JPH0543357B2 - - Google Patents
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- JPH0543357B2 JPH0543357B2 JP58167458A JP16745883A JPH0543357B2 JP H0543357 B2 JPH0543357 B2 JP H0543357B2 JP 58167458 A JP58167458 A JP 58167458A JP 16745883 A JP16745883 A JP 16745883A JP H0543357 B2 JPH0543357 B2 JP H0543357B2
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- pivka
- antibody
- prothrombin
- measurement
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- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/86—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving blood coagulating time or factors, or their receptors
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- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
- G01N2333/914—Hydrolases (3)
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- G01N2333/974—Thrombin
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、モノクローナル抗PIVKA−抗
体、当該抗体を用いてPIVKA−を二抗体サン
ドイツチ法を利用する酵素免疫測定法によつて測
定する測定方法および測定試薬に関する。
体、当該抗体を用いてPIVKA−を二抗体サン
ドイツチ法を利用する酵素免疫測定法によつて測
定する測定方法および測定試薬に関する。
PIVKA−とはプロトロンビン前駆物質およ
びプロトロンビン前駆物質のグルタミン酸残基に
ついてのカルボキシル化体であつて、当該カルボ
キシ化の程度が不完全なものを言う。これに対
し、プロトロンビン前駆物質のグルタミン酸残基
についてのカルボキシル化体であつて、当該カル
ボキシル化の程度が完全なものを正常プロトロン
ビンと言う。従つて、PIVKA−とは正常プロ
トロンビンのγ−カルボキシルグルタミン酸残基
についての脱カルボキシル化体であるということ
もできる。ところで実際には、例えば血液中にお
いては上記定義に属しながらカルボキシル化の程
度の異なる複数の物質が混在した状態で存在して
おり、当該混在物質群についてこれを包括的に
PIVKA−と呼ぶことがある。本発明は主とし
て血液中に存するPIVKA−の測定を目的とし
ているので、本発明におけるPIVKA−とは、
特にことわらない限り、包括的な意味における
PIVKA−を言う。地方、PIVKA−は生理
的、臨床的にはビタミンＫの不足する状態あるい
はビタミンＫ拮抗剤の投与によつてビタミンＫ作
用の抑制された状態の場合に出現することがわか
つている。すなわちプロトロンビン前駆物質はそ
のグルタルミン酸残基がビタミンＫおよびカルボ
キシラーゼの存在下においてカルボキシル化され
活性体正常プロトロンビンとなるのであるが、ビ
タミンＫの不足状態あるいは抑制状態においては
当該カルボキシル化が不完全となり、その結果
PIVKA−が血液中に出現するのである。
PIVKA−とはProtein induced by vitamin
Ｋ absence−の略称であり、これは上記生理
的観点に基づいて命名されたものである。
びプロトロンビン前駆物質のグルタミン酸残基に
ついてのカルボキシル化体であつて、当該カルボ
キシ化の程度が不完全なものを言う。これに対
し、プロトロンビン前駆物質のグルタミン酸残基
についてのカルボキシル化体であつて、当該カル
ボキシル化の程度が完全なものを正常プロトロン
ビンと言う。従つて、PIVKA−とは正常プロ
トロンビンのγ−カルボキシルグルタミン酸残基
についての脱カルボキシル化体であるということ
もできる。ところで実際には、例えば血液中にお
いては上記定義に属しながらカルボキシル化の程
度の異なる複数の物質が混在した状態で存在して
おり、当該混在物質群についてこれを包括的に
PIVKA−と呼ぶことがある。本発明は主とし
て血液中に存するPIVKA−の測定を目的とし
ているので、本発明におけるPIVKA−とは、
特にことわらない限り、包括的な意味における
PIVKA−を言う。地方、PIVKA−は生理
的、臨床的にはビタミンＫの不足する状態あるい
はビタミンＫ拮抗剤の投与によつてビタミンＫ作
用の抑制された状態の場合に出現することがわか
つている。すなわちプロトロンビン前駆物質はそ
のグルタルミン酸残基がビタミンＫおよびカルボ
キシラーゼの存在下においてカルボキシル化され
活性体正常プロトロンビンとなるのであるが、ビ
タミンＫの不足状態あるいは抑制状態においては
当該カルボキシル化が不完全となり、その結果
PIVKA−が血液中に出現するのである。
PIVKA−とはProtein induced by vitamin
Ｋ absence−の略称であり、これは上記生理
的観点に基づいて命名されたものである。
PIVKA−およびPIVKA−とビタミンＫ
との関連について参考のために下記文献(1)〜(3)を
列挙する。
との関連について参考のために下記文献(1)〜(3)を
列挙する。
(1) Stenflo J.Fernlund P.Egan W.Roepstorff
P.Vitamine Ｋ dependent modification of
glutamic acid residues in prothrombin.
Proc.Natl.Acad.Sci.USA.（1974）71、2730−
３ (2) Nelsestuen GL.Zytkovicz TH.Howard
JB. The mode of action of vitamin Ｋ：
identification of γ−carboxyglutamic acid
as ａ compornent of prothrombin. J.Biol.Chem.1974；249：6347−50 (3) Magnusson S.Sottrup−Jensen L.Petersen
TE.Morris HR.Dell A.Primary structure of
the vitamin Ｋ−dependent part of
prothrombin. FEBS Lett.1974；44：189−93 さて、血液中のPIVKA−を測定すること
によつてビタミンＫ欠乏症、とりわけ乳児の頭
蓋内出血など乳児のビタミンＫ欠乏性出血症を
早期に発見することは臨床上重要な作業であ
る。
P.Vitamine Ｋ dependent modification of
glutamic acid residues in prothrombin.
Proc.Natl.Acad.Sci.USA.（1974）71、2730−
３ (2) Nelsestuen GL.Zytkovicz TH.Howard
JB. The mode of action of vitamin Ｋ：
identification of γ−carboxyglutamic acid
as ａ compornent of prothrombin. J.Biol.Chem.1974；249：6347−50 (3) Magnusson S.Sottrup−Jensen L.Petersen
TE.Morris HR.Dell A.Primary structure of
the vitamin Ｋ−dependent part of
prothrombin. FEBS Lett.1974；44：189−93 さて、血液中のPIVKA−を測定すること
によつてビタミンＫ欠乏症、とりわけ乳児の頭
蓋内出血など乳児のビタミンＫ欠乏性出血症を
早期に発見することは臨床上重要な作業であ
る。
かかる予知予防の評価のために現在はヘパプ
ラスチンテスト（HPT）が頻用されているの
であるが、特に乳児期においては凝固蛋白によ
る生理的低値が認められるためにヘパプラスチ
ンテストは必ずしもビタミンＫの欠乏状態を反
映するものではないのが実情である。そこで、
より適格な、かつ正確な予知予防法を確立する
ためにはPIVKA−を直接に定量する必要が
あり、この目的のために二次元交叉免疫電気泳
動法（CIEP）の実施が推奨されるのである。
しかしながらこの方法は操作が繁雑であり、多
くの検体数がある場合には、それを同時に処理
することは困難であり、臨床検査の場において
実用的ではない。従つてより簡便な方法を確立
するためには放射免疫測定法、酵素免疫測定法
の実施が好まれるのである。例えば下記文献(4)
に示される例は放射免疫測定法を実施する方法
である。
ラスチンテスト（HPT）が頻用されているの
であるが、特に乳児期においては凝固蛋白によ
る生理的低値が認められるためにヘパプラスチ
ンテストは必ずしもビタミンＫの欠乏状態を反
映するものではないのが実情である。そこで、
より適格な、かつ正確な予知予防法を確立する
ためにはPIVKA−を直接に定量する必要が
あり、この目的のために二次元交叉免疫電気泳
動法（CIEP）の実施が推奨されるのである。
しかしながらこの方法は操作が繁雑であり、多
くの検体数がある場合には、それを同時に処理
することは困難であり、臨床検査の場において
実用的ではない。従つてより簡便な方法を確立
するためには放射免疫測定法、酵素免疫測定法
の実施が好まれるのである。例えば下記文献(4)
に示される例は放射免疫測定法を実施する方法
である。
(4) Rita A.Blanchard et al、Acquired
vitamin Ｋ−dependent carboxylation
defficiemcy in liver disease： The New England J.Medicine、vol.305No.
５（1981）242−248 しかしこの方法は競合ラジオイムノアツセイ
を利用する方法であり、いまだ実用的なものと
は言えない。またこの方法ではPIVKA−特
異抗体の精製が繁雑であり、かつ得られても量
的制限がある。
vitamin Ｋ−dependent carboxylation
defficiemcy in liver disease： The New England J.Medicine、vol.305No.
５（1981）242−248 しかしこの方法は競合ラジオイムノアツセイ
を利用する方法であり、いまだ実用的なものと
は言えない。またこの方法ではPIVKA−特
異抗体の精製が繁雑であり、かつ得られても量
的制限がある。
かかる実情にかんがみ本発明者はPIVKA−
を正確に、かつ簡便に測定することができ、
とりわけ臨床検査の場において多数の検体数を
同時に処理することのできる実用的な方法を求
めて検討をおこなつた。特に臨床検査の場にお
いては、例えば小児科領域におけるごとく測定
に先立ち採取血漿をあらかじめ紙により乾燥
する前処理が通常におこなわれており、従つて
求められている方法は当該前処理を実施した場
合であつてもPIVKA−を正確にかつ、簡便
に測定できる方法でなければならないという特
別の事情がある。本発明者はかかる事情を考慮
しつつ検討をおこない、その結果、二抗体サン
ドイツチ法を利用する酵素免疫測定法を採用す
べきこと、並びに当該二抗体サンドイツチ法に
おける固相化抗体としてモノクロナール抗
PIVKA−抗体を使用すべきことを見出し、
本発明を完成するに至つた。
を正確に、かつ簡便に測定することができ、
とりわけ臨床検査の場において多数の検体数を
同時に処理することのできる実用的な方法を求
めて検討をおこなつた。特に臨床検査の場にお
いては、例えば小児科領域におけるごとく測定
に先立ち採取血漿をあらかじめ紙により乾燥
する前処理が通常におこなわれており、従つて
求められている方法は当該前処理を実施した場
合であつてもPIVKA−を正確にかつ、簡便
に測定できる方法でなければならないという特
別の事情がある。本発明者はかかる事情を考慮
しつつ検討をおこない、その結果、二抗体サン
ドイツチ法を利用する酵素免疫測定法を採用す
べきこと、並びに当該二抗体サンドイツチ法に
おける固相化抗体としてモノクロナール抗
PIVKA−抗体を使用すべきことを見出し、
本発明を完成するに至つた。
すなわち、本発明の目的はたとえ検体数が多
く、また乾燥前処理をおこなつた場合において
も、それら検体中のPIVKA−を正確に、か
つ簡便に測定することを可能にすることであ
り、本発明は該目的の達成のために二抗体サン
ドイツチ法を利用する酵素免疫測定法であつ
て、固相化抗体としてモノクロナール抗
PIVKA−抗体を使用する構成を提示する。
く、また乾燥前処理をおこなつた場合において
も、それら検体中のPIVKA−を正確に、か
つ簡便に測定することを可能にすることであ
り、本発明は該目的の達成のために二抗体サン
ドイツチ法を利用する酵素免疫測定法であつ
て、固相化抗体としてモノクロナール抗
PIVKA−抗体を使用する構成を提示する。
以下に本発明を詳細に説明する。
本発明に係るモノクロナール抗PIVKA−
抗体は例えば次のように製造される。
抗体は例えば次のように製造される。
まずPIVKA−を用意する。このためには
ワーフアリン服用者血漿をBaSO4、BaCO3処
理してプロトロンビンを吸着除去し、次にDE
−52celluloseによるイオン交換をおこない、
最後に正常プロトロンビンおよびPIVKA−
の両者に対する共通部分のモノクロナール抗体
を用いたアフイニテイカラムに吸着せしめ、
4M塩酸グアニジンにて溶出し、透析し、濃縮
すれば得られる。
ワーフアリン服用者血漿をBaSO4、BaCO3処
理してプロトロンビンを吸着除去し、次にDE
−52celluloseによるイオン交換をおこない、
最後に正常プロトロンビンおよびPIVKA−
の両者に対する共通部分のモノクロナール抗体
を用いたアフイニテイカラムに吸着せしめ、
4M塩酸グアニジンにて溶出し、透析し、濃縮
すれば得られる。
用意したPIVKA−50μｇを同容量のフロ
イント完全アジユバントと共にBALE／Ｃマウ
スの腹腔内に投与し、さらに２週後にPIVKA
−15μｇを尾静脈内へ投与し、３日後に脾細
胞を摘出する。
イント完全アジユバントと共にBALE／Ｃマウ
スの腹腔内に投与し、さらに２週後にPIVKA
−15μｇを尾静脈内へ投与し、３日後に脾細
胞を摘出する。
直ちに腫瘍細胞株P3U1と渡辺等の方法（下
記文献(5)参照）よりポリエチレングリコール
4000をもつて細胞融合し、限界希釈法によりク
ローニングを３回おこなえばよい。ここでクロ
ーニングは例えばmono−AB−Screen Ｇキツ
ト（Zymed）を用い、正常プロトロンビンと
は反応を呈さず、かつ脱カルボキシル化したプ
ロトロンビンとのみ反応を呈するウエルを選択
し、さらにこのウエルがネーテイブな異常プロ
トロンビンと反応を呈することを確認すること
によつてモノクロナール抗PIVKA−抗体産
生セルラインとして確立される。なお、ここで
使用される正常プロトロビンおよび脱カルボキ
シル化したプロトロンビンはそれぞれ下記文献
(6)のShapiro等の方法および(7)のTuhy等の方
法によつて製造すればよい。正常プロトロンビ
ンは例えば以下のごとく製造される。
記文献(5)参照）よりポリエチレングリコール
4000をもつて細胞融合し、限界希釈法によりク
ローニングを３回おこなえばよい。ここでクロ
ーニングは例えばmono−AB−Screen Ｇキツ
ト（Zymed）を用い、正常プロトロンビンと
は反応を呈さず、かつ脱カルボキシル化したプ
ロトロンビンとのみ反応を呈するウエルを選択
し、さらにこのウエルがネーテイブな異常プロ
トロンビンと反応を呈することを確認すること
によつてモノクロナール抗PIVKA−抗体産
生セルラインとして確立される。なお、ここで
使用される正常プロトロビンおよび脱カルボキ
シル化したプロトロンビンはそれぞれ下記文献
(6)のShapiro等の方法および(7)のTuhy等の方
法によつて製造すればよい。正常プロトロンビ
ンは例えば以下のごとく製造される。
新鮮凍結血漿にDE−52 celluloseおよびクエ
ン酸緩衝液を加え、撹拌後沈渣を洗浄し、クエ
ン酸緩衝液で溶出し、BaCl2を加えてこれを吸
着せしめ、クエン酸緩衝液で溶出し、飽和硫酸
アンモニウムを加えて塩析せしめる。塩析物を
クエン酸緩衝液にサスペンジヨンし、透析し、
Sephadex Ｇ−100カラムでゲル過して所定
のピークに相当するフラクシヨンを集める。
DE−52celluloseカラムにかけNaClの濃度勾配
をもつたクエン酸緩衝液で溶出せしめれば目的
の正常プロトロンビンが得られる。
ン酸緩衝液を加え、撹拌後沈渣を洗浄し、クエ
ン酸緩衝液で溶出し、BaCl2を加えてこれを吸
着せしめ、クエン酸緩衝液で溶出し、飽和硫酸
アンモニウムを加えて塩析せしめる。塩析物を
クエン酸緩衝液にサスペンジヨンし、透析し、
Sephadex Ｇ−100カラムでゲル過して所定
のピークに相当するフラクシヨンを集める。
DE−52celluloseカラムにかけNaClの濃度勾配
をもつたクエン酸緩衝液で溶出せしめれば目的
の正常プロトロンビンが得られる。
(5) 渡辺、海津：リンパ球の細胞融合法
Biemodical Sciences Vol.1、No.１、46−51
（1980） (6) Shapiro S.S、D.E.Waugh：The
purification of human prothrombin、
Thromb.Diath Haemorph.、16、469−490
（1966） (7) Tuhy PM、Bloom JW、Mann KG：
Decarboxylation of bovine prothrombin
frag−ment Ｉ and prothrombin、
Biochemistry 1939、18、5842−８ 次に本発明における二抗体サンドイツチ法を利
用する酵素免疫測定法は例えば次のように実施さ
れる。
Biemodical Sciences Vol.1、No.１、46−51
（1980） (6) Shapiro S.S、D.E.Waugh：The
purification of human prothrombin、
Thromb.Diath Haemorph.、16、469−490
（1966） (7) Tuhy PM、Bloom JW、Mann KG：
Decarboxylation of bovine prothrombin
frag−ment Ｉ and prothrombin、
Biochemistry 1939、18、5842−８ 次に本発明における二抗体サンドイツチ法を利
用する酵素免疫測定法は例えば次のように実施さ
れる。
測定系全体の構成要素は固相、固相コート用の
モノクロナール抗PIVKA−抗体（第一抗体）、
標準抗原または被検血漿、標識用抗体（第二抗
体）、酵素および基質である。固相としてはエン
ザイムイムノアツセイ用のマイクロタイタープレ
ートのウエルを用いればよい。測定に先立ちモノ
クロナール抗PIVKA−抗体を炭酸緩衝液（PH
8.5）に溶解し、例えばポリスチロール製エンザ
イムイムノアツセイ用ウエルに入れ、４℃で一夜
放置すれば固相表面はコートされる。しかしモノ
クロナール抗体によつてコートされていない表面
部分もあるので、この部分に対しては牛血清アル
ブミンをリン酸緩衝液に溶解してウエルに加え同
様に放置して牛血清アルブミンによつてコートす
る。
モノクロナール抗PIVKA−抗体（第一抗体）、
標準抗原または被検血漿、標識用抗体（第二抗
体）、酵素および基質である。固相としてはエン
ザイムイムノアツセイ用のマイクロタイタープレ
ートのウエルを用いればよい。測定に先立ちモノ
クロナール抗PIVKA−抗体を炭酸緩衝液（PH
8.5）に溶解し、例えばポリスチロール製エンザ
イムイムノアツセイ用ウエルに入れ、４℃で一夜
放置すれば固相表面はコートされる。しかしモノ
クロナール抗体によつてコートされていない表面
部分もあるので、この部分に対しては牛血清アル
ブミンをリン酸緩衝液に溶解してウエルに加え同
様に放置して牛血清アルブミンによつてコートす
る。
標準抗原としては濃度既知の患者血漿を使用す
る。標準抗原を牛血清アルブミン含有リン酸緩衝
液（PH7.4）に溶解し、コートされたウエルに加
えて反応せしめてから洗浄すればよい。
る。標準抗原を牛血清アルブミン含有リン酸緩衝
液（PH7.4）に溶解し、コートされたウエルに加
えて反応せしめてから洗浄すればよい。
標識用抗体（第二抗体）としては適当なる抗ヒ
トロプロトロンビン抗体を選択すればよく、例え
ば抗ヒトプロトロンビンウサギIgGを使用すれば
よい。抗ヒトプロトロンビンウサギIgGは次のよ
うに製造すればよい。
トロプロトロンビン抗体を選択すればよく、例え
ば抗ヒトプロトロンビンウサギIgGを使用すれば
よい。抗ヒトプロトロンビンウサギIgGは次のよ
うに製造すればよい。
まず、新鮮凍結血漿より前記Shapiro等の方法
によりヒトプロトロンビンを得る。次にこのヒト
プロトロンビンでウサギを免疫し、採血し、血清
に硫酸アンモニウムを加えて塩析し、透析後、
DE−52 celluloseでイオン交換する。これをヒト
プロトロンビンアフイニテイーカラムにかけ、
4M塩酸グアニジンで溶出すれば、目的の抗ヒト
プロトロンビンウサギIgGを得る。なお、ヒトプ
ロトロンビンアフイニテイーカラムはCN−Brを
常法により活性化し、これにヒトプロトロンビン
をリン酸緩衝液に溶解して加えて吸着せしめれば
調製される。
によりヒトプロトロンビンを得る。次にこのヒト
プロトロンビンでウサギを免疫し、採血し、血清
に硫酸アンモニウムを加えて塩析し、透析後、
DE−52 celluloseでイオン交換する。これをヒト
プロトロンビンアフイニテイーカラムにかけ、
4M塩酸グアニジンで溶出すれば、目的の抗ヒト
プロトロンビンウサギIgGを得る。なお、ヒトプ
ロトロンビンアフイニテイーカラムはCN−Brを
常法により活性化し、これにヒトプロトロンビン
をリン酸緩衝液に溶解して加えて吸着せしめれば
調製される。
酸素としてはアルカリホスフアターゼ、グルコ
ースオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、ベータオ
キシデーザ等を使用することができる。測定に先
立ちグルタールアルデヒドのごとき結合剤をもつ
て標識用抗体に酵素を結合せしめてコンジユゲー
トとし、本発明測定方法の実施のための試薬の一
部としてあらかじめ準備しておくことができる。
例えば下記文献(8)のNakane等の方法により標識
すればよい。
ースオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、ベータオ
キシデーザ等を使用することができる。測定に先
立ちグルタールアルデヒドのごとき結合剤をもつ
て標識用抗体に酵素を結合せしめてコンジユゲー
トとし、本発明測定方法の実施のための試薬の一
部としてあらかじめ準備しておくことができる。
例えば下記文献(8)のNakane等の方法により標識
すればよい。
(8) PK.Nakane、RM.Nakamura、WR.Dito、
ES.Tucker：「Preparation and
standarization of enzyme labeled
conjugate」 immunoassaies in the clinical laboratory
（3ed）P81 Alan Ｒ Liss Inc.NY 基質は選択した酵素に応じて適宜使用すれば
よい。例えば酵素としてアルカリホスフアター
ゼを選択した場合においてはｐ−ニトロフエニ
ルホスフエートを、またペルオキシダーゼを選
択した場合においてはABTSJ2，2′−アジノー
ビ（3′エチルベンツチアゾリンスルホン酸））
を使用すればよい。
ES.Tucker：「Preparation and
standarization of enzyme labeled
conjugate」 immunoassaies in the clinical laboratory
（3ed）P81 Alan Ｒ Liss Inc.NY 基質は選択した酵素に応じて適宜使用すれば
よい。例えば酵素としてアルカリホスフアター
ゼを選択した場合においてはｐ−ニトロフエニ
ルホスフエートを、またペルオキシダーゼを選
択した場合においてはABTSJ2，2′−アジノー
ビ（3′エチルベンツチアゾリンスルホン酸））
を使用すればよい。
測定は二抗体サンドイツチ法を利用する酵素
免疫測定法における通常の手順に従つておこな
えばよい。従つて後記実施例において示される
ごとくコートしたウエルに標準抗原または被検
血漿を加えてインキユベートし、続いて酵素標
識抗体を加えてインキユベートし、最後に基質
を加えてインキユベートし、反応を停止せしめ
てから、基質の分解量を分光光度計を用いて測
定すればよい。
免疫測定法における通常の手順に従つておこな
えばよい。従つて後記実施例において示される
ごとくコートしたウエルに標準抗原または被検
血漿を加えてインキユベートし、続いて酵素標
識抗体を加えてインキユベートし、最後に基質
を加えてインキユベートし、反応を停止せしめ
てから、基質の分解量を分光光度計を用いて測
定すればよい。
次に本発明測定試薬は本発明測定方法の実施
に直接使用する試薬であり、測定方法における
と同一の目的を達成するものである。従つて本
発明測定試薬の具体的態様を示せば次のごとく
なる。
に直接使用する試薬であり、測定方法における
と同一の目的を達成するものである。従つて本
発明測定試薬の具体的態様を示せば次のごとく
なる。
すなわち、本発明測定試薬はモノクロナール
抗PIVKA−抗体を必須の構成成分とし、当
該抗体単独または当該抗体に固相、標準抗原、
標識用抗ヒトプロトロンビン抗体、酵素および
基質よりなる群から任意に選択した一乃至五を
組合せたもののセツトである。ここにおいて、
セツト中に固相が含まれる場合に当該固相がモ
ノクロナール抗PIVKA−抗体によつてコー
トされた状態で提供されること、あるいはセツ
ト中に標識用抗ヒトプロトロンビン抗体と酵素
とが含まれる場合に、両者がコンジユゲートし
た状態で提供されることは自由であり、これら
も同様に本発明測定試薬の態様に含まれる。ま
た測定の実施の便益のために適当なる抗原希釈
液、反応希釈液、基質溶解液、反応停止液等が
セツト中に添付されることも自由であり、これ
らは本発明を限定するものではない。
抗PIVKA−抗体を必須の構成成分とし、当
該抗体単独または当該抗体に固相、標準抗原、
標識用抗ヒトプロトロンビン抗体、酵素および
基質よりなる群から任意に選択した一乃至五を
組合せたもののセツトである。ここにおいて、
セツト中に固相が含まれる場合に当該固相がモ
ノクロナール抗PIVKA−抗体によつてコー
トされた状態で提供されること、あるいはセツ
ト中に標識用抗ヒトプロトロンビン抗体と酵素
とが含まれる場合に、両者がコンジユゲートし
た状態で提供されることは自由であり、これら
も同様に本発明測定試薬の態様に含まれる。ま
た測定の実施の便益のために適当なる抗原希釈
液、反応希釈液、基質溶解液、反応停止液等が
セツト中に添付されることも自由であり、これ
らは本発明を限定するものではない。
本発明の効果は次のごとく要約される。
まず本発明は二抗体サンドイツチ法を利用する
酵素免疫測定法を実施するものであるから、操作
が単純簡明であり、従つて多数の検体を同時に処
理することを可能としており、臨床検査の場に対
して実用性が高い。
酵素免疫測定法を実施するものであるから、操作
が単純簡明であり、従つて多数の検体を同時に処
理することを可能としており、臨床検査の場に対
して実用性が高い。
次に、PIVKA−と正常プロトロビンとは分
子構造が酷似しているので、PIVKA−で免疫
して得られる通常の抗体は正常プロトロンビンと
交叉してしまうのであるが、本発明においては固
相化抗体としてモノクロナール抗PIVKA−抗
体を使用するので、かくのごとき交叉はなく、従
つて後記実験例において示されるごとくPIVKA
−に対する検量性が非常によき、従来より
PIVKA−の陽性または陰性についての正確な
判定をする方法として推奨されてきた二次元交叉
免疫電気泳動法（CIEP）との間によい相関性が
ある。
子構造が酷似しているので、PIVKA−で免疫
して得られる通常の抗体は正常プロトロンビンと
交叉してしまうのであるが、本発明においては固
相化抗体としてモノクロナール抗PIVKA−抗
体を使用するので、かくのごとき交叉はなく、従
つて後記実験例において示されるごとくPIVKA
−に対する検量性が非常によき、従来より
PIVKA−の陽性または陰性についての正確な
判定をする方法として推奨されてきた二次元交叉
免疫電気泳動法（CIEP）との間によい相関性が
ある。
とりわけ本発明の優れた点は、測定に先立ち被
検血漿をあらかじめ例えば先天代謝異常スクリー
ニング用乾燥紙を用いて乾燥する前処理をおこ
なつた場合においても検量性を失うことがなく、
被検血漿をそのまま直接に測定する場合における
と同様の測定結果をもたらすことができる点であ
る。
検血漿をあらかじめ例えば先天代謝異常スクリー
ニング用乾燥紙を用いて乾燥する前処理をおこ
なつた場合においても検量性を失うことがなく、
被検血漿をそのまま直接に測定する場合における
と同様の測定結果をもたらすことができる点であ
る。
以下に記載する実施例をもつて本発明の効果を
説明する。
説明する。
実験例 １
資料および方法
三種類の試料を用意した。すなわちまず正常血
漿１ml当りBaSO4およびBaCO3を各100mgずつ加
えて120分間攪拌し、正常プロトロンビンをあら
かじめ吸着除去したプロトロンビンフリー血漿
（試料ａ）を用意した。次に試料ａに後記実施例
１において得られた正常プロトロンビンを添加し
た試料（試料ｂ）およびPIVKA−を添加した
試料（試料ｃ）を用意した。各試料をモノクロナ
ール抗PIVKA−抗体をコートしたウエルにウ
エル当りの蛋白量を変えて注入し、以下後記実施
例４におけると同じ手順に従つて測定をおこなつ
た。
漿１ml当りBaSO4およびBaCO3を各100mgずつ加
えて120分間攪拌し、正常プロトロンビンをあら
かじめ吸着除去したプロトロンビンフリー血漿
（試料ａ）を用意した。次に試料ａに後記実施例
１において得られた正常プロトロンビンを添加し
た試料（試料ｂ）およびPIVKA−を添加した
試料（試料ｃ）を用意した。各試料をモノクロナ
ール抗PIVKA−抗体をコートしたウエルにウ
エル当りの蛋白量を変えて注入し、以下後記実施
例４におけると同じ手順に従つて測定をおこなつ
た。
結 果
結果を図１に示す。図１の黄軸はウエル当りの
PIVKA−またはプロトロンビン蛋白量（μ
ｇ）を表わし、縦軸はOD420nｍ値を表わす。ま
た図中Ｘ印線は試料ａ、●印線は試料ｂ、○印線
は試料ｃについての測定結果を示す。図１より本
発明はPIVKA−に対して特異性が高く、かつ
検量性がよいことが判明する。
PIVKA−またはプロトロンビン蛋白量（μ
ｇ）を表わし、縦軸はOD420nｍ値を表わす。ま
た図中Ｘ印線は試料ａ、●印線は試料ｂ、○印線
は試料ｃについての測定結果を示す。図１より本
発明はPIVKA−に対して特異性が高く、かつ
検量性がよいことが判明する。
実験例 ２
試料および方法
ワーフアリン服用患者血漿32例、ビタミンＫ欠
乏性出血症患者血漿３例を用意して試料とした。
各試料につき二次交叉免疫電気泳動法（CIEP）
による陰性または陽性の判定並びに後記実施例４
におけると同じ手順に従う本発明方法による測定
をおこなつた。また健康成人血漿25例について同
じく実施例４におけると同じ手順に従う本発明方
法による測定をおこなつた。なお、プロトロンビ
ン時間が20秒以上であるワーフアリン服用患者血
漿16例の血漿をプールし、BaSO4およびBaCO3
による前記処理をおこなつて正常プロトロンビン
を除去し、標準抗原としてのPIVKA−を用意
し、次いでローレル法で当該PIVKA−を定量
し、正常プロトロンビン1μｇに相当する抗原量
を1A.U.と定め、A.U.／ml値と本発明方法による
OD420ｍｎ値との間の検量線をあらかじめ作成し
て、算出した。ここでこの検量線における測定範
囲内でのCVは0.015〜0.06であつた。
乏性出血症患者血漿３例を用意して試料とした。
各試料につき二次交叉免疫電気泳動法（CIEP）
による陰性または陽性の判定並びに後記実施例４
におけると同じ手順に従う本発明方法による測定
をおこなつた。また健康成人血漿25例について同
じく実施例４におけると同じ手順に従う本発明方
法による測定をおこなつた。なお、プロトロンビ
ン時間が20秒以上であるワーフアリン服用患者血
漿16例の血漿をプールし、BaSO4およびBaCO3
による前記処理をおこなつて正常プロトロンビン
を除去し、標準抗原としてのPIVKA−を用意
し、次いでローレル法で当該PIVKA−を定量
し、正常プロトロンビン1μｇに相当する抗原量
を1A.U.と定め、A.U.／ml値と本発明方法による
OD420ｍｎ値との間の検量線をあらかじめ作成し
て、算出した。ここでこの検量線における測定範
囲内でのCVは0.015〜0.06であつた。
結 果
結果を図２に示す。図２の左側は健康成人血漿
について、また右側はワーフアリン服用患者血漿
およびビタミンＫ欠乏性出血患者児血漿について
の結果を示す。右欄中〓印はビタミンＫ欠乏性出
血患者児血漿についての結果を表わし、●印はワ
ーフアリン服用患者血漿であつて、CIEPにおい
て陽性と判定された血漿例の結果をまた○印はワ
ーフアリン服用患者血漿であつて、CIEPにおい
て陰性と判定された血漿例の結果を表わす。図２
より本発明が正確な判定方法として推奨される
CIEPとの間によい相関性があり、それに代わり
得ることが判明する。
について、また右側はワーフアリン服用患者血漿
およびビタミンＫ欠乏性出血患者児血漿について
の結果を示す。右欄中〓印はビタミンＫ欠乏性出
血患者児血漿についての結果を表わし、●印はワ
ーフアリン服用患者血漿であつて、CIEPにおい
て陽性と判定された血漿例の結果をまた○印はワ
ーフアリン服用患者血漿であつて、CIEPにおい
て陰性と判定された血漿例の結果を表わす。図２
より本発明が正確な判定方法として推奨される
CIEPとの間によい相関性があり、それに代わり
得ることが判明する。
実験例 ３
試料および方法
実験例２の試料および方法の項に記載される正
常プロトロンビンを除去した後の血漿にＯ型赤血
球を55：45の比で添加し、先天代謝異常スクリー
ニング用乾燥紙に浸透し、室温で６時間乾燥
後、直径５mmにパンチアウトし、その８枚につき
牛血清アルブミン含有リン酸緩衝液0.3mlを加え
て溶出したものを標準抗原としての試料とした。
標準抗原をウエルに各種の濃度において注入し、
後記実施例４におけると同様の手順によつて本発
明方法の測定をおこなつた。
常プロトロンビンを除去した後の血漿にＯ型赤血
球を55：45の比で添加し、先天代謝異常スクリー
ニング用乾燥紙に浸透し、室温で６時間乾燥
後、直径５mmにパンチアウトし、その８枚につき
牛血清アルブミン含有リン酸緩衝液0.3mlを加え
て溶出したものを標準抗原としての試料とした。
標準抗原をウエルに各種の濃度において注入し、
後記実施例４におけると同様の手順によつて本発
明方法の測定をおこなつた。
結 果
結果を図３二示す。図３は検量線であり、63〜
63×10-3A.U.／mlの範囲におけるCVは0.063〜
0.092であつた。図３より乾燥用紙による前処
理をおこなつた場合においても、本発明測定方法
の検量性は失われることがないことが判明する。
63×10-3A.U.／mlの範囲におけるCVは0.063〜
0.092であつた。図３より乾燥用紙による前処
理をおこなつた場合においても、本発明測定方法
の検量性は失われることがないことが判明する。
実験例 ４
試料および方法
ワーフアリン服用患者血漿21例、ビタミンＫ欠
乏性出血患者児血漿３例を試料として用意した。
各試料についてそのまま直接に実施例４における
と同様の手順による測定および実験例３の試料お
よび方法の項に記載の要領に従つてあらかじめ乾
燥用紙による前処理をおこなつてから実施例４
におけると同様の手順による測定の両方をおこな
つた。
乏性出血患者児血漿３例を試料として用意した。
各試料についてそのまま直接に実施例４における
と同様の手順による測定および実験例３の試料お
よび方法の項に記載の要領に従つてあらかじめ乾
燥用紙による前処理をおこなつてから実施例４
におけると同様の手順による測定の両方をおこな
つた。
結 果
結果を図４に示す。図４の横軸は直接に測定を
おこなつた場合の測定値を表わし、縦軸は乾燥用
紙による前処理をおこなつてから測定した場合
の測定値を表わす。また図中＊印を付した例はビ
タミンＫ欠乏性出血症患者児血漿についての結果
を示す。図中の図帰直線の式はＹ＝0.57X＋3.67
であり、その相関係数ｒは0.954（Ｐ＜0.005）で
ある。図４よりその両側定値の間にはよい相関性
があり、従つて血漿採取が困難であり、乾燥のた
めの前処理をおこなう場合においても、本発明は
被検血漿をそのまま直接に測定する場合における
と同様の測定結果をもたらすことができることが
判明する。
おこなつた場合の測定値を表わし、縦軸は乾燥用
紙による前処理をおこなつてから測定した場合
の測定値を表わす。また図中＊印を付した例はビ
タミンＫ欠乏性出血症患者児血漿についての結果
を示す。図中の図帰直線の式はＹ＝0.57X＋3.67
であり、その相関係数ｒは0.954（Ｐ＜0.005）で
ある。図４よりその両側定値の間にはよい相関性
があり、従つて血漿採取が困難であり、乾燥のた
めの前処理をおこなう場合においても、本発明は
被検血漿をそのまま直接に測定する場合における
と同様の測定結果をもたらすことができることが
判明する。
以下に記載する実施例をもつて本発明をさらに
具体的に説明する。
具体的に説明する。
実施例 １
Ａ 新鮮凍結血漿400mlにDE−52 celluloseおよ
び10mMクエン酸ナトリウム液（PH7.0）200ml
を加え、５分間攪拌し、1500rpmにて遠心分離
した。沈渣を100ｍＭクエン酸三ナトリウム液
（PH7.0）で１回につき400mlずつ３回洗浄した。
次に500ｍＭクエン酸三ナトリウム液（PH7.0）
400mlを加えて溶出せしめ、溶出液に20ｍＭク
エン酸三ナトリウム液（PH7.0）2000ml添加し、
さらにBaCl220ｇを加え、15分間攪拌し、
5000rpmにて15分間遠心分離した。沈渣をと
り、脱イオン水で３回洗浄し、170ｍＭクエン
酸三ナトリウム液（PH7.0）40mlを加えて溶出
せしめた、溶出液に飽和硫酸アンモニウム20ml
を加え、3500rpmで10分間遠心分離し、さらに
その上清に飽和硫酸アンモニウム60mlを加え、
9000rpmで20分間遠心分離した。沈渣を10ｍＭ
クエン酸三ナトリウム液（PH7.0、250ｍＭ
NaCl含有）にサスペンドし、透析し、
SephadexG−100カラムでゲル過し、ピーク
部分のフラクシヨンを集めた。これをDE−52
celluloseカラムにかけ、20ｍＭクエン酸三ナ
トリウム液（100ｍＭ NaCl含有）から20ｍＭ
クエン酸三ナトリウム液（500ｍＭ NaCl含
有）に至る濃度勾配によつて溶出せしめ、ピー
ク部分のフラクシヨンを集めた。ここに精製さ
れた正常ヒトプロトロンビンが得られ、その最
終回収率は25〜35％であつた。
び10mMクエン酸ナトリウム液（PH7.0）200ml
を加え、５分間攪拌し、1500rpmにて遠心分離
した。沈渣を100ｍＭクエン酸三ナトリウム液
（PH7.0）で１回につき400mlずつ３回洗浄した。
次に500ｍＭクエン酸三ナトリウム液（PH7.0）
400mlを加えて溶出せしめ、溶出液に20ｍＭク
エン酸三ナトリウム液（PH7.0）2000ml添加し、
さらにBaCl220ｇを加え、15分間攪拌し、
5000rpmにて15分間遠心分離した。沈渣をと
り、脱イオン水で３回洗浄し、170ｍＭクエン
酸三ナトリウム液（PH7.0）40mlを加えて溶出
せしめた、溶出液に飽和硫酸アンモニウム20ml
を加え、3500rpmで10分間遠心分離し、さらに
その上清に飽和硫酸アンモニウム60mlを加え、
9000rpmで20分間遠心分離した。沈渣を10ｍＭ
クエン酸三ナトリウム液（PH7.0、250ｍＭ
NaCl含有）にサスペンドし、透析し、
SephadexG−100カラムでゲル過し、ピーク
部分のフラクシヨンを集めた。これをDE−52
celluloseカラムにかけ、20ｍＭクエン酸三ナ
トリウム液（100ｍＭ NaCl含有）から20ｍＭ
クエン酸三ナトリウム液（500ｍＭ NaCl含
有）に至る濃度勾配によつて溶出せしめ、ピー
ク部分のフラクシヨンを集めた。ここに精製さ
れた正常ヒトプロトロンビンが得られ、その最
終回収率は25〜35％であつた。
ここに得られた正常ヒトプロトロンビンでウ
サギを免疫し、その抗血清に35％硫酸アンモニ
ウムを加えて沈渣となし、透析し、DEAE−
celluloseカラムにかけ、17ｍＭリン酸緩衝液
（PH6.8）でIgG分劃をとつた。別に正常プロト
ロンビンを10ｍＭリン酸緩衝液（PH7.2、130ｍ
Ｍ NaCl含有）に３mg／c.c.となるように溶解
し、あらかじめ常法により活性化したCN−Br
に吸着させて、プロトロンビンアフイニテイー
カラムを用意した。前記IgG分劃をこのプロト
ロンビンアフイニテイーカラムにかけ、4M塩
酸グアニジンで溶出させて抗ヒトプロトロンビ
ンウサギIgGを得た。また正常ヒトプロトロン
ビンをTuhyの方法で脱カルボキシル化し、脱
カルボキシル化ヒトプロトロンビンを得た。
サギを免疫し、その抗血清に35％硫酸アンモニ
ウムを加えて沈渣となし、透析し、DEAE−
celluloseカラムにかけ、17ｍＭリン酸緩衝液
（PH6.8）でIgG分劃をとつた。別に正常プロト
ロンビンを10ｍＭリン酸緩衝液（PH7.2、130ｍ
Ｍ NaCl含有）に３mg／c.c.となるように溶解
し、あらかじめ常法により活性化したCN−Br
に吸着させて、プロトロンビンアフイニテイー
カラムを用意した。前記IgG分劃をこのプロト
ロンビンアフイニテイーカラムにかけ、4M塩
酸グアニジンで溶出させて抗ヒトプロトロンビ
ンウサギIgGを得た。また正常ヒトプロトロン
ビンをTuhyの方法で脱カルボキシル化し、脱
カルボキシル化ヒトプロトロンビンを得た。
Ｂ ワーフアリン服用者血漿にBaSO4および
BaCO3をそれぞれ100mg／mlの割合で加え、
120分間攪拌し正常プロトロンビンを吸着除去
し、次にDE−52celluloseに加えてイオン交換
をおこない、正常プロトロンビンおよび
PIVKA−の両者に対する共通部分のモノク
ロナール抗体を用いたアフイニテイーカラムに
かけ、4M塩酸グアニジンで溶出させて、透析
し、濃縮してPIVKA−を精製した。
BaCO3をそれぞれ100mg／mlの割合で加え、
120分間攪拌し正常プロトロンビンを吸着除去
し、次にDE−52celluloseに加えてイオン交換
をおこない、正常プロトロンビンおよび
PIVKA−の両者に対する共通部分のモノク
ロナール抗体を用いたアフイニテイーカラムに
かけ、4M塩酸グアニジンで溶出させて、透析
し、濃縮してPIVKA−を精製した。
得られたPIVKA−50μｇを同容量のフロ
イント完全アジユバンドと共にBALB／Ｃマ
ウス（メス、４週齢）の腹腔内に投与し、さら
に２週後にPIVKA−15μｇを尾静脈内へ投
与し、３日後に脾細胞を摘出し、腫瘍細胞株
P3U1と細胞融合した。細胞融合はポリエチレ
ングリコール4000を用いて渡辺等の方法でおこ
なつた。次に96ウエルマイクロプレートを用い
て限界希釈法により三回クローニングをおこな
つた。なおクローニングのためのアツセイには
前記Ａでの脱カルボキシル化ヒトプロトロンビ
ンおよび最終的にはネーテイブなPIVKA−
を用いた。クローニングによつて確立された抗
体産生ハイブリドーマのセルラインにはそれぞ
れ、MU−１、MU−２、MU−３、MU−４、
MU−５の識別記号を付した。これらセルライ
ンの保存培地にはFCS20％およびDMSO10％
を含有するRPMI1640倍地を使用した。凍結は
−160℃でおこない。解結は37℃でおこなう。
また生存確認は顕微鏡による形態観察および経
時的な細胞増殖能の観察によつておこなう。
イント完全アジユバンドと共にBALB／Ｃマ
ウス（メス、４週齢）の腹腔内に投与し、さら
に２週後にPIVKA−15μｇを尾静脈内へ投
与し、３日後に脾細胞を摘出し、腫瘍細胞株
P3U1と細胞融合した。細胞融合はポリエチレ
ングリコール4000を用いて渡辺等の方法でおこ
なつた。次に96ウエルマイクロプレートを用い
て限界希釈法により三回クローニングをおこな
つた。なおクローニングのためのアツセイには
前記Ａでの脱カルボキシル化ヒトプロトロンビ
ンおよび最終的にはネーテイブなPIVKA−
を用いた。クローニングによつて確立された抗
体産生ハイブリドーマのセルラインにはそれぞ
れ、MU−１、MU−２、MU−３、MU−４、
MU−５の識別記号を付した。これらセルライ
ンの保存培地にはFCS20％およびDMSO10％
を含有するRPMI1640倍地を使用した。凍結は
−160℃でおこない。解結は37℃でおこなう。
また生存確認は顕微鏡による形態観察および経
時的な細胞増殖能の観察によつておこなう。
セルラインMU−３よりモノクロナール抗
PIVKA−抗体を常法により得た。
PIVKA−抗体を常法により得た。
得られたモノクロナール抗PIVKA−抗体
を本発明測定試薬とした。またモノクロナール
抗PIVKA−抗体とＡにおいて得られた抗ヒ
トプロトロンビンウサギIgGとを組合わせてセ
ツトとなし、本発明測定試薬とした。
を本発明測定試薬とした。またモノクロナール
抗PIVKA−抗体とＡにおいて得られた抗ヒ
トプロトロンビンウサギIgGとを組合わせてセ
ツトとなし、本発明測定試薬とした。
実施例 ２
実施例１で得られたモノクロナール抗PIVKA
−抗体10〜15μｇを0.1M炭酸緩衝液（PH8.5）
50μの割合で溶解し、エンザイムイムノアツセ
イ用マルチプレートに１ウエルにつき100μず
つ注入し、４℃で一夜放置した。10ｍＭリン酸緩
衝液（PH7.4、牛血清アルブミン0.2％、
NaCl0.15M含有）で一回洗浄し、さらに１％牛
血清アルブミンを注入して一夜放置し、前記緩衝
液で三回洗浄して、コート化固相を用意した。
−抗体10〜15μｇを0.1M炭酸緩衝液（PH8.5）
50μの割合で溶解し、エンザイムイムノアツセ
イ用マルチプレートに１ウエルにつき100μず
つ注入し、４℃で一夜放置した。10ｍＭリン酸緩
衝液（PH7.4、牛血清アルブミン0.2％、
NaCl0.15M含有）で一回洗浄し、さらに１％牛
血清アルブミンを注入して一夜放置し、前記緩衝
液で三回洗浄して、コート化固相を用意した。
また実施例１で得られた抗ヒトプロトロンビン
ウサギIgGにNakane等の方法によりペルオキシ
ダーゼをコンジユゲートし、酵素標識抗体を用意
した。
ウサギIgGにNakane等の方法によりペルオキシ
ダーゼをコンジユゲートし、酵素標識抗体を用意
した。
コート化固相および酵素標識抗体を組合せてセ
ツトとし、本発明測定試薬とした。
ツトとし、本発明測定試薬とした。
実施例 ３
実施例２記載の試薬にさらにスクリーニング用
乾燥紙を添付して本発明測定試薬とした。
乾燥紙を添付して本発明測定試薬とした。
実施例 ４
実施例２におけるコート化固相に１ウエル当り
被検血漿100μを注入し、４℃で24時間インキ
ユベートする。10ｍＭリン酸緩衝液mm27.4、牛血
清アルブミン0.2％、NaCl0.15M含有）で三回洗
浄し、実施例２における酵素標識抗体50μを加
えて、37℃で60分間インキユベートする。次に前
記緩衝液で三回洗浄し、ABTS溶液100μを加
えて、30分間放置し、２ｍＭアジ化ナトリウム
50μを加えて反応を停止させる。ここでOD420n
ｍを測定する。
被検血漿100μを注入し、４℃で24時間インキ
ユベートする。10ｍＭリン酸緩衝液mm27.4、牛血
清アルブミン0.2％、NaCl0.15M含有）で三回洗
浄し、実施例２における酵素標識抗体50μを加
えて、37℃で60分間インキユベートする。次に前
記緩衝液で三回洗浄し、ABTS溶液100μを加
えて、30分間放置し、２ｍＭアジ化ナトリウム
50μを加えて反応を停止させる。ここでOD420n
ｍを測定する。
図１は実験例１結果の項に記載の図１に相当
し、本発明測定方法の一態様において示される蛋
白量と測定値との間の関係を表わすグラフであ
る。図２は実験例２結果の項に記載の図２に相当
し、本発明測定方法と二次元交叉免疫電気泳動法
との相関を示すグラフである。図３は実験例３結
果の項に記載の図３に相当し、被検血漿を乾燥用
紙によつて前処理した場合における検量線を示
すグラフである。図４は実験例４結果の項に記載
の図４に相当し、被検血漿を直接測定した場合に
おける測定値と乾燥処理後に測定した場合におけ
る測定値との相関を示すグラフである。
し、本発明測定方法の一態様において示される蛋
白量と測定値との間の関係を表わすグラフであ
る。図２は実験例２結果の項に記載の図２に相当
し、本発明測定方法と二次元交叉免疫電気泳動法
との相関を示すグラフである。図３は実験例３結
果の項に記載の図３に相当し、被検血漿を乾燥用
紙によつて前処理した場合における検量線を示
すグラフである。図４は実験例４結果の項に記載
の図４に相当し、被検血漿を直接測定した場合に
おける測定値と乾燥処理後に測定した場合におけ
る測定値との相関を示すグラフである。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ PIVKA−で免疫されたマウス脾細胞とマ
ウス腫瘍細胞P3U1との融合により形成されたハ
イブリドーマより生成されたヒトPIVKA−と
反応するがヒトプロトロビンとは反応しないモノ
クロナール抗PIVKA−抗体。 ２ 臨床検体中のPIVKA−を測定するにあた
り、二抗体サンドイツチ法を利用する酵素免疫測
定法を用い、その測定に係る固体化抗体として、
PIVKA−で免疫されたマウス脾細胞とマウス
腫瘍細胞P3U1との融合により形成されたハイブ
リドーマより生成されたヒトPIVKA−と反応
するがヒプロトロビンとは反応しないモノクロナ
ール抗PIVKA−抗体を使用することを特徴と
するPIVKA−の測定方法。 ３ 臨床検体中のPIVKA−の測定にあたり、
被験血漿をあらかじめ先天代謝異常スクリーニン
グ用乾燥瀘紙を用いて乾燥したのち該測定をおこ
なう特許請求の範囲第２項記載のPIVKA−の
測定方法。 ４ PIVKA−を二抗体サンドイツチ法を利用
する酵素免疫測定法によつて測定する試薬であつ
て、当該測定に係る固相化抗体として、PIVKA
−で免疫されたマウス脾細胞とマウス腫瘍細胞
P3U1との融合により形成されたハイブリドーマ
より生成されたヒトPIVKA−と反応するがヒ
トプロトロビンとは反応しないモノクロナール抗
PIVKA−抗体を必須の構成成分とする
PIVKA−の測定試薬。
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