【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
本発明はリゾチーム活性測定用試薬に関するも
のである。体液中のリゾチーム活性の測定は、急
性単球性白血病や非典型的結核症の診断及び腎疾
患のスクリーニングに有用な情報を与えるものと
して臨床的意義が高い。
（従来の技術）
従来、リゾチーム活性は生菌体、例えばミクロ
コツカス・リゾデイクテイカス（Micrococcus
lysodeiktcus）等を基質として、その溶菌速度に
より活性を求めていたが、定量性に乏しく感度が
低く、測定時間も半日以上と長く、また基質が生
菌体であるから調製毎のバラツキが大きく、その
結果として測定値のバラツキが大きなものとなつ
ており、実際には臨床診断法として実用化される
ことがなかつた。
一方、最近Ｎ−アセチルグルコサミンのオリゴ
マーにアグリコンとして発色物質、例えばｐ−ニ
トロフエノールを結合した化合物を基質とするリ
ゾチームの測定法が提案されている（特開昭55−
38504号公報）。この方法は上記生菌体を用いる方
法に比べて定量性に優れるが、リゾチームの作用
PH（約6.0付近）と加水分解されて生じるｐ−ニ
トロフエノールが発色するPH（8.5以上）とが異
なるために、酵素反応と発色反応を同じ条件で行
うことができないために、試薬数および操作ステ
ツプが多く、酵素活性を求める場合に一番適当で
あるといわれている速度分析（レートアツセイ）
が出来ない欠点がある。
（発明が解決しようとする問題点）
本発明の目的は、定量性に優れたリゾチームの
レートアツセイが可能となるリゾチーム活性測定
試薬を提供することである。
（問題点を解決するための手段）
本発明者らは、上記目的を達成するために、
種々鋭意検討したところ、基質としてＮ−アセチ
ルキトオリゴ糖を用い、Ｎ−アセチルヘキソサミ
ンオキシダーゼをアデノシントリホスフエート
（以下ATPと略記する）の存在下、共役酵素とし
て用いることにより、体液中のリゾチーム活性を
短時間に正確簡単にレートアツセイ出来ることを
見出し、本発明に到達した。すなわち本発明はＮ
−アセチルキトオリゴ糖、Ｎ−アセチルヘキソサ
ミンオキシダーゼおよびアデノシントリホスフエ
ートを含有することを特徴とするリゾチーム活性
測定用試薬である。
本発明に使用するＮ−アセチルキトオリゴ糖と
しては、下記一般式で示される化合物がある。
（式中ｎ＝３又は４）
具体的にはキトペンタオース（ｎ＝３）、キト
ヘキサオース（ｎ＝４）である。
本発明に用いるＮ−アセチルヘキソサミンオキ
シダーゼ（以下NAHODと略記する）は、Ｎ−
アセチルグルコサミンを基質として過酸化水素を
生成するものであればいかなる起源のものでもよ
いが、例えばシユードモナス（Pseudomonas）
属に属する微生物が産生するNAHODがある。
NAHODの精製ならびに性質については日本農
芸化学会昭和58年度大会において発表されてい
る。
本発明のリゾチーム活性測定試験は上記基質、
酵素およびATPを含有する。該試薬はPH4.0〜9.0
好ましくは5.0〜7.0を示す緩衝液、例えばリン酸
緩衝液、あるいは有機酸緩衝液として、クエン
酸、フタル酸緩衝液やグツド緩衝液を含むことが
望ましい。基質濃度としては特に制限はないが、
好ましくは最大のリゾチームの酵素活性を示す濃
度が適当であり、例えば0.05M以上である。次に
共役酵素であるNAHODの量としては特に制限
はないが、好ましくは最大リゾチーム活性を示す
濃度、つまりリゾチーム酵素反応を100％追随出
来る量以上添加することが適当であり、例えば
0.05U／ml以上である。ATP必要量は１ｍＭ以上
であれば十分である。
本発明のリゾチーム活性測定試薬を用いてリゾ
チーム活性を測定する方法としては、試料を該試
薬と反応させて、生成する過酸化水素を直接過酸
化水素電極で測定するか、あるいはペルオキシダ
ーゼあるいはカララーゼ等の酵素を用いて過酸化
水素を発色系に導いて比色定量するか、あるいは
NAHOD作用時に消費される酸素を酸素電極等
で直接測定する方法がある。
（作用）
本発明のリゾチーム活性測定試薬において、
ATPがNAHODの作用を活性化させることによ
り、体液中のリゾチーム活性を短時間に正確簡単
にレートアツセイすることができる。
（実施例）
以下、本発明を実施例により詳細に説明する。
実施例 １
被検液中のリゾチーム活性量を下記試薬を用い
て、下記方法により測定した。
１ 試薬
試薬R1：
NAHOD ２単位
ペルオキシダーゼ 100単位
発色剤（TOOS） ２mg
４−アミノアンチピリン 0.5mg
ATP 1.0ｍMole
0.1Mクエン酸リン酸緩衝液（PH6.0） 全量10ml
TOOS：
Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−ス
ルホプロピル）−ｍ−トルイジン−ナトリウム
試薬R2：
キトペンタオース ５ｍＭ
0.1Mクエン酸−リン酸緩衝液（PH6.0）
２ 測定方法
被検液又は既知濃度のリゾチームを含有する
サンプル50μに、試薬R1 ２mlおよび試薬R2
500μを加えて37℃で反応させ、その吸光度
を波長550nｍで測定して発色速度を求め、既
知濃度との発色速度の比較により、被検体中の
リゾチーム活性を求めた。
反応曲線を第１図に示し、検量線を第２図に示
す。
実施例 ２
実施例１の試薬R1を用い、かつ下記試薬R2を
用いて、被検液中のリゾチーム活性量（既知濃度
のリゾチーム20mg／dl）を測定した。また実施例
１の試薬R1からATPを除いた他は同一組成の試
薬R3を用い、かつ下記試薬R2を用いて、ATP無
添加の場合の被検液中のリゾチーム活性量を測定
した。
その結果を第１表に示す。第１表から明らかな
ように、ATPを添加した方が約1.4倍高い吸光度
を示す。
試薬R2は次の組成からなる。
キトヘキサオース ５ｍＭ
0.1Mクエン酸−リン酸緩衝液 PH6.0
【表】DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION (Industrial Field of Application) The present invention relates to a reagent for measuring lysozyme activity. Measurement of lysozyme activity in body fluids has high clinical significance as it provides useful information for diagnosing acute monocytic leukemia and atypical tuberculosis and screening for renal disease. (Prior art) Lysozyme activity has conventionally been measured in living bacterial cells, such as Micrococcus lysodeichteicus.
lysodeiktcus) as a substrate, and its bacteriolysis rate was used to determine the activity, but it was not quantitative and had low sensitivity, the measurement time was long (more than half a day), and since the substrate was live bacterial cells, there was a large variation between preparations. As a result, the variation in measured values was large, and it was never put to practical use as a clinical diagnostic method. On the other hand, a method for measuring lysozyme has recently been proposed using as a substrate a compound in which a color-forming substance, such as p-nitrophenol, is bound as an aglycone to an oligomer of N-acetylglucosamine (Japanese Patent Laid-Open No. 1983-1983-1).
Publication No. 38504). This method has superior quantitative performance compared to the above method using live bacteria, but the effect of lysozyme
Because the pH (around 6.0) and the pH (8.5 or higher) at which p-nitrophenol produced by hydrolysis develops color are different, the enzymatic reaction and the coloring reaction cannot be performed under the same conditions, so the number of reagents and operations are different. Rate assay has many steps and is said to be most suitable for determining enzyme activity.
There is a drawback that it cannot be done. (Problems to be Solved by the Invention) An object of the present invention is to provide a reagent for measuring lysozyme activity that enables rate assay of lysozyme with excellent quantitative properties. (Means for solving the problem) In order to achieve the above object, the present inventors
After extensive research, we found that by using N-acetyl chito-oligosaccharide as a substrate and N-acetylhexosamine oxidase as a conjugate enzyme in the presence of adenosine triphosphate (hereinafter abbreviated as ATP), we found that lysozyme activity in body fluids can be increased. We have discovered that rate assays can be easily and accurately performed in a short period of time, and have arrived at the present invention. That is, the present invention
- A reagent for measuring lysozyme activity characterized by containing acetyl chito-oligosaccharide, N-acetylhexosamine oxidase and adenosine triphosphate. As the N-acetylchito-oligosaccharide used in the present invention, there are compounds represented by the following general formula. (In the formula, n = 3 or 4) Specifically, they are chitopentaose (n = 3) and chitohexaose (n = 4). N-acetylhexosamine oxidase (hereinafter abbreviated as NAHOD) used in the present invention is N-
It can be of any origin as long as it produces hydrogen peroxide using acetylglucosamine as a substrate, but for example, Pseudomonas
There is NAHOD produced by microorganisms belonging to the genus.
The purification and properties of NAHOD were presented at the 1981 Annual Meeting of the Japanese Society of Agricultural Chemistry. The lysozyme activity measurement test of the present invention uses the above substrate,
Contains enzymes and ATP. The reagent has a pH of 4.0 to 9.0.
It is preferable to include a buffer having a pH of 5.0 to 7.0, such as a phosphate buffer, or a citric acid buffer, a phthalate buffer, or a good buffer as an organic acid buffer. There are no particular restrictions on the substrate concentration, but
Preferably, the concentration exhibiting the maximum lysozyme enzyme activity is appropriate, for example, 0.05M or higher. Next, there is no particular limit to the amount of NAHOD, which is a coupling enzyme, but it is preferable to add it at a concentration that exhibits maximum lysozyme activity, that is, an amount that can follow 100% of the lysozyme enzymatic reaction. For example,
It is 0.05U/ml or more. A required amount of ATP of 1 mM or more is sufficient. Methods for measuring lysozyme activity using the reagent for measuring lysozyme activity of the present invention include reacting a sample with the reagent and measuring the generated hydrogen peroxide directly with a hydrogen peroxide electrode, or using peroxidase, carralase, etc. Hydrogen peroxide is introduced into a color system using an enzyme for colorimetric determination, or
There is a method of directly measuring the oxygen consumed during NAHOD action using an oxygen electrode, etc. (Action) In the reagent for measuring lysozyme activity of the present invention,
By activating the action of NAHOD by ATP, lysozyme activity in body fluids can be accurately and easily rate assayed in a short time. (Example) Hereinafter, the present invention will be explained in detail with reference to Examples. Example 1 The amount of lysozyme activity in the test solution was measured using the following reagent and the following method. 1 Reagent Reagent R 1 : NAHOD 2 units peroxidase 100 units Color developer (TOOS) 2 mg 4-aminoantipyrine 0.5 mg ATP 1.0 mMole 0.1 M citrate phosphate buffer (PH6.0) Total volume 10 ml TOOS: N-Ethyl-N- (2-Hydroxy-3-sulfopropyl)-m-toluidine-sodium reagent R2 : Chitopentaose 5mM 0.1M citric acid-phosphate buffer (PH6.0) 2 Measurement method Test solution or known concentration of lysozyme 50 μ of sample containing 2 ml of reagent R 1 and reagent R 2
500μ was added and reacted at 37°C, the absorbance was measured at a wavelength of 550 nm to determine the color development rate, and the lysozyme activity in the sample was determined by comparing the color development rate with a known concentration. The reaction curve is shown in FIG. 1, and the calibration curve is shown in FIG. Example 2 The amount of lysozyme activity (20 mg/dl of known concentration of lysozyme) in the test solution was measured using the reagent R 1 of Example 1 and the following reagent R 2 . In addition, the amount of lysozyme activity in the test solution without ATP was measured using reagent R 3 , which had the same composition except that ATP was removed from reagent R 1 in Example 1, and the following reagent R 2 . . The results are shown in Table 1. As is clear from Table 1, the absorbance is approximately 1.4 times higher when ATP is added. Reagent R 2 consists of the following composition. Chitohexaose 5mM 0.1M citric acid-phosphate buffer PH6.0 [Table]
【図面の簡単な説明】[Brief explanation of the drawing]
第１図は反応曲線を示し、第２図は検量線を示
す。
Figure 1 shows the reaction curve and Figure 2 shows the calibration curve.