【発明の詳細な説明】[Detailed description of the invention]
本発明はウロキナーゼの精製法に関する。
さらに詳しくは、式、
−（CH2）ｎ−Ｘ （）
（式中、Ｘは水酸基、メチル基、水酸基で置換
されていてもよいフエニル基またはアミノ基を、
ｎは３〜10の整数を示す）で表わされる基をリガ
ンドとして有する水不溶性の担体にウロキナーゼ
を吸着させ、さらに少なくとも２個のアミノ基を
有する化合物又はその塩にて溶出することによる
ウロキナーゼの精製法に関するものである。
ウロキナーゼは人尿、および腎細胞の組織培養
液中に存在する酵素であり、人血漿中に含まれる
プラスミノーゲンを賦活化してフイブリン溶解能
を有するプラスミンを生成する機能がある。この
故にウロキナーゼは人尿等から捕集して精製さ
れ、各種血栓症や心筋梗塞症等の治療に広く臨床
使用されている。のみならず、最近においては制
癌剤と併用することにより、制癌剤の薬効を向上
せしめることが知られている。しかも、ウロキナ
ーゼは人間の尿または腎細胞の組織培養液からの
抽出精製物であるから、抗原性を有さないため、
抗原抗体反応による副作用がなく、広く賞用され
ている。
本発明者らは、ウロキナーゼと疎水性吸着体と
が、疎水的な親和性を有することに着目し、吸着
方法、溶出方法などについて研究を重ねてきたと
ころ、上述の基（）をリガンドとして有する水
不溶性担体を吸着剤とし、さらに少なくとも２個
のアミノ基を有する化合物又はその塩を添加した
溶液を用いることによつて、より高純度、高回収
率でウロキナーゼが得られることを見出し、本発
明を完成するに至つた。
本発明で使用される基（）を有する水不溶性
の担体は水不溶性担体に基（）を導入したもの
であり、基（）としては、具体的にはC4H9−
（ブチル基）、C5H11−（ペンチル基）、C8H17−（オ
クチル基）、−C4H8NH2（アミノブチル基）、−C8
H16NH2（アミノオクチル基）、−C4H8OH（ハイド
ロキシブチル基）、−C8H16OH（ハイドロキシオク
チル基）、
The present invention relates to a method for purifying urokinase. More specifically, the formula, -( CH2 )n-X () (wherein,
Purification of urokinase by adsorbing urokinase onto a water-insoluble carrier having a group represented by (n represents an integer of 3 to 10) as a ligand, and further eluting with a compound having at least two amino groups or a salt thereof. It is about law. Urokinase is an enzyme present in human urine and tissue culture fluid of kidney cells, and has the function of activating plasminogen contained in human plasma to generate plasmin having fibrinolytic ability. For this reason, urokinase is collected and purified from human urine, etc., and is widely used clinically for the treatment of various thromboses, myocardial infarctions, etc. In addition, it has recently been known that the efficacy of anticancer drugs can be improved by using them in combination with anticancer drugs. Moreover, since urokinase is extracted and purified from human urine or kidney cell tissue culture fluid, it has no antigenicity.
It has no side effects due to antigen-antibody reactions and is widely used. The present inventors focused on the fact that urokinase and a hydrophobic adsorbent have hydrophobic affinity, and conducted repeated research on adsorption methods, elution methods, etc., and found that It has been discovered that urokinase can be obtained with higher purity and higher recovery rate by using a water-insoluble carrier as an adsorbent and a solution containing a compound having at least two amino groups or a salt thereof, and the present invention has been made based on the present invention. I was able to complete it. The water-insoluble carrier having a group () used in the present invention is a water-insoluble carrier into which a group () is introduced, and specifically, the group () is C 4 H 9 −
(butyl group), C 5 H 11 - (pentyl group), C 8 H 17 - (octyl group), -C 4 H 8 NH 2 (aminobutyl group), -C 8
H 16 NH 2 (aminooctyl group), -C 4 H 8 OH (hydroxybutyl group), -C 8 H 16 OH (hydroxyoctyl group),
【式】（フエニルブチ
ル基）、[Formula] (Phenyl butylene)
group),
【式】（フエニルオクチ
ル基）等が好ましいものとして例示される。
水不溶性担体としては、上記の基（）を導入
しうる水不溶性担体ならばいかなるものでも使用
可能であり、具体的にはアガロース、セルロー
ス、セフアクリル（フアルマシア社製）、セフア
デツクス（フアルマシア社製）等の水不溶性の多
糖類、ポリビニル系のゲル等が好適なものとして
列挙される。
かかる基（）を有する水不溶性担体として
は、例えばブチルトヨパール（東洋曹達工業社
製）、アルキルアガロース・シリーズ（マイル社
製）、フエニルオクチル・セフアローズ、オクチ
ル・セフアローズ（フアルマシア社製）、アルキ
ルアガロース・シリーズ（マイルス社製）、ω−
アミノ・アルキル・アガロースシリーズ（マイル
ス社製）等が現在市販されており、これら以外の
ものについても市販品と同様の方法ないしはこれ
に準ずる方法によつて容易に製造することができ
る。
本発明におけるウロキナーゼ吸着工程は、一般
に粗ウロキナーゼを基（）を有する水不溶性担
体に接触させることによつて行われ、当該接触は
吸着操作手段として自体既知の手段、たとえば当
該基（）を有する水不溶性担体を充填したカラ
ムに粗ウロキナーゼを通過させる方法等によつて
行われる。
粗ウロキナーゼは、一般的には水溶液の形で基
（）を有する水不溶性担体による吸着処理に付
される。
この際、ウロキナーゼを吸着せしめるために塩
類を適量添加して、溶媒の疎水性を高めることが
好ましい。添加する塩としては、酵素を吸着体に
吸着するに際して塩濃度を高めるために通常用い
られる塩類であればいずれもが使用できる。特に
好ましい塩類としては、例えば食塩、塩化カリウ
ム、塩化マグネシウムなどの１価の中性塩があげ
られる。
当該塩類は、0.5〜3Mとして添加するのが好適
である。
また、吸着に際してのPHについては特定の範囲
を定める必要はないが、中性域（６〜８）が好ま
しい。
吸着したウロキナーゼの溶出は、溶媒の疎水性
を下げることで行い得るが、塩濃度だけを下げて
も、充分な回収率が得難く、また精製効果が上ら
ないのが常である。
本発明者らは、この問題を解決すべく溶出方法
について研究した結果、少なくとも２個のアミノ
基を有する化合物又はその塩にてウロキナーゼの
溶出を行うことによつて、その回収率が高まるこ
とを見出した。
少なくとも２個のアミノ基を有する化合物にお
けるアミノ基は、アミジノ基の形態でもよく、ま
た塩としては、塩酸塩、硫酸塩などの鉱酸塩があ
げられる。かかる化合物及びその塩としては、リ
ジン、アルギニン等のジアミノモノカルボン酸、
これらの塩酸塩、硫酸塩などの鉱酸塩等があげら
れ、５〜15％（ｗ／ｖ）水溶液で使用することが
好ましい。
かくして精製されたウロキナーゼの溶出液は常
法により脱塩、濃縮、高度精製の処理を行い、医
薬品として使用できるウロキナーゼとすることが
できる。
本発明方法にて使用される吸着用担体及び溶出
剤は、各々より選択的にウロキナーゼを吸着又は
溶出するので、本発明方法によつて粗ウロキナー
ゼから高純度、高収率で精製ウロキナーゼを回収
することが可能である。
従つて、本発明方法は、工業的規模におけるウ
ロキナーゼの製法として極めて有利である。
以下実施例により本発明を詳細に説明する。
実施例 １
人尿より抽出し、電導度を４〜５ｍ mho／cm
（25℃）に調製した粗ウロキナーゼ溶液４ml
（20000国際単位／ml、比活性35000国際単位／mg
蛋白）に1M量の塩化カリウムを溶解し、PHを6.9
に調製した。２ml（カラム体積）のブチルアガロ
ース（マイルス社製）をカラムに充填し、
0.0725Mリン酸塩溶液に1M量の塩化カリウムを
溶解し、PHを6.9に調製した液を通し平衡化した。
これに先に調製したウロキナーゼ溶液を通過さ
せ、ウロキナーゼを吸着させた後、平衡化溶液で
洗浄した。その後、10％（ｗ／ｖ）のリジン塩酸
塩を含むPH６の溶液を通過させ、ウロキナーゼを
溶出した。溶出液よりリジン塩酸塩を除去し、比
活性70000国際単位／mg蛋白のウロキナーゼが回
収率85％で得られた。
実施例 ２
人尿より抽出し、電導度を４〜５ｍ mho／cm
（25℃）に調製した粗ウロキナーゼ溶液４ml
（20000国際単位／ml、比活性35000国際単位／mg
蛋白）に1M量の塩化カリウムを溶解し、PHを6.9
に調製した。２ml（カラム体積）のブチルトヨパ
ール（東洋曹達工業製）をカラムに充填し、
0.0725Mリン酸塩溶液に1M量の塩化カリウムを
溶解し、PHを6.9に調製した液を通し平衡化した。
これに先に調製したウロキナーゼ溶液を通過さ
せ、ウロキナーゼを吸着させた後、平衡化溶液で
洗浄した。その後、10％（ｗ／ｖ）のアルギニン
塩酸塩を含むPH6.0の溶液を通過させ、ウロキナ
ーゼを溶出した。この時の溶出率は95％であつ
た。この後、アルギニン塩酸塩を除去し、比活性
75000国際単位／mg蛋白のウロキナーゼを85％の
回収率で得た。
実施例 ３
電導度を４〜５ｍ mho／cm（25℃）に調製し
た組織培養由来の粗ウロキナーゼ溶液32ml（5000
国際単位／ml、比活性6000国際単位／mg蛋白）に
0.8M量の塩化ナトリウムを溶解し、PHを6.9に調
製した。４ml（カラム体積）のブチルトヨパール
（東洋曹達工業製）をカラムに充填し、0.0725M
リン酸塩溶液に0.8M量の塩化ナトリウムを溶解
し、PHを6.9に調製した液を通し平衡化した。こ
れに先に調製したウロキナーゼを吸着させた後、
平衡化溶液で洗浄した。その後、10％（ｗ／ｖ）
のアルギニン塩酸塩を含むPH6.0の溶液を通過さ
せ、ウロキナーゼを溶出した。この後、アルギニ
ン塩酸塩を除去し、比活性60000国際単位／mg蛋
白のウロキナーゼを90％の回収率で得た。
実施例 ４
人尿より抽出し、電導度を４〜５ｍ mho／cm
（25℃）に調製した粗ウロキナーゼ溶液50ml
（3500国際単位／ml、比活性350国際単位／mg蛋
白）に3.5M量の塩化ナトリウムを溶解し、PHを
6.8に調製した。25ml（カラム体積）のフエニル
オクチル・セフアローズをカラムに充填し、
0.05Mリン酸塩溶液に3.5M量の塩化ナトリウム
を溶解し、PHを6.8に調製した液を通し平衡化し
た。これに先に調製したウロキナーゼ溶液を通過
させ、ウロキナーゼを吸着させた後、平衡化溶液
で洗浄した。その後、10％（ｗ／ｖ）のアルギニ
ン塩酸塩を含むPH６の溶液を通過させ、ウロキナ
ーゼを溶出した。溶出液よりアルギニン塩酸塩を
除去し、弱酸性カチオン交換体により精製したと
ころ、比活性50000国際単位／mg蛋白のウロキナ
ーゼが回収率80％で得られた。
実施例 ５
人尿より抽出し、電導度を４〜５ｍ mho／cm
（25℃）に調製した部分精製粗ウロキナーゼ溶液
100ml（20000国際単位／ml、比活性7000国際単
位／mg蛋白）に対し、2.0M量の塩化カリウムを
添加し、PHを6.8に調製した。80ml（カラム体積）
のオクチル・アガロースをカラムに充填し、
0.05Mリン酸塩溶液に2.0M量の塩化カリウムを
溶解し、PHを6.8に調製した液を通し平衡化した。
これに先に調製したウロキナーゼ溶液を通過さ
せ、ウロキナーゼを吸着させた後、平衡化溶液で
洗浄した。その後、10％（ｗ／ｖ）のリジン塩酸
塩を含むPH６の溶液を通過させ、ウロキナーゼを
溶出した。溶出液よりリジン塩酸塩を除去し、
60000国際単位／mg蛋白の精製ウロキナーゼを84
％の回収率で得た。
実施例 ６
実施例５の粗ウロキナーゼ溶液100mlに2.0M量
の塩化カリウムを溶解し、PHを6.8に調製した。
80ml（カラム体積）のアミノオクチルセフアロー
ズをカラムに充填し、0.05Mリン酸塩溶液に
2.0M量の塩化カリウムを溶解し、PHを6.8に調製
した液を通し平衡化した。これに先に調製したウ
ロキナーゼ溶液を通過させ、ウロキナーゼを吸着
させた後、平衡化溶液で洗浄した。その後、10％
（ｗ／ｖ）のアルギニン塩酸塩を含むPH６の溶液
を通過させウロキナーゼを溶出した。溶出液より
アルギニン塩酸塩を除去し、比活性72000国際単
位／mg蛋白の精製ウロキナーゼを91％の回収率で
得た。Preferred examples include [Formula] (phenyl octyl group). As the water-insoluble carrier, any water-insoluble carrier into which the above groups () can be introduced can be used, and specific examples include agarose, cellulose, Cephacryl (manufactured by Pharmacia), Cephadex (manufactured by Pharmacia), etc. Preferred examples include water-insoluble polysaccharides, polyvinyl gels, and the like. Examples of water-insoluble carriers having such a group ( ) include butyl toyopearl (manufactured by Toyo Soda Kogyo Co., Ltd.), alkyl agarose series (manufactured by Miles Co., Ltd.), phenyl octyl cepharose, octyl cephalose (manufactured by Pharmacia Co., Ltd.), alkyl Agarose series (manufactured by Miles), ω-
Amino alkyl agarose series (manufactured by Miles Corporation) and the like are currently commercially available, and other products can be easily produced by the same method as commercially available products or a method analogous thereto. The urokinase adsorption step in the present invention is generally carried out by bringing crude urokinase into contact with a water-insoluble carrier having the group (), and the contact is carried out by means known per se as an adsorption operation means, such as by contacting crude urokinase with a water-insoluble carrier having the group (). This is carried out by passing crude urokinase through a column packed with an insoluble carrier. Crude urokinase is generally subjected to an adsorption treatment in the form of an aqueous solution with a water-insoluble carrier having groups (). At this time, it is preferable to add an appropriate amount of salt to increase the hydrophobicity of the solvent in order to adsorb urokinase. As the salt to be added, any salt that is commonly used to increase the salt concentration when adsorbing the enzyme to the adsorbent can be used. Particularly preferred salts include monovalent neutral salts such as common salt, potassium chloride, and magnesium chloride. The salts are preferably added at a concentration of 0.5 to 3M. Furthermore, it is not necessary to set a specific range for the pH during adsorption, but a neutral range (6 to 8) is preferred. Adsorbed urokinase can be eluted by lowering the hydrophobicity of the solvent, but even if only the salt concentration is lowered, it is difficult to obtain a sufficient recovery rate, and the purification effect is usually not improved. As a result of research into elution methods to solve this problem, the present inventors found that the recovery rate of urokinase can be increased by elution of urokinase with a compound having at least two amino groups or a salt thereof. I found it. The amino group in the compound having at least two amino groups may be in the form of an amidino group, and examples of the salt include mineral acid salts such as hydrochloride and sulfate. Such compounds and their salts include diaminomonocarboxylic acids such as lysine and arginine;
Examples include mineral acid salts such as hydrochloride and sulfate, and it is preferable to use them in a 5-15% (w/v) aqueous solution. The eluate of urokinase thus purified can be desalted, concentrated, and highly purified by conventional methods to obtain urokinase that can be used as a pharmaceutical product. Since the adsorption carrier and eluent used in the method of the present invention each adsorb or elute urokinase more selectively, purified urokinase can be recovered from crude urokinase with high purity and high yield by the method of the present invention. Is possible. Therefore, the method of the present invention is extremely advantageous as a method for producing urokinase on an industrial scale. The present invention will be explained in detail below with reference to Examples. Example 1 Extracted from human urine, conductivity was 4-5m mho/cm
4ml of crude urokinase solution prepared at (25℃)
(20000 international units/ml, specific activity 35000 international units/mg
Dissolve 1M amount of potassium chloride in protein) and adjust the pH to 6.9.
It was prepared as follows. Fill the column with 2 ml (column volume) of butyl agarose (manufactured by Miles),
1M potassium chloride was dissolved in a 0.0725M phosphate solution and the solution was equilibrated to pH 6.9.
The previously prepared urokinase solution was passed through this to adsorb urokinase, and then washed with an equilibration solution. Thereafter, a PH6 solution containing 10% (w/v) lysine hydrochloride was passed through to elute urokinase. Lysine hydrochloride was removed from the eluate, and urokinase with a specific activity of 70,000 international units/mg protein was obtained with a recovery rate of 85%. Example 2 Extracted from human urine, conductivity was 4-5m mho/cm
4ml of crude urokinase solution prepared at (25℃)
(20000 international units/ml, specific activity 35000 international units/mg
Dissolve 1M amount of potassium chloride in protein) and adjust the pH to 6.9.
It was prepared as follows. Fill the column with 2 ml (column volume) of Butyl Toyopearl (manufactured by Toyo Soda Kogyo),
1M potassium chloride was dissolved in a 0.0725M phosphate solution and the solution was equilibrated to pH 6.9.
The previously prepared urokinase solution was passed through this to adsorb urokinase, and then washed with an equilibration solution. Thereafter, a pH 6.0 solution containing 10% (w/v) arginine hydrochloride was passed through to elute urokinase. The elution rate at this time was 95%. After this, arginine hydrochloride was removed and the specific activity
Urokinase of 75000 international units/mg protein was obtained with 85% recovery. Example 3 32 ml of tissue culture-derived crude urokinase solution (5000
international units/ml, specific activity 6000 international units/mg protein)
A 0.8M amount of sodium chloride was dissolved and the pH was adjusted to 6.9. The column was filled with 4 ml (column volume) of Butyl Toyopearl (manufactured by Toyo Soda Kogyo) and 0.0725 M
0.8 M of sodium chloride was dissolved in a phosphate solution, and the solution was equilibrated to a pH of 6.9. After adsorbing the previously prepared urokinase,
Washed with equilibration solution. Then 10% (w/v)
A pH 6.0 solution containing arginine hydrochloride was passed through the tube to elute urokinase. After this, arginine hydrochloride was removed, and urokinase with a specific activity of 60,000 international units/mg protein was obtained with a recovery rate of 90%. Example 4 Extracted from human urine, conductivity was 4-5m mho/cm
50ml of crude urokinase solution prepared at (25℃)
(3500 international units/ml, specific activity 350 international units/mg protein) by dissolving 3.5M amount of sodium chloride and adjusting the pH.
Prepared in 6.8. Fill the column with 25 ml (column volume) of phenyl octyl separose,
3.5M amount of sodium chloride was dissolved in 0.05M phosphate solution and the solution was equilibrated to pH 6.8. The previously prepared urokinase solution was passed through this to adsorb urokinase, and then washed with an equilibration solution. Thereafter, a PH6 solution containing 10% (w/v) arginine hydrochloride was passed through to elute urokinase. When arginine hydrochloride was removed from the eluate and purified using a weakly acidic cation exchanger, urokinase with a specific activity of 50,000 international units/mg protein was obtained with a recovery rate of 80%. Example 5 Extracted from human urine, conductivity was 4-5m mho/cm
Partially purified crude urokinase solution prepared at (25℃)
To 100 ml (20000 international units/ml, specific activity 7000 international units/mg protein), 2.0 M of potassium chloride was added to adjust the pH to 6.8. 80ml (column volume)
Fill the column with octyl agarose of
2.0M potassium chloride was dissolved in a 0.05M phosphate solution and the solution was equilibrated to pH 6.8.
The previously prepared urokinase solution was passed through this to adsorb urokinase, and then washed with an equilibration solution. Thereafter, a PH6 solution containing 10% (w/v) lysine hydrochloride was passed through to elute urokinase. Remove lysine hydrochloride from the eluate,
Purified urokinase of 60000 international units/mg protein 84
% recovery was obtained. Example 6 2.0 M potassium chloride was dissolved in 100 ml of the crude urokinase solution of Example 5, and the pH was adjusted to 6.8.
Fill the column with 80 ml (column volume) of aminooctylcephalose and add to the 0.05 M phosphate solution.
Equilibration was carried out through a solution in which 2.0 M of potassium chloride was dissolved and the pH was adjusted to 6.8. The previously prepared urokinase solution was passed through this to adsorb urokinase, and then washed with an equilibration solution. Then 10%
Urokinase was eluted by passing through a PH6 solution containing (w/v) arginine hydrochloride. Arginine hydrochloride was removed from the eluate, and purified urokinase with a specific activity of 72,000 international units/mg protein was obtained with a recovery rate of 91%.
【特許請求の範囲】[Claims]
【表】【table】