨンオイル、３０……
スライドグラス、３１……カバーグラス、３２…
…光学顕微鏡、３５……薬液注入口、３６……エ
アー抜き口、３８……注入器、３９……薬液、４
０……窒素ガス注入口。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ 水中の微生物等微小不純物を検定するにあた
   り、検出対象の微生物等微小不純物に主として結
   合する染色剤をサンプル水に加えることにより、
   あらかじめサンプル水中に存在する微生物等微小
   不純物に前記染色剤を反応させて染色した後濾過
   捕集して検鏡することを特徴とする水中微小不純
   物の検定方法。