JPH0515432B2 - - Google Patents
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- JPH0515432B2 JPH0515432B2 JP59044901A JP4490184A JPH0515432B2 JP H0515432 B2 JPH0515432 B2 JP H0515432B2 JP 59044901 A JP59044901 A JP 59044901A JP 4490184 A JP4490184 A JP 4490184A JP H0515432 B2 JPH0515432 B2 JP H0515432B2
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- prochymosin
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
- C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
- C12N9/6478—Aspartic endopeptidases (3.4.23)
- C12N9/6481—Pepsins (3.4.23.1; 3.4.23.2; 3.4.23.3)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
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- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
- C12N15/71—Expression systems using regulatory sequences derived from the trp-operon
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明はプロキモシン遺伝子を発現させる発現
型組換えプラスミドに関する。より詳しくは、仔
牛プロキモシンCDNAの全配列を有し、E. coli
trpプロモーターの制御下、大腸菌宿主細胞内で
プロキモシンCDNA全長を効率よく発現可能な
新規の発現型プラスミドに関する。 プロキモシンは仔牛第４胃から得られチーズ製
造の際に牛乳を凝固させるのに用いられる一種の
プロテアーゼであるキモシンの前駆体蛋白質であ
る。プロキモシンは分子量４万、アミノ酸残基数
365よりなり、そのＮ末端42個のアミノ酸よりな
るペプチドが自己消化により切断されてキモシン
を生成する。最近では微生物起源の凝乳酵素が見
い出されて、キモシンに代替しつつあるが、チー
ズ工業における仔牛キモシンに対する潜在的需要
は依然として大きい。従つて、仔牛キモシンを組
換えDNA技術を用いて微生物に生産させること
は遺伝子工学の実用面での目標のひとつと考えら
れている。 本発明の目的は宿主細胞中、E. coli trpプロモ
ーターの制御下、高い発現率でプロキモシン
CDNA全長の発現を可能にさせる新規の発現プ
ラスミドを得ることである。 本発明の他の目的は前記の発現プラスミドで宿
主を形質転換し、形質転換株を培養することによ
りプロキモシンを生産する方法を提供することで
ある。 本発明の別の目的は前記の発現プラスミドを構
成する方法を提供することである。 組換えDNA操作を用いて、プロキモシン
CDNAを大腸菌宿主細胞中で形質発現させ、プ
ロキモシンを生産させる方法は既に公知である。
例えば、西森ら、Gene，19，337（1982）、特開昭
58−32896号（別府輝彦）、特開昭57−141287号
（コラボラテイブ・リサーチ）はE. coli lacオペロ
ンプロモーター制御下、プロキモシンが産生され
ることを開示している。一方、E. coli trpプロモ
ーター制御下でも同様に、プロキモシンが産生さ
れることが、特開昭58−9687号（セルテツク・リ
ミテツド）、清水ら、農芸化学会講演要旨集2A−
19（1982）、特願昭58−38439号（別府輝彦）に記
載されている。特に、上記清水らの文献にはプロ
キモシンの全構造遺伝子がクローン化されて、E.
colitrpプロモーターの制御下、大腸菌宿主細胞
内で発現するプラスミドpCR701が開示されてい
る。このプラスミドは全長約5.3Kbでプロキモシ
ンのCDNAの全長がtrpプロモーターの下流trpＬ
遺伝子のリポゾーム結合位に挿入されている。第
１図にpCR701の制限酵素地図を示す。SD配列と
ATG開始コドンの間には次の14塩基が存在する。 5′ −AAGGGTATCGATAAGCTTATGGCT−3′ SD Met Alo プロキモシン このプラスミドで形質転換した大腸菌株E. coli
c600rK−mk−CPCR701）は微工研に寄託されて
いる（受託番号FERMBP264）。しかしながら前
述の西森らの文献中に記載されているように、
pCR701の発現率は他の公知のプラスミド
pCR501，pCR601と比較して非常に低い。プロキ
モシン蛋白の生産量は競合結合ラジオイムノアツ
セイ法（Competitivebinding
radioimmunoassay）の測定によると宿主細胞あ
たり約700分子であり、免疫ブロツテング法の測
定によると細胞あたり約12000分子であつた。 本発明はE. colitrpプロモーター、オペレータ
ー系とプロキモシンCDNA全配列から成り、大
腸菌宿主細胞内でtrpプロモーター制御下、プロ
キモシンCDNA全長を発現可能な発現型組換え
プラスミドであつて、該CDNAのＮ末端にATG
開始コドンが接続されそして該プロモーター領域
内のSD配列とATG開始コドンとの間の塩基対が
高発現率を与えるように構成されていることを特
徴とするプラスミドを提供する。 又、本発明はプラスミドpCR701のSD配列と
ATG開始コドンとの間を制限酵素によつて切断
し、再連結することにより該SD配列とATG開始
コドンとの間の塩基対のたとえば種類及び／又は
数の如き構成を変化させ、より発現率の高い新規
のプラスミドを得る方法を提供する。前述の方法
に於いて、制限酵素による切断後、一本鎖構造部
分を修復して切断末端を再連結し、SD配列と
ATG開始コドンとの間の距離をのばすことも、
逆に一本鎖構造部分を除去して切断末端を再連結
し、SD配列とATG開始コドンとの間の距離を縮
めることも可能であるが、好ましくは後者の手法
（距離を縮める）が用いられる。本発明は、かく
して得られた発現効率の高い発現プラスミドを宿
主細胞に形質転換法により導入し、形質転換細胞
を培養することからなるプロキモシンの生産方法
をも提供する。更に、本発明は形質転換された微
生物そしてそれから産生されたプロキモシンを包
含する。 本発明に於いて、用いられる宿主微生物は、本
発明の発現プラスミドを受容し、宿主細胞が増殖
して、プロキモシンを産生するものなら、特定の
菌株に限定されないが、実用的な理由から大腸菌
C600由来株の利用が好ましい。特に好ましくは、
大腸菌E. coliC600rk−mk−株が用いられる。本発
明の方法で生産されるプロキモシンは全てＮ末端
にメチオニルが付着したメチオニルプロキモシン
であるが明細書中単にプロキモシンと称する。 以下に好適な実施態様を例にして本発明をより
詳しく説明する。 プラスミドpCR711 プラスミドpCR701をまず、制限酵素Hindで
切断する。一本鎖構造部分を有する両末端を
DNAポリメラーゼを用いて修復する。修復され
た平滑末端をT4DNAリガーゼで連結する。これ
らの操作で、SD配列−ATG開始コドン間の距離
は４塩基対増加して、18塩基対となる。得られた
新プラスミドpCR711はSD−ATG間の塩基配列
以外pCR701と全く同一である。SD配列とATG
開始コドンとの間のDNA配列はMaxam−
Gilbert法で解析すると以下の通りである。 5′ −AAGGGTATCGATAAGCTAGCTTATG−
3′ SD Met pCR701からpCR711を構成する模様を第２図に
示す。pCR711で形質転換した宿主細胞E. coli
C600rk−mk−の内、アンピシリン耐性株を選択
すると、これらの株はプラスミドpCR711を保有
し、trpプロモーターの制御下でプロキモシンを
産生する。 プラスミドpCR712及びpCR713 プラスミドpCR701を前記と同様にHindで切
断する。得られた一本鎖構造部位を有する末端を
ヌクレアーゼ（Nuclease）S1で除去する。続い
て平滑末端をT4DNAリガーゼで再連結する。こ
の際切断条件の差違（主に、緩衝液の組成の違
い）によりSD配列−ATGコドン間の長さの異つ
ているプラスミドpCR712又はpCR713が別個に生
成する。両プラスミド共SD配列−ATGコドン間
の塩基配列以外はpCR701と全く同一である。新
プラスミドpCR712の該塩基配列をMaxam−
Gilbert法で解析すると次の通りである。5′ AAGG GTATCGATATG 3′ SD Met 又、新プラスミドpCR713の該塩基配列を
Maxam−Gilbert法で解析すると次の通りであ
る。5′ AAGG GTATCGATG 3′ SD Met pCR701からpCR712又はpCR713を構成する模
様を第２図に示す。pCR712で形質転換した宿主
細胞E. coliC600rk−mk−の内アンピシリン耐性株
を選択する。これらの株はプラスミドpCR712を
保有し、trpプロモーターの制御下でプロキモシ
ンを産生する。同様に、pCR713を保有する形質
転換株E. coliC600rk−mk−（pCR713）もプロキモ
シンを産出する。 プラスミドpCR714 プラスミドpCR712を制限酵素claで切断し、
dGTP，dCTPの存在下、DNAポリメラーゼを
用いて斯くて切断された一本鎖構造部分を部分的
に修復、例えば、CG部位のみを修復し、突出し
た末端を有するままT4DNAリガーゼで再連結す
るとプラスミドpCR714が得られる。これら一連
の操作で、pCR712のSD−ATGコドン間の塩基
数が２減少して６塩基対となる。この部位以外は
pCR712と全く同一である。pCR714のSD配列と
ATGコドンとの間の塩基配列はMaxam−
Gilbert法で解析すると次の通りである。5′ AAGG GTCGATATG 3′ SD Met pCR712からpCR714を構成する模様を第２図に
示す。pCR714で形質転換した宿主細胞E. coli
C600rk−mk−の内アンピシリン耐性株を選択す
ると、これらの株はpCR714を保有し、trpプロモ
ーターの制御下でプロキモシンを産生する。 発現実験 プラスミドpCR711，712，713，714を保有する
大腸菌E. coliC600rk−mk−は通常の培養技術によ
つて生育させることができる。使用する培地の例
は、周知のＬ−Ｂ培地、M9培地などであり、こ
れらの培地中、細胞密度が1012細胞／に到達す
るまで培養し、培養後、菌体抽出液を調製する。
抽出液を競合的ラジオイムノアツセイ法
（binding competitive radioimmunoassay）又
は蛋白ブロツテング法により分析した結果、いず
れの場合にも、菌体中にプロキモシンと同一分子
量で免疫的にも同一の蛋白質が生成していること
が認められる。定量的な分析から、各プラスミド
保有株のプロキモシン産生能を算出したところ、
pCR712株が最高の発現率を示し（細胞当り約30
万分子のプロキモシン：蛋白ブロテイング法によ
り測定）、親プラスミドpCR701株に比べて産生能
が約25倍になつているという驚くべき事実が見い
出される。他のプラスミド含有株の発現率は
pCR712》pCR701≧pCR711＞pCR714＞pCR713
の順である。以上の結果より、pCR701系列のプ
ラスミドのプロキモシン発現効率は必ずしもSD
配列とATG開始コドンとの間の距離だけによら
ず塩基配列そのものに依存することは明白であ
る。 生成された微生物由来のプロキモシンは酸性PH
にさらすことによつて活性キモシンへと活性化す
ることができる。 本発明を以下の実施例によりさらに詳しく説明
するが、様々な変更又は修正が本発明の技術範囲
内で許されることを理解すべきである。 実施例 実施例中常に用いられるTEN緩衝液はトリス
塩酸20mM，NaCl50mM，EDTA1mMを含みPH
は7.5である。形質転換及び発現実験に用いる栄
養培地は次の組成を有する。 Ｌ−Broth／（PH7.2〜7.4） Bacto−Trypton 10g Yeast Extract 5g グルコース 1g NaCl 5g M9−Broth／ NaHPO4 6g KH2PO4 3g NaCl 5g NH4Cl 1g CaCl2 15mg MgSO4・7H2Ｏ 0.1g Bl（チアミンHCl） 0.2g casamino acid 2.5g グルコース 5g ベータインドリルアクリル酸 1.5mg （3β−indolylacrylic acid） アンピシリン 50mg 実施例１ プラスミドpCR711の組み立て プラスミドpCR701 10μｇ（32μ）をHind
（30単位、5μ），Hind緩衝液5μ，H2O53μ
から成る総量100μの反応溶液中、37℃で２
時間保温（インキユベート）することにより
Hindで切断した。 生成DNAをエタノールで沈殿させ、20μのTE
溶液に溶解した。次にHindで消化された
pCR701 4μｇ（8μ），DNAポリメラーゼ
（Krenowの断片）（1.5単位、1μTEN）、ポリメ
ラーゼ緩衝液4μ，5mMdNTP（4μTEN），
H2O23μから成る総量40μの反応溶液を30℃
で10分間保温することによりHindで切断され
た一本鎖部分を修復した。反応はフエノール処理
により停止し、フエノールをエーテル抽出により
除去し、生成DNAはエタノールで沈殿させた。
沈殿物を20μの水に溶解した。この溶解液（4μ
ｇのDNAを含む）にT4DNAリガーゼ（3.6単位、
4μ），3mMATP、リゲエーシヨン緩衝液8μ
を加え最終容量を40μとした。これを22°Cで一
夜保温した。生成物をエタノールで沈殿させ、
40μTEに溶解した。形質転換は宿主E. coli
C600γK−mK−をNorgardの方法（Norgard，et
al.Gene，３，279（1978）に従つて転換した。 コンピテントな（DNA取り込み能を有する）
細胞を調製し、これに前述のDNA溶解液を加え、
処理し、形質転換反応を完了させた後、アンピシ
リン50μｇ／mlを含有するＬ培地で生育させ、ア
ンピシリン耐性形質転換株を採取した。これらの
株E. coliC600γK−mK−（pCR711）はプラズミド
pCR711を保有する。 実施例２ プラスミドpCR712の組み立て 実施例１で得られたpCR701のHind消化物1μ
ｇ（2μ），Nuclease S1（50単位、1μ），
Nuclease S1緩衝液5μ，H2O42μから成る総
量50μの反応溶液を16℃で２時間保温した。こ
の反応で用いた（X10）Nuclease S1緩衝液の組
成は2.5M NaCl，0.5M AcONa，10mM
ZnSO4，５％グリセロールでPH4.5である。反応
をフエノール処理により停止し、フエノールをエ
ーテル抽出により除去し、生成DNAをエタノー
ルで沈殿させた。沈殿を19μH2Ｏに溶解した。
このDNA1μｇ（19μ），T4DNAリガーゼ（0.9
単位、1μ），3mM ATP3μ，50％PEG6000
（4μ）、リゲーシヨン緩衝液3μから成る総量
30μの反応液を22°Cで90分間保温した。こうし
て再連結されたDNAは実施例１と同様に、宿主
E.coliC600rK−mK−に形質転換により導入され
た。得られたアンピシリン耐性形質転換株、E.
coliC600rK−mK−（pCR712）はプラスミド
pCR712を保有する。この株は微工研に受託番号
FERM BP−502号として寄託された。 実施例３ プラスミドpCR713の組み立て 実施例１で得られたpCR701のHind消化物1μ
ｇ（2μ），Nuclease S1（50単位、1μ），
Nuclease S1緩衝液5μ、H2Ｏ 42μから成る
総量50μの反応溶液を22℃で30分間保温した。
この反応で用いた緩衝液の組成は実施例２の場合
と若干異なつている。即ち、0.3M AcONa，
0.5M NaCl，10mM ZnSO4から成りPH4.6であ
る。反応をフエノール処理により停止し、フエノ
ールをエーテル抽出により除去し、生成DNAを
エタノールで沈殿させた。このDNA3μｇ（20μ
TEN），3mM ATP（8μ），T4DNAリガーゼ
（3.6単位、4μ）、リゲーシヨン緩衝液8μから
成る総量40μの反応液を22℃で一夜保温した。
生成DNAをエタノールで沈殿させ、沈殿を40μ
に溶解した。再連結されたDNAは実施例１と
同様に、宿主E. coliC600rK−mK−に形質転換に
より導入された。得られたアンピシリン耐性形質
転換株、E. coliC600rK−mK−（pCR713）はプラ
スミドpCR713を保有する。 実施例４ プラスミドpCR714の組み立て 実施例４で得られたpCR701 2μｇ（15μ），
cla（18単位、3μ），cla緩衝液5μ，H2
O27μから成る総量50μの反応液を37℃で２時
間保温して、pCR701をclaで消化した。生成物
をエタノールで沈殿させ、41.5μH2Ｏに溶解し
た。この溶液に20mM dCTP（1.25μ），20mM
dGTP（1.25μ），DNAポリメラーゼ
（Klenow断片）（1.5単位、1μ），ポリメラーゼ
緩衝液（5μ）を加え、総量50μとして、30℃
で10分間保温した。反応をフエノール処理により
停止し、フエノールをエーテル抽出により除去
し、生成DNAをエタノールで沈殿させ、更に沈
殿生成物を28μのH2Ｏに溶解させた。この溶液
に、3mM ATP（6μ），T4DNAリガーゼ（1.8
単位、2μ），リゲーシヨン緩衝液（4μ）を加
え、最終容量40μとし22℃で一夜保温した。生
成DNAをエタノールで沈殿させ、沈殿を40μ
に溶解させた。再連結されたDNAを実施例１と
同様に、宿主E. coliC600rK−mK−に形質転換に
より導入した。得られたアニピシリン耐性形質転
換株、E. coliC600rK−mK−（pCR714）はプラス
ミドpCR714を保有する。 実施例５ 発現実験 プラスミドpCR711，pCR712，pCR713，
pCR714を保有する形質転換株をLB培地中、37℃
で一夜培養した後、培養物１mlを10mlの新鮮な
M9培地に接種し、１時間培養した。それに15μ
ｇ／mlの３−ベーターインドールアクリル酸を添
加し、３時間培養した。培養により大腸菌は4.0
×108細胞mlの密度まで生育した。培養後、遠心
分離により集菌し、これを1mM PMSF（フエニ
ルメチルスルホニルフルオライド）を含有する
PBS緩衝液（20mHリン酸ナトリウム緩衝剤中
150mMの塩化ナトリウムを含むPH7.0）３mlに懸
濁させた。この懸濁液に250mMのEDTA（60μ
）と10mg／のリゾチーム（30μ）を加え０
℃で30分間保温した。生成したスフエロプラスト
（speroplast）を音波で破壊し、これに尿素を加
えて、尿素の最終濃度を8Mとした。細胞処理溶
解物（cell lysate）を37℃で１時間保温した。こ
れを30000rmpで30分間遠心分離にかけた後、上
澄液をpBS緩衝液に透析し、透析液に競合結合ラ
ジオイムノアツセイ（binding competitive
radioimmu−noassay）を適用した。標準的な手
法は例えば、西森らGene，19，337（1982）に記
載されている。 前記の音波処理した無細胞抽出液を4M尿素で
処理し、遠心分離した後、SDSゲル電気泳動にか
けた。移動した蛋白をニトロセルローゼ上に転写
し、プロキモシン抗体と結合するバンドをオート
ラジオグラフで検出した（蛋白ブロテイング法）。
いづれのプラスミドを保有する大腸菌について
も、標品プロキモシンに対応するバンドが観察さ
れた。この帯の密度と標品のそれを比較すること
により定量的にプロキモシンの量が算出された。 プロキモシン産生能はpCR712》pCR701≧
pCR711＞pCR714＞pCR713の順で基準のpCR701
と比べるとpCR712は実に約25倍の発現効果を示
した。
型組換えプラスミドに関する。より詳しくは、仔
牛プロキモシンCDNAの全配列を有し、E. coli
trpプロモーターの制御下、大腸菌宿主細胞内で
プロキモシンCDNA全長を効率よく発現可能な
新規の発現型プラスミドに関する。 プロキモシンは仔牛第４胃から得られチーズ製
造の際に牛乳を凝固させるのに用いられる一種の
プロテアーゼであるキモシンの前駆体蛋白質であ
る。プロキモシンは分子量４万、アミノ酸残基数
365よりなり、そのＮ末端42個のアミノ酸よりな
るペプチドが自己消化により切断されてキモシン
を生成する。最近では微生物起源の凝乳酵素が見
い出されて、キモシンに代替しつつあるが、チー
ズ工業における仔牛キモシンに対する潜在的需要
は依然として大きい。従つて、仔牛キモシンを組
換えDNA技術を用いて微生物に生産させること
は遺伝子工学の実用面での目標のひとつと考えら
れている。 本発明の目的は宿主細胞中、E. coli trpプロモ
ーターの制御下、高い発現率でプロキモシン
CDNA全長の発現を可能にさせる新規の発現プ
ラスミドを得ることである。 本発明の他の目的は前記の発現プラスミドで宿
主を形質転換し、形質転換株を培養することによ
りプロキモシンを生産する方法を提供することで
ある。 本発明の別の目的は前記の発現プラスミドを構
成する方法を提供することである。 組換えDNA操作を用いて、プロキモシン
CDNAを大腸菌宿主細胞中で形質発現させ、プ
ロキモシンを生産させる方法は既に公知である。
例えば、西森ら、Gene，19，337（1982）、特開昭
58−32896号（別府輝彦）、特開昭57−141287号
（コラボラテイブ・リサーチ）はE. coli lacオペロ
ンプロモーター制御下、プロキモシンが産生され
ることを開示している。一方、E. coli trpプロモ
ーター制御下でも同様に、プロキモシンが産生さ
れることが、特開昭58−9687号（セルテツク・リ
ミテツド）、清水ら、農芸化学会講演要旨集2A−
19（1982）、特願昭58−38439号（別府輝彦）に記
載されている。特に、上記清水らの文献にはプロ
キモシンの全構造遺伝子がクローン化されて、E.
colitrpプロモーターの制御下、大腸菌宿主細胞
内で発現するプラスミドpCR701が開示されてい
る。このプラスミドは全長約5.3Kbでプロキモシ
ンのCDNAの全長がtrpプロモーターの下流trpＬ
遺伝子のリポゾーム結合位に挿入されている。第
１図にpCR701の制限酵素地図を示す。SD配列と
ATG開始コドンの間には次の14塩基が存在する。 5′ −AAGGGTATCGATAAGCTTATGGCT−3′ SD Met Alo プロキモシン このプラスミドで形質転換した大腸菌株E. coli
c600rK−mk−CPCR701）は微工研に寄託されて
いる（受託番号FERMBP264）。しかしながら前
述の西森らの文献中に記載されているように、
pCR701の発現率は他の公知のプラスミド
pCR501，pCR601と比較して非常に低い。プロキ
モシン蛋白の生産量は競合結合ラジオイムノアツ
セイ法（Competitivebinding
radioimmunoassay）の測定によると宿主細胞あ
たり約700分子であり、免疫ブロツテング法の測
定によると細胞あたり約12000分子であつた。 本発明はE. colitrpプロモーター、オペレータ
ー系とプロキモシンCDNA全配列から成り、大
腸菌宿主細胞内でtrpプロモーター制御下、プロ
キモシンCDNA全長を発現可能な発現型組換え
プラスミドであつて、該CDNAのＮ末端にATG
開始コドンが接続されそして該プロモーター領域
内のSD配列とATG開始コドンとの間の塩基対が
高発現率を与えるように構成されていることを特
徴とするプラスミドを提供する。 又、本発明はプラスミドpCR701のSD配列と
ATG開始コドンとの間を制限酵素によつて切断
し、再連結することにより該SD配列とATG開始
コドンとの間の塩基対のたとえば種類及び／又は
数の如き構成を変化させ、より発現率の高い新規
のプラスミドを得る方法を提供する。前述の方法
に於いて、制限酵素による切断後、一本鎖構造部
分を修復して切断末端を再連結し、SD配列と
ATG開始コドンとの間の距離をのばすことも、
逆に一本鎖構造部分を除去して切断末端を再連結
し、SD配列とATG開始コドンとの間の距離を縮
めることも可能であるが、好ましくは後者の手法
（距離を縮める）が用いられる。本発明は、かく
して得られた発現効率の高い発現プラスミドを宿
主細胞に形質転換法により導入し、形質転換細胞
を培養することからなるプロキモシンの生産方法
をも提供する。更に、本発明は形質転換された微
生物そしてそれから産生されたプロキモシンを包
含する。 本発明に於いて、用いられる宿主微生物は、本
発明の発現プラスミドを受容し、宿主細胞が増殖
して、プロキモシンを産生するものなら、特定の
菌株に限定されないが、実用的な理由から大腸菌
C600由来株の利用が好ましい。特に好ましくは、
大腸菌E. coliC600rk−mk−株が用いられる。本発
明の方法で生産されるプロキモシンは全てＮ末端
にメチオニルが付着したメチオニルプロキモシン
であるが明細書中単にプロキモシンと称する。 以下に好適な実施態様を例にして本発明をより
詳しく説明する。 プラスミドpCR711 プラスミドpCR701をまず、制限酵素Hindで
切断する。一本鎖構造部分を有する両末端を
DNAポリメラーゼを用いて修復する。修復され
た平滑末端をT4DNAリガーゼで連結する。これ
らの操作で、SD配列−ATG開始コドン間の距離
は４塩基対増加して、18塩基対となる。得られた
新プラスミドpCR711はSD−ATG間の塩基配列
以外pCR701と全く同一である。SD配列とATG
開始コドンとの間のDNA配列はMaxam−
Gilbert法で解析すると以下の通りである。 5′ −AAGGGTATCGATAAGCTAGCTTATG−
3′ SD Met pCR701からpCR711を構成する模様を第２図に
示す。pCR711で形質転換した宿主細胞E. coli
C600rk−mk−の内、アンピシリン耐性株を選択
すると、これらの株はプラスミドpCR711を保有
し、trpプロモーターの制御下でプロキモシンを
産生する。 プラスミドpCR712及びpCR713 プラスミドpCR701を前記と同様にHindで切
断する。得られた一本鎖構造部位を有する末端を
ヌクレアーゼ（Nuclease）S1で除去する。続い
て平滑末端をT4DNAリガーゼで再連結する。こ
の際切断条件の差違（主に、緩衝液の組成の違
い）によりSD配列−ATGコドン間の長さの異つ
ているプラスミドpCR712又はpCR713が別個に生
成する。両プラスミド共SD配列−ATGコドン間
の塩基配列以外はpCR701と全く同一である。新
プラスミドpCR712の該塩基配列をMaxam−
Gilbert法で解析すると次の通りである。5′ AAGG GTATCGATATG 3′ SD Met 又、新プラスミドpCR713の該塩基配列を
Maxam−Gilbert法で解析すると次の通りであ
る。5′ AAGG GTATCGATG 3′ SD Met pCR701からpCR712又はpCR713を構成する模
様を第２図に示す。pCR712で形質転換した宿主
細胞E. coliC600rk−mk−の内アンピシリン耐性株
を選択する。これらの株はプラスミドpCR712を
保有し、trpプロモーターの制御下でプロキモシ
ンを産生する。同様に、pCR713を保有する形質
転換株E. coliC600rk−mk−（pCR713）もプロキモ
シンを産出する。 プラスミドpCR714 プラスミドpCR712を制限酵素claで切断し、
dGTP，dCTPの存在下、DNAポリメラーゼを
用いて斯くて切断された一本鎖構造部分を部分的
に修復、例えば、CG部位のみを修復し、突出し
た末端を有するままT4DNAリガーゼで再連結す
るとプラスミドpCR714が得られる。これら一連
の操作で、pCR712のSD−ATGコドン間の塩基
数が２減少して６塩基対となる。この部位以外は
pCR712と全く同一である。pCR714のSD配列と
ATGコドンとの間の塩基配列はMaxam−
Gilbert法で解析すると次の通りである。5′ AAGG GTCGATATG 3′ SD Met pCR712からpCR714を構成する模様を第２図に
示す。pCR714で形質転換した宿主細胞E. coli
C600rk−mk−の内アンピシリン耐性株を選択す
ると、これらの株はpCR714を保有し、trpプロモ
ーターの制御下でプロキモシンを産生する。 発現実験 プラスミドpCR711，712，713，714を保有する
大腸菌E. coliC600rk−mk−は通常の培養技術によ
つて生育させることができる。使用する培地の例
は、周知のＬ−Ｂ培地、M9培地などであり、こ
れらの培地中、細胞密度が1012細胞／に到達す
るまで培養し、培養後、菌体抽出液を調製する。
抽出液を競合的ラジオイムノアツセイ法
（binding competitive radioimmunoassay）又
は蛋白ブロツテング法により分析した結果、いず
れの場合にも、菌体中にプロキモシンと同一分子
量で免疫的にも同一の蛋白質が生成していること
が認められる。定量的な分析から、各プラスミド
保有株のプロキモシン産生能を算出したところ、
pCR712株が最高の発現率を示し（細胞当り約30
万分子のプロキモシン：蛋白ブロテイング法によ
り測定）、親プラスミドpCR701株に比べて産生能
が約25倍になつているという驚くべき事実が見い
出される。他のプラスミド含有株の発現率は
pCR712》pCR701≧pCR711＞pCR714＞pCR713
の順である。以上の結果より、pCR701系列のプ
ラスミドのプロキモシン発現効率は必ずしもSD
配列とATG開始コドンとの間の距離だけによら
ず塩基配列そのものに依存することは明白であ
る。 生成された微生物由来のプロキモシンは酸性PH
にさらすことによつて活性キモシンへと活性化す
ることができる。 本発明を以下の実施例によりさらに詳しく説明
するが、様々な変更又は修正が本発明の技術範囲
内で許されることを理解すべきである。 実施例 実施例中常に用いられるTEN緩衝液はトリス
塩酸20mM，NaCl50mM，EDTA1mMを含みPH
は7.5である。形質転換及び発現実験に用いる栄
養培地は次の組成を有する。 Ｌ−Broth／（PH7.2〜7.4） Bacto−Trypton 10g Yeast Extract 5g グルコース 1g NaCl 5g M9−Broth／ NaHPO4 6g KH2PO4 3g NaCl 5g NH4Cl 1g CaCl2 15mg MgSO4・7H2Ｏ 0.1g Bl（チアミンHCl） 0.2g casamino acid 2.5g グルコース 5g ベータインドリルアクリル酸 1.5mg （3β−indolylacrylic acid） アンピシリン 50mg 実施例１ プラスミドpCR711の組み立て プラスミドpCR701 10μｇ（32μ）をHind
（30単位、5μ），Hind緩衝液5μ，H2O53μ
から成る総量100μの反応溶液中、37℃で２
時間保温（インキユベート）することにより
Hindで切断した。 生成DNAをエタノールで沈殿させ、20μのTE
溶液に溶解した。次にHindで消化された
pCR701 4μｇ（8μ），DNAポリメラーゼ
（Krenowの断片）（1.5単位、1μTEN）、ポリメ
ラーゼ緩衝液4μ，5mMdNTP（4μTEN），
H2O23μから成る総量40μの反応溶液を30℃
で10分間保温することによりHindで切断され
た一本鎖部分を修復した。反応はフエノール処理
により停止し、フエノールをエーテル抽出により
除去し、生成DNAはエタノールで沈殿させた。
沈殿物を20μの水に溶解した。この溶解液（4μ
ｇのDNAを含む）にT4DNAリガーゼ（3.6単位、
4μ），3mMATP、リゲエーシヨン緩衝液8μ
を加え最終容量を40μとした。これを22°Cで一
夜保温した。生成物をエタノールで沈殿させ、
40μTEに溶解した。形質転換は宿主E. coli
C600γK−mK−をNorgardの方法（Norgard，et
al.Gene，３，279（1978）に従つて転換した。 コンピテントな（DNA取り込み能を有する）
細胞を調製し、これに前述のDNA溶解液を加え、
処理し、形質転換反応を完了させた後、アンピシ
リン50μｇ／mlを含有するＬ培地で生育させ、ア
ンピシリン耐性形質転換株を採取した。これらの
株E. coliC600γK−mK−（pCR711）はプラズミド
pCR711を保有する。 実施例２ プラスミドpCR712の組み立て 実施例１で得られたpCR701のHind消化物1μ
ｇ（2μ），Nuclease S1（50単位、1μ），
Nuclease S1緩衝液5μ，H2O42μから成る総
量50μの反応溶液を16℃で２時間保温した。こ
の反応で用いた（X10）Nuclease S1緩衝液の組
成は2.5M NaCl，0.5M AcONa，10mM
ZnSO4，５％グリセロールでPH4.5である。反応
をフエノール処理により停止し、フエノールをエ
ーテル抽出により除去し、生成DNAをエタノー
ルで沈殿させた。沈殿を19μH2Ｏに溶解した。
このDNA1μｇ（19μ），T4DNAリガーゼ（0.9
単位、1μ），3mM ATP3μ，50％PEG6000
（4μ）、リゲーシヨン緩衝液3μから成る総量
30μの反応液を22°Cで90分間保温した。こうし
て再連結されたDNAは実施例１と同様に、宿主
E.coliC600rK−mK−に形質転換により導入され
た。得られたアンピシリン耐性形質転換株、E.
coliC600rK−mK−（pCR712）はプラスミド
pCR712を保有する。この株は微工研に受託番号
FERM BP−502号として寄託された。 実施例３ プラスミドpCR713の組み立て 実施例１で得られたpCR701のHind消化物1μ
ｇ（2μ），Nuclease S1（50単位、1μ），
Nuclease S1緩衝液5μ、H2Ｏ 42μから成る
総量50μの反応溶液を22℃で30分間保温した。
この反応で用いた緩衝液の組成は実施例２の場合
と若干異なつている。即ち、0.3M AcONa，
0.5M NaCl，10mM ZnSO4から成りPH4.6であ
る。反応をフエノール処理により停止し、フエノ
ールをエーテル抽出により除去し、生成DNAを
エタノールで沈殿させた。このDNA3μｇ（20μ
TEN），3mM ATP（8μ），T4DNAリガーゼ
（3.6単位、4μ）、リゲーシヨン緩衝液8μから
成る総量40μの反応液を22℃で一夜保温した。
生成DNAをエタノールで沈殿させ、沈殿を40μ
に溶解した。再連結されたDNAは実施例１と
同様に、宿主E. coliC600rK−mK−に形質転換に
より導入された。得られたアンピシリン耐性形質
転換株、E. coliC600rK−mK−（pCR713）はプラ
スミドpCR713を保有する。 実施例４ プラスミドpCR714の組み立て 実施例４で得られたpCR701 2μｇ（15μ），
cla（18単位、3μ），cla緩衝液5μ，H2
O27μから成る総量50μの反応液を37℃で２時
間保温して、pCR701をclaで消化した。生成物
をエタノールで沈殿させ、41.5μH2Ｏに溶解し
た。この溶液に20mM dCTP（1.25μ），20mM
dGTP（1.25μ），DNAポリメラーゼ
（Klenow断片）（1.5単位、1μ），ポリメラーゼ
緩衝液（5μ）を加え、総量50μとして、30℃
で10分間保温した。反応をフエノール処理により
停止し、フエノールをエーテル抽出により除去
し、生成DNAをエタノールで沈殿させ、更に沈
殿生成物を28μのH2Ｏに溶解させた。この溶液
に、3mM ATP（6μ），T4DNAリガーゼ（1.8
単位、2μ），リゲーシヨン緩衝液（4μ）を加
え、最終容量40μとし22℃で一夜保温した。生
成DNAをエタノールで沈殿させ、沈殿を40μ
に溶解させた。再連結されたDNAを実施例１と
同様に、宿主E. coliC600rK−mK−に形質転換に
より導入した。得られたアニピシリン耐性形質転
換株、E. coliC600rK−mK−（pCR714）はプラス
ミドpCR714を保有する。 実施例５ 発現実験 プラスミドpCR711，pCR712，pCR713，
pCR714を保有する形質転換株をLB培地中、37℃
で一夜培養した後、培養物１mlを10mlの新鮮な
M9培地に接種し、１時間培養した。それに15μ
ｇ／mlの３−ベーターインドールアクリル酸を添
加し、３時間培養した。培養により大腸菌は4.0
×108細胞mlの密度まで生育した。培養後、遠心
分離により集菌し、これを1mM PMSF（フエニ
ルメチルスルホニルフルオライド）を含有する
PBS緩衝液（20mHリン酸ナトリウム緩衝剤中
150mMの塩化ナトリウムを含むPH7.0）３mlに懸
濁させた。この懸濁液に250mMのEDTA（60μ
）と10mg／のリゾチーム（30μ）を加え０
℃で30分間保温した。生成したスフエロプラスト
（speroplast）を音波で破壊し、これに尿素を加
えて、尿素の最終濃度を8Mとした。細胞処理溶
解物（cell lysate）を37℃で１時間保温した。こ
れを30000rmpで30分間遠心分離にかけた後、上
澄液をpBS緩衝液に透析し、透析液に競合結合ラ
ジオイムノアツセイ（binding competitive
radioimmu−noassay）を適用した。標準的な手
法は例えば、西森らGene，19，337（1982）に記
載されている。 前記の音波処理した無細胞抽出液を4M尿素で
処理し、遠心分離した後、SDSゲル電気泳動にか
けた。移動した蛋白をニトロセルローゼ上に転写
し、プロキモシン抗体と結合するバンドをオート
ラジオグラフで検出した（蛋白ブロテイング法）。
いづれのプラスミドを保有する大腸菌について
も、標品プロキモシンに対応するバンドが観察さ
れた。この帯の密度と標品のそれを比較すること
により定量的にプロキモシンの量が算出された。 プロキモシン産生能はpCR712》pCR701≧
pCR711＞pCR714＞pCR713の順で基準のpCR701
と比べるとpCR712は実に約25倍の発現効果を示
した。
第１図はプラスミドpCR701の制限酵素地図で
ある。 第２図はプラスミドpCR701，pCR711，
pCR712，pCR713，pCR714のSD配列とATG開
始コドンとの間の塩基配列とpCR701から他のプ
ラスミドを構成するフローチヤートを示す。
ある。 第２図はプラスミドpCR701，pCR711，
pCR712，pCR713，pCR714のSD配列とATG開
始コドンとの間の塩基配列とpCR701から他のプ
ラスミドを構成するフローチヤートを示す。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ プロキモシンのcDNA全配列と、E. coli trpプ
ロモーターの制御下にプロキモシンのcDNA全長
を発現可能なE. coli trpプロモーターオペレータ
ー系から成り、ATG開始コドンが該cDNAのＮ
−末端に結合しており、そして該プロモーター領
域内のSD配列とATG開始コドンとの間の塩基対
が GTATCGAT CATAGCTA から成ることを特徴とする発現型組換えプラスミ
ド。 ２ 微工研に受託番号FERM BP−502として寄
託されている大腸菌（E. coli）中に見い出される
プラスミドpCR712である特許請求の範囲第１項
記載のプラスミド。 ３ 次の工程： ａ プラスミドpCR701をHind で消化し； ｂ 切断された一本鎖構造部分をヌクレアーゼ
S1で分解することにより除去し； ｃ 切断末端をT4DNAリガーゼを用いて連結
し；そして ｄ E. coli trpプロモーターオペレーター領域内
のSD配列とATG開始コドンとの間の塩基対 GTATCGAT CATAGCTA によつて特徴づけられるプラスミドを選択するこ
と より成ることを特徴とするプラスミドpCR712の
製造方法。 ４ プロキモシンのcDNA全配列と、E. coli trpプ
ロモーターの制御下にプロキモシンのcDNA全長
を発現可能なE. coli trpプロモーターオペレータ
ー系から成り、ATG開始コドンが該cDNAのＮ
−末端に結合しており、そして該プロモーター領
域内のSD配列とATG開始コドンとの間の塩基対
が GTATCGAT CATAGCTA から成る発現型組換えプラスミドpCR712で形質
転換された大腸菌（E. coli）菌株。 ５ 大腸菌E. coliC600rK−mK -（pCR712）（微工
研受託番号FERM BP−502）である特許請求の
範囲第４項記載の菌株。
Priority Applications (14)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59044901A JPS60188077A (ja) | 1984-03-09 | 1984-03-09 | 仔牛プロキモシンｃＤΝＡの全配列を有する新規な発現プラスミド |
| US06/706,979 US4757020A (en) | 1984-03-09 | 1985-03-01 | Novel expression plasmids containing the full cDNA sequence of calf prochymosin |
| CA000475737A CA1288072C (en) | 1984-03-09 | 1985-03-05 | Expression plasmids containing the full cdna sequence of calf prochymosin |
| IL74537A IL74537A (en) | 1984-03-09 | 1985-03-07 | Expression plasmids containing the full cdna sequence of calf prochymosin |
| AU39640/85A AU594012B2 (en) | 1984-03-09 | 1985-03-07 | Novel expression plasmids containing the full cDNA sequence of calf prochymosin |
| DE8585102658T DE3585695D1 (de) | 1984-03-09 | 1985-03-08 | Expressionsplasmide die vollstaendige cdna-sequenz von kalbsprochymosin enthaltend. |
| ES541121A ES8705520A1 (es) | 1984-03-09 | 1985-03-08 | Un procedimiento para preparar el plasmido plr 711 |
| AT85102658T ATE74161T1 (de) | 1984-03-09 | 1985-03-08 | Expressionsplasmide die vollstaendige cdna-sequenz von kalbsprochymosin enthaltend. |
| IE60685A IE58820B1 (en) | 1984-03-09 | 1985-03-08 | Novel expression plasmids containing the full dna sequence of calf prochymosin |
| EP85102658A EP0154350B1 (en) | 1984-03-09 | 1985-03-08 | Novel expression plasmids containing the full cdna sequence of calf prochymosin |
| DK107885A DK107885A (da) | 1984-03-09 | 1985-03-08 | Ekspressionsplasmider, der indeholder hele cdna-sekvensen af kalve-prochymosin, og fremgangsmaader til fremstilling heraf |
| ES550867A ES8704205A1 (es) | 1984-03-09 | 1986-01-14 | Un procedimiento para preparar el plasmido pcr714 |
| ES550866A ES8802183A1 (es) | 1984-03-09 | 1986-01-14 | Un procedimiento para preparar el plasmido pcr712 o pcr713 |
| ES550868A ES8802181A1 (es) | 1984-03-09 | 1986-01-14 | Un procedimiento para la produccion de proquimosina |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59044901A JPS60188077A (ja) | 1984-03-09 | 1984-03-09 | 仔牛プロキモシンｃＤΝＡの全配列を有する新規な発現プラスミド |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP30063292A Division JPH0673455B2 (ja) | 1992-10-14 | 1992-10-14 | プロキモシンの製造方法 |
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|---|---|
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| JPH0515432B2 true JPH0515432B2 (ja) | 1993-03-01 |
Family
ID=12704373
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59044901A Granted JPS60188077A (ja) | 1984-03-09 | 1984-03-09 | 仔牛プロキモシンｃＤΝＡの全配列を有する新規な発現プラスミド |
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| Country | Link |
|---|---|
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| JP (1) | JPS60188077A (ja) |
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| IT1221765B (it) * | 1986-05-07 | 1990-07-12 | Eniricerche Spa | Sequenza nucleotidica capace di indurre alti livelli di traduzione di un gene eterologo in bacillus subtilis ed escherichia coli |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| IE53517B1 (en) * | 1981-06-17 | 1988-12-07 | Celltech Ltd | Process for the production of a polypeptide |
| JPS589687A (ja) * | 1981-06-17 | 1983-01-20 | セルテク リミテッド | ポリペプチドの生産方法 |
| JPS58110600A (ja) * | 1981-12-25 | 1983-07-01 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | ヒトβ型インタ−フエロン遺伝子を含む組みかえ体プラスミド |
| JPS59166086A (ja) * | 1983-03-09 | 1984-09-19 | Teruhiko Beppu | 新規な発現型プラスミドとそれらを用いて仔牛プロキモシン遺伝子を大腸菌内で発現させる方法 |
-
1984
- 1984-03-09 JP JP59044901A patent/JPS60188077A/ja active Granted
-
1985
- 1985-03-01 US US06/706,979 patent/US4757020A/en not_active Expired - Lifetime
- 1985-03-05 CA CA000475737A patent/CA1288072C/en not_active Expired - Lifetime
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