【発明の詳細な説明】[Detailed description of the invention]
本発明は、動物細胞または動物細胞由来の細胞
を培養する無血清または低タンパク質濃度の培地
に関するものであり、ローヤルゼリーおよび／ま
たはローヤルゼリーの成分を含有することを特徴
とする細胞培養用培地に関するものである。
動物細胞および動物細胞由来の脂肪には、抗
体、インターフエロン、インシユリン、酵素など
の有効物質を産生するものが知られており、その
細胞を培養することによつてこれらの有効物質を
得ることの実施または試みがなされている。従来
よりこれらの細胞を培養するためには、ほとんど
の場合、培地に血清を添加することが必要であ
る。血清としては、一般に牛胎児血清、子牛血清
などが用いられており、添加量は通常10％程度で
ある。しかし、これらの血清は高価であること、
品質が一定しないこと、供給に制限があることな
どの難点がある。また、血清はタンパク質などの
多種多様な成分を含んでいるため、培養物から有
効物質を分離する場合に分離、精製が容易でな
い。
本発明者らは、これらのことを解決すべく研究
を重ねた結果、低タンパク質濃度さらには無血清
の培地で細胞増殖が可能なことを見いだし、本発
明を完成したものである。
ローヤルゼリーは蜜蜂などから得られるが、こ
れは、例えば農事組合法人クヰーン・ビー・ガー
デン養蜂組合から入手できる。
ローヤルゼリーは粘性が高いので、例えばリン
酸緩衝化生理食塩水、100mM Na−Hepes緩衝
液、水などで抽出、透析し粘性を減少させた画分
（以下ローヤルゼリーの抽出、透析画分と略す）
を用いると以後の処理が容易になる。分子量分画
は、例えばSephadex Ｇ−200（Pharmacia Fine
Chemicals）またはCellulofine GC−700（生化学
工業株式会社）などを用いるゲルろ過法により行
う。そのとき用いる平衡化および溶出用溶液は、
例えばリン酸緩衝化生理食塩水、100mM Na−
Hepes緩衝液（PH7.4）、水などである。ローヤル
ゼリーの分子量約58000のタンパク質（以下ロー
ヤルゼリータンパク質と略す）は、例えば以下の
ようにして精製する。ローヤルゼリーをリン酸緩
衝化生理食塩水で２倍に希釈後、それに対して透
析する。透析後、２万×ｇで遠心し、得られる上
清を上記の方法で分子量分画し、分子量５−８万
の画分を得る。この画分を1mM Tris−HCl緩衝
液（PH8.0）に透析後、同様の緩衝液で平衡化し
たBlue Sepharose（Pharmacia Fine
Chemicals）にかけ、素通り画分すなわちローヤ
ルゼリータンパク質を得ることできる。このロー
ヤルゼリータンパク質はSDS電気泳動（Weber，
K.，and Osborn，M.（1969）J.Biol.Chem.244，
4406−4412）で単一バンドを示し、同電気泳動に
より分子量を決定したところ58000であつた。本
発明の細胞培養用培地は、これらのものを通常の
動物細胞の培養に用いられる基礎培地（血清を含
まない）に添加して用いる。
また、これらのローヤルゼリーおよび／または
ローヤルゼリーの成分と、乳および／または乳の
成分、胎盤血の分子量５−８万の画分の中より１
種以上を基礎培地に添加して用いることもでき
る。乳の成分は、以下のようにして得る。
乳を、例えば２万×ｇで遠心して溶液画分を得
る。得られる画分をローヤルゼリーの場合と同様
の方法で分子量分画し、分子量20万以上の画分お
よび分子量４−９万の画分を得る。ラクトフエリ
ンは、例えばＬｏ¨nnerdalらの方法（Ｌｏ¨
nnerdal，B.，Carlsson，J.，and Porath，J.
（1977）FEBS Letter.75，89−92）で精製する。
また、ヒト胎盤血の分子量５−８万の画分（以
下ヒト胎盤血画分と略す）については、例えば胎
盤から自然にしみ出た血液を２万×ｇで遠心し、
その上清をさらに上記の方法で分子量分画して得
ることができる。
本発明培地の基礎培地としては、一般の動物細
胞の培養に用いられるものであれば、いかなるも
のも用いることができる。例えば、Dulbecco's
Modified Eagle midium（以下D'MEMと略す）、
Ｆ−12、RPMI−1640などの基礎培地、また、こ
れら基礎培地にインシユリン（２−10μｇ／ml）、
セレニウム（10-11−10-8Ｍ）、トランスフエリン
（10−35μｇ／ml）、核酸前駆体（例えばチミジ
ン、ヒポキサンチンなど、10-6Ｍ程度）、血清ア
ルブミン（50−400μｇ／ml）などを添加した培
地も基礎培地として用いることができる。本発明
の培地に添加するローヤルゼリーは、0.003−0.3
％（タンパク質の最終濃度は３−300μｇ／ml）、
好ましくは0.01−0.2％の範囲にすることが望ま
しい。ローヤルゼリーの抽出、透析画分、分子量
20万以上の画分、分子量４−９万の画分およびロ
ーヤルゼリータンパク質については10−200μ
ｇ／mlが望ましい。その他の乳および乳の成分に
ついては0.5−350μｇ／ml、胎盤血画分につては
50−300μｇ／mlであることが望ましい。
本発明培地は、繊維芽細胞、リンパ芽球細胞な
どの動物細胞の培養に用いることもできるが、リ
ンパ球由来細胞などの動物細胞由来の細胞の培養
に最も好適に用いられる。本発明の培地を用いれ
ば血清を大量に添加した従来の培地にほぼ匹敵す
る細胞増殖を得ることができる。また、10％の血
清を添加する従来の方法に比べ、ローヤルゼリー
の添加量は0.01−0.2％と少なくてよく、従つて
安価であり且つ混雑物を少なくなるという利点を
有する。例えば培地中のタンパク質濃度を比べる
と、血清を10％添加した場合３mg／ml以上である
のに比べ、本発明培地は0.4mgml以下とタンパク
質濃度が低い。更に、本発明培地は分子量的に分
画した画分を添加することも可能であることか
ら、有効物質の分子量により使いわけることもで
きる。例えば抗体（分子量15万以上）を産生する
細胞を培養する場合には、ローヤルゼリータンパ
ク質および／またはローヤルゼリーの分子量５−
８万画分とラクトフエリン、乳の分子量４−９万
の画分、胎盤血画分を必要に応じ加え、用いるな
どのように行う。以上のように、本発明培地を有
効物質産生に用いることにより有効物質の分離、
精製が容易となるという利点を有する。
以下に実施例により本発明を説明する。
実施例 １
健康人の末梢リンパ球株細胞（Bri7）105個細
胞を、D'MEM／Ｆ−12（１：１）に第１表に示
す添加物を添加した培地２mmに、植え込む。５％
CO2，37℃の条件下で３日間培養を行う。得られ
た結果は第１表に示すとおりである。
The present invention relates to a serum-free or low protein concentration medium for culturing animal cells or cells derived from animal cells, and relates to a cell culture medium characterized by containing royal jelly and/or components of royal jelly. be. Animal cells and animal cell-derived fats are known to produce active substances such as antibodies, interferon, insulin, and enzymes, and it is possible to obtain these active substances by culturing these cells. being carried out or attempted. Traditionally, in order to culture these cells, it is almost always necessary to add serum to the culture medium. Fetal bovine serum, calf serum, etc. are generally used as serum, and the amount added is usually about 10%. However, these serums are expensive;
There are drawbacks such as inconsistent quality and limited supply. Furthermore, since serum contains a wide variety of components such as proteins, it is difficult to separate and purify effective substances from culture. As a result of repeated research to solve these problems, the present inventors discovered that cells can be grown in a serum-free medium with a low protein concentration, and have completed the present invention. Royal jelly is obtained from bees, etc., and can be obtained from, for example, the Queen Bee Garden Beekeeping Association, an agricultural cooperative corporation. Royal jelly has a high viscosity, so it is extracted with phosphate buffered saline, 100mM Na-Hepes buffer, water, etc., and dialyzed to reduce the viscosity (hereinafter referred to as royal jelly extraction and dialysis fraction).
Using , subsequent processing becomes easier. Molecular weight fractionation can be carried out using, for example, Sephadex G-200 (Pharmacia Fine
Chemicals) or by gel filtration using Cellulofine GC-700 (Seikagaku Corporation). The equilibration and elution solutions used at that time are:
For example, phosphate buffered saline, 100mM Na−
Hepes buffer (PH7.4), water, etc. Royal jelly protein having a molecular weight of about 58,000 (hereinafter abbreviated as royal jelly protein) is purified, for example, as follows. Royal jelly is diluted 2 times with phosphate buffered saline and then dialyzed against it. After dialysis, it is centrifuged at 20,000 x g, and the resulting supernatant is subjected to molecular weight fractionation using the method described above to obtain a fraction with a molecular weight of 50,000 to 80,000. After dialysis of this fraction against 1mM Tris-HCl buffer (PH8.0), Blue Sepharose (Pharmacia Fine
Chemicals) to obtain a flow-through fraction, that is, royal jelly protein. This royal jelly protein was analyzed by SDS electrophoresis (Weber,
K., and Osborn, M. (1969) J.Biol.Chem.244,
4406-4412), and the molecular weight determined by the same electrophoresis was 58,000. The cell culture medium of the present invention is used by adding these materials to a basal medium (not containing serum) used for normal animal cell culture. In addition, 1 of these royal jelly and/or royal jelly components, milk and/or milk components, and a fraction of placental blood with a molecular weight of 50,000 to 80,000.
It is also possible to use seeds or more by adding them to the basal medium. The milk components are obtained as follows. Milk is centrifuged at, for example, 20,000 x g to obtain a solution fraction. The resulting fractions are subjected to molecular weight fractionation in the same manner as in the case of royal jelly to obtain a fraction with a molecular weight of 200,000 or more and a fraction with a molecular weight of 40,000 to 90,000. Lactoferrin can be extracted, for example, by the method of Lo¨nnerdal et al.
nnerdal, B., Carlsson, J., and Porath, J.
(1977) FEBS Letter.75, 89-92). In addition, for the fraction of human placental blood with a molecular weight of 50,000 to 80,000 (hereinafter referred to as human placental blood fraction), for example, blood naturally exuded from the placenta is centrifuged at 20,000 x g.
The supernatant can be further obtained by molecular weight fractionation using the method described above. As the basal medium of the culture medium of the present invention, any medium can be used as long as it is used for culturing general animal cells. For example, Dulbecco's
Modified Eagle midium (hereinafter abbreviated as D'MEM),
Basal media such as F-12, RPMI-1640, insulin (2-10 μg/ml),
Selenium ( 10-11-10-8 M), transferrin (10-35 μg/ ml ), nucleic acid precursors (e.g. thymidine, hypoxanthine, etc., about 10-6 M), serum albumin (50-400 μg/ml), etc. A medium supplemented with can also be used as a basal medium. The royal jelly added to the medium of the present invention is 0.003-0.3
% (final protein concentration 3-300 μg/ml),
The preferred range is 0.01-0.2%. Royal jelly extraction, dialysis fraction, molecular weight
10-200μ for fractions of 200,000 or more, molecular weight fractions of 40,000-90,000, and royal jelly proteins.
g/ml is desirable. 0.5-350μg/ml for other milk and milk components; for placental blood fraction
Desirably, it is 50-300 μg/ml. Although the culture medium of the present invention can be used for culturing animal cells such as fibroblasts and lymphoblastoid cells, it is most preferably used for culturing animal cell-derived cells such as lymphocyte-derived cells. Using the medium of the present invention, it is possible to obtain cell proliferation almost comparable to that of a conventional medium supplemented with a large amount of serum. Furthermore, compared to the conventional method of adding 10% serum, the amount of royal jelly added can be as small as 0.01-0.2%, which has the advantage of being inexpensive and reducing congested substances. For example, when comparing the protein concentration in the medium, it is 3 mg/ml or more when 10% serum is added, whereas the protein concentration in the medium of the present invention is low at 0.4 mg/ml or less. Furthermore, since it is possible to add molecular weight fractions to the culture medium of the present invention, it is possible to use the medium according to the molecular weight of the effective substance. For example, when culturing cells that produce antibodies (with a molecular weight of 150,000 or more), royal jelly protein and/or royal jelly with a molecular weight of 5-
The 80,000 fraction, lactoferrin, the milk fraction with a molecular weight of 40,000 to 90,000, and the placental blood fraction are added and used as necessary. As described above, by using the culture medium of the present invention for the production of effective substances, separation of effective substances,
It has the advantage of being easy to purify. The present invention will be explained below with reference to Examples. Example 1 105 cells of a peripheral lymphocyte cell line (Bri7) from a healthy person are implanted in 2 mm of a medium containing D'MEM/F-12 (1:1) and the additives shown in Table 1. 5%
Culture is performed for 3 days under CO 2 and 37°C conditions. The results obtained are shown in Table 1.
【表】
なおD′MEM／Ｆ−12に添加物としてローヤル
ゼリータンパク質単独、ローヤルゼリータンパク
質およびヒトラクトフエリン、ヒト血清アルブミ
ンとローヤルゼリータンパク質およびヒトラクト
フエリンの３種をそれぞれ加えた培地で30日間以
上継代培養してもそれぞれの増殖速度に変化がみ
られなかつた。このことは永続的に継代培養する
ことが可能であることを示している。
実施例 ２
Epstein−Barr Virusでトランスフオームした
ヒト由来のリンパ球株細胞（NL−matsumoto）
について実施例１と同様にして培養を行う。得ら
れた結果は第２表に示すとおりである。[Table] D'MEM/F-12 was incubated for over 30 days in a medium containing three additives: royal jelly protein alone, royal jelly protein and human lactoferrin, and human serum albumin and royal jelly protein and human lactoferrin. Even after subculturing, no change was observed in the respective growth rates. This indicates that continuous subculture is possible. Example 2 Human-derived lymphocyte cell line transformed with Epstein-Barr Virus (NL-matsumoto)
The cells are cultured in the same manner as in Example 1. The results obtained are shown in Table 2.
【表】【table】
【表】
ク質
＋牛胎児血清、20％ 6400 8.2×10５
実施例 ３
ヒト由来のリンパ球株細胞（HYON）につい
て実施例１と同様にして培養を行う。得られた結
果は第３表に示すとおりである。[Table] Quality
+Fetal bovine serum, 20% 6400 8.2×10 5
Example 3 Human-derived lymphoid cells (HYON) are cultured in the same manner as in Example 1. The results obtained are shown in Table 3.
【表】
を添加したときの全体のタンパク質
濃度を示す。
[Table] Total protein when added
Indicates concentration.
【特許請求の範囲】[Claims]
１ 付着依存性細胞用無血清ないし低血清含有培
地において、固定化プロテアーゼインヒビターを
有効成分とする付着依存性細胞用増殖助剤。
２ 固定化プロテアーゼインヒビターにおけるプ
ロテアーゼインヒビターの培地濃度が、少なくと
も0.05mMである請求項１記載の増殖助剤。
３ 付着依存性細胞が、ヒト組織由来細胞である
請求項１記載の増殖助剤。
４ ヒト組織由来細胞が、ヒト腎癌由来細胞
TRC−29R（FERM Ｐ−10274）である請求項１
記載の増殖助剤。
1. A growth aid for adhesion-dependent cells containing an immobilized protease inhibitor as an active ingredient in a serum-free or low-serum-containing medium for adhesion-dependent cells. 2. The growth aid according to claim 1, wherein the concentration of protease inhibitor in the medium in the immobilized protease inhibitor is at least 0.05mM. 3. The growth aid according to claim 1, wherein the adhesion-dependent cells are human tissue-derived cells. 4 Human tissue-derived cells are human renal cancer-derived cells
Claim 1 which is TRC-29R (FERM P-10274)
Growth aids as described.