JPH0476673B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は新規な修飾酵素に関する。 更に詳しくは、アクロモバクター・リテイカス
から産生されるリシルエンドペプチダーゼ（アク
ロモバクター・プロテアーゼ）（以下、PLPを
略称する。）をポリアルキレングリコールを架橋
剤として用いて、分子間で架橋重合させて得られ
る新規な修飾酵素に関する。 酸素反応は一般に広く利用されているが、通
常、酵素は水性溶液に溶解した状態で使用される
為、反応終了後の酵素回収は至難であると共に、
反応生成物の分離精製も容易ではない。更に元
来、酵素は決して安定ではなく、通常中性域で常
温付近、常圧下に使用されるが、回収によつて著
しく損耗する。従つて、広い温度域及び広いPH域
で安定、各種の溶剤中に於いても使用出来、簡単
に回収できるという要件を備えることは、全ての
酵素に共通した志向であり、PLPに於いても当
然の要求であつた。 PLPは土壌から分離されたアクロモバクタ
ー・リテイカスM497−１が産生する菌外酵素で、
副島、正木らによつて発見され、アグリカルチユ
ラル・アンド・バイオロジカル・ケミストリー、
第42巻1443頁（1978年）、及び特開昭54−119085
号に記載されているアクロモバクター・プロテア
ーゼと同一の酵素である。至適温度は45℃、カ
ゼインを基質とした場合、プロテアーゼ活性の至
適PHは8.5〜10.5、ゲル過法による分子量は
27000、等電点PH6.9、ジイソプロピルフオスフオ
クロリド及びトシル−Ｌ−リシンクロロメチルケ
トンによつて強く阻害を受け、トシル−Ｌ−フエ
ニルアラニンクロロメチルケトン、エチレンジア
ミンテトラアセテート、オルソフエナンスロリン
及びｐ−クロロマーキユリーベンゾエートで阻害
されないセリン酵素であり、Ｌ−リジンのカルボ
キシル基に於けるエステル結合及びアミド結合を
特異的に水解し、それ故にアミノ酸配列決定の際
のペプチドの酵素分解並びにリシル−ペプチドの
分解及び合成に於いて有用な酵素であることは周
知の如くである。近年、この酵素を利用して豚イ
ンシユリンからヒトインシユリンの合成が行なわ
れているが（副島・正木らの特開昭54−135789号
及び森原・岡らのバイオケミカル・アンド・バイ
オフイジカル・リサーチ・コミユニケイシヨン、
92巻、362頁（1980年））、これらの方法はいずれ
も水溶性酵素単体を使用する液相反応であるた
め、得られたヒトインシユリンと異質の蛋白であ
るPLPを分離精製する必要があり、もし精製が
不十分である場合は、医薬品として人体に投与し
た場合に異種蛋白による抗体の生成という免疫学
的な副作用を判ない、殊に長期間に連続的に投与
する場合は極めて重大な結果を惹起する恐れがあ
る。更に当然の如く分離精製には多大の労力と時
間を要し、又分離後の酵素は失活の為、再使用に
耐えないので、高価な酵素を製造バツチ毎に使い
捨てることになり、その経済的損失は大なるもの
がある。それ故本酵素を何らかの誘導性に導き、
安定性を増し、且つ反応液からの分離を容易に行
なえる形態にして使用すれば、目的物の品質向上
並びに経済面からも優位性を保ち得ることは明ら
かである。 一般にこのような目的を達成する為、酵素を誘
導体に導く方法としては数多くの方法が知られて
いるが、それらの方法の内、代表的な方法を列挙
すると、(1)酵素を水不溶性の担体に共有結合させ
る方法、(2)酵素を水不溶性の担体にイオン結合さ
せる方法、(3)酵素を水不溶性の担体に吸着させる
方法、(4)酵素を架橋剤で架橋させ、水に不溶性な
ものにする方法、(5)担体を重合させ、酵素を包括
させ水に不溶なものにする方法、などがある。 しかしながら、上記の方法で得られた所謂、固
体化酵素は、水に不溶性であるために、バツチ法
で種々の反応に使用するに際して、反応液が不均
一な懸濁状態になつたり、あるいは比重が高い固
定化酵素はすぐに沈澱してしまうために、反応を
速やかに進行させる場合には、可能な限り反応液
を撹拌させたり、あるいは反応容器を回転させた
りする事により出来るだけ均一な懸濁状態を作
り、固定化酵素と反応物との接触時間を長くした
り、あるいは接触頻度を多くする必要がある。従
つて、反応させる物質が非常に不安定であり、空
気中の酸素により酸化され易く、激しい機械的な
撹拌又は回転は避けなければならないような反応
には固定化酵素は使用出来ない場合もある。 また、水に不溶性の固定化酵素を用いた反応に
於ては、当然のことながら、固相と液相との不均
一な反応となる為、液相中での反応に比較すると
必然的に反応速度が遅くなることは否めない事実
である。 更に、カラム法及びバツチ法に於いて、水不溶
性固定化酵素を反応に用いる場合、基質は溶媒に
溶解させているが、反応中に生じてくる反応生成
物あるいは副生成物のいずれか又は両者ともが、
用いる溶媒に難溶性もしくは不溶性の時には、固
定化酵素との分離が非常に困難になつてくる。沈
澱として生じてくる反応生成物と固定化酵素とを
分離するために、数多くの方法が試みられている
が、例えば、沈澱を生じせしめないような有機溶
媒などを使用する方法に於ては、有機溶剤の種類
によつては、時には著しく固定化酵素の失活を招
き、その結果、繰り返し使用回数も減少し、経済
性も悪くなる。また、反応生成物が反応溶媒に溶
解する場合であつても、繰り返し使用している間
に、反応生成物が水に不溶性な固定化酵素に非特
異的な吸着を惹起し、目的物の収率が悪くなる欠
点もある。 また、繰り返し固定化酵素を使用するに従い、
その担体の比活性が徐々に低下するため、反応率
を上昇させるには、当然新しい固定化酵素を補充
せねばならないが、バツチ法に於いて反応を行な
う場合、基質濃度との関係から溶媒の量を増加で
きない事もあり、このような時には実際には反応
が不可能になる。 本発明者らは、固定化酵素のかかる問題点を解
決すずべく、水に可溶で、尚且つ原料及び得られ
た生成物との分離が容易な修飾酵素について鋭意
研究を重ねた結果、ポリアルキレングリコール
（以下、PAGと略称する。）架橋剤として用いて、
PLPを分子間で架橋重合させることにより、酵
素活性を減ずることなく、不溶性を保つたまま
で、安定で、且つ原料及び反応生成物との分離が
容易な、新規な修飾酵素が得られることを見出
し、本発明を完成するに到つた。 これまで酵素療法の分野で、その免疫原性を低
下させることを目的として、分子表面に存在する
アミノ酸残基に非免疫原性高分子を化学結合さ
せ、これにより酵素分子表面に存在する抗原決定
部位を覆いかくし、抗体との結合能を減少あるい
は消失させる為に、酵素タンパクを合成高分子、
例えば、モノメトキシポリエチレングリコールの
ような一価性のポリエチレングリコールで化学修
飾する試みがなされている例があるが、この場合
はあくまでも酵素タンパクのもつ免疫原性を低下
させることが目的であつて、その為に一価性のポ
リエチレングリコール即ち、モノメトキシポリエ
チレングリコールでその周囲を覆うわけである
が、本発明の如く、不溶性を保つたままで酵素を
更に高分子化し、酵素反応に用いられる基質や反
応生成物との分離を容易ならしめる目的で、架橋
剤として二価性のポリアルキレングリコールを用
いて酵素を架橋重合させている例はこれまでに無
く、本発明者らが独自の知見に基いて完成した新
規な発明である。 本発明の修飾酵素即ち、ポリアルキレングリコ
ール−リシルエンドペプチダーゼ重合体（以下、
PAG−PLP重合体と略称する。）は、PAG分子
中の水酸基を活性化剤で活性化後、次いでこれに
PLPを作用させることにより製造される。 本発明に使用されるポリアルキレングリコール
としては、ポリエチレングリコール（以下、
PEGと略称する。）、ポリプロピレングリコール、
ポリブチレングリコール等が挙げられ、いずれも
両端の水酸基がメトキシ基に置換されていない二
価性のものが用いられる。また、PEGの場合に
は通常、分子量200〜20000のものが用いられる
が、好ましくは分子量6000〜20000のものがよい。 本発明の修飾酵素を得る方法は、好ましくは２
工程で行なわれる。先ず、PAGに活性化剤を反
応させて活性化させる。活性化剤としては、例え
ば１，1′−カルボニルジイミダゾール、塩化シア
ヌル等が使用され、これらはPAG中の水酸基１
個に対し１〜10倍量を用いるのが好ましい。反応
は一般にジオキサンやベンゼンなどの有機溶剤中
で行なわれ、温度は０〜50℃で行なうのが好まし
い。 このようにして活性化されたPAGは、一旦反
応液から単離・精製したのち、第２の反応を行な
うのが好ましい。活性化PAGの単離は、反応後、
透析により未反応の低分子量のものを除去する
か、ゲル過するか、限外過するか、もしくは
有機溶媒による沈澱法を用いるのが良い結果を与
える。第２工程は、活性化されたPAGとPLPと
を水溶液中、好ましくは弱アルカリ性の条件下で
反応させる。活性化PAGの量は、PLP分子中の
アミノ基の数に対し１〜1000倍量になるようにす
る。反応は０〜40℃で行なわれ、塩化シアヌルで
活性化されたPAGを用いた場合は１〜５時間で、
１，1′−カルボニルジイミダゾールで活性化され
たPAGを用いた場合は１〜５日間で完結する。
反応後の分離・精製は、水溶性高分子化合物、特
に蛋白質の精製法として汎用されている方法、例
えば透析法・ゲル過・限外過法・有機溶剤に
よる沈澱法などを適宜選択して利用する事ができ
る。 PLPの反応液中での最終濃度は、通常0.02〜20
重量％、より好ましくは0.1〜15重量％に調製さ
れる。酵素濃度が低すぎると、目的物である水溶
性PAG−PLP重合体の収率が低く、実用性に乏
しくなる。また、酵素濃度が高すぎると、得られ
てくる重合体が水不溶性となる恐れがある。 本発明に使用される活性化PAGは、二官能基
もしくはそれ以上の官能基を有するものであれば
いずれでもよいが、通常は先に挙げた１，1′−カ
ルボニルジイミダゾール又は塩化シアヌルで活性
化された二官能基、若しくは三官能基を有する活
性化PAGが用いられる。 本発明のPAG−PLPは、重合前のPLPと基質
特異性に於て変らず、また、至適PH、至適温度、
ミカエリス定数（Km値）及び最大速度Vmaxに関
して、重合前のPLPの値と変化がなかつた。 例えば、PEG−PLPの基質特異性を第１表に
示す。

【表】 尚、上記酵素類の活性測定法は次のように行な
つた。即ち、0.2M2−アミノ−２−メチル−１，
３−プロパンジオール緩衝液（PH9.5）2.6mlに、
2.5mM各基質溶液0.3mlを加え、30℃にて予備加
温後、酵素溶液0.1mlを添加し、各基質に応じて
10分間から20時間、30℃にて反応させた。反応
後、45％酢酸水溶液10mlを加え反応を停止させた
のち、405nmにて比色測定し、その吸光度を求め
た。酵素単位としては、30℃に於いて１分間当り
1μmoleのｐ−ニトロアニリンを生成する酵素量
を１単位とした。酵素力価の算出方法は、次式に
従つた。（ｐ−ニトロアニリンの分子吸光係数は、
9.62×10³l・mole^-1・cm^-1である。） 活性（ｕ／ml）＝ΔO.D.／min×１／9.62×4.0／0.1・
希釈倍数 第１表から明らかなように、本発明のPEG−
PLP重合体はリジンのカルボキシ基のアミド結
合に強く作用し、アルギニンに対しては殆んど作
用せず、またその他のアミノ酸残基のアミド結合
を加水分解することはなく、重合前のPLPと同
じ基質特異性を示すものである。 本発明の酵素誘導体の大きな特徴の１つは、分
子量が大きいために、ゲル過法によつて目的の
反応生成物と酵素とを非常に容易に分離でき、ま
た回収できた本発明PAG−PLP重合体は、その
酵素活性に全く損耗をきたしていないので、繰り
返し使用する事ができる点である。即ち、PLP
は分子量が27000〜30000であるため、分子量10万
以下のペプチドあるいは蛋白とのゲル過法によ
る完全な分離は容易ではなく、他の、より複雑な
方法を用いる必要があるが、本発明の酵素誘導体
は、分子量40万以上と極めて高分子であるので容
易に分離ができ、蛋白やペプチドの分解、合成の
生成物と酵素との分離・精製に極めて利する所大
なるものがある。 以上の如く、本発明の修飾酵素は、修飾前の酵
素と基質特異性、至適PH、至適温度、ミカエリス
定数（Km値）、最大速度Vmax共に変らず、酵素
活性を減ずることなく、水溶性を保つたままで高
分子化されており、安定で、反応液からの分離が
容易な為、反応生成物中に混入して問題を生じる
恐れもなく、又、酵素自体のくり返し再使用も容
易にできる点等に大きな特徴を有するものである
が、更に、本発明の修飾酵素の意外な効果として
は、修飾した結果、有機溶剤に対する溶解性が著
しく増大した点が挙げられる。本効果を示すもの
として、次に、本発明PEG−PLP重合体の各種
有機溶剤に対する溶解性データを第２表に示す。

【表】

【表】 また第２表に於ける有機溶剤に溶解された本品
の溶液を、30℃にて200分間加温した後、アミダ
ーゼ活性の測定を行ない、水に溶解させたものと
の活性の比較を行なつた結果を第３表に示す。

【表】

【表】 第３表から明らかなように、重合前のPLPは
ジメチルスルホキシドとベンゼンにしか溶解せ
ず、また溶解しても殆んど活性が残つていない
が、一方、PEG−PLP重合体は、アセトン中で
は失活はなく、PEG₆−PLPに於てはむしろ活性
が増大しており、またジオキサン、ベンゼン、ク
ロロホルム及びテトラヒドロフラン中ではかなり
の活性を保持している。 このようにPAG−PLPの重合体は、水素では
勿論の事、有機溶剤系に於いても反応に使用する
ことが可能である。従来、酵素反応は酵素の溶解
性の故に水の存在下で行なうのが通常の方法であ
り、有機溶済下では実施できないというのが常識
であつたが、本発明の酵素誘導体をもつてすれ
ば、酵素反応を利用した各種技術分野での新しい
展開が期待できる。 例えば化学法によるペプチド合成は、一般に熱
や圧力をかけるためラセミ化が起こり易く、光学
純度が下がる欠点があり、また、圧力をかける場
合には特別の装置を必要とする。 一方、酵素を用いるペプチド合成は、一般には
常温・常圧での反応のため、ラセミ化が起こりに
くく、且つ酵素の基質特異性が高いために、ラセ
ミ体の原料を用いてもいずれか一方の原料としか
反応せず光学分割が容易であるので、光学純度の
高いものが得られる。 一般に、ペプチド合成は、反応機構及び使用す
る原料や反応生成物の溶解性の面からすれば、有
機溶剤中で反応を行なうのが好ましいが、酵素法
の場合、反応に用いる酵素の溶解性及び活性の発
現の面から、反応は水溶液中で行なわざるを得
ず、水と混和する有機溶剤を用いる場合でも、有
機溶剤の濃度は可能な限り低い方がよいとされて
おり、一般的には65％以下の濃度で使用されてい
る。 従つて、酵素によるペプチド合成は、ペプチド
合成の反応機構からは有機溶剤を高濃度に使用す
るのがよいとされているが、他方、酵素を触媒に
用いるためには有機溶剤を出来るだけ低濃度に抑
える必要があるという二律背反の問題から生じる
種々の制約を受けることになる。 しかしながら、本発明者らは、本発明の酵素誘
導体、即ちPAG−PLP重合体の有機溶剤中での
溶解性に着目し、95容量％という高濃度の有機溶
剤中、PEG−PLP重合体を用いてペプチド合成
を試みた結果、ペプチド合成が高収率で進行する
という驚くべき事実をも見い出している。即ち、
ジメチルホルムアミド85容量％、エタノール10容
量％及び0.5Mトリス−塩酸緩衝液（PH6.5）５容
量％中、PEG₆−PLP重合体0.95単位存在下、デ
スアラニンインスリン20mg（3.5mM）とスレオ
ニン第３級ブチルエステル90mg（340mM）とを
37℃で15時間反応させ、反応液を高速液体クロマ
トグラフイーにより分析したところ、B³⁰位スレ
オニン第３級ブチルエステルインスリンが81％の
変換率で得られていることが確認された。 この場合、有機溶剤としてジメチルホルムアミ
ド及びエタノールを用いているが、これらの溶剤
に溶かしたPEG−PLP重合体は、第３表に示さ
れているようにペプチドの加水分解に於いては、
あまり活性が残つていなかつたものであるが、ペ
プチド合成に於いては、意外にも酵素活性を示し
ており、また、回収したPEG₆−PLP重合体は、
その酵素活性に全く損耗をきたしていなかつた。 このように溶解能の高い有機溶剤系でのPAG
−PLP重合体の利用は、リジンを含むペプチド
の合成及び水解に於いて有効な手段となりうるこ
と自明である。 本発明の修飾酵素、即ちPAG−PLP重合体は
水溶性であるため、均一系で反応できること及び
極めて安定性が高いため、酵素活性を損うことな
く、回収及び繰り返し使用が可能である事、水単
独でも、水と混和できる有機溶剤を広範囲に併用
する系でも、高収率に酵素反応が行なわれる事、
更に本発明PAG−PLP重合体は、高分子量であ
るため、反応系から例えば分子篩ゲル過法等に
より簡単に取り出すことができるので、目的物の
分離・精製も、また本発明PAG−PLP重合体の
回収も極めて有利である事から、本発明の利用価
値は非常に高く、具体的には、アミノ酸配列決定
の際のペプチドの酵素分解、並びにリシル−ペプ
チドの分解及び合成など幅広い目的に利用でき、
斯業に貢献するところ甚だ大なるものがある。 以下に参考例及び実施例を挙げて本発明を更に
詳しく説明するが、本発明はこれらによつて何ら
限定されるものでないことはいうまでもない。 参考例 １ 200ml容コルベン中、PEG6000（平均分子量
7500、ライオン油脂製）15ｇをジオキサン50mlに
溶解し、１，1′−カルボニルジイミダゾール4.05
ｇを添加溶解後、37℃にて２時間反応させた。反
応後、反応液を透析チユーブ（スペクトラポア
６、分画分子量3500、スペクトラム・メデイカ
ル・インダストリー社製）に入れ、水に対して一
夜透析後、透析内液を凍結乾燥させ、活性化
PEG6000（以下、活性化PEG₆と略称する。）を
14.5ｇ得た。 参考例 ２ 塩化シアヌル5.5ｇ（0.03mole）を、無水炭酸
ナトリウム10ｇを含有する無水ベンゼン400mlに
溶解し、PEG20000（平均分子量20000±5000、日
本油脂製）100ｇ（0.005mole）を加えた後、室
温で一夜反応後、反応混合物を過し、液に石
油エーテル600mlをゆつくり撹拌しながら加えた。
析出する沈澱を取後、沈澱をベンゼン400mlに
再溶解し、石油エーテル600mlを撹拌下ゆつくり
加え、析出する沈澱を取する。同様に沈澱析出
工程及び過工程を数回繰り返し、活性化
PEG20000（以下、活性化PEG₂₀と略称する。）が
80ｇ得られた。 実施例 １ PLP3.6単位を10mMホウ酸塩緩衝液（PH8.5）
0.5mlに溶解後、参考例１で得られた活性化PEG₆
を338mg添加溶解し、４℃にて72時間撹拌反応さ
せた。反応後、反応液をセフアデツクスＧ−100
（フアルマシア社製）のカラム（φ1.5×85cm）に
よるゲル過に付し、カラム容積比0.36の位置に
PEG₆−PLP重合体が2.92単位（収率81.1％）得
られた。ここに得られた重合体の諸性質は以下の
通りである。 (1) 分子量 40万以上（セフアデツクスＧ−200を用いるゲ
ル過法による） (2) PH安定性 緩衝液としてブリトン・ロビンソン緩衝液（PH
２〜12）を用い、30℃にて１時間保持した後、本
重合体の活性を測定した結果、本重合体はPH５〜
11で安定である事が認められた。（第１図参照） (3) 熱安定性 0.2M2−アミノ−２−メチル−１，３−プロパ
ンジオール緩衝液（PH9.5）を用いて、各温度で
１時間加温後の結果、本重合体は40℃まで安定で
ある事が認められた。（第２図参照） (4) ミカエリス定数 0.2M2−アミノ−２−メチル−１，３−プロパ
ンジオール緩衝液（PH9.5）中、30℃にてベンゾ
イル・リジン−ｐ−ニトロアニリドを基質とした
場合、本重合体のKm値は0.17mMであつた。また
最大速度Vmaxは0.19μmole／min／mlであつた。 (5) 至適PH ブリトン・ロビンソン緩衝液（PH３〜12）を用
いて、30℃にて各PHに於ける本重合体の活性測定
を行なつた結果、本重合体の至適PHは9.5であつ
た。 (6) 至適温度 0.2M2−アミノ−２−メチル−１，３−プロパ
ンジオール緩衝液（PH9.5）中、ベンゾイル・リ
ジン−ｐ−ニトロアニリドを基質とし、各温度に
於ける活性を測定した結果、本重合体の至適温度
は50℃であつた。 (7) 保存安定性 10mMホウ酸塩緩衝液（PH8.5）中、４℃にて
40日間保存後の活性をチエツクした結果、活性の
低下はなく、またセフアデツクスＧ−100のカラ
ムによるゲル過では、本重合体の分解も認めら
れなかつた。 実施例 ２ PLP2.8単位と、参考例２で得られた活性化
PEG₂₀300mgとを100mMホウ酸塩緩衝液（PH9.2）
0.5mlに溶解し、４℃にて１時間撹拌反応させた
後、実施例１と同様に処理を行ない、PEG₂₀−
PLP重合体が1.58単位（収率56.4％）得られた。
ここに得られた本重合体の諸性質を以下に示す。
（測定法は実施例１の場合と同様に行なつた。） (1) 分子量：40万以上。 (2) PH安定性：PH５〜11に於いて安定（第１図参
照）。 (3) 熱安定性：40℃迄安定（第２図参照） (4) ミカエリス定数（Km値）：0.18mM 最大速度Vmax：0.18μmole／min／ml (5) 至適PH：PH9.5〜10.0 (6) 至適温度：50℃ (7) 保存安定性：失活及び分解なし

【図面の簡単な説明】

第１図は、実施例１及び実施例２に於ける本発
明のPEG₆−PLP重合体及びPEG₂₀−PLP重合体
のPH安定性を示す曲線を、また第２図は、同じく
熱安定性を示す曲線を表わす。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ アクロモバクター・リテイカス産生リシルエ
   ンドペプチダーゼ（アクロモバクター・プロテア
   ーゼ）をポリアルキレングリコールで架橋重合
   させて得られる修飾酵素。 ２ ポリアルキレングリコールが、１，1′−カル
   ボニルジイミダゾールで活性化されたポリアルキ
   レングリコールである、特許請求の範囲第１項記
   載の修飾酵素。 ３ ポリアルキレングリコールが、塩化シアヌル
   で活性化されたポリアルキレングリコールであ
   る、特許請求の範囲第１項記載の修飾酵素。 ４ ポリアルキレングリコールがポリエチレング
   リコールである、特許請求の範囲第１項、第２項
   又は第３項記載の修飾酵素。 ５ ポリエチレングリコールの分子量が200から
   20000である特許請求の範囲第４項記載の修飾酵
   素。