JPH0542262B2

JPH0542262B2 -

Info

Publication number: JPH0542262B2
Application number: JP59191858A
Authority: JP
Inventors: Semureru Rasuro; Nagi Isutoban Dokut Udobarudei
Original assignee: Richter Gedeon Nyrt; Richter Gedeon Vegyeszeti Gyar RT
Current assignee: Richter Gedeon Nyrt; Richter Gedeon Vegyeszeti Gyar Nyrt
Priority date: 1983-09-16
Filing date: 1984-09-14
Publication date: 1993-06-28
Also published as: US4752584A; IT1207560B; HU188954B; CS693184A2; DE3430895C2; IN160227B; FR2552103B1; CS274650B2; JPS6094097A; DD228303A5; NL8402693A; GB2149817B; IT8422675A0; DE3430895A1; FR2552103A1; GB8423198D0; BE900572A; GB2149817A; HUT35285A

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野）この発明は補酵素B₁₂の嫌気的発酵に適する新
規な接種材料に関する。さらに詳しくは、この発
明は、非無菌条件下での補酵素B₁₂の回分式、半
連続式又は連続式発酵において使用するための、
新規な嫌気性中温性メタン生産性混合微生物集団
を含有する新規な接種材料に関する。

この明細書において使用する「補酵素B₁₂」な
る語は、補酵素B₁₂それ自体のみならず、他の生
物学的に活性なコリノイド（例えば、フアクター
）をも意味する〔Barker等、Biol
Chem.235480（1960）〕。

文献に従えば、接種材料は、「新たな無菌培養
物の製造のために使用されるウイルス溶液、微生
物もしくは細胞懸濁液、又は植物性器官、織組も
しくは細胞」である（Straub，F.B：Biological
Encyclopadia．287頁、Akademiai Kiado
ブダペスト、1978年）。この発明の接種材料は嫌
気性非無菌的中温性メタン生産性混合微生物集団
を含有する。

この明細書において用いる前駆体なる語は、一
連の生物学的反応によつて目的最終生成物を製造
するための出発化合物（前掲437、例えば５，
６−ジメチル−ベンズイミダゾール、塩化コバル
ト等）である。

ブロスは、微生物の発酵において使用するため
に調製された培地である。ブロスは、発酵中に微
生物が必要とする資化可能な形のすべての栄養素
（前掲、249；例えばメタノール、炭酸水素アン
モニウム、塩化マグネシウム等）を含有する。こ
の明細書において、「ブロス」なる語は栄養素の
組み合わせ及び前駆体を含有する培地を意味す
る。

栄養素は、微生物集団のために必要な化学物
質、例えば炭素源及び窒素源である。この発明の
方法においては、メタノールは２つの機能を有
し、１つは生合成のための炭素源であり、そして
同時に混合微生物集団を形成するために必要なエ
ネルギーを提供する。

（従来の技術）知られているように、約20年前、補酵素B₁₂は
汚泥中に存在する微生物を用いて下水汚泥の栄養
素からの発酵により製造された。場合によつて
は、下水汚泥に種々の他の栄養素がさらに補充さ
れた。この方法は、非無菌的条件下で発酵を行う
ことができるという利点を有するが、各発酵につ
いて大量の下水汚泥を発酵プラントに輸送しなけ
ればならず、汚泥の組成及び細菌集団が変動し、
いわゆる「野性株」が下水汚泥に侵入することが
あり、この存在によつて安定な細菌集団の形成が
不可能となる。

ハンガリー特許第153740号明細書によれば、補
酵素B₁₂は、嫌気的無菌的条件下において、次の
方法により製造される。必要な栄養素を含有する
ブロスに下水汚泥を１回のみ加え、そして少なく
とも５回経代接種した後混合微生物集団を富化
し、これが接種材料として機能し、そして補酵素
B₁₂が発酵ブロス１当り約６〜6.2mgの量で製造
される。このいわゆる下水汚泥−不含法において
は、下水汚泥由来の微生物を順応せしめて補酵素
B₁₂を生産せしめるために少なくとも５回の接種
が必要であり、このためにこの方法は煩雑なもの
となる。さらに、補酵素B₁₂の生産性が低く、多
数の異なる栄養素が必要であり、従つて製造コス
トが高い。

増加した補酵素B₁₂含量を有する発酵ブロスを
製造するために、多くの方法が当業界において知
られており（例えば、米国特許第3954971号、及
び第3979259号明細書を参照のこと）、これらの方
法は上記「下水汚泥−不含」法の強化に関する。

中温性メタン生産性混合微生物集団は最初、ハ
ンガリー特許第167658号明細書に記載された〔コ
リネバクテリウム（Corynehacterium）、sp.
（24A1）、コリネバクテリウムsp.（62B9）、ラクト
バシルス（Lactohacillus）sp.（244B／C1）、及び
プロピオニバクテリウム（Propionibacterium）
sp（239A1／６）；それぞれ、Hungarian
National Collection of Medical Bacteria
（OKI）National Institute of Hygieneに、No.
00076、No.00077、No.00078、及びNo.00079として寄
託されている〕。しかしながら、この嫌気性中温
性メタノール生産性混合微生物集団は、一般的で
ない栄養素を含有するブロスに順応するのが困難
であり、６〜７回の経代接種を必要とする。１回
の継代接種サイクルに約７日間を要するとして、
大量生産のための、上記微生物集団に基礎を置く
順応は約40〜50日間継続し、これは非常に長期間
であり、そしてこのために生産コストが高くな
る。

（発明が解決しようとする問題点）この発明は上記の欠点を除去することを目的と
する。所望の結果を得るために、すでに確立され
た上記の嫌気性中温性メタン生産性混合微生物集
団を新たなブロスに順応せしめるのではなく、発
明者等は下水汚泥に返つて、これに存在する微生
物集団から、全く新規な栄養素組成を有するがそ
の他の点では常用のブロスと同一であるブロスに
おいて、新規な嫌気性中温性メタン生産性微生物
集団を開発した。「常用のブロス」なる語は、例
えば米国特許第395497号明細書に開示されている
ブロスを意味する。この新規な微生物集団中に存
在する菌株は、Hungarian National Collection
of Medical Bacteria（OKI）National Institute
of Hygieneに、No.00076、No.00079、及びNo.00272
として寄託されており、それぞれコリネバクテリ
ウム（Corynebacterium）sp.（24A1）、プロピオ
ニバクテリウム（Propionibacterium）sp.
（239A₁／６）、及びメタノコツカス
（Metanococcus）sp.（MC−017）である。

接種材料を製造するためのこの発明の新規な方
法を用いることにより、新規な混合微生物集団を
１回の接種により再現性良く製造することができ
る。栄養に富むブロスの代りに少ない栄養を含有
するブロスを使用すること、及びコーンステイー
プリカーの熱処理（加水分解）とは別に、この方
法は、最初においてすでに本質上少ない細菌がブ
ロスを伴う系においてすでに本質上少ない細菌が
ブロスを伴う系に適用され、従つて接種のために
使用される汚泥の細菌が有効である点において有
利である。少量の有機物を含有し、そして有機成
分として特にメタノールを含有するブロスは、メ
タノールを分解し、そしてメタンを生産する細菌
にとつて好都合である。

さらに、この発明の方法は、嫌気性中温性メタ
ン生産性非無菌的発酵のために非常に確実な条件
を提供する。目的とする微生物集団をいつでも低
コストで急速に再生産することができ、そして補
酵素B₁₂の製造のために使用することができるか
らである。

（問題点を解決するための手段）この発明は、補酵素B₁₂（コバミドコエンザイ
ム）の回分式、半連続式又は連続式発酵のために
適切な新規な嫌気性中温性メタン生産性混合微生
物集団を含有する新しい接種材料の製造方法に関
する。下水汚泥に由来する (1) コリネバクテリウム（Corynebacterium）に
属する微生物、プロピオニバクテリウム
（Propionibacterium）に属する微生物及びメ
タノコツカス（Metanococcus）に属する微生
物を含んで成る混合微生物を、メタノール、熱
処理により加水分解されていてもよいコーンス
テイープリカー溶液及び／又は熱処理により加
水分解されたコーンスロツプ、炭酸水素アンモ
ニウム、塩化マグネシウム、塩化コバルト、
５，６−ジメチルベンジミダゾール並びに亜硫
酸水素ナトリウムを含む培地に、0.3〜0.5容量
％のメタノールを毎日添加しながら、嫌気的、
中温、非無菌的条件下で発酵を行い、 (2) 得られた発酵ブロス（第一代）又はその部分
を、前記(1)に記載した培地成分の同じ成分を含
む培地数倍容量に加え、そして前記(1)と同じ条
件下でPHが５〜5.5に低下するまで発酵を継続
し、 (3) 前記(2)において得られた発酵ブロス（第二
代）５〜10容量％を取り出し、そして同じ容量
の、メタノール、加熱により加水分解されてい
てもよいコーンステイープリカー溶液及び／又
は加熱により加水分解されたコーンスロツプ、
炭酸水素アンモニウム、塩化マグネシウム、塩
化コバルト、５，６−ジメチルベンジミダゾー
ル並びに亜硫酸水素ナトリウムを含む培地で置
き換え、そして (4) 所望により数日間にわたり発酵を継続するこ
とにより、補酵素B₁₂の製造における使用に適
し、嫌気性中温性混合微生物集団を含有する接
種材料を得る。

この発明の方法を実施する場合、ブロスは従来
使用されている商業的に得られる栄養成分である
コーンスステイープリカーの代りに、熱処理した
コーンステイープリカー（加水分解物）、又はコ
ーンスロツプを用いて調製する。

「コーンスロツプ」は、コーンステイープと蒸
留残渣の混合物を蒸発せしめることによつて得ら
れる蒸留廃棄物である。

熱処理前に、コーンステイープリカーを微生物
学的試験に付し、そして熱処理（加水分解）を十
分量のコーンステイープリカーについてのみ行
う。微生物学的試験のために、本質上例１に記載
したのと同様な発酵を使用する。試験の４日目に
おいて、バイオガス生産が0.3〜0.6／発酵ブ
ロス／日であれば、コーンステイープリカーはこ
の発明の新規な接種材料の製造のために適当であ
る。この場合、微生物学的に適当なコーンステイ
ープリカーに同容量の水を加え、そしてこの混合
物を15分間煮沸して、所望の熱処理コーンステイ
ープリカー（加水分解物）を得る。

新しい接種材料の製造において使用するブロス
はそれ自体公知の方法により製造される（例えば
例１）。

この発明の方法において使用されるブロスは、
従来使用されていたブロスと次の点において異
る。

◎有機物質含量が少なく、そして有機物質として
特徴的にメタノールを含有する。

◎商業的に入手できるコーンステイープリカーと
異り、その熱処理物（加水分解物）、又はコー
ンスロツプを含有する。

新規なブロス組成の結果として、接種材料の製
造中に富化された混合微生物集団の組成及び生産
性が変化し、そして６〜７回の継代接種ではなく
１回の接種と数日間（１〜２日間）の発酵で十分
である。

メタノール、コーンステイープリカー加水分解
物、炭酸水素アンモニウム、塩化マグネシウム、
塩化コバルト、５，６−ジメチルベンズイミダゾ
ール、及び亜硫酸ナトリウムを含有する新しいブ
ロスに、15〜25容量％の消化された下水汚泥を加
える。この下水汚泥は、好ましくは公共下水汚泥
の嫌気性後消化槽から新たに得る。十分に均一に
した後、30℃〜32℃において発酵を開始し、そし
て約１週間（PHが5.0〜5.5に低下するまで）継続
し、この間に毎日メタノールを添加し、そして発
酵ブロスからサンプルを採取する。このサンプル
から、発酵ブロスのPH及びメタノール含量、並び
にバイオガスの発生速度を決定する。これら３つ
のデータは、発酵の進行についての非常に重要な
情報である。すなわち、嫌気性中温性混合微生物
集団の形成のためには、わずかに酸性（PH５〜
６）の培地が好都合であることが知られている。
高過ぎる又は低過ぎるメタノール濃度は順応を遅
延せしめるから、発酵ブロスのメタノール濃度も
重要である。最後に、メタノール濃度とバイオガ
ス発生速度との間に直接的な相互関係が存在する
から、バイオガス発生速度及びメタノール資化速
度が重要である。

この発明の好ましい態様に従えば、上記のよう
に、発酵を約１週間継続する。この後、第１代ブ
ロスと称する得られた発酵ブロス、又はその部分
を（場合によつては拡大された規模において）接
種する。すなわち、数倍量のブロスに加える。こ
のブロスの組成は出発ブロスのそれと同一であ
る。発酵を、上記の条件と実質上同じ条件下でさ
らに数日間継続する。この第２発酵後に得られた
発酵ブロスを第２代ブロスと称する。この後、約
10容量％の第２代ブロスを、同容量の培養ブロス
で置き換える。この培養ブロスは同じ栄養素を含
有するが、メタノール、５，６−ジメチルベンズ
イミダゾール及び塩化コバルト以外の濃度は1/10
である。

上記の新鮮なブロスを補充された発酵ブロスを
33℃〜34℃にてさらに１日又は２日保持する。

このようにして、B₁₂発酵の開始に適する接種
材料が得られる。この接種材料は新規な嫌気性中
温性メタン生産性混合微生物集団を含有する。

この発明の新規な接種材料は、本出願人の同日
の特許出願の明細書に記載されているようにし
て、補酵素B₁₂の発酵において使用することがで
きる。

次に、この発明の方法をさらに詳細に説明す
る。但し、これによりこの発明の範囲を限定する
ものではない。

例１ 10の実働容積を有する実験室規模のガラス製
発酵槽に、あらかじめ30℃〜33℃に加温した水道
水を加え、次に下記の栄養素を加える。

メタノール 35ml 50ｇのコーンステイープリカーから得られた加水
分解物 100ml 炭酸水素アンモニウム 30ｇ塩化マグネシウム 1.0ｇ塩化コバルト 0.05ｇ５，６−ジメチルベンズイミダゾール 0.03ｇ亜硫酸水素ナトリウム 0.30ｇ次に、培養ブロスを十分に均一にし、そして30
℃〜33℃の水道水により8000mlにした。このブロ
スに、公共下水プラントから新たに得た消化後の
下水汚泥2000mlを加えた。この混合物を混合し、
ガラス製発酵槽をゴム板で覆い、そして32℃〜34
℃の恒温器に入れる。

発酵の次の期間において、毎日50mlのサンプル
を（均一にした後に）採取し、そして35mlのメタ
ノールを発酵槽に加え、この後さらに200mlのサ
ンプルを採取し、発酵槽をゴム板で覆い、そして
同じ温度においてさらに７日間嫌気的発酵を継続
する。

第１の７日間の後に得た発酵ブロスを第１代ブ
ロスと称する。

メタノールの添加前に採取したサンプルから、
発酵ブロスのPH及びメタノール濃度を測定する。
メタノールの添加後に取り出した200mlの発酵ブ
ロスをガスメーターに入れ、そしてバイオガスの
発生速度を測定する。サンプルをガスメーターか
ら取り出し、そして次のメタノールの添加と平行
して発酵槽に再充填する。

発酵の７日目に５倍のスケールアツプを行う。
すなわち、50の実働容積を有する発酵槽に、30
〜32℃の水道水30を入れ、次にこれに下記の栄
養素を補充する。

メタノール 175ml 250ｇのコーンステイープリカーから得た加水分
解物 500ml 炭酸水素アンモニウム 150ｇ塩化マグネシウム５ｇ塩化コバルト 0.25ｇ５，６−ジメチルベンズイミダゾール 0.15ｇ亜硫酸水素ナトリウム 1.5ｇ栄養素の添加が完了した時、ブロスを30℃〜32
℃の水道水により40にする。

次に、７日目の発酵ブロス（第１代ブロス）の
全量（10）を新たに調製したブロスに加え（接
種）、そして強力に均一化した後発酵槽を密封し、
そしてさらに７日間32℃〜34℃において嫌気的発
酵を継続する。

第２の７日目の間、毎日50mlのサンプルを採取
し、175mlのメタノールを発酵槽に加え、そして
次に200mlのサンプルを採る。発酵槽を密封し、
そして32℃〜34℃にて発酵を継続する。メタノー
ル添加の前後において採取したサンプルからPH、
メタノール濃度、及びバイオガス発生速度を測定
する。

第２の７日間の後に得られた発酵ブロスを第２
代ブロスと称する。10％（5.0）の第２代ブロ
スを取り出し、そしてこれと同じ容量の次の組成
を有するブロスを加える。

30℃〜32℃の水道水 5000ml メタノール 175ml 25ｇのコーンステイープリカーから得られた加水
分解物 50ml 炭酸水素アンモニウム 15ｇ塩化マグネシウム 0.5ｇ塩化コバルト 0.25ｇ５，６−ジメチルベンズイミダゾール 0.15ｇ亜硫酸水素ナトリウム 0.1ｇブロスを添加した後、発酵ブロスを十分に混合
し、発酵槽を密封し、そして32℃〜34℃にて発酵
をさらに１日継続する。

上記の手順を通して、新しい嫌気性中温性メタ
ン生産性混合微生物集団が形成され、このもの
は、コリネバクテリウムsp.（24A1）、プロピオニ
バクテリウムsp.（239A.／６）、及びメタノコツカ
スsp.（MC−017）を含有し、これらはそれぞれ
Hungarian National Collection in Medical
Bacteria（OKI）National Institute of Hygiene
に、No.00076、No.00079、及びNo.00272として寄託
されている。この接種材料は5.4〜5.8のPH、0.5〜
0.8／日／のバイオガス生産によつて特徴付
けられる。

得られた接種材料は補酵素B₁₂の製造に適す
る。

ハンガリー特許第167658号明細書において開示
されている方法により、半連続操作の第１日目に
採取したサンプルから測定された発酵ブロスの活
性成分濃度は7.3mg／である。

栄養成分は次のようにして調製する。約45％の
乾物量を有するコーンステイープリカーを同容量
の水道水により稀釈し、この混合物を15分間沸騰
せしめる。次に溶液を冷却し、そして水道水によ
りもとの容量にする。得られた新鮮な溶液はいわ
ゆる熱処理コーンステイープリカー（加水分解
物）である。

活性成分製造用接種材料の製造のために使用さ
れるコーンステイープリカーの適合性を、その使
用前に次のようにして決定する。10の実働容積
を有する実験室用ガラス製発酵槽に、30℃〜32℃
の水道水９を入れ、次に下記の栄養素を加え
る。

メタノール 50ml 45％の乾物を含有する、試験すべき未処理（未加
水分解）コーンステイープリカー 50ｇ炭酸水素アンモニウム 30ｇ塩化マグネシウム１ｇ塩化コバルト 0.05ｇ５，６−ジメチルベンズイミダゾール 0.03ｇ亜硫酸ナトリウム 0.20ｇ均一にした後、補酵素B₁₂の発酵槽からの発酵
ブロス300mlをブロスに加え、次にこれを、30℃
〜32℃の水道水により10にする。発酵槽をゴム
板で覆い、そして32℃〜34℃の恒温器に入れる。
毎日、混合物に50mlのメタノールを加え、均一に
した後200mlの発酵ブロスを取り出し、バイオガ
スの生産速度を測定し、発酵槽を覆い、そして32
℃〜34℃にて発酵を継続する。発酵の４日目にバ
イオガスの生産が0.3〜0.6／発酵ブロス／日
であれば、このコーンステイープリカーは、前記
の熱処理の後、接種材料の製造のために適当であ
る。

５，６−ジメチルイミダゾールは、規定量のメ
タノールに溶解した後ブロスに加える。

他の栄養素はブロスに直接加え、そしてその中
に溶解する。

例２（参考例）この例は、スケールアツプを伴わない接種材料
の製造を例示する。この技法は、少量の接種材料
で十分な場合に一般に使用される。

例１に記載した手順に従つて第１代の接種材料
を、10の実働容積を有するガラス製発酵槽中に
調製する。

発酵の７日目（第１代）に、十分に混合した発
酵ブロスから２を取り出し、そしてこれを10
の実働容積を有する他のガラス製発酵槽に注入す
ることにより接種を行う。この後、30℃〜32℃の
水道水６、及び次に下記の栄養素を後者の発酵
槽に加える。

メタノール 35ml 50ｇのコーンステイープリカーから得られる加水
分解物 100ml 炭酸水素アンモニウム 30ｇ塩化マグネシウム１ｇ塩化コバルト 0.05ｇ５，６−ジメチルベンズイミダゾール 0.03ｇ亜硫酸ナトリウム 0.30ｇ成分の添加が完了した時、混合物を十分に均一
にし、30℃〜32℃の水道水で10にし、再度均一
にし、そしてガラス製発酵槽をゴム板で覆い、そ
して32℃〜34℃の恒温器に入れる。

この後毎日、50mlのサンプルを採取し、35mlの
メタノールを加え、そしてさらに200mlのサンプ
ルを取り出し、そして発酵槽をゴム板で覆い、そ
して同じ温度においてさらに７日間嫌気的発酵を
継続する。

この第２の７日間の後に得られた発酵ブロスを
第２代ブロスと称する。

第２代ブロスから、均一にした発酵ブロス10容
量％を取り出し、そして下記の組成を有する同容
量のブロスを導入する。30℃〜32℃の水道水1.0
に次の栄養素を加える。

メタノール 35ml 5.0ｇのコーンステイープリカーから得られる加
水分解物 10ml 炭酸水素アンモニウム 3.0ｇ塩化マグネシウム 0.1ｇ塩化コバルト 0.05ｇ５，６−ジメチルベンズイミダゾール 0.03ｇ亜硫酸水素ナトリウム 0.02ｇブロスを添加した後、発酵ブロスを十分に混合
し、発酵槽をゴム板で覆い、そして32℃〜34℃に
てさらに24時間発酵を継続する。

24時間の発酵の後に得られた発酵ブロス（接種
材料）は補酵素B₁₂の製造において使用するのに
適する。

例３この例は、この発明の方法が工業的規模におい
ても実施され得ることを示す。

2.0ｍ³の実働容積を有する発酵槽に、30℃〜32
℃に加温した水道水1000をポンプ送入し、この
後、例１に記載したようにして調製した後下記の
栄養素を加える。

メタノール 7.0 10Kgのコーンステイープリカーから得られた加水
分解物 20.0 炭酸水素アンモニウム 6.0Kg 塩化マグネシウム 0.2Kg 塩化コバルト 0.01Kg ５，６−ジメチルベンズイミダゾール 0.006Kg 亜硫酸水素ナトリウム 0.06Kg 上記の栄養素を含有するブロスを十分に均一に
し、そして次に例１に記載した嫌気的下水汚泥
400を加える。混合物を、30℃〜32℃の水道水
により２m³とし、均一にし、発酵槽を密封し、そ
して30℃〜32℃にて嫌気的発酵を開始する。

この後毎日、（20分間撹拌した後に）発酵ブロ
スからサンプルを採取し、7.0のメタノールを
加え、撹拌を20分間継続し、サンプルを採取しそ
して発酵を24時間継続する。メタノールの添加前
に採取したサンプルから発酵ブロス中のメタノー
ル濃度及びPHを測定し、他方メタノール添加後に
採取したサンプルを用いてバイオガスの発生速度
を測定する。

発酵の７日目（第１代）に培養物を新鮮なブロ
スに接種し、規模を５倍に拡大する10m³の実働容
積を有する発酵槽に30℃〜32℃に加温した水道水
６m³をポンプ送入し、この後下記の栄養素を導入
する。

メタノール 35.0 50Kgのコーンステイープリカーから得られた加水
分解物 100.0 炭酸水素アンモニウム 30.0Kg 塩化マグネシウム 1.0Kg 塩化コバルト 0.05Kg ５，６−ジメチルベンズイミダゾール 0.03Kg 亜硫酸水素ナトリウム 0.30Kg 十分に均一した後、７日間発酵したブロス２m³
を、前記のブロスにポンプ送入し、次にこれを30
℃〜32℃の水道水により10m³とし、そして均一に
した後、30℃〜32℃にて嫌気的発酵を開始する。

この後毎日、発酵ブロスを30分間撹拌し、サン
プルを採取し、35のメタノールを導入し、撹拌
をさらに30分間継続し、そしてさらにサンプルを
採取する。

サンプルは前記のようにして規則的に分析す
る。

40分間撹拌した後10容量％の第２代発酵ブロス
を取り出し、そして下記のようにして調製した同
容量のブロスを導入する。

30℃〜32℃に加温した水道水0.5m³に次の栄養
素を溶解する。

メタノール 35.0 5.0Kgのコーンステイープリカーから得られた加
水分解物 10.0 炭酸水素アンモニウム 3.0Kg 塩化マグネシウム 0.1Kg 塩化コバルト 0.05Kg ５，６−ジメチルベンズイミダゾール 0.03Kg 亜硫酸水素ナトリウム 0.02Kg 上記のブロスを発酵槽に導入し、そして次に水
道水により10m³にする。これを30分間撹拌し、次
に撹拌を停止し、そしてさらに24時間嫌気的発酵
を継続する。

24時間後、接種材料の製造が完了する。発酵ブ
ロスの特性は、PH＝5.4〜5.8；ガス発生0.5〜0.8
／発酵ブロス／日；活性成分含量8.3mg／
である。

得られた発酵ブロスは補酵素B₁₂の製造におい
て使用するのに適する。

栄養素の調製、及びコーンステイープリカーの
品質は例１に記載した方法により調節する。

Claims

【特許請求の範囲】１非無菌的条件下で補酵素B₁₂を回分式、半連
続式又は連続式に発酵生産するために適する、嫌
気性中温性メタン生産性混合微生物集団を含有す
る接種材料の製造方法であつて、下水汚泥に由来する (1) コリネバクテリウム（Corynebacterium）に
属する微生物、プロピオニバクテリウム
（Propionibacterium）に属する微生物及びメ
タノコツカス（Metanococcus）に属する微生
物を含んで成る混合微生物を、メタノール、熱
処理により加水分解されていてもよいコーンス
テイプリカー溶液及び／又は熱処理により加水
分解されたコーンスロツプ、炭酸水素アンモニ
ウム、塩化マグネシウム、塩化コバルト、５，
６−ジメチルベンジミダゾール並びに亜硫酸水
素ナトリウムを含む培地に、0.3〜0.5容量％の
メタノールを毎日添加しながら、嫌気的、中
温、非無菌的条件下で発酵を行い、 (2) 得られた発酵ブロス（第一代）又はその部分
を、前記(1)に記載した培地成分の同じ成分を含
む培地数倍容量に加え、そして前記(1)と同じ条
件下でPHが５〜5.5に低下するまで発酵を継続
し、 (3) 前記(2)において得られた発酵ブロス（第二
代）５〜10容量％を取り出し、そして同じ容量
の、メタノール、加熱により加水分解されてい
てもよいコーンステイープリカー溶液及び／又
は加熱により加水分解されたコーンスロツプ、
炭酸水素アンモニウム、塩化マグネシウム、塩
化コバルト、５，６−ジメチルベンジミダゾー
ル並びに亜硫酸水素ナトリウムを含む培地で置
き換え、そして (4) 所望により数日間にわたり発酵を継続するこ
とにより、補酵素B₁₂の製造における使用に適
し、嫌気性中温性混合微生物集団を含有する接
種材料を得る、ことを特徴とする方法。２前記コーンステイープリカー及び熱処理によ
り加水分解されたコーンスロツプが微生物に適す
るものである、特許請求の範囲第１項に記載の方
法。