JPH0533992B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明はブレオマイシン類の製造法に関するも
ので、より詳しくは、ストレプトミセス属に属す
るブレオマイシン生産菌株を、栄養源を含有する
培地に接種し、必要に応じて、目的とするブレオ
マイシン類の末端アミン残基に対応する第１級ア
ミンを添加し、培養し、ブレオマイシン類を生成
蓄積せしめ、それを単離するブレオマイシン類の
製造法において、下記一般式(1) （式中Ｒは炭素数１−６のアルキル基、Ａおよ
びＢはアルキル基上の置換基を示し、Ａは水素ま
たはヒドロキシル基、Ｂは水素、フエニル基、イ
ンドール基または置換フエニル基を示す。）で示
されるアミノ酸を添加して培養することを特徴と
するブレオマイシン類の改良醗酵法に関するもの
で、本発明によれば醗酵によるブレオマイシン類
の製造の際併産されるクレオマイシン類を著じる
しく減少させることができるものである。 本発明の方法を適用すれば、ブレオマイシンの
精製工程中で、複雑なクレオマイシン除去工程を
簡易化、又は省略することが可能となり、高純度
のブレオマイシン粉末が容易に製造出来ることに
なり、経済的効果が大きい。 即ち、本発明方法を用いない場合には20〜30％
のクレオマイシン類が副生するのに対し本発明に
よればその副生を10％以上も減少させることがで
き一般式(1)の化合物の選択等により、その副生を
数パーセント以下とすることもできる。 ブレオマイシンは、梅沢らにより発見された抗
腫瘍性抗生物質で、広く癌の化学療法に用いら
れ、特に、扁平上皮癌に有効である（梅沢らJ.
Antibiotics 19A巻、200頁、1966年）。 ブレオマイシンは、放線菌、例えば、ストレプ
トミセス属に属するストレプトミセス・バーチシ
ラスを通常の栄養源を含有する液体培地で通気攪
拌下に培養することにより産生され、培養液よ
り公知の方法で抽出、精製することにより、一原
子の銅をキレートした青色粉末として得られる。
（梅沢ら、J.Antibiotics 19A巻、210頁、1966年） 通常の培養法によれば、末端アミン残基が異な
る十数種のブレオマイシン混合物が生産される。
又、末端アミン残基に対応する第１級アミンを前
駆体として培養液に添加する方法（特公昭48−
32354、特公昭48−32355）により培養すれば、一
種類のブレオマイシンが選択的に産生される。 ブレオマイシン生産菌、ストレプトミセスバー
チシラスは、ブレオマイシン類を産生する条件下
で、弱いクレオマイシン産生能を示す。 クレオマイシン類は特開昭56−25197号公報か
らも判るようにブレオマイシン類と構造的に著じ
るしく類似しており、また理化学的性質も対応す
るブレオマイシン類と極めて類似している。その
ため、現在高度な技術と煩雑な操作により相互の
分離がなされている。そこで、例えば培養条件の
改良などにより、副生されるクレオマイシンを抑
制することは、この高度で煩雑な操作を簡略化あ
るいは省略することにつながり、ブレオマイシン
生産に於いてその有用性は非常に高い。 以上の観点から本発明者らは、培養条件の検討
を行つた結果、培地に必要な栄養源の他に、一般
式(1)で表わされる化合物の一種類を加えて培養す
ると、クレオマイシンの生産が抑制されることを
見出し、本発明を完成した。 本発明に用いられる微生物はブレオマイシン生
産菌であれば何でも良く、従来ストレプトミセス
属に属するストレプトミセス・バーチシラスが知
られており、その代表的なものはストレプトミセ
ス・バーチシラス（Streptomyces verticillus）
NK68−144（微工研受託番号第4108号、
ATCCNO.31307）である。（ストレプトミセス・
バーチシラスはBergeis Mannual of
Determinative Bacteriology，８ editionでは
ストレプトバーチシリウム バーチシラス
（Streptoverticillium verticillus）と分類するこ
とも提案されているが、本明細書においては従来
通りストレプトミセス属とした。）放線菌は自然
あるいは、人工的に抗生物質の生産能が変化し易
いことは周知のことであり、公知の方法例えばＸ
線、紫外線、あるいは変異誘起剤を作用させるな
どの方法でブレオマイシン生産能の高い変異株を
造成し用いることは可能である。 本発明で用いられるブレオマイシン生産菌に
は、このような自然、あるいは人工変異株も当然
含有される。 ストレプトミセス・バーチシラスNK68−144
はストレプトミセス・バーチシラスB80−Z2
（ATCC No.15003）（米国特許No.3681491に詳細記
載）をUV照射及びγ線照射による変異処理を行
つて、ブレオマイシン類の生産性を高めた変異株
である。 本発明の一般式(1)のＲで示されるアルキル基と
してはメチル、エチル、プロピル、イソプロピ
ル、ｎ−ブチル、イソブチル、sec−ブチル、ｎ
−ペンチル、イソペンチル、ｎ−ヘキシル、２−
エチルブチル等のアルキル基であり、好ましくは
Ｂが水素を示すときはＲは炭素数が２以上より好
ましくは３以上のアルキル基が好ましい。Ａまた
は（および）Ｂが水素以外の基である場合の基

【式】の具体例をあげれば１−ヒドロキシエ チル、ベンジル、フエニルエチル、フエニルプロ
ピル、ｐ−ヒドロキシベンジル、１−ヒドロキシ
ベンジル、１−ヒドロキシヘキシル、フエニルブ
チル等である。 一般式(1)のアミノ酸としてはスレオニン、バリ
ン、ロイシン、イソロイシン、フエニルアラニ
ン、トリプトフアン、β−ハイドロキシノルバリ
ン、フエニルセリン、α−アミノ酪酸、ノルバリ
ン等であり、バリン、ロイシン、イソロイシン、
フエニルアラニン、β−ハイドロキシノルバリン
等は収率もよくかつクレオマイシンの副生も抑制
されるので好ましい。 これらの中でロイシン、イソロイシン、ノルロ
イシン、ノルバリンは特に好ましい。 本発明で用いられる培地は、澱粉、水飴、グル
コース、マンノース、フラクトース、ガラクトー
ス、ラクトース、マルトース、シユークロース、
イノシトール、マンニトール、グリセリン、デキ
ストリン、糖蜜、有機酸などの炭素源の一つまた
は数種、塩化アンモン、硫安、硝酸アンモン、硝
酸ナトリウム、尿素、ペプトン、肉エキス、酵母
エキス、乾燥酵母、コーンスチープリカー、大豆
粉、脱脂大豆粉、カザミノ酸、リジン、システイ
ンなどの窒素源のうちの一種または数種、およ
び、塩化ナトリウム、塩化カリ、リン酸塩、炭酸
カルシウム、硫酸亜鉛、硫酸マグネシウム、硫酸
銅などの無機塩類などが適切に組合わされて用い
られる。また特定の末端アミン残基を有するブレ
オマイシン、クレオマイシン類の生産を促進する
目的で分子中２個以上の塩基性基を有する脱脂族
第一級アミンを培地に適当量添加して培養する方
法が確立されている〔特許第728158（特公昭48−
32354）、特許第728159（特公昭48−32355）〕が、
本発明に於いてもこの方法が適用出来ることは言
うまでもなく、必要に応じて上記アミン類も培地
に添加して用いられる。このようなアミン類の代
表的なものとしてはＮ−（１−フエニルエチルア
ミン）−１，３−ジアミノプロパン、Ｎ−ブチル
−１，３−ジアミノプロパン、Ｎ，Ｎ−ビス−
（３−アミノプロピル）−１，３−ジアミノプロパ
ン、３−モルホリノプロピルアミン等である。 本発明において、上記培地での培養に際して添
加する前記一般式(1)のアミノ酸の添加量は、培地
に対して、0.02〜５％好ましくは0.05〜３％であ
る。 これらの添加物はあらかじめ培地に加えて滅菌
しても、また別に滅菌し、滅菌後の培地にブレオ
マイシンの産生菌株の接種時あるいは培養開始後
ブレオマイシンの生産の開始されるまでの適当な
時期に加えてもよい。 培養は通常通気攪拌下に20〜30℃で６〜15日程
度行われる。 培養終了時期は、マイコバクテリウム607を被
検菌とした特定で最高力価に達した時点とする。
培養終了後の培養液から公知の方法たとえば、ア
ンバーライト XAD−２、アルミナ、セフアデ
ツクス LH−20などを用いたクロマトグラフイ
ーを行うことによりブレオマイシンの粗粉末が青
色粉末として得られる。この粗粉末中のブレオマ
イシンとクレオマイシンの存在量は、逆相高速液
体クロマトグラフイーを行うことにより分離定量
が出来る。このようにして得られるブレオマイシ
ン類の若干の例を示すと ３−Ｎ−（１−フエニルエチル）−アミノプロピ
ルアミノブレオマイシン ３−Ｎ−ブチルアミノプロピルアミノブレオマ
イシン ３−（Ｎ−メチル−Ｎ−３−アミノプロピル） −アミノプロピルブレオマイシン ３−（モリホリノ）−プロピルアミノブレオマイ
シン 等である。 次に実施例により具体的に説明する。 実施例１ 培地１による培養 澱粉１％、ブドー糖１％、ペプトン0.75％、肉
エキス0.75％、食塩0.3％を含む培地（PH7.0）100
mlを500mlのエーレンマイヤーフラスコに入れ、
滅菌したのち、ストレプトミセス・バーチシラス
NK−68−144（微工研委託受理番号第4108号、
ATCC No.31307）を接種し28℃、48時間、回転
振盪培養して種培養液をつくる。 次に、デキストリン１％、フラクトース１％、
グルタミン酸0.2％、ヒスチジン0.1％、システイ
ン0.1％、リジン0.1％、食塩0.3％、硝酸ナトリウ
ム0.2％、リン酸第２カリ0.5％、硫酸亜鉛0.05％、
硫酸銅0.01％、硫酸マグネシウム0.5％の組成を
有する培地（培地１）に、３−モルホリノプロピ
ルアミン塩酸塩を0.1mg／mlの割合で添加し、更
に、本発明で使用するアミノ酸としてスレオニン
１％を添加し、500ml容エーレンマイヤーフラス
コ10本に100mlづつ入れ滅菌したのち、先の種培
養液を５％の割合で接種し28℃、180rpmで10日
間回転振盪培養を行つた。培養終了後、培養液を
珪藻土の過助剤ダイカライト ５％と共に過
し、液900mlを得た。この液をアンバーライ
ト XAD−２を充填した100mlの樹脂塔に通して
目的物を吸着させ水洗後0.01N塩酸−メタノール
（１：４）150mlを用いて溶出した。溶出液を中和
したのち、濃縮乾固し、少量の水−メタノール
（１：４）に溶かした。不溶物は去後、液を
水−メタノール（１：４）で充填したアルミナカ
ラム（５ml）に通し、同溶媒で溶出し、青色分画
20mlを集めた。この分画を濃縮後約５mlの水−メ
タノール（１：４）に溶解し、同溶媒で充填した
セフアデツクスLH−20カラム（100ml）につけ、
同溶媒を展開剤としてクロマトグラフイーを行
い、青色分画を集め凍結乾燥することにより３−
モルホリノアミノプロピルブレオマイシン（以
後、MOP−BPMと称する）の青色粉末5.87mgを
得た。 この粉末を水にとかし、その一部を下記の条件
により、逆相高速液体クロマトグラフイーにより
分析した結果、クレオマイシン含量は、0.2％で
あつた。 （分析条件） クロマトグラフ塔：ヌクレオシル 7C18（ナー
ゲル社）６mm×250mm 展開剤：４％酢酸カリ、２％酢酸水溶液：アセ
トニトリル（85：15v／ｖ） 流速（圧）：1.5ml／分（2000psi） 検出：UV292nm この条件下では、モルホリンブレオマイシン、
モルホリンクレオマイシンはそれぞれ、13分、15
分に分離溶出される。両成分の含量はピーク面積
比より算出した。 なお本実施例において、スレオニン無添加で同
様に培養を行うとMOP−BLMの粗粉末10.62mg
を得た。この粉末のクレオマイシン含量は、26％
であつた。 実施例２ 培地１による培養に対するロイシン添
加効果 培地１にロイシン1.0％を添加した以外すべて
実施例１と同じ方法で培養、精製操作を行つて、
MOP−BLMの粗粉末38.4mgを得た。クレオマイ
シン含量は2.6％であつた。 実施例３ 培地１による培養に対するノルバリン
添加効果 培地１にノルバリン0.5％を添加した以外はす
べて実施例１と同じ方法で培養、精製操作を行つ
て、MOP−BLMの粗粉末38.62mgを得た。この
粉末のクレオマイシン含量は2.3％であつた。 実施例４ 培地２による培養 実施例１と同じ操作で得た種培養液をさらに、
同一組成をもつ培地１を含む５容エーレンマ
イヤーフラスコに移し、さらに48時間回転振盪培
養を行つて種培養液をつくる。 次に、水飴6.4％、ブドー糖0.5％、大豆粉3.5
％、コーンスチープリカー0.75％、塩化ナトリウ
ム0.3％、リン酸２カリ0.5％、硫酸亜鉛0.05％、
硫酸銅0.01％、硝酸ナトリウム0.2％、硫酸マグ
ネシウム0.5％、プロナールST−１ 0.03％の組
成（培地２）でさらに、３−モルホリノプロピル
アミン0.01％、更にノルバリン0.5％を加えた培
地20を30容ジヤーフアーメンターに入れ滅菌
したものに上記種培養液１を加え、28℃、
400rpmで７日間培養した。培養後実施例１で記
載した方法を用いて精製を行い、1.62ｇのMOP
−BLMの粗粉末を得た。この粗粉末のクレオマ
イシン含量は４％であつた。 なお本実施例で、ノルバリン無添加で培養、精
製を行い、MOP−BLMの粗粉末1.02ｇを得た。
この粉末のクレオマイシン含量は19.5％であつ
た。 実施例１又は３と同様にして、一般式(1)のアミ
ノ酸を添加してMOP−BLMの培養を行つた。実
施例の結果も含めて、次表に示す。

【表】

【表】 実施例５ 培地２でのノルバリン添加培養による
３−（Ｎ−（Ｓ）−1′−フエニルエチル）アミノ
プロピルアミノ（ブレオマイシンPEP−BLM）
の生産 実施例３において、培地２に、MOPのかわり
にＮ−〔（Ｓ）−1′−フエニルエチル〕−１，３−ジ
アミノプロパン塩酸塩を0.1％添加し、さらにノ
ルバリンを0.5％加えた以外、すべて実施例３と
同様に培養、精製を行い、PEP−BLMの粗粉末
1.11ｇを得た。この粉末のクレオマイシン含量
は、3.1％であつた。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ ストレプトミセス属に属するブレオマイシン
   生産菌株を栄養源を含有する培地に接種し必要に
   応じ、目的とするブレオマイシン類の末端アミン
   残基に対応する脂肪族第１級アミンを添加し、培
   養し、ブレオマイシン類を生成蓄積せしめ、それ
   を単離するブレオマイシン類の製造法において、
   培地に、下記一般式 （式中Ｒは炭素数１−６のアルキル基、Ａおよ
   びＢはアルキル基上の置換基を示し、Ａは水素ま
   たはヒドロキシ基、Ｂは水素、フエニル基、イン
   ドール基または置換フエニル基を示す。） で示されるアミノ酸を添加して培養することを特
   徴とするブレオマイシン類の製造法。