JPH054074B2 - - Google Patents
Info
- Publication number
- JPH054074B2 JPH054074B2 JP57156229A JP15622982A JPH054074B2 JP H054074 B2 JPH054074 B2 JP H054074B2 JP 57156229 A JP57156229 A JP 57156229A JP 15622982 A JP15622982 A JP 15622982A JP H054074 B2 JPH054074 B2 JP H054074B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- hla
- cells
- mouse
- antibody
- cultured
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
近年、ヒト主要組織適合系（以下HLAと略称）
に関する研究が臓器移植、疾患関連性、免疫応答
機構、人類学、遺伝学、輸血学、法医学の領域に
導入されるにつれて、HLA分析の重要性と需要
が増加し、それに伴つて選択性と活性の強い
HLA抗体を得ることが重要となつてきている。 従来、HLA分析には妊婦の血液がら採取した
HLA抗体が用いられているが、量的にも限度が
あり、また活性面でもさらに高いものが望まれて
いる。 最近、抗体製造の分野にもリンパ球とミエロー
マ細胞を融合させたハイブリドーマを用いる方法
が実用化段階に入りつつあり、HLA抗体につい
てもマウス・ハイブリドーマを用いる方法が研究
され、実用化されつつある。しかし、ヒトのアロ
抗原であるHLA抗原を認識する抗体をマウスの
リンパ球で作られる場合、特異性の高い抗体を得
ることが難しい。 この発明の発明者は、かかる状況下において、
ヒトのHLA−DR抗原を有するヒトのＢリンパ球
をマウスに免疫させ、免疫させたマウスからＢリ
ンパ球を取り出し、マウス・ミエローマ細胞と細
胞融合させ、クローニングすることによつて、妊
婦の血液から採取したHLA抗体におきかえて
HLA分析に用いることが可能な単クローン性抗
体を得ることに成功した。これらの単クローン性
抗体はHLA−DR抗原に対し新規な型特異性を有
する。 この発明はHLA−DR抗原に対し新規な型特異
性を有する５種の単クローン性抗体、即ち マウス・ハイブリドーマにより産生され、
HLA−DR2、HLA−DRw6.2およびHLA−
DRw9を有するヒト培養リンパ芽球様細胞に反
応するが、前記抗原を有せずHLA−DR1、
HLA−DRw6、HLA−DR7およびHLA−
8wDRw6Yを有するヒト培養リンパ芽球様細胞
に反応しないイムノグロブリンG2aクラスの抗
体、 マウス・ハイブリドーマにより産生され、
HLA−DR1、HLA−DR2、HLA−
8wDRw6YおよびHLA−DRw9を有するヒト
培養リンパ芽球様細胞に反応するが、前記抗原
を有せずHLA−DRw6.2、HLA−DRw6およ
びHLA−DR7を有するヒト培養リンパ芽球様
細胞に反応しないイムノグロブリンG2aクラス
の抗体、 マウス・ハイブリドーマにより産生され、
HLA−DR1、HLA−DR2、HLA−
8wDRw6YおよびHLA−DRw9を有するヒト
培養リンパ芽球様細胞に反応するが、前記抗原
を有せずHLA−DRw6.2、HLA−DRw6およ
びHLA−DR7を有するヒト培養リンパ芽球様
細胞に反応しないイムノグロブリンＭクラスの
抗体、 マウス・ハイブリドーマにより産生され、
HLA−DR1、HLA−DR2、HLA−
8wDRw6Y、HLA−DRw6.2およびHLA−
DRw9を有するヒト培養リンパ芽球様細胞に反
応するが、前記抗原を有せずHLA−DRw6お
よびHLA−DR7を有するヒト培養リンパ芽球
様細胞に反応しないイムノグロブリンG2aクラ
スの抗体、 マウス・ハイブリドーマにより産生され、
HLA−8wDRw6Y、HLA−DRw6.2、HLA−
DR7およびHLA−DRw9を有するヒト培養リ
ンパ芽球様細胞に反応するが、前記抗原をは有
せずHLA−DR1、HLA−DR2およびHLA−
DRw6を有するヒト培養リンパ芽球様細胞に反
応しないイムノグロブリンG3クラスの抗体で
ある単クローン性抗体に関するものである。 次にこの発明の単クローン性抗体およびこれら
の単クローン性抗体を産生するマウス・ハイブリ
ドーマの製造法を説明する。 HLA−Ｄ抗原およびHLA−DR抗原をホモに
有するヒト・Ｂリンパ球Sh（またはHOまたは
HORまたはKy）にEBウイルスを感染させてin
vitroで増殖可能なリンパ芽球様細胞とする。一
方HLA−Ｄ抗原およびHLA−DR抗原をホモに
有するヒト培養リンパ芽球様細胞であるLG−10
はそのままin vitroで増殖させて用いる。上記の
方法で得られたそれぞれのリンパ芽球様細胞をマ
ウスに感作させた後、それぞれのマウスから脾臓
を摘出し、脾細胞懸濁液を調製する。ついでそれ
ぞれをマウス（リンパ芽球様細胞を感作させたの
と同系統のマウス）のミエローマ細胞と混合し、
ポリエチレングリコールを用いて融合させる。上
記の方法で得られたそれぞれのハイブリドーマを
常法により培養後、それぞれ対応するヒト・Ｂリ
ンパ球Sh（またはHOまたはHORまたはKyまた
はLG−10）に対し細胞毒性が陽性のものを選び
出す。このようにして得られたものをそれぞれ、
例えばフイブリンゲルプレートを用いる方法等の
常法によつてクローニングし、産生する単クロー
ン性抗体の特異性を調べ目的とする単クローン性
抗体を得る。 また目的とするマウス・ハイブリドーマは目的
とする単クローン性抗体を産生するマウス・ハイ
ブリドーマを常法により採取することによつて得
る。 上記操作法について、以下にさらに詳細に説明
する。 ヒト・Ｂリンパ球をマウスに感作させる実施態
様としては、例えば２〜４×107個程度の培養し
たヒト・Ｂリンパ球をまずマウスの腹腔に投与し
て感作させ、必要に応じて例えば１〜３週間後に
２〜４×107個程度の培養したヒト・Ｂリンパ球
を静注または／および腹腔投与する等の方法が挙
げられるが、要は該ヒト・Ｂリンパ球がマウスに
感作され、必要とする抗体産生細胞が得られれば
よいのであり、従つて上述の実施態様に限定され
るものでないのは勿論である。 この発明の単クローン性抗体を得るために用い
るマウスとしては特に限定されるものではない
が、ハイブリツドーマを比較的容易に得るために
は融合させるミエローマ細胞が由来するマウスと
同系統のマウスを用いるのが望ましい。 先に抗原として、また後に培養リンパ芽球様細
胞に対する細胞毒性試験に用いたヒト・Ｂリンパ
球の性質を示すと表１の通りである。
に関する研究が臓器移植、疾患関連性、免疫応答
機構、人類学、遺伝学、輸血学、法医学の領域に
導入されるにつれて、HLA分析の重要性と需要
が増加し、それに伴つて選択性と活性の強い
HLA抗体を得ることが重要となつてきている。 従来、HLA分析には妊婦の血液がら採取した
HLA抗体が用いられているが、量的にも限度が
あり、また活性面でもさらに高いものが望まれて
いる。 最近、抗体製造の分野にもリンパ球とミエロー
マ細胞を融合させたハイブリドーマを用いる方法
が実用化段階に入りつつあり、HLA抗体につい
てもマウス・ハイブリドーマを用いる方法が研究
され、実用化されつつある。しかし、ヒトのアロ
抗原であるHLA抗原を認識する抗体をマウスの
リンパ球で作られる場合、特異性の高い抗体を得
ることが難しい。 この発明の発明者は、かかる状況下において、
ヒトのHLA−DR抗原を有するヒトのＢリンパ球
をマウスに免疫させ、免疫させたマウスからＢリ
ンパ球を取り出し、マウス・ミエローマ細胞と細
胞融合させ、クローニングすることによつて、妊
婦の血液から採取したHLA抗体におきかえて
HLA分析に用いることが可能な単クローン性抗
体を得ることに成功した。これらの単クローン性
抗体はHLA−DR抗原に対し新規な型特異性を有
する。 この発明はHLA−DR抗原に対し新規な型特異
性を有する５種の単クローン性抗体、即ち マウス・ハイブリドーマにより産生され、
HLA−DR2、HLA−DRw6.2およびHLA−
DRw9を有するヒト培養リンパ芽球様細胞に反
応するが、前記抗原を有せずHLA−DR1、
HLA−DRw6、HLA−DR7およびHLA−
8wDRw6Yを有するヒト培養リンパ芽球様細胞
に反応しないイムノグロブリンG2aクラスの抗
体、 マウス・ハイブリドーマにより産生され、
HLA−DR1、HLA−DR2、HLA−
8wDRw6YおよびHLA−DRw9を有するヒト
培養リンパ芽球様細胞に反応するが、前記抗原
を有せずHLA−DRw6.2、HLA−DRw6およ
びHLA−DR7を有するヒト培養リンパ芽球様
細胞に反応しないイムノグロブリンG2aクラス
の抗体、 マウス・ハイブリドーマにより産生され、
HLA−DR1、HLA−DR2、HLA−
8wDRw6YおよびHLA−DRw9を有するヒト
培養リンパ芽球様細胞に反応するが、前記抗原
を有せずHLA−DRw6.2、HLA−DRw6およ
びHLA−DR7を有するヒト培養リンパ芽球様
細胞に反応しないイムノグロブリンＭクラスの
抗体、 マウス・ハイブリドーマにより産生され、
HLA−DR1、HLA−DR2、HLA−
8wDRw6Y、HLA−DRw6.2およびHLA−
DRw9を有するヒト培養リンパ芽球様細胞に反
応するが、前記抗原を有せずHLA−DRw6お
よびHLA−DR7を有するヒト培養リンパ芽球
様細胞に反応しないイムノグロブリンG2aクラ
スの抗体、 マウス・ハイブリドーマにより産生され、
HLA−8wDRw6Y、HLA−DRw6.2、HLA−
DR7およびHLA−DRw9を有するヒト培養リ
ンパ芽球様細胞に反応するが、前記抗原をは有
せずHLA−DR1、HLA−DR2およびHLA−
DRw6を有するヒト培養リンパ芽球様細胞に反
応しないイムノグロブリンG3クラスの抗体で
ある単クローン性抗体に関するものである。 次にこの発明の単クローン性抗体およびこれら
の単クローン性抗体を産生するマウス・ハイブリ
ドーマの製造法を説明する。 HLA−Ｄ抗原およびHLA−DR抗原をホモに
有するヒト・Ｂリンパ球Sh（またはHOまたは
HORまたはKy）にEBウイルスを感染させてin
vitroで増殖可能なリンパ芽球様細胞とする。一
方HLA−Ｄ抗原およびHLA−DR抗原をホモに
有するヒト培養リンパ芽球様細胞であるLG−10
はそのままin vitroで増殖させて用いる。上記の
方法で得られたそれぞれのリンパ芽球様細胞をマ
ウスに感作させた後、それぞれのマウスから脾臓
を摘出し、脾細胞懸濁液を調製する。ついでそれ
ぞれをマウス（リンパ芽球様細胞を感作させたの
と同系統のマウス）のミエローマ細胞と混合し、
ポリエチレングリコールを用いて融合させる。上
記の方法で得られたそれぞれのハイブリドーマを
常法により培養後、それぞれ対応するヒト・Ｂリ
ンパ球Sh（またはHOまたはHORまたはKyまた
はLG−10）に対し細胞毒性が陽性のものを選び
出す。このようにして得られたものをそれぞれ、
例えばフイブリンゲルプレートを用いる方法等の
常法によつてクローニングし、産生する単クロー
ン性抗体の特異性を調べ目的とする単クローン性
抗体を得る。 また目的とするマウス・ハイブリドーマは目的
とする単クローン性抗体を産生するマウス・ハイ
ブリドーマを常法により採取することによつて得
る。 上記操作法について、以下にさらに詳細に説明
する。 ヒト・Ｂリンパ球をマウスに感作させる実施態
様としては、例えば２〜４×107個程度の培養し
たヒト・Ｂリンパ球をまずマウスの腹腔に投与し
て感作させ、必要に応じて例えば１〜３週間後に
２〜４×107個程度の培養したヒト・Ｂリンパ球
を静注または／および腹腔投与する等の方法が挙
げられるが、要は該ヒト・Ｂリンパ球がマウスに
感作され、必要とする抗体産生細胞が得られれば
よいのであり、従つて上述の実施態様に限定され
るものでないのは勿論である。 この発明の単クローン性抗体を得るために用い
るマウスとしては特に限定されるものではない
が、ハイブリツドーマを比較的容易に得るために
は融合させるミエローマ細胞が由来するマウスと
同系統のマウスを用いるのが望ましい。 先に抗原として、また後に培養リンパ芽球様細
胞に対する細胞毒性試験に用いたヒト・Ｂリンパ
球の性質を示すと表１の通りである。
【表】
性を示す
得られた単クローン性抗体の性質を示すと表２
の通りである。
得られた単クローン性抗体の性質を示すと表２
の通りである。
【表】
また得られた単クローン性抗体の種々の 125I
−ラベル膜抗原との結合性並びにオクタローニ法
によつて測定したイムノグロブリン・クラスを示
すと表３の通りである。
−ラベル膜抗原との結合性並びにオクタローニ法
によつて測定したイムノグロブリン・クラスを示
すと表３の通りである。
【表】
次にこの発明で得られた単クローン性抗体の
HLD−DRタイプの判明しているヒト末梢血から
分離したＴリンパ球とＢリンパ球に対する反応を
常法のHLAタイピング細胞毒性試験を用いて調
べた結果、次のような特異性を示した。SH−２−60−１抗体 検体数：54
HLD−DRタイプの判明しているヒト末梢血から
分離したＴリンパ球とＢリンパ球に対する反応を
常法のHLAタイピング細胞毒性試験を用いて調
べた結果、次のような特異性を示した。SH−２−60−１抗体 検体数：54
【表】
【表】
不明
なお、この抗体はそれぞれの検体のＴリンパ球
とは反応しなかつた。HO−３−43−４抗体 検体数：54
なお、この抗体はそれぞれの検体のＴリンパ球
とは反応しなかつた。HO−３−43−４抗体 検体数：54
【表】
【表】
不明
なお、この検体はそれぞれの検体のＴリンパ球
とは反応しなかつた。HOR−２−16−２抗体 検体数：54
なお、この検体はそれぞれの検体のＴリンパ球
とは反応しなかつた。HOR−２−16−２抗体 検体数：54
【表】
不明
なお、この抗体はそれぞれの検体のＴリンパ球
とは反応しなかつた。 ＊あらかじめ１週間前にプリスタンを投与してお
いたマウス（Balb／ｃ、♀）の腹腔内に１×
107個の該ハイブリドーマを移植し、移植後14
日後に開腹し、腹水を得た。Ky−６−16−23抗体 検体数：54
なお、この抗体はそれぞれの検体のＴリンパ球
とは反応しなかつた。 ＊あらかじめ１週間前にプリスタンを投与してお
いたマウス（Balb／ｃ、♀）の腹腔内に１×
107個の該ハイブリドーマを移植し、移植後14
日後に開腹し、腹水を得た。Ky−６−16−23抗体 検体数：54
【表】
不明
なお、この抗体はそれぞれの検体のＴリンパ球
とは反応しなかつた。Dw7−３−５−10抗体 検体数：53
なお、この抗体はそれぞれの検体のＴリンパ球
とは反応しなかつた。Dw7−３−５−10抗体 検体数：53
【表】
不明
なお、この抗体はそれぞれの検体のＴリンパ球
とは反応しなかつた。 ＊あらかじめ１週間前にプリスタンを投与してお
いたマウス（Balb／ｃ、♀）に１×107個の該
ハイブリドーマを移植し、移植後14日後に開腹
し、腹水を得た。 上記データから、この発明の単クローン性抗体
はいずれもヒトのアロ抗原であるHLA抗原との
相関性が高く、HLA分析に経産婦HLA抗体にお
きかえて使用することが可能であることが判明し
た。 次に実施例に基づきこの発明をさらに詳しく説
明する。 実施例 １ ヒト・リンパ球Shの培養細胞にEBウイルスを
感染させて得られたリンパ芽球様細胞をin vitro
で増殖させ、その細胞を10％牛胎児血清添加
RPMI1640培地を用いて37℃、５％炭酸ガス気流
中で培養増殖させ、その４×107個をBalb／ｃマ
ウス（♀）の腹腔に生理食塩水に懸濁させて投与
した。投与24日後に、さらに上記細胞の1.5×107
個を静脈内に、1.5×107個を腹腔内に投与した。
その３日後そのマウスを開腹し脾臓を摘出し脾細
胞懸濁液を調製した。その脾細胞懸濁液とマウ
ス・ミエローマP3／×63Ag8U1細胞懸濁液
（Ba1b／ｃマウス由来のミエローマ）を10：１の
細胞比で混合し遠心分離後45％ポリエチレングリ
コール（シグマ社、分子量4000）を徐々に滴下し
６分間室温で放置させて細胞を融合させた。この
融合細胞を15％牛胎児血清添加ダルベツコ改変イ
ーグル最小栄養培地（２ｍＭグルタミン、５×
10-5M2−メルカプトエタノール、80μｇ／mlゲン
タミシン硫酸塩、100単位／mlペニシリンＧ、
100μｇ／mlストレプトマイシン硫酸塩を含む）
に懸濁してリンブロ（Linbro）社の24ウエルプ
レートに植え込み、翌日、翌々日およびその後２
〜３日毎にHAT培地（ヒポキサンチン、アメト
プリテン、チミジン添加培地）で半量交換して融
合細胞のみを生育させた。培養11日後の培養液に
ついて抗体産生の有無をSh細胞に対する細胞毒
性試験で調べた。細胞毒性試験はHLAタイピン
グ用プレートの各ウエルにウエル当り2μの培
養上清と2μの細胞懸濁液（１×106個／ml）と
5μのウサギ補体を入れて37℃で２時間保ち、
倒立顕微鏡で生死を観察する方法に依つた。表１
に挙げた細胞のうちSh細胞以外のＢリンパ球培
養細胞およびＴリンパ球培養細胞（CCRF−
CEM細胞およびHSB−２細胞）に対する作用を
調べ、後者には作用せず前者の一部に作用する培
養液を選んだ。このようにして選別した培養細胞
をフイブリンゲルプレート（直径６cmのデイツシ
ユに１mlの0.25％シグマ社製フイブリノーゲン溶
液を加え、0.02単位／mlのトロンビンを含有する
RPMI培地４mlを加えて調製した）に10、200、
500および1000個接種し、10日間培養後１個の細
胞に由来すると考えられるコロニーを選びクロー
ンとした。 抗体のDR型特異性はクローニングした細胞の
培養３日目の培養上清を上記の細胞毒性試験の条
件下で表１に挙げた細胞に対する作用の有無によ
つて調べた。 抗体がHLA−DR抗体であることの確認は表３
に挙げた 125Iでラベルした膜可溶化HLA−DR抗
原との結合をアクリルアミドゲル電気泳動で調
べ、35000ダルトン鎖（α鎖）と27000ダルトン鎖
（β鎖）と反応していることに依つた。 抗マウスイムノグロブリン重鎖ウサギ抗体を用
いてオクタロニー法により抗体のイムノグロブリ
ンクラスを調べ、20倍濃縮培養上清の沈降線の生
成から、イムノグロブリンG2aクラスと判定し
た。 以上の結果から、マウス・ハイブリドーマ
（Mouse hybridoma）SH−２−60−１抗体は、
HLA−DR2、HLA−DRw6.2およびHLA−
DRw9に対し特異的に反応することが判明した。 実施例 ２ HLA−DH0をホモに有するヒト・リンパ球H0
の培養細胞にEBウイルスを感染させin vitroで
増殖可能なリンパ芽球様細胞とした。この細胞を
10％牛胎児血清添加RPMI1640培地を用いて37℃
で５％炭酸ガス気流中で培養増殖させ、その1.4
×107個をBalb／ｃマウス（♀）の腹腔に生理食
塩水に懸濁させて投与した。投与17日後に、さら
に上記細胞の２×107個を静脈内に、２×107個を
腹腔内に投与した。その３日後にそのマウスを開
腹し脾臓を摘出し脾細胞懸濁液を調製した。その
脾細胞懸濁液とマウス・ミエローマP3／×
63Ag8U1細胞懸濁液（Balb／ｃマウス由来のミ
エローマ）を10：１の細胞比で混合し遠心分離後
45％ポリエチレングリコール（シグマ社、分子量
4000）を徐々に滴下し６分間室温で放置させて細
胞を融合させた。この融合細胞を15％牛胎児血清
添加ダルベツコ改変イーグル最小栄養培地（２ｍ
Ｍグルタミン、５×10-5M2−メルカプトエタノ
ール、80μｇ／mlゲンタミシン硫酸塩、100単
位／mlペニシリンＧ、100μｇ／mlストレプトマ
イシン硫酸塩を含む）に懸濁してリンブロ
（Linbro）社の24ウエルプレートに植え込み、翌
日、翌々日およびその後２〜３日毎にHAT培地
（ヒポキサンチン、アメトプリテン、チミジン添
加培地）で半量交換して融合細胞のみを生育させ
た。培養11日後の培養液について抗体産生の有無
をHO細胞に対する細胞毒性試験で調べた。細胞
毒性試験はHLAタイピング用プレートの各ウエ
ルにウエル当り2μの培養上清と2μの細胞懸
濁液（１×106個／ml）と5μのウサギ補体を入
れて37℃で２時間保ち、倒立顕微鏡で生死を観察
する方法に依つた。表１に挙げた細胞のうち細胞
以外のＢリンパ球培養細胞およびＴリンパ球培養
細胞（CCRF−CEM細胞およびHSB−２細胞）
に対する作用を調べ、後者には作用せず前者の一
部に作用する培養液を選んだ。このようにして選
別した培養細胞をフイブリンゲルプレート（直径
６cmのデイツシユに１mlの0.25％シグマ社製フイ
ブリノーゲン溶液を加え、0.002単位／mlのトロ
ンビンを含有するRPMI培地４mlを加えて調製し
た）に10、200、500および1000個接種し、10日間
培養後１個の細胞に由来すると考えられるコロニ
ーを選びクローンとした。 抗体のDR型特異性はクローニングした細胞の
培養３日目の培養上清を上記の細胞毒性試験の条
件下で表１に挙げた細胞に対する作用の有無によ
つて調べた。 抗体がHLA−DR抗体であることの確認は表３
に挙げた 125Iでラベルした膜可溶化HLA−DR抗
原との結合をアクリルアミドゲル電気泳動で調
べ、35000ダルトン鎖（α鎖）と27000ダルトン鎖
（β鎖）と反応していることに依つた。 抗マウスイムノグロブリン重鎖ウサギ抗体を用
いてオクタロニー法により抗体のイムノグロブリ
ンクラスを調べ、20倍濃縮培養上清の沈降線の生
成から、イムノグロブリンG2aクラスと判定し
た。 以上の結果から、マウス・ハイブリドーマ
（Mouse hybridoma）HO−３−43−４抗体は、
HLA−DR1、HLA−DR2、HLA−8wDRw6Y
およびHLA−DRw9に対し特異的に反応するこ
とが判明した。 実施例 ３ HLA−DEnをホモに有するヒト・リンパ球
HORの培養細胞にEBウイルスを感染させin
vitroで増殖可能なリンパ芽球様細胞とした。こ
の細胞を10％牛胎児血清添加RPMI1640培地を用
いて37℃で５％炭酸ガス気流中で培養増殖させ、
その3.5×107個をBalb／ｃマウス（♀）の腹腔に
生理食塩水に懸濁させて投与した。投与10日後
に、さらに上記細胞の４×107個を腹腔内に投与
した。その４日後にそのマウスを開腹し脾臓を摘
出し脾細胞懸濁液を調製した。その脾細胞懸濁液
とマウス・ミエローマP3／×63Ag8U1細胞懸濁
液（Banb／ｃマウス由来のミエローマ）を10：
１の細胞比で混合し遠心分離後45％ポリエチレン
グリコール（シグマ社、分子量4000）を徐々に滴
下し６分間室温で放置させて細胞を融合させた。
この融合細胞を15％牛胎児血清添加ダルベツコ改
変イーグル最小栄養培地（２ｍＭグルタミン．５
×10-5M2−メルカプトエタノール、80μｇ／mlゲ
ンタミシン硫酸塩、100単位／mlペニシリンＧ、
100μｇ／mlストレプトマイシン硫酸塩を含む）
に懸濁してリンブロ（Linbro）社の24ウエルプ
レートに植え込み、翌日、翌々日およびその後２
〜３日毎にHAT培地（ヒポキサンチン、アメト
プリテン、チミジン添加培地）で半量交換して融
合細胞のみを生育させた。培養11日後の培養液に
ついて抗体産生の有無をHOR細胞に対する細胞
毒性試験で調べた。細胞毒性試験はHLAタイピ
ング用プレートの各ウエルにウエル当り2μの
培養上清と2μの細胞懸濁液（１×106個／ml）
と5μのウサギ補体を入れて37℃で２時間保ち、
倒立顕微鏡で生死を観察する方法に依つた。表１
に挙げた細胞のうちHOR細胞以外のＢリンパ球
培養細胞およびＴリンパ球培養細胞（CCRF−
CEM細胞およびHSB−２細胞）に対する作用を
調べ、後者には作用せず前者の一部に作用する培
養液を選んだ。このようにして選別した培養細胞
をフイブリンゲルプレート（直径６cmのデイツシ
ユに１mlの0.25％シグマ社製フイブリノーゲン溶
液を加え、0.002単位／mlのトロンビンを含有す
るRPMI培地４mlを加えて調製した）に10、200、
500および1000個接種し、10日間培養後１個の細
胞に由来すると考えられるコロニーを選びクロー
ンとした。 抗体のDR型特異性はクローニングした細胞の
培養３日目の培養上清を上記の細胞毒性試験の条
件下で表１に挙げた細胞に対する作用の有無によ
つて調べた。 抗体がHLA−DR抗体であることの確認は表３
に挙げた 125Iでラベルした膜可溶化HLA−DR抗
原との結合をアクリルアミドゲル電気泳動で調
べ、35000ダルトン鎖（α鎖）と27000ダルトン鎖
（β鎖）と反応していることに依つた。 抗マウスイムノグロブリン重鎖ウサギ抗体を用
いてオクタロニー法により抗体のイムノグロブリ
ンクラスを調べ、20倍濃縮培養上清の沈降線の生
成から、イムノグロブリンＭクラスと判定した。 以上の結果から、マウス・ハイブリドーマ
（Mouse hybridoma）HOR−２−16−２抗体は、
HLA−DR1、HLA−DR2、HLA−8wDRwYお
よびHLA−DRw9に対し特異的に反応すること
が判明した。 実施例 ４ HLA−DKyをホモに有するヒト・リンパ球Ky
の培養細胞にEBウイルスを感染させin vitroで
増殖可能なリンパ芽球様細胞とした。この細胞を
10％牛胎児血清添加RPMI1640培地を用いて37℃
で５％炭酸ガス気流中で培養増殖させ、その４×
107個をBalb／ｃマウス（♀）の腹腔に生理食塩
水に懸濁させて投与した。投与10日後に、さらに
上記細胞の４×107個を腹腔内に投与した。その
３日後そのマウスを開腹し脾臓を摘出し脾細胞懸
濁液を調製した。その脾細胞懸濁液とマウス・ミ
エローマP3／×63Ag8U1細胞懸濁液（Balb／ｃ
マウス由来のミエローマ）を10：１の細胞比で混
合し遠心分離後45％ポリエチレングリコール（シ
グマ社、分子量4000）を徐々に滴下し６分間室温
で放置させて細胞を融合させた。この融合細胞を
15％牛胎児血清添加ダルベツコ改変イーグル最小
栄養培地（２ｍＭグルタミン．５×10-5M2−メ
ルカプトエタノール、80μｇ／mlゲンタミシン硫
酸塩、100単位／mlペニシリンＧ、100μｇ／mlス
トレプトマイシン硫酸塩を含む）に懸濁してリン
ブロ（Linbro）社の24ウエルプレートに植え込
み、翌日、翌々日およびその後２〜３日毎に
HAT培地（ヒポキサンチン、アメトプリテン、
チミジン添加培地）で半量交換して融合細胞のみ
を生育させた。培養11日後の培養液について抗体
産生の有無をKy細胞に対する細胞毒性試験で調
べた。細胞毒性試験はHLAタイピング用プレー
トの各ウエルにウエル当り2μの培養上清と2μ
の細胞懸濁液（１×106個／ml）と5μのウサ
ギ補体を入れて37℃で２時間保ち、倒立顕微鏡で
生死を観察する方法に依つた。表１に挙げた細胞
のうちKy細胞以外のＢリンパ球培養細胞および
Ｔリンパ球培養細胞（CCRF−CEM細胞および
HSB−２細胞）に対する作用を調べ、後者には
作用せず前者の一部に作用する培養液を選んだ。
このようにして選別した培養細胞をフイブリンゲ
ルプレート（直径６cmのデイツシユに１mlの0.25
％シグマ社製フイブリノーゲン溶液を加え、
0.002単位／mlのトロンビンを含有するRPMI培
地４mlを加えて調製した）に10、200、500および
1000個接種し、10日間培養後１個の細胞に由来す
ると考えられるコロニーを選びクローンとした。 抗体のDR型特異性はクローニングした細胞の
培養３日目の培養上清を上記の細胞毒性試験の条
件下で表１に挙げた細胞に対する作用の有無によ
つて調べた。 抗体がHLA−DR抗体であることの確認は表３
に挙げた 125Iでラベルした膜可溶化HLA−DR抗
原との結合をアクリルアミドゲル電気泳動で調
べ、35000ダルトン鎖（α鎖）と27000ダルトン鎖
（β鎖）と反応していることに依つた。 抗マウスイムノグロブリン重鎖ウサギ抗体を用
いてオクタロニー法により抗体のイムノグロブリ
ンクラスを調べ、20倍濃縮培養上清の沈降線の生
成から、イムノグロブリンG2aクラスと判定し
た。 以上の結果から、マウス・ハイブリドーマ
（Mouse hybridoma）Ky6−16−23抗体は、
HLA−DR1、HLA−DR2、HLA−8wDRw6Y、
HLA−DRw6.2およびHLA−DRw9に対し特異
的に反応することが判明した。 実施例 ５ HLA−Dw7をホモに有するヒト・リンパ芽球
様細胞LG−10を10％牛胎児血清添加RPMI1640
培地を用いて37℃で５％炭酸ガス気流中で培養増
殖させ、その４×107個をBalb／ｃマウス（♀）
の腹腔に生理食塩水に懸濁させて投与した。投与
14日後に、さらに上記細胞の1.5×107個を静脈内
に、1.5×107個を腹腔内に投与した。その３日後
にそのマウスを開腹し脾臓を摘出し脾細胞懸濁液
を調製した。その脾細胞懸濁液とマウス・ミエロ
ーマP3／×63Ag8U1細胞懸濁液（Ba1b／ｃマウ
ス由来のミエローマ）を10：１の細胞比で混合し
遠心分離後45％ポリエチレングリコール（シグマ
社、分子量4000）を徐々に滴下し６分間室温で放
置させて細胞を融合させた。この融合細胞を15％
牛胎児血清添加ダルベツコ改変イーグル最小栄養
培地（２ｍＭグルタミン、５×10-5M2−メルカ
プトエタノール、80μｇ／mlゲンタミシン硫酸
塩、100単位／mlペニシリンＧ、100μｇ／mlスト
レプトマイシン硫酸塩を含む）に懸濁してリンブ
ロ（Linbro）社の24ウエルプレートに植え込み、
翌日、翌々日およびその後２〜３日毎にHAT培
地（ヒポキサンチン、アメトプテリン、チミジン
添加培地）で半量交換して融合細胞のみを生育さ
せた。培養11日後の培養液について抗体産生の有
無をLG−10細胞に対する細胞毒性試験で調べた。
細胞毒性試験はHLAタイピング用プレートの各
ウエルにウエル当り2μの培養上清と2μの細
胞懸濁液（１×106個／ml）と5μのウサギ補体
を入れて37℃で２時間保ち、倒立顕微鏡で生死を
観察する方法に依つた。表１に挙げた細胞のうち
LG−10細胞以外のＢリンパ球培養細胞およびＴ
リンパ球培養細胞（CCRF−CEM細胞および
HSB−２細胞）に対する作用を調べ、後者には
作用せず前者の一部に作用する培養液を選んだ。
このようにして選別した培養細胞をフイブリンゲ
ルプレート（直径６cmのデイツシユに１mlの0.25
％シグマ社製フイブリノーゲン溶液を加え、
0.002単位／mlのトロンビンを含有するRPMI培
地４mlを加えて調製した）に10、200、500および
1000個接種し、10日間培養後１個の細胞に由来す
ると考えられるコロニーを選びクローンとした。 抗体のDR型特異性はクローニングした細胞の
培養３日目の培養上清を上記の細胞毒性試験の条
件下で表１に挙げた細胞に対する作用の有無によ
つて調べた。 抗体がHLA−DR抗体であることの確認は表３
に挙げた 125Iでラベルした膜可溶化HLA−DR抗
原との結合をアクリルアミドゲル電気泳動で調
べ、35000ダルトン鎖（α鎖）と27000ダルトン鎖
（β鎖）と反応していることに依つた。 抗マウスイムノグロブリン重鎖ウサギ抗体を用
いてオクタロニー法により抗体のイムノグロブリ
ンクラスを調べ、20倍濃縮培養上清の沈降線の生
成から、イムノグロブリンG3クラスと判定した。 以上の結果から、マウス・ハイブリドーマ
（Mouse hybridoma）Dw7−３−５−10抗体は、
HLA−8wDRw6Y、HLA−DRw6.2、HLA−
DR7およびHLA−DRw9に対し特異的に反応す
ることが判明した。
なお、この抗体はそれぞれの検体のＴリンパ球
とは反応しなかつた。 ＊あらかじめ１週間前にプリスタンを投与してお
いたマウス（Balb／ｃ、♀）に１×107個の該
ハイブリドーマを移植し、移植後14日後に開腹
し、腹水を得た。 上記データから、この発明の単クローン性抗体
はいずれもヒトのアロ抗原であるHLA抗原との
相関性が高く、HLA分析に経産婦HLA抗体にお
きかえて使用することが可能であることが判明し
た。 次に実施例に基づきこの発明をさらに詳しく説
明する。 実施例 １ ヒト・リンパ球Shの培養細胞にEBウイルスを
感染させて得られたリンパ芽球様細胞をin vitro
で増殖させ、その細胞を10％牛胎児血清添加
RPMI1640培地を用いて37℃、５％炭酸ガス気流
中で培養増殖させ、その４×107個をBalb／ｃマ
ウス（♀）の腹腔に生理食塩水に懸濁させて投与
した。投与24日後に、さらに上記細胞の1.5×107
個を静脈内に、1.5×107個を腹腔内に投与した。
その３日後そのマウスを開腹し脾臓を摘出し脾細
胞懸濁液を調製した。その脾細胞懸濁液とマウ
ス・ミエローマP3／×63Ag8U1細胞懸濁液
（Ba1b／ｃマウス由来のミエローマ）を10：１の
細胞比で混合し遠心分離後45％ポリエチレングリ
コール（シグマ社、分子量4000）を徐々に滴下し
６分間室温で放置させて細胞を融合させた。この
融合細胞を15％牛胎児血清添加ダルベツコ改変イ
ーグル最小栄養培地（２ｍＭグルタミン、５×
10-5M2−メルカプトエタノール、80μｇ／mlゲン
タミシン硫酸塩、100単位／mlペニシリンＧ、
100μｇ／mlストレプトマイシン硫酸塩を含む）
に懸濁してリンブロ（Linbro）社の24ウエルプ
レートに植え込み、翌日、翌々日およびその後２
〜３日毎にHAT培地（ヒポキサンチン、アメト
プリテン、チミジン添加培地）で半量交換して融
合細胞のみを生育させた。培養11日後の培養液に
ついて抗体産生の有無をSh細胞に対する細胞毒
性試験で調べた。細胞毒性試験はHLAタイピン
グ用プレートの各ウエルにウエル当り2μの培
養上清と2μの細胞懸濁液（１×106個／ml）と
5μのウサギ補体を入れて37℃で２時間保ち、
倒立顕微鏡で生死を観察する方法に依つた。表１
に挙げた細胞のうちSh細胞以外のＢリンパ球培
養細胞およびＴリンパ球培養細胞（CCRF−
CEM細胞およびHSB−２細胞）に対する作用を
調べ、後者には作用せず前者の一部に作用する培
養液を選んだ。このようにして選別した培養細胞
をフイブリンゲルプレート（直径６cmのデイツシ
ユに１mlの0.25％シグマ社製フイブリノーゲン溶
液を加え、0.02単位／mlのトロンビンを含有する
RPMI培地４mlを加えて調製した）に10、200、
500および1000個接種し、10日間培養後１個の細
胞に由来すると考えられるコロニーを選びクロー
ンとした。 抗体のDR型特異性はクローニングした細胞の
培養３日目の培養上清を上記の細胞毒性試験の条
件下で表１に挙げた細胞に対する作用の有無によ
つて調べた。 抗体がHLA−DR抗体であることの確認は表３
に挙げた 125Iでラベルした膜可溶化HLA−DR抗
原との結合をアクリルアミドゲル電気泳動で調
べ、35000ダルトン鎖（α鎖）と27000ダルトン鎖
（β鎖）と反応していることに依つた。 抗マウスイムノグロブリン重鎖ウサギ抗体を用
いてオクタロニー法により抗体のイムノグロブリ
ンクラスを調べ、20倍濃縮培養上清の沈降線の生
成から、イムノグロブリンG2aクラスと判定し
た。 以上の結果から、マウス・ハイブリドーマ
（Mouse hybridoma）SH−２−60−１抗体は、
HLA−DR2、HLA−DRw6.2およびHLA−
DRw9に対し特異的に反応することが判明した。 実施例 ２ HLA−DH0をホモに有するヒト・リンパ球H0
の培養細胞にEBウイルスを感染させin vitroで
増殖可能なリンパ芽球様細胞とした。この細胞を
10％牛胎児血清添加RPMI1640培地を用いて37℃
で５％炭酸ガス気流中で培養増殖させ、その1.4
×107個をBalb／ｃマウス（♀）の腹腔に生理食
塩水に懸濁させて投与した。投与17日後に、さら
に上記細胞の２×107個を静脈内に、２×107個を
腹腔内に投与した。その３日後にそのマウスを開
腹し脾臓を摘出し脾細胞懸濁液を調製した。その
脾細胞懸濁液とマウス・ミエローマP3／×
63Ag8U1細胞懸濁液（Balb／ｃマウス由来のミ
エローマ）を10：１の細胞比で混合し遠心分離後
45％ポリエチレングリコール（シグマ社、分子量
4000）を徐々に滴下し６分間室温で放置させて細
胞を融合させた。この融合細胞を15％牛胎児血清
添加ダルベツコ改変イーグル最小栄養培地（２ｍ
Ｍグルタミン、５×10-5M2−メルカプトエタノ
ール、80μｇ／mlゲンタミシン硫酸塩、100単
位／mlペニシリンＧ、100μｇ／mlストレプトマ
イシン硫酸塩を含む）に懸濁してリンブロ
（Linbro）社の24ウエルプレートに植え込み、翌
日、翌々日およびその後２〜３日毎にHAT培地
（ヒポキサンチン、アメトプリテン、チミジン添
加培地）で半量交換して融合細胞のみを生育させ
た。培養11日後の培養液について抗体産生の有無
をHO細胞に対する細胞毒性試験で調べた。細胞
毒性試験はHLAタイピング用プレートの各ウエ
ルにウエル当り2μの培養上清と2μの細胞懸
濁液（１×106個／ml）と5μのウサギ補体を入
れて37℃で２時間保ち、倒立顕微鏡で生死を観察
する方法に依つた。表１に挙げた細胞のうち細胞
以外のＢリンパ球培養細胞およびＴリンパ球培養
細胞（CCRF−CEM細胞およびHSB−２細胞）
に対する作用を調べ、後者には作用せず前者の一
部に作用する培養液を選んだ。このようにして選
別した培養細胞をフイブリンゲルプレート（直径
６cmのデイツシユに１mlの0.25％シグマ社製フイ
ブリノーゲン溶液を加え、0.002単位／mlのトロ
ンビンを含有するRPMI培地４mlを加えて調製し
た）に10、200、500および1000個接種し、10日間
培養後１個の細胞に由来すると考えられるコロニ
ーを選びクローンとした。 抗体のDR型特異性はクローニングした細胞の
培養３日目の培養上清を上記の細胞毒性試験の条
件下で表１に挙げた細胞に対する作用の有無によ
つて調べた。 抗体がHLA−DR抗体であることの確認は表３
に挙げた 125Iでラベルした膜可溶化HLA−DR抗
原との結合をアクリルアミドゲル電気泳動で調
べ、35000ダルトン鎖（α鎖）と27000ダルトン鎖
（β鎖）と反応していることに依つた。 抗マウスイムノグロブリン重鎖ウサギ抗体を用
いてオクタロニー法により抗体のイムノグロブリ
ンクラスを調べ、20倍濃縮培養上清の沈降線の生
成から、イムノグロブリンG2aクラスと判定し
た。 以上の結果から、マウス・ハイブリドーマ
（Mouse hybridoma）HO−３−43−４抗体は、
HLA−DR1、HLA−DR2、HLA−8wDRw6Y
およびHLA−DRw9に対し特異的に反応するこ
とが判明した。 実施例 ３ HLA−DEnをホモに有するヒト・リンパ球
HORの培養細胞にEBウイルスを感染させin
vitroで増殖可能なリンパ芽球様細胞とした。こ
の細胞を10％牛胎児血清添加RPMI1640培地を用
いて37℃で５％炭酸ガス気流中で培養増殖させ、
その3.5×107個をBalb／ｃマウス（♀）の腹腔に
生理食塩水に懸濁させて投与した。投与10日後
に、さらに上記細胞の４×107個を腹腔内に投与
した。その４日後にそのマウスを開腹し脾臓を摘
出し脾細胞懸濁液を調製した。その脾細胞懸濁液
とマウス・ミエローマP3／×63Ag8U1細胞懸濁
液（Banb／ｃマウス由来のミエローマ）を10：
１の細胞比で混合し遠心分離後45％ポリエチレン
グリコール（シグマ社、分子量4000）を徐々に滴
下し６分間室温で放置させて細胞を融合させた。
この融合細胞を15％牛胎児血清添加ダルベツコ改
変イーグル最小栄養培地（２ｍＭグルタミン．５
×10-5M2−メルカプトエタノール、80μｇ／mlゲ
ンタミシン硫酸塩、100単位／mlペニシリンＧ、
100μｇ／mlストレプトマイシン硫酸塩を含む）
に懸濁してリンブロ（Linbro）社の24ウエルプ
レートに植え込み、翌日、翌々日およびその後２
〜３日毎にHAT培地（ヒポキサンチン、アメト
プリテン、チミジン添加培地）で半量交換して融
合細胞のみを生育させた。培養11日後の培養液に
ついて抗体産生の有無をHOR細胞に対する細胞
毒性試験で調べた。細胞毒性試験はHLAタイピ
ング用プレートの各ウエルにウエル当り2μの
培養上清と2μの細胞懸濁液（１×106個／ml）
と5μのウサギ補体を入れて37℃で２時間保ち、
倒立顕微鏡で生死を観察する方法に依つた。表１
に挙げた細胞のうちHOR細胞以外のＢリンパ球
培養細胞およびＴリンパ球培養細胞（CCRF−
CEM細胞およびHSB−２細胞）に対する作用を
調べ、後者には作用せず前者の一部に作用する培
養液を選んだ。このようにして選別した培養細胞
をフイブリンゲルプレート（直径６cmのデイツシ
ユに１mlの0.25％シグマ社製フイブリノーゲン溶
液を加え、0.002単位／mlのトロンビンを含有す
るRPMI培地４mlを加えて調製した）に10、200、
500および1000個接種し、10日間培養後１個の細
胞に由来すると考えられるコロニーを選びクロー
ンとした。 抗体のDR型特異性はクローニングした細胞の
培養３日目の培養上清を上記の細胞毒性試験の条
件下で表１に挙げた細胞に対する作用の有無によ
つて調べた。 抗体がHLA−DR抗体であることの確認は表３
に挙げた 125Iでラベルした膜可溶化HLA−DR抗
原との結合をアクリルアミドゲル電気泳動で調
べ、35000ダルトン鎖（α鎖）と27000ダルトン鎖
（β鎖）と反応していることに依つた。 抗マウスイムノグロブリン重鎖ウサギ抗体を用
いてオクタロニー法により抗体のイムノグロブリ
ンクラスを調べ、20倍濃縮培養上清の沈降線の生
成から、イムノグロブリンＭクラスと判定した。 以上の結果から、マウス・ハイブリドーマ
（Mouse hybridoma）HOR−２−16−２抗体は、
HLA−DR1、HLA−DR2、HLA−8wDRwYお
よびHLA−DRw9に対し特異的に反応すること
が判明した。 実施例 ４ HLA−DKyをホモに有するヒト・リンパ球Ky
の培養細胞にEBウイルスを感染させin vitroで
増殖可能なリンパ芽球様細胞とした。この細胞を
10％牛胎児血清添加RPMI1640培地を用いて37℃
で５％炭酸ガス気流中で培養増殖させ、その４×
107個をBalb／ｃマウス（♀）の腹腔に生理食塩
水に懸濁させて投与した。投与10日後に、さらに
上記細胞の４×107個を腹腔内に投与した。その
３日後そのマウスを開腹し脾臓を摘出し脾細胞懸
濁液を調製した。その脾細胞懸濁液とマウス・ミ
エローマP3／×63Ag8U1細胞懸濁液（Balb／ｃ
マウス由来のミエローマ）を10：１の細胞比で混
合し遠心分離後45％ポリエチレングリコール（シ
グマ社、分子量4000）を徐々に滴下し６分間室温
で放置させて細胞を融合させた。この融合細胞を
15％牛胎児血清添加ダルベツコ改変イーグル最小
栄養培地（２ｍＭグルタミン．５×10-5M2−メ
ルカプトエタノール、80μｇ／mlゲンタミシン硫
酸塩、100単位／mlペニシリンＧ、100μｇ／mlス
トレプトマイシン硫酸塩を含む）に懸濁してリン
ブロ（Linbro）社の24ウエルプレートに植え込
み、翌日、翌々日およびその後２〜３日毎に
HAT培地（ヒポキサンチン、アメトプリテン、
チミジン添加培地）で半量交換して融合細胞のみ
を生育させた。培養11日後の培養液について抗体
産生の有無をKy細胞に対する細胞毒性試験で調
べた。細胞毒性試験はHLAタイピング用プレー
トの各ウエルにウエル当り2μの培養上清と2μ
の細胞懸濁液（１×106個／ml）と5μのウサ
ギ補体を入れて37℃で２時間保ち、倒立顕微鏡で
生死を観察する方法に依つた。表１に挙げた細胞
のうちKy細胞以外のＢリンパ球培養細胞および
Ｔリンパ球培養細胞（CCRF−CEM細胞および
HSB−２細胞）に対する作用を調べ、後者には
作用せず前者の一部に作用する培養液を選んだ。
このようにして選別した培養細胞をフイブリンゲ
ルプレート（直径６cmのデイツシユに１mlの0.25
％シグマ社製フイブリノーゲン溶液を加え、
0.002単位／mlのトロンビンを含有するRPMI培
地４mlを加えて調製した）に10、200、500および
1000個接種し、10日間培養後１個の細胞に由来す
ると考えられるコロニーを選びクローンとした。 抗体のDR型特異性はクローニングした細胞の
培養３日目の培養上清を上記の細胞毒性試験の条
件下で表１に挙げた細胞に対する作用の有無によ
つて調べた。 抗体がHLA−DR抗体であることの確認は表３
に挙げた 125Iでラベルした膜可溶化HLA−DR抗
原との結合をアクリルアミドゲル電気泳動で調
べ、35000ダルトン鎖（α鎖）と27000ダルトン鎖
（β鎖）と反応していることに依つた。 抗マウスイムノグロブリン重鎖ウサギ抗体を用
いてオクタロニー法により抗体のイムノグロブリ
ンクラスを調べ、20倍濃縮培養上清の沈降線の生
成から、イムノグロブリンG2aクラスと判定し
た。 以上の結果から、マウス・ハイブリドーマ
（Mouse hybridoma）Ky6−16−23抗体は、
HLA−DR1、HLA−DR2、HLA−8wDRw6Y、
HLA−DRw6.2およびHLA−DRw9に対し特異
的に反応することが判明した。 実施例 ５ HLA−Dw7をホモに有するヒト・リンパ芽球
様細胞LG−10を10％牛胎児血清添加RPMI1640
培地を用いて37℃で５％炭酸ガス気流中で培養増
殖させ、その４×107個をBalb／ｃマウス（♀）
の腹腔に生理食塩水に懸濁させて投与した。投与
14日後に、さらに上記細胞の1.5×107個を静脈内
に、1.5×107個を腹腔内に投与した。その３日後
にそのマウスを開腹し脾臓を摘出し脾細胞懸濁液
を調製した。その脾細胞懸濁液とマウス・ミエロ
ーマP3／×63Ag8U1細胞懸濁液（Ba1b／ｃマウ
ス由来のミエローマ）を10：１の細胞比で混合し
遠心分離後45％ポリエチレングリコール（シグマ
社、分子量4000）を徐々に滴下し６分間室温で放
置させて細胞を融合させた。この融合細胞を15％
牛胎児血清添加ダルベツコ改変イーグル最小栄養
培地（２ｍＭグルタミン、５×10-5M2−メルカ
プトエタノール、80μｇ／mlゲンタミシン硫酸
塩、100単位／mlペニシリンＧ、100μｇ／mlスト
レプトマイシン硫酸塩を含む）に懸濁してリンブ
ロ（Linbro）社の24ウエルプレートに植え込み、
翌日、翌々日およびその後２〜３日毎にHAT培
地（ヒポキサンチン、アメトプテリン、チミジン
添加培地）で半量交換して融合細胞のみを生育さ
せた。培養11日後の培養液について抗体産生の有
無をLG−10細胞に対する細胞毒性試験で調べた。
細胞毒性試験はHLAタイピング用プレートの各
ウエルにウエル当り2μの培養上清と2μの細
胞懸濁液（１×106個／ml）と5μのウサギ補体
を入れて37℃で２時間保ち、倒立顕微鏡で生死を
観察する方法に依つた。表１に挙げた細胞のうち
LG−10細胞以外のＢリンパ球培養細胞およびＴ
リンパ球培養細胞（CCRF−CEM細胞および
HSB−２細胞）に対する作用を調べ、後者には
作用せず前者の一部に作用する培養液を選んだ。
このようにして選別した培養細胞をフイブリンゲ
ルプレート（直径６cmのデイツシユに１mlの0.25
％シグマ社製フイブリノーゲン溶液を加え、
0.002単位／mlのトロンビンを含有するRPMI培
地４mlを加えて調製した）に10、200、500および
1000個接種し、10日間培養後１個の細胞に由来す
ると考えられるコロニーを選びクローンとした。 抗体のDR型特異性はクローニングした細胞の
培養３日目の培養上清を上記の細胞毒性試験の条
件下で表１に挙げた細胞に対する作用の有無によ
つて調べた。 抗体がHLA−DR抗体であることの確認は表３
に挙げた 125Iでラベルした膜可溶化HLA−DR抗
原との結合をアクリルアミドゲル電気泳動で調
べ、35000ダルトン鎖（α鎖）と27000ダルトン鎖
（β鎖）と反応していることに依つた。 抗マウスイムノグロブリン重鎖ウサギ抗体を用
いてオクタロニー法により抗体のイムノグロブリ
ンクラスを調べ、20倍濃縮培養上清の沈降線の生
成から、イムノグロブリンG3クラスと判定した。 以上の結果から、マウス・ハイブリドーマ
（Mouse hybridoma）Dw7−３−５−10抗体は、
HLA−8wDRw6Y、HLA−DRw6.2、HLA−
DR7およびHLA−DRw9に対し特異的に反応す
ることが判明した。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ マウス・ハイブリドーマにより産生され、
HLA−DR2、HLA−DRw6.2およびHLA−
DRw9を有するヒト培養リンパ芽球様細胞に反応
するが、前記抗原を有せずHLA−DR1、HLA−
DRw6、HLA−DR7およびHLA−8wDRw6Yを
有するヒト培養リンパ芽球様細胞に反応しないイ
ムノグロブリンG2aクラスの抗体または、 マウス・ハイブリドーマにより産生され、
HLA−DR1、HLA−DR2、HLA−8wDRw6Y
およびHLA−DRw9を有するヒト培養リンパ芽
球様細胞に反応するが、前記抗原を有せずHLA
−DRw6.2、HLA−DRw6およびHLA−DR7を
有するヒト培養リンパ芽球様細胞に反応しないイ
ムノグロブリンG2aクラスの抗体または、 マウス・ハイブリドーマにより産生され、
HLA−DR1、HLA−DR2、HLA−8wDRw6Y
およびHLA−DRw9を有するヒト培養リンパ芽
球様細胞に反応するが、前記抗原を有せずHLA
−DRw6.2、HLA−DRw6およびHLA−DR7を
有するヒト培養リンパ芽球様細胞に反応しないイ
ムノグロブリンＭクラスの抗体または、 マウス・ハイブリドーマにより産生され、
HLA−DR1、HLA−DR2、HLA−8wDRw6Y、
HLA−DRw6.2およびHLA−DRw9を有するヒ
ト培養リンパ芽球様細胞に反応するが、前記抗原
を有せずHLA−DRw6およびHLA−DR7を有す
るヒト培養リンパ芽球様細胞に反応しないイムノ
グロブリンG2aクラスの抗体または マウス・ハイブリドーマにより産生され、
HLA−8wDRw6Y、HLA−DRw6.2、HLA−
DR7およびHLA−DRw9を有するヒト培養リン
パ芽球様細胞に反応するが、前記抗原には有せず
HLA−DR1、HLA−DR2およびHLA−DRw6
を有するヒト培養リンパ芽球様細胞に反応しない
イムノグロブリンG3クラスの抗体である単クロ
ーン性抗体。 ２ ヒト・Ｂリンパ球ShまたはHOまたはHOR
またはKyまたはLG−10をそれぞれリンパ芽球様
細胞とし、マウスに感作させた後、該マウスの脾
細胞を得、ついで該脾細胞をマウス・ミエローマ
細胞と融合させ、クローニングし、ついでそれぞ
れ目的とするHLA−DR抗原を有するヒト培養リ
ンパ芽球様細胞に特異的に反応する単クローン性
抗体を産生するハイブリドーマを得、ついでそれ
ぞれの該ハイブリドーマを用いて産出される特許
請求の範囲第１項記載の単クローン性抗体。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP57156229A JPS5944325A (ja) | 1982-09-07 | 1982-09-07 | 単クロ−ン性抗体およびそれらを産生するハイブリド−マ |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP57156229A JPS5944325A (ja) | 1982-09-07 | 1982-09-07 | 単クロ−ン性抗体およびそれらを産生するハイブリド−マ |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5944325A JPS5944325A (ja) | 1984-03-12 |
| JPH054074B2 true JPH054074B2 (ja) | 1993-01-19 |
Family
ID=15623178
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP57156229A Granted JPS5944325A (ja) | 1982-09-07 | 1982-09-07 | 単クロ−ン性抗体およびそれらを産生するハイブリド−マ |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS5944325A (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0239102A3 (en) * | 1986-03-28 | 1989-07-12 | Tsuji, Kimiyoshi | Process for the formation of human-human hybridoma |
-
1982
- 1982-09-07 JP JP57156229A patent/JPS5944325A/ja active Granted
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| J.IMMUNOL=1980 * |
| J.IMMUNOL=1981 * |
| PROC.NATL.ACAD.SCI=1979US * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS5944325A (ja) | 1984-03-12 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| FI75363C (fi) | Foerfarande foer framstaellning av en monoklonal antikropp mot maenniskans hjaelpar-t-celler, medelst en ny hybridcellinje. | |
| FI75183B (fi) | Foerfarande foer framstaellning av en komplement-bindande monoklonal antikropp mot maenniskans t-celler genom anvaendning av en ny hybridcellinje. | |
| JP2648419B2 (ja) | モノクローナル抗体混合物 | |
| Lake et al. | Production and characterization of cytotoxic Thy‐1 antibody‐secreting hybrid cell lines Detection of T cell subsets | |
| EP0043718B1 (en) | Improvements in or relating to cell lines | |
| RU2202615C2 (ru) | Моноклональное антитело, способное распознавать антиген, вызывающий апоптоз миелоидных клеток костного мозга, и обладающее свойством вызывать апоптоз миеломных клеток, его фрагмент и гибридома | |
| JPS63294779A (ja) | ハイブリドマ | |
| JPH0690753A (ja) | ハイブリドーマセルラインの製造法 | |
| CA1201396A (en) | Process for the preparation of permanent animal and human cell lines and their use | |
| FI75598B (fi) | Foerfarande foer framstaellning av en monoklonal antikropp mot en maensklig tymocytantigen medelst en ny hybridcellinje. | |
| EP0102601A2 (en) | Monoclonal antibody, a process for its production and the use of this monoclonal antibody | |
| US4618585A (en) | Hybridoma cell lines producing monoclonal antibodies directed against cervical cancer cells | |
| JPH054074B2 (ja) | ||
| JPH05506241A (ja) | ３５ｋｄ腫瘍関連タンパク質抗原および免疫複合体 | |
| JPS6117518A (ja) | ヒトｔ−ｔ細胞ハイブリド−マの製法とヒトｔ−ｔ細胞ハイブリド−マによる抑制因子の製法 | |
| SK281965B6 (sk) | Monoklonálna protilátka inhibujúca zachytávanie krvotvorných kmeňových buniek a hybridóm | |
| JPS6081130A (ja) | 抗ｈｌａ−ａ２抗体およびそれを産生するハイブリド−マ | |
| EP0393062A1 (en) | Monoclonal antibody that recognizes an epitope of the gamma chain of human t cell surface receptors | |
| US5763274A (en) | Antibody 103B2 | |
| JPH06319585A (ja) | 抗体およびその製造法 | |
| Faraggiana et al. | Antibody formation and transient immune complex glomerulopathy in A-strain mice with C1300 neuroblastoma tumors | |
| EP0370768A2 (en) | Monoclonal antibody for the antigen specific to carcinoma of the thyroid | |
| CS276448B6 (cs) | Způsob výroby permanentních buněčných lini-í živočišného i lidského původu | |
| JPS59186925A (ja) | カンジダ菌感染症治療用薬剤 | |
| Bertolini et al. | Antibody Formation and Transient Immune Complex Glomerulopathy in A-Strain Mice with C 1300 Neuroblastoma Tumors |