【発明の詳細な説明】[Detailed description of the invention]
本発明はリパーゼ反応物の製造方法、更に詳し
くは超臨界状態においてリパーゼ反応せしめるこ
とを特徴とするリパーゼ反応物の製造方法に関す
る。
本発明においては、超臨界状態の溶媒（「超臨
界ガス」と単に略す場合もある）を用いるがこれ
は臨界温度Tcおよび臨界圧力Pcをこえた状態に
ある流体のことをいう。
近年超臨界ガスの物理特性を応用した抽出分離
技術が種々開発されている。超臨界ガス抽出は超
臨界状態の流体が多くの物質に対してすぐれた溶
解性を示し、温度および圧力の変化によつて溶解
性が変化する性質を利用したものであり、ホツ
プ、スパイス、ニコチン、カフエインなどの抽出
操作に応用されている。
本発明者らは、リパーゼ反応について種々検討
していたが、超臨界状態（例えば二酸化炭素にお
いては31.1℃以上、73気圧以上）という生体にと
つては未経験の過酷な条件においてもリパーゼ反
応は進行し、かえつて、反応後の分離操作などが
容易であること、従来不均一系で行われていた反
応が均一相で進行すること、などのメリツトがあ
ることを発見し本発明を完成した。
即ち、本発明は(a)リパーゼ、(b)油脂及び脂肪酸
を１種又は２種以上組み合せたもの、および(c)超
臨界状態において溶媒となりうる物質とを含有す
る混合物を、超臨界状態にせしめ、リパーゼ反応
が進行する温度に保持することを特徴とするリパ
ーゼ反応物の製造方法である。
本発明で用いるリパーゼは、生体細胞が生産す
るタンパク質性高分子有機触媒であればよく、特
に本発明では超臨界状態の溶媒中でもその構造・
性質を保持しているような構造的に安定なリパー
ゼが有用である。
上記リパーゼに対応してリパーゼ反応される物
質、一般には基質として知られている物質を用い
る。以下、リパーゼとしてリパーゼ、リパーゼ反
応される物質として油脂または、油脂および脂肪
酸の一種または二種以上を用いる場合を記載する
が、本発明はこれに限定されるものではない。
まず、リパーゼについては、リゾプス・デレマ
ー、リゾプス・アルヒザス、アスペルギルス・ニ
ガー、キヤンデイダ・シリンドラツセ、ジヨオー
トリカム・キヤンデイダムなどを用いることがで
きる。油脂としては、パーム油、大豆油、菜種
油、オリーブ油、ヤシ油、コーン油、綿実油、サ
フラワー油などの植物油、牛脂、豚脂、魚脂など
の動物油脂、トリラウリン・トリステアリン・ト
リオレインなどの合成油脂をいい、更に脂肪酸と
しては炭素数８ないし20の直鎖のもので、パルミ
チン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール
酸、リノレイン酸などをいい、これらの一種また
は二種以上を用いることができる。
リパーゼの使用量は、市販酵素剤を用いる場合
には原料の油脂または脂肪酸に対して0.025ない
し５重量％（油脂100ｇに対し５×102ないし５×
105unitの脂質分解性を有する酵素量）を用いる。
更にこのリパーゼによる油脂のエステル交換反
応を不活性有機溶媒および／または担体の共存下
で行うことにより反応を促進することができる。
不活性有機溶媒としては石油ベンジン、ｎ−ヘキ
サン、石油エーテルなど、担体としてはセライ
ト、活性炭、アルミナ、ケイ酸、セルロースなど
常態で使用されているものを用いることができ
る。
酵素、および酵素反応される物質に加えて超臨
界状態において溶媒となりうる物質を混合する。
具体的にはエタン・エチレン・プロパン・プロピ
レン・酸化窒素などがあげられるが、二酸化炭素
が無害の不活性ガスであること、臨界点が室温近
傍であり酵素反応が進行する温度に保持するのに
好適であることから最も扱いやすい。
このような混合物を超臨界状態にせしめ、酵素
反応が進行する温度に保持する。具体的には10℃
ないし50℃の範囲が好ましい。二酸化炭素を用い
た場合、臨界温度Tc31.1℃、臨界圧力Pc73気圧で
あり特に好ましいが、水を用いた反応系には二酸
化炭素が溶解してしまうので、PHも酵素反応に適
した値となるように調整する必要がある。
反応物は該反応系の圧力および／または温度を
上昇および／または低下させることにより回収す
ることができる。この回収プロセスは一般の超臨
界ガスの抽出操作を応用することができ、減圧に
よる方法、温度上昇によつて分離する方法、分離
槽中に目的成分のみを吸着する吸着剤を入れて分
離する方法などによつて行なうことができる。
本発明のリパーゼ反応は超臨界状態で行なうの
でリパーゼを固定化しておいたほうが、後の分離
工程などにおいて取扱い易い。酵素の固定化用担
体としてはセルロースなどの多糖類、多孔質ガラ
ス、イオン交換樹脂などの担体を用いることがで
き、これに酵素を物理的吸着、イオン結合、ある
いは共有結合させることによつて固定化させるこ
とができる。担体の多くは粒状であるが、膜状、
板状、管状あるいは繊維状にすることもできる。
また、酵素を２官能基を有する試薬と反応させて
橋かけする方法、酵素をゲルの格子の中に包み込
むかあるいは選択透過性のポリマーの皮膜で被覆
する方法などのうち超臨界状態の溶媒中で機能す
る方法によつて固定化させてもよい。酵素反応装
置としてはバツチ法による方法でもよいが、固定
化リパーゼカラムを用いたり、限外過膜を用い
て酵素を循環使用したりして連続的に反応させる
ことも可能である。
次に本発明方法を図面を用いて説明する。第１
図に示したような温度調節が可能な反応容器１に
原料をフイードする。原料はマグネチツクスター
ラー２によつて撹拌することができる。二酸化炭
素ボンベ３より供給される二酸化炭素ガスは、液
クロポンプ４により昇圧しながら、二次圧力調節
弁５、ストツプ弁６、微量調節弁７、安全弁８、
ストツプ弁６′，６″，６などにより圧力制御さ
れて反応容器１に供給される。一定時間超臨界状
態でリパーゼ反応させた後、反応容器を冷却し二
酸化炭素を反応物と共にドライアイス化させ、更
に弁を開放した後ドライアイスを室温で昇華させ
ることにより反応物を回収する。反応物はヘキサ
ンなどで抽出することにより脂質を分離すること
ができる。二酸化炭素は、並列に連結され酵素反
応用原料をフイードした第二の反応容器に適当な
再昇圧装置を介して供給することをできる。
なお、固定化酵素を用いる場合の反応器・分離
器のシステムは第２図のようにすることもでき
る。この場合は、連続反応によつて生成する物質
は、超臨界流体の特性を生かして圧力および／ま
たは温度の上昇および／または低下によつて分離
器１および分離器２２において分離することが可
能である。即ち反応容器１内に固定化酵素カラム
１０を、二酸化炭素供給ラインに基質注入口１１
を、更に一定期間連続反応後洗浄する為のライン
１２及び弁（三方弁）１３を設ける。酵素反応物
はラインフイルター１４、六方弁１５，１５′、
クイツクコネクター１６，１６′を通過し、分離
器１７，１７′内で二酸化炭素と分離される。圧
力の調節は六方弁１５，１５′、一次圧力調節弁
５′、圧力計９″，９流量計１８、三方弁１３′
などにより適宜調節される。
従来法は、反応が常温常圧で行なつていたので
反応系は流動性に富んだ均一な液状になる場合は
少なく、反応性が劣るものであつたが、本発明の
超臨界状態において酵素反応を行なうことにより
反応系を均一系とすることが可能となる。また、
超臨界ガスは液体溶剤より低粘度で高い拡散係数
をもつため、固体中にも浸透しやすく、反応が平
衡に達する時間が短かい。更に超臨界ガスと反応
物との分離が容易であり、分別工程が簡単であ
る。酵素反応によつて得られた不揮発性成分や熱
に対して敏感な反応物も常温に近い温度で処理で
きるなどのメリツトがある。更に、超臨界状態と
いう生体にとつては過酷な条件においても酵素の
活性作用は衰えず酵素反応が進行することを見い
出したものである。
実施例 １
実験方法
内容積40mlの撹拌可能な液クロカラム充填器を
反応容器１，１′とし、２個並列につないで使用
した。第１図に実験装置の概略図を示す。この反
応容器中にトリオレイン（半井化学製）0.2ｇ、
Rhizopus delemar起原のリパーゼ（生化学工業
製、コード番号100890）0.1ｇまたは0.2ｇ、
0.3MTES緩衝液（和光純薬製、PH6.8）0.2ml、セ
ライト（和光純薬製）１ｇを入れた。反応容器中
に液状の二酸化炭素を液クロポンプ（日本分光(株)
TRIROTAR）４を用いて昇圧しながら送り、圧
力100気圧に達したら撹拌を開始し、32℃にて表
１に示す一定時間反応を行なわせた。反応中は連
続してポンプを働かせ、二次圧力調節弁５と安全
弁８とを使用し反応容器内の圧力を一定に保つ
た。
反応終了後、容器をアセトン・ドライアイスで
冷却し、反応物をドライアイス中に回収したが、
ドライアイス化は圧力計９で確認した。ドライア
イスを室温で昇華させたのち、残渣をヘキサンで
抽出し、脂質を分離した。
分析方法
ヘキサン中に分離された反応生成物を、７％含
水フロリジル（半井化学、60〜80メツシユ、30
ｇ）のカラムに加え、容積化20：80のジエチルエ
ーテル・ヘキサンの混合溶媒で展開し、その40〜
80mlの画分を集め、減圧濃縮した。濃縮物の少量
をTLCプレート（シリカゲル−60、No.5747、
Merck）上に打ち、容積比70：30：１のヘキサ
ン・エチルエーテル・酢酸の混合溶媒で展開し、
モノグリセリドおよびジグリセリドが含まれてい
ないことを確認した。
上記濃縮物を乾固後、BF3・メタノール法（日
本油脂基準分析法２、４、20、２−77）で脂肪酸
メチルエステルを調製し、ガスクロマトグラフイ
ーによつて定量分析を行つた。ガスクロマトグラ
フイーの分析は、20％DEGS Diasolid Ｌ、80〜
100メツシユ（ガスクロ工業）を充填したカラム
（内径３mm、長さ２ｍ）のカラムを用い、注入口、
検出器（FID）およびカラムの各温度をそれぞれ
200℃、210℃および190℃に保つて行つた。ガス
クロマトグラフイーの使用機種は日立663・30で
あつた。
オレイン酸メチルに対するステアリン酸メチル
の割合を計算した。結果を表１に示す。
The present invention relates to a method for producing a lipase reactant, and more particularly to a method for producing a lipase reactant characterized by carrying out a lipase reaction in a supercritical state. In the present invention, a supercritical solvent (sometimes simply abbreviated as "supercritical gas") is used, which refers to a fluid that exceeds a critical temperature T c and a critical pressure P c . In recent years, various extraction and separation techniques that apply the physical properties of supercritical gases have been developed. Supercritical gas extraction takes advantage of the fact that supercritical fluid exhibits excellent solubility for many substances, and the solubility changes with changes in temperature and pressure, such as hops, spices, and nicotine. It is applied to the extraction operation of caffeine, etc. The present inventors have conducted various studies on the lipase reaction, and found that the lipase reaction proceeds even under harsh conditions that are unprecedented for living organisms, such as supercritical conditions (for example, 31.1°C or higher and 73 atmospheres or higher for carbon dioxide). However, the present invention was completed based on the discovery that there are other advantages, such as ease of separation after the reaction, and the fact that the reaction, which was conventionally carried out in a heterogeneous system, proceeds in a homogeneous phase. That is, the present invention brings a mixture containing (a) lipase, (b) one type or a combination of two or more of oils and fats and fatty acids, and (c) a substance that can serve as a solvent in a supercritical state to a supercritical state. This is a method for producing a lipase reaction product, which is characterized by maintaining the temperature at a temperature at which the lipase reaction proceeds. The lipase used in the present invention may be any proteinaceous polymer organic catalyst produced by living cells.
Structurally stable lipases that retain their properties are useful. A substance that is reacted with the lipase, generally known as a substrate, is used in correspondence with the above-mentioned lipase. Hereinafter, a case will be described in which a lipase is used as a lipase, and a fat or oil, or one or more kinds of fats and oils and fatty acids is used as a substance to be reacted with the lipase, but the present invention is not limited thereto. First, regarding the lipase, Rhizopus deremer, Rhizopus alhizas, Aspergillus niger, Candida cylindrace, Diyoautrichum candidaum, etc. can be used. Examples of oils and fats include vegetable oils such as palm oil, soybean oil, rapeseed oil, olive oil, coconut oil, corn oil, cottonseed oil, and safflower oil, animal fats such as beef tallow, lard, and fish fat, and trilaurin, tristearin, and triolein. It refers to synthetic oils and fats, and the fatty acids are straight chain fatty acids with 8 to 20 carbon atoms, such as palmitic acid, stearic acid, oleic acid, linoleic acid, and linoleic acid, and one or more of these can be used. can. When using a commercially available enzyme agent, the amount of lipase used is 0.025 to 5% by weight based on the raw material oil or fatty acid (5 x 102 to 5 x
10 5 units of lipolytic enzyme) is used. Furthermore, the transesterification reaction of fats and oils by lipase can be promoted by carrying out the transesterification reaction of fats and oils in the presence of an inert organic solvent and/or a carrier.
As the inert organic solvent, petroleum benzene, n-hexane, petroleum ether, etc. can be used, and as the carrier, commonly used carriers such as celite, activated carbon, alumina, silicic acid, cellulose, etc. can be used. In addition to the enzyme and the substance to be reacted with the enzyme, a substance that can serve as a solvent in a supercritical state is mixed.
Specific examples include ethane, ethylene, propane, propylene, and nitrogen oxide, but carbon dioxide is a harmless inert gas, and its critical point is near room temperature, so it is necessary to maintain the temperature at which the enzymatic reaction proceeds. It is the easiest to handle due to its suitability. Such a mixture is brought into a supercritical state and maintained at a temperature at which the enzymatic reaction proceeds. Specifically 10℃
The temperature range is preferably from 50°C to 50°C. When carbon dioxide is used, the critical temperature T c is 31.1°C and the critical pressure P c is 73 atm, which is particularly preferable, but since carbon dioxide dissolves in a reaction system using water, the pH is also suitable for enzymatic reactions. It is necessary to adjust it so that the value is the same. Reactants can be recovered by increasing and/or decreasing the pressure and/or temperature of the reaction system. This recovery process can be applied to general supercritical gas extraction operations, such as by reducing pressure, separating by increasing temperature, and separating by placing an adsorbent that adsorbs only the target component in a separation tank. This can be done by, for example. Since the lipase reaction of the present invention is carried out in a supercritical state, it is easier to handle the lipase in subsequent separation steps if it is immobilized. As carriers for immobilizing enzymes, carriers such as polysaccharides such as cellulose, porous glass, and ion exchange resins can be used, and enzymes can be immobilized onto these by physical adsorption, ionic bonding, or covalent bonding. can be made into Most carriers are granular, but there are also membrane-like,
It can also be shaped into a plate, a tube or a fiber.
In addition, among the methods of cross-linking the enzyme by reacting it with a reagent having a bifunctional group, and the method of encasing the enzyme in a gel lattice or coating it with a selectively permeable polymer film, there are methods in which the enzyme is placed in a supercritical solvent. It may be immobilized by a method that functions in The enzyme reaction apparatus may be a batch method, but it is also possible to carry out the reaction continuously by using an immobilized lipase column or by circulating the enzyme using an ultrafiltration membrane. Next, the method of the present invention will be explained using the drawings. 1st
Raw materials are fed into a reaction vessel 1 whose temperature can be controlled as shown in the figure. The raw materials can be stirred using a magnetic stirrer 2. The carbon dioxide gas supplied from the carbon dioxide cylinder 3 is pressurized by the liquid chromatography pump 4 while passing through a secondary pressure control valve 5, a stop valve 6, a trace control valve 7, a safety valve 8,
The pressure is controlled by stop valves 6', 6'', 6, etc., and the liquid is supplied to the reaction vessel 1. After the lipase reaction is carried out in a supercritical state for a certain period of time, the reaction vessel is cooled and carbon dioxide is turned into dry ice together with the reactants. Then, after opening the valve, the reactant is recovered by sublimating dry ice at room temperature.The reactant can be extracted with hexane etc. to separate the lipids.The carbon dioxide is connected in parallel and the enzymatic reaction begins. It is possible to feed the raw material to the second reaction vessel through a suitable repressurization device. In addition, when using immobilized enzyme, the reactor/separator system should be as shown in Figure 2. In this case, the substances produced by the continuous reaction can be separated in the separator 1 and the separator 22 by increasing and/or decreasing the pressure and/or temperature by taking advantage of the characteristics of supercritical fluid. That is, the immobilized enzyme column 10 is placed in the reaction vessel 1, and the substrate inlet 11 is connected to the carbon dioxide supply line.
Furthermore, a line 12 and a valve (three-way valve) 13 are provided for cleaning after continuous reaction for a certain period of time. The enzyme reaction product is passed through a line filter 14, six-way valves 15, 15',
It passes through quick connectors 16, 16' and is separated from carbon dioxide in separators 17, 17'. Pressure is adjusted using six-way valves 15, 15', primary pressure regulating valve 5', pressure gauge 9'', 9-flow meter 18, and three-way valve 13'.
Adjustments are made as appropriate. In the conventional method, the reaction was carried out at room temperature and pressure, so the reaction system rarely became a homogeneous liquid with high fluidity, resulting in poor reactivity.However, in the present invention, enzymes are By carrying out the reaction, it becomes possible to make the reaction system homogeneous. Also,
Supercritical gases have a lower viscosity and higher diffusion coefficient than liquid solvents, so they can easily penetrate solids, and it takes less time for reactions to reach equilibrium. Furthermore, it is easy to separate the supercritical gas and the reactants, and the fractionation process is simple. It has the advantage that non-volatile components obtained through enzymatic reactions and reactants sensitive to heat can be processed at temperatures close to room temperature. Furthermore, it has been discovered that even in a supercritical state, which is harsh for living organisms, the activity of the enzyme does not decline and the enzymatic reaction proceeds. Example 1 Experimental method Stirrable liquid chromatography column packings with an internal volume of 40 ml were used as reaction vessels 1 and 1', and two were connected in parallel. Figure 1 shows a schematic diagram of the experimental apparatus. In this reaction vessel, 0.2 g of triolein (manufactured by Hanui Chemical),
Lipase originating from Rhizopus delemar (manufactured by Seikagaku Corporation, code number 100890) 0.1g or 0.2g,
0.2 ml of 0.3M TES buffer (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd., PH6.8) and 1 g of Celite (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) were added. Liquid carbon dioxide is pumped into the reaction vessel using a liquid chromatography pump (JASCO Corporation).
TRIROTAR) 4 was used to increase the pressure while feeding, and when the pressure reached 100 atmospheres, stirring was started, and the reaction was carried out at 32°C for a certain period of time shown in Table 1. During the reaction, the pump was operated continuously, and the pressure inside the reaction vessel was kept constant using the secondary pressure control valve 5 and the safety valve 8. After the reaction was completed, the container was cooled with acetone and dry ice, and the reactants were collected in dry ice.
Conversion to dry ice was confirmed using a pressure gauge 9. After sublimating dry ice at room temperature, the residue was extracted with hexane to separate lipids. Analysis method: The reaction product separated in hexane was separated into 7% hydrated Florisil (Hani Chemical, 60-80 mesh, 30
In addition to the column in g), develop with a mixed solvent of diethyl ether/hexane with a volume ratio of 20:80.
80ml fractions were collected and concentrated under reduced pressure. Transfer a small amount of the concentrate to a TLC plate (silica gel-60, No. 5747,
Merck) and developed with a mixed solvent of hexane, ethyl ether, and acetic acid in a volume ratio of 70:30:1.
It was confirmed that monoglycerides and diglycerides were not included. After drying the concentrate, fatty acid methyl ester was prepared by the BF 3 methanol method (NOF Standard Analysis Method 2, 4, 20, 2-77), and quantitative analysis was performed by gas chromatography. For gas chromatography analysis, 20% DEGS Diasolid L, 80~
Using a column (inner diameter 3 mm, length 2 m) filled with 100 mesh (Gas Kuro Kogyo), the injection port,
Each temperature of the detector (FID) and column
It was maintained at 200°C, 210°C and 190°C. The model of gas chromatography used was a Hitachi 663.30. The ratio of methyl stearate to methyl oleate was calculated. The results are shown in Table 1.
【表】
実施例 ２
実施例１と同様の方法で反応温度35℃にて酵素
量0.02ｇを添加して反応させた。結果を表２に示
す。[Table] Example 2 A reaction was carried out in the same manner as in Example 1 at a reaction temperature of 35° C. by adding 0.02 g of enzyme. The results are shown in Table 2.
【表】
実施例 ３
実施例１と同様の方法で反応温度40℃にて酵素
量0.01ｇまたは0.02ｇを添加して反応させた。結
果を表３に示す。[Table] Example 3 A reaction was carried out in the same manner as in Example 1 at a reaction temperature of 40° C. by adding an amount of enzyme of 0.01 g or 0.02 g. The results are shown in Table 3.
【表】【table】
【図面の簡単な説明】[Brief explanation of drawings]
第１図は実施例１で用いた実験装置の概略図を
表わす。第２図は固定化酵素を用いた場合の実験
装置の概略図を表わす。
図中、１及び１′は反応容器、２及び２′はマグ
ネチツクスターラー、３は二酸化炭素ボンベ、４
は液クロポンプ、５及び５′は二次圧力調節弁、
６，６′，６″及び６はストツプ弁、７は微量調
節弁、８は安全弁、９，９′，９″及び９は圧力
計、１０は固定化酵素カラム、１１は基質注入
口、１２は洗浄ライン、１３及び１３′は三方弁、
１４はラインフイルター、１５及び１５′は六方
弁、１６及び１６′はクイツクコネクター、１７
及び１７′は分離機、１８は流量計を表わす。
FIG. 1 shows a schematic diagram of the experimental apparatus used in Example 1. FIG. 2 shows a schematic diagram of the experimental setup when using immobilized enzymes. In the figure, 1 and 1' are reaction vessels, 2 and 2' are magnetic stirrers, 3 is a carbon dioxide cylinder, and 4 is a carbon dioxide cylinder.
is a liquid chromatographic pump, 5 and 5' are secondary pressure regulating valves,
6, 6', 6'' and 6 are stop valves, 7 is a micro-control valve, 8 is a safety valve, 9, 9', 9'' and 9 are pressure gauges, 10 is an immobilized enzyme column, 11 is a substrate injection port, 12 is a cleaning line, 13 and 13' are three-way valves,
14 is a line filter, 15 and 15' are hexagonal valves, 16 and 16' are quick connectors, 17
and 17' represent a separator, and 18 represents a flow meter.