JPH05502369A - 養子免疫療法に用いられる生体外増殖リンパ性細胞の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ３１、請求の範囲第６項記載の方法により製造された生体外増殖リンパ性細胞。

３２、請求の範囲第１４項記載の方法により製造された生体外増殖リンパ性細胞 。

３３、請求の範囲第１６項記載の方法により製造された腫瘍浸潤リンパ球。

３４、請求の範囲第１９項記載の方法により製造された腸瘍浸潤リンパ球。

３５、請求の範囲第２４項記載の方法により製造された腫瘍浸潤リンパ球。

３６、請求の範囲第１２項記載の方法により製造された中空糸外空間細胞上清。

３７、請求の範囲第１３項記載の方法により製造された中空糸外空間調整培地。

３８、請求の範囲第２２項記載の方法により製造された中空糸外空間細胞上清。

３９、請求の範囲第２３項記載の方法により製造された中空糸外空間調整培地。

４０゜生体外増殖リンパ性細胞を製造するための改良法であって、有効量の中空 糸外空間調整培地の存在下において該細胞を培養することを具備し、鎖員が、該 増殖細胞の成長速度を刺激して、それが存在しない場合の該細胞の成長よりも少 なくとも約５０％増加させる方法。

明細書 養子免疫療法に用いられる 生体外増殖リンパ性細胞の製造方法 この発明は、１９８８年８月３１日出願の米国特許出願０７／２３８゜４４５の 一部継続出願であり、その主題はそれらを参考にする疾病の治療的処置における 最近の非常に有望な発展に、養子免疫の利用がある（例えば、υｒｏｌｏｇｉｃ 　Ｏｎｃｏｌｏｇｙ　、、Ｌｅｐｏｒら編、Ｋｌｕｗｅｒ　Ａｃａｄｅｍｉｃ　 Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、ボストン、の第１２章、ＢｅｌｌｄｅｇｒｕＩｌら、を 参照）。養子免疫は、苦しんでいるホストへの生体外増殖リンパ性細胞（ｉｎ　 ｖｉｔｒｏ　ｅｘｐａｎｄｅｄ　ｌｙｍｐｈｏｉｄｃｅｌｌ）の受身移入である 。この生体外増殖リンパ性細胞は、疾病の処置に治療上効果的である。これは、 ホストの冒された細胞に特異的な相互作用によって、ホストの冒された細胞を破 壊することにより、またはホストに治療上有効な物質を与えることによるもので ある。

養子免疫には、罹患個体からのリンパ性細胞の単離、リンパ性細胞亜集団（ｓｕ ｂｐｏｐｌ、ｌｌ！ｔｉｏｎ　）の選択的増殖および罹患ホストへの多数（１× １０１Ｏないし５Ｘ１０”）の増殖細胞の再導入が含まれ、それにより生体外増 殖リンパ性細胞が癌性もしくは他の冒された細胞を破壊し、または治療上有効な 物質を供給する。前記リンパ性亜集団は、癌性もしくは他の冒された細胞に対す る高度の反応性を有しているか、またはイン・ビトロで、細胞集団の亜集団の増 殖に介在するインターロイキンのような成長促進物質の存在下において、高度の 反応性を有するべく変性されている。いくつかの養子免疫療法に対して、成長促 進物質の他に、標的抗原または標的抗原を示す細胞の存在下でリンパ性細胞が増 殖される。標的抗原を示す細胞は、一般に、罹患個体由来である。標的抗原は、 罹患個体の細胞から単離することが可能であり、または合成手段、例えば、組換 えＤＮＡ技術もしくはペプチド合成により調製することができる。癌治療への養 子免疫の利用は広く研究されている（例えば、前述のＢｅｌｌｄｅｇｒｕｎら参 照）。養子免疫は、腎臓、結腸、肺、腎部もしくは胸部の癌、メラノーマ、リン パ腫および内膜の治療に用いられている（例えば、前述のＢｅｔ　ｌｄｅｇｒｕ ｎ　ら、Ｔａｐａｌｉａｎら（１９８８）　１．　Ｃｌ１ｎ、０ｎｃｏ！、５　 ：８３９−８５３　、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ　（１９８７ａ　）米国特許４．６９ ０．９１５号を参照、その開示はそれらを参照することによりその全てがここに 組み込まれている；その他、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら（１９８７ｂ　）　ＮｅｗＥ ｎｇ、ｌ、　Ｍｅｄ、３１６　：　８８９−８９７、Ｉｌ！ｌｐｏｒｔａｍｔ　 Ａｄｖａｎｃｅｓ　ＩｎＯｎｃｏｌｏｇ７．　ＤｅＶｉｔａら編、ＩＢ　Ｌｉｐ ｐｉｎｃｏ目、ニューヨークの第５５頁ないし第９１頁のＲｏｓｅｎｂｅｒｇを 参照）。

養子免疫は、また、ウィルス性疾患および遺伝子欠損を含む他の疾患の治療に用 いることもできる。例えば、患者からリンパ性細胞を単離し、遺伝子欠損を修正 する酵素をコードさせるために、もしくは治療上有効な作用物質をコードさせる ために、このリンパ性細胞のＤＮＡにクローン化ＤＮＡを組み込むことにより変 性させ、培養し、その体内でクローン化ＤＮＡが発現する患者に再導入すること ができる。特異性ウィルス性標的抗原およびＩＬ−２のような特異的因子の存在 下で培養された免疫活性リンパ性細胞は、そのようなウィルスに対する個体の治 療または免疫に有用であり得る。

上述のように、リンパ性細胞が、ウィルス性抗原または免疫学的に活性なウィル ス性タンパクもしくは抗原の抗原部位のような特異的抗原の存在下において、あ るいはそのような抗原を有する細胞、例えば、腫瘍細胞もしくはウィルス感染細 胞の存在下において培養されている場合には、養子免疫療法のいくつかは、リン パ性細胞から生成したリンパ性細胞の増殖並集団の使用を必要とする。使用され る抗原は、照射腫瘍細胞のように細胞表面上に存在するものでもよく、精製抗原 であってもよく、またはクローン化ＤＮＡの発現もしくはペプチド合成のような 方法により製造された合成抗原であってもよい。抗原源が腫瘍細胞であって、腫 瘍細胞がＩＬ−２の存在下で培養されている場合には、生成する細胞は腫瘍浸潤 リンパ球である（以下、ＴＩＬ）。

そのような腫瘍特異性リンパ性細胞の増殖に必要な介在物は成長促進物質であり 、マイトジェン、サイトカインおよびリンホカインが含まれる。マイトジェンは リンパ性細胞の抗原非依存性成長に応答し、サイトカインは他の細胞に影響を及 ぼす細胞により生成される、リンホカインもしくはモノカインのような因子であ り、リンホカインは活性Ｔリンパ球により生成、分泌され、他の細胞型に影響を 及ぼす物質である。

特に、ＩＬ−２のような特定のリンホカインは、特異性表面表現型マーカーを有 し、冒された細胞表面の特定の抗原を特異的に認識するリンパ性細胞の亜集団の 特異的増殖を介在することが知られている。リンホカインであるインターロイキ ン−２（以下、ＩＬ−２）は、高度の抗腫瘍活性を有する特定のリンパ球集団の 増殖に用いられている（例えば、前述のＲｏｓｅｎｂｅｒｇ　（１９８７ａ　） 参照。その他、前述のＲｏｓｅｎｂｅｒｇ　（１９８７ｂ　）、Ｒｏｓｅｎｂｅ ｒｇ　（１９８６ａ　）　、前述のＹｒｏｎら、前述のＲｏｓｅｎｂｅｒｇ（１ ９８５）を参照）。

本来Ｔ細胞成長因子として同定されたＩＬ−２は、同質遺伝的もしくは同種異質 遺伝的腫瘍に罹患したホストに対する抗腫瘍反応性を有する特定のリンパ性細胞 の生成に用いられている。例えば、ヒトおよびマウスを含む腫瘍罹患ホストから 得た休止リンパ球をＩＬ−２の存在下で３ないし４日インキュベートすることに より、ナチュラルキラー細胞（以下、ＮＫ）耐性腫瘍細胞を溶解することが可能 であるが、正常細胞は溶解しないリンパ球皿集団の増殖が結果として起こる（例 えば、前述のＢｅｌｌｄｅｇｒｕｎら参照）。この現象は、リンホカイン活性化 キリング（以下、ＬＡＫ）と呼ばれ、この現象に応答するリンパ球は２タイプの 細胞からなる。第１のタイプの細胞はＬＡＫ細胞と呼ばれ、第２のタイプの細胞 はＴＩＬと呼ばれる。

ＬＡＫ細胞は、正常個体および癌もしくは他の疾患に罹患している個体の両者か ら得ることができる。ＬＡＫ細胞は、ＮＫおよび細胞溶解性Ｔ　ＩＪリン８球以 下、ＣＴＬ）細胞とは区別される細胞溶解系を構成するように思われる。ＬＡＫ 細胞前駆体およびエフェクター細胞は、ＮＫ細胞に典型的な表現型を有する（例 えば、Ｐｈ１ｌｌｉｐｓら、（１９８６）　Ｊ、ＥＫＬ　Ｍｅｄ。

１６４：８１４を参照）が、新鮮な非培養ＮＫ耐性異質遺伝的原初もしくは転移 癌細胞を溶解する能力を有し、末梢血リンパ球（以下、ＰＢＬ）、胸腺、牌臓、 リンパ節、骨髄、および胸管細胞から生成することが可能である（例えば、前述 のＢｅｌｌｌｅｇｒｕｎら、第２１５頁ないし第２１６頁）。また、ＬＡＫ細胞 は、新鮮な自己由来かつ異質遺伝的な腫瘍″細胞、および多くの培養細胞株を溶 解する能力を有する。ＬＡＫ細胞前駆体がＴおよびＢ細胞表面マーカーのいずれ も有していないにもかかわらず、ＬＡＫ細胞はＴ　ｈ　ｙ　１．２−陽性および Ｉａ−陰性であり、細胞毒性活性の大部分はＦｃＲ陽性亜集団にあるように見え る（例えば、Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｎａｔｕｒａｌ　Ｉｍｍｕｎ ｅＳｙｓｔｅｍＳＲｅｙｎｏｌｄｓら編、Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｕｂ、Ｃｏｒｐ、の 第３９頁ないし第５６頁のＬｅｆｏｒら（１９８９）参照）。また、ＬＡＫ細胞 は、抗体依存性細胞媒介細胞毒性（ＡＤＣＣ）に介在することが示されている（ 例えば、前述のＬｅｆｏｒらを参照）。ＩＬ−１および腫瘍壊死因子（ＴＮＦ） がそのようなＩＬ−２誘導ＡＤＣＣ活性を増強し、そのような増強が誘導された リンパ性細胞の溶解能の増強に相関していることが示されている（例えば、Ｅｉ ｓｅｎｊｈａｌら（１９８９）　Ｊ、　ｏｆ　Ｉａｍｕｎｏｌ、　１４２　：　 ２３０７−２３１３　）。

ＴＩＬ細胞は、ホストの免疫系の免疫学的応答が高まっている腫瘍内に浸潤する リンパ球であり、そこから単離することが可能である（例えば、前述のＹｒｏｎ 　ら、および前述の＾ｎｄｅｒ＠ｏｎらを参照）。ＴＩＬ細胞は、自己由来細胞 に対してはＬＡＫ細胞よりも高い特異性を有し、癌の養子免疫療法においてはＬ ＡＫ細胞よりも効力が高いことが見出されている（例えば、前述のＹｔｏｎら参 照）。ＴＩＬ細胞は、腎臓、結腸、および胸部の癌、メラノーマ、および肉腫を 含む、切除されたヒト腫瘍から得られる。

腫瘍から得られ、かつＩＬ−２の存在下で成長した細胞をイン・ビトロでインキ ュベーションすることにより、腫瘍内の活性Ｔ細胞の増殖および腫瘍細胞もしく は組織の破壊が起こる。培養の２−３週間後には全ての腫瘍が破壊されており、 培養物は細胞溶解性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の表現型を有するリンパ性細胞からな る（例えば、Ｍｕｕｌら（１９８７ａ　）　Ｊ、１ｍｍｕｎｏｔ１３８：　９８ ９、前述の７ｏｐａｌｉａｏ　ら、およびＨｏｈら（１９８６）Ｃａｎｃｅｒ　 Ｒｅｓ、　４６　：　３０１１を参照）。ヒトＴＩＬ細胞のいくつかは、彼らの 自己由来の腫瘍に対する高い特異性を示す。

ＴＩＬ細胞はまた、遺伝子治療法における利用の見込みをも示す（例えば、Ｃｕ １ｌｉｔｏｎ　（１９８９）　、５ｅｉｅｎｃ！２４４　：　１４３０−１４３ ３の“Ｎｅｗｓ　ａｎｄ　Ｃｏｍｍｅｔ　”を参照）。それらは、所望のタンパ クをコードするＤＮＡを挿入することにより変性させ、培養し、および患者に再 導入することが可能な自己由来細胞の源を提供する。所望のタンパクは、癌治療 に用いられる腫瘍壊死因子、ＨＩＶが結合するＣＤ４受容体、処置を施すホスト に欠けている酵素のような、治療上有効なタンパクであってもよく、または処置 を施したホストにおけるＴＩＬ細胞の運命を研究することを可能にするマーカー タンパクであってもよい。

ＬＡＫおよびＴＩＬ細胞に加えて、他のタイプのリンパ性細胞も抗腫瘍反応性を 有することが見出されている。例えば、ＲＬＮ　（局所排出リンパ節（＋ｅｇｉ ｏｎａｌ　ｄｒａｉｎｉｎｇ　ｌｙｍｐｈ　ｎｏｄｅ））細胞は、抗腫瘍活性を 有しており、弱い免疫原性腫瘍で免疫された腫瘍を有するマウスに由来するもの である（Ｓｌｅｐｈｅｎｓｏｎら（１９８９）　Ｓｕｒｇｅｒ７１０５：　５２ ３−５２８）　、　ＲＬＮ細胞は、治療用エフェクター細胞であり、ＬＡＫ細胞 とは異なる細胞集団を示す。

多くの癌患者は養子免疫療法には応答しないので、養子免疫療法剤として使用す るためのリンパ性細胞亜集団の増殖に、単独で、もしくはＩＬ−２と組み合わせ て有用な他のリンホカイン、サイトカインおよび／またはマイトジェンを同定す る研究が進行中である。リンパ性細胞亜集団の生成に最初に用いられたのはＩＬ −２ではあるが、ＩＬ−４、ＩＬ−６およびインターフェロンのような他のリン ホカイン、およびＴＮＦもまた生体外増殖リンパ性細胞の製造に有用であること が示されており、リンパ性細胞の特異的並集団の増殖に有用であることが立証さ れるであろう。例えば、Ｉ　Ｌ−４（Ｂ　Ｓ　Ｆ−１とも呼ぶ）はＴ細胞由来の 糖タンパクであり、最初にリンパ性細胞かＩＬ−２で刺激されていればＬＡＫ活 性を誘導するが、細胞が予め刺激されていなければ抑制されることが示されてい る（Ｘａｗａｋａｍｉ　ら　（１９８９）　Ｊ、ｏｌ　ＩｍｍｕｎｏＬ　１４２ 　二　３４５２−３４６１　）　。

ＩＬ−４はまた、それ単独で、もしくはＩＬ−２と一緒に、ＴＩＬ細胞の成長を 刺激し得ることが示されている。ＩＬ−４はＴＩＬ細胞の成長を増強し、それに 付随して、非特異的キラー活性に応答するＮＫＨｆ　細胞の成長を阻害するよう に見える（Ｈｕｎｕｎ　Ｔｕｍｏｒ　Ａｎｔｉｇｅｎｓ　ａｎｄ　５ｐＣｃｉｆ ｉｃ　Ｔｕｍｏｒ　Ｔｈｅｒｉｐ７＾ｔａｎ　Ｒ，Ｌｉ５ｓ、　Ｉｎｃ、、の第 １６７頁ないし第１７９頁のＬｏｔｚｅ　ら（１９８９）を参照、その他、ｋａ ｗａｋａｍｉら（１９８８）　１．　ｏｆＥｘｐｔａｌ、　Ｍｅｄ、１６８　： 　２１８３−２１８１を参照）。

養子免疫療法の利用可能性はほとんど無限である。リンパ性細胞と腫瘍との特異 的相互作用によって癌の治療に用いることができるだけではなく、上述のように 、遺伝病の治療に利用することができ、かつ抗腫瘍剤および他の治療剤の送達手 段としても利用することが可能である。リンパ性細胞は、酵素もしくはホルモン 欠損の結果として起こる遺伝病を患う個人から除去することが可能である。興味 の対象となる遺伝子の野生型コピーをリンパ球に挿入することができ、このリン パ球を選択剤の存在下で培養して苦しんでいる個体に再導入することができる。

別の方法として、治療上効果的な、インターフェロンもしくはＴＮＦのような抗 癌剤もしくは抗ウィルス剤を発現するようにリンパ性細胞を遺伝的に変性し、患 者に再導入することもできる（例えば、Ｇｅｎｅｊｉｃ　ｌ！ｎｇ。

Ｎｅｗｓ、ｖｏｌ、９　、Ｎｏｊ、１９８９年３月、およびＢｕｓｉｎｅｓａ　 Ｗｅｅｋ／゛１９８９年５月１日の１３３頁を参照）。

養子免疫療法の実施においては、治療上有用なリンパ性細胞亜集団の同定法を開 発するだけではなく、そのような細胞を大量に生成する方法が必要である。ヒト の癌および他の疾患の養子免疫療法は非常に有望な方法ではあるが、臨床的に有 用な数の免疫反応性リンパ性細胞を生成することが不可能であることが養子免疫 療法を利用するにあたり主要な障害となっている（例えば、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ ら（１９８６ｂ　）　５ｃｉｅｎｃｅ　２３３：１３１ｇ−１３２１、および前 述のＣｕ１ｌｉｔｏｎ参照）。このため、リンパ性細胞の大規模製造方法、およ び増殖のための新規の細胞もしくは作用物質が同定された場合に容易に適応し得 る方法の必要性が存在する。

現在、転移性疾患に罹患している患者に投与するに十分な数の、ＴＴＬのような リンパ性細胞の増殖並集団の生成は、時間がかかり、非効率的であり、かつ禁止 的に高価である。

これは、転移性の病変に由来するＴＩＬを、各々ヒト血清アルブミンおよび組換 えヒトＩＬ−２を含有する約１．５リツトルの組織培養培地を保持するプラスチ ック製のガス透過性培養バッグにおいて成長させることにより達成される（例え ば、Ｍｕｆｆら（１９８７ｂ　）　Ｊ、ＩｍｍｕｎｏｌｌＭｅｔｈ、１０１：　 １７１−１８１を参照、その他、前述のＣｕ１ｌｉｊｏｎを参照）。細胞は、最 大でバッグ当り細胞２−３Ｘ　１０９個の最大密度に達するまで成長し、分裂す る。最大濃度では、それらを追加の培養バッグに分けなければならない。このた め、患者−人の１回の臨床処置に十分な数の細胞を生成させるために、５０ない し１５０個のバッグが必要となる。臨床処置に十分な数の細胞が生成するまで、 ４ないし６週間にわたり細胞を成長させ、かつ追加のバッグに分けて、典型的に は１００ないし１５０個のバッグに増殖させる。

このバッグには約ｌ０１１個の細胞か含まれる。その後、１５１）ないし２５０ リツトルの体積中の細胞を遠心し、無菌条件下に維持しなければならない。単独 の患者を治療するに十分な細胞を生成する全工程においては、多くの時間と人力 の他に、多量の哺乳動物細胞培養培地、ヒト血清アルブミンおよびＩＬ−２が用 いられる。典型的には、１回処置量の細胞を回収するために約５時間必要である 。この細胞濃縮法（ｃｅｌｌ　ｃｏｎｃｅｎｌｒａｔｉｏｎ　ｍｅｔｈｏｄ　） は、希釈溶液中に細胞を生じ、培養細胞汚染の機会が多く、かつ禁止的に高価で あるため、臨床処置に治療上必要な量の細胞を生成する手段としての利用は非常 に限られる。

したがって、養子免疫療法における利用に適した、多数の生物学的に活性な生体 外増殖リンパ性細胞の効率的かつコスト有効的な成長に利用することができる方 法を開発する必要がある。さらに、この方法によって処置可能である病気が広い 範囲にわたるため、変更プロトコルおよびリンパ性細胞の増殖並集団が利用され る多くのプロトコルに容易に適合し得る方法を開発する必要がある。

発明の要旨 この発明の目的の１つは、養子免疫療法に用いることができる生体外増殖リンパ 性細胞の大規模製造の改良法であって、（ａ）中空糸バイオリアクターの中空糸 外空間にリンパ性細胞を成長促進因子含有培地に懸濁させた懸濁液を接種し、（ ｂ）！Ｊンパ性細胞の治療上有用な亜集団を特異的に増殖させる成長促進物質の 少なくとも１種を有効量含有する組織培養培地でバイオリアクターを潅流し、こ こで、前記有効量は特異的増殖を行なうに十分な量であり、前記組織培養培地は 亜集団の細胞分裂および成長を維持し、および前記治療上の利用は養子免疫療法 であり、および（Ｃ）バイオリアクタ−中の細胞を成長促進物質の存在下におい て治療上有効な数の生体外増殖リンパ性細胞が得られるに十分な時間培養するこ とを具備する方法を提供することにある。

この発明の他の目的は、養子免疫療法に用いられる生体外増殖リンパ性細胞を製 造するための改良法であって、前記増殖リンパ性細胞がＴＩＬ細胞であり、（ａ ）切除腫瘍組織由来の細胞を組織培養培地に懸濁し、（ｂ）懸濁液を腫瘍浸潤リ ンパ球の増殖を促進することが可能な少なくとも１種のサイトカインの有効量の 存在下において培養し、ここで、前記有効量は懸濁液における腫瘍浸潤リンパ球 の増殖を行なうに十分な量であり、（ｃ）中空糸培養システムの１構成要素であ る中空糸バイオリアクターの中空糸外空間に腫瘍浸潤リンパ球の培養懸濁液を接 種し、（ｄ）腫瘍浸潤リンパ球の増殖を促進することが可能な少なくとも１種の サイトカインの有効量を含有する組織培養培地でバイオリアクターを潅流し、こ こで、前記有効量は特異的な増殖を行なうに十分な量であり、かつ前記組織培養 培地は腫瘍浸潤リンパ球の細胞分裂および成長を維持し、および（ｅ）腫瘍浸潤 リンパ球を、バイオリアクター中で組織培養培地の存在下において、治療上有効 な数の腫瘍浸潤リンパ球を得るに十分な時間培養することを具備する方法を提供 することにある。

この発明の他の目的は、養子免疫療法に用いられる生体外増殖リンパ性細胞を提 供することにある。

この発明の他の目的は、養子免疫療法に用いられる生体外増殖リンパ性細胞を提 供することにあり、ここで、前記増殖リンパ性細胞はＴＩＬ細胞である。

この発明の他の目的は、養子免疫療法に用いられる生体外増殖リンパ性細胞を提 供することにあり、ここで、前記増殖リンパ性細胞はクローン化ＤＮＡを挿入す ることによりゲノムが変性されているリンパ球である。

この発明の他の目的は、生体外増殖リンパ性細胞の成長の刺激に用いられ、およ び治療上有用な生体外増殖リンパ性細胞を特異的に増殖させる生物学的に活性な 成長促進物質の源として用いられる調整培地の製造方法であって、生体外増殖リ ンパ性細胞が培養されているバイオリアクターの中空糸外空間の内容物を除去し 、前記中空糸外空間の内容物から細胞をペレット化し、かつ除去して中空糸外空 間細胞上清を生成させ、および前記中空糸外空間細胞上清を組織培養培地に対し て透析して中空糸外空間調整培地を調製することを含む方法を提供することにあ る。

この発明の他の目的は、生体外増殖リンパ性細胞の成長の刺激に用いられ、かつ 治療上有用な生体外増殖リンパ性細胞を特異的に増殖させる生物学的に活性な成 長促進物質の源として用いられる調整培地を製造することにある。

この発明の他の目的は、生体外増殖リンパ性細胞を製造するための改良法であっ て、前記細胞をを動量の中空糸外空間調整培地の存在下において培養することを 具備し、前記量が増殖細胞の成長速度を刺激して、それが無い場合の細胞の成長 よりも少なくとも約５０％増加させるに有効な量である方法を提供することにあ る。

この発明は、養子免疫療法手順の特定の要求に適合し得る生体外増殖リンパ性細 胞の改良培養法を提供することにより、治療上有用な量の生体外増殖リンパ性細 胞を調製するための手順を大きく改善する。この改良培養法では、リンパ性細胞 が患者から得られ、中空糸バイオリアクター培養システムに接種され、および治 療上有用なリンパ性細胞亜集団を特異的に増殖させる少なくとも１種の成長促進 物値の有効量の存在下において培養される。

この発明を実施することにより、都合の良い方法を用いて、生物学的に活性で治 療上有効な生体外増殖リンパ性細胞の治療上有用な収量が得られる。これは、前 記細胞の製造に関するコストを大幅に減少するだけではなく、製造し得る細胞の 数を大幅に増加させる。

図面の簡単な説明 図１は、この発明の方法によるＴＩＬ成長に典型的な成長曲線を表わす。ＴＩＬ は、切除生検の日からの経過時間に対して細胞数が増加している。細胞は、患者 Ｗから切除した腫瘍より得た。標準培養フラスコにおいて、酵素で分散させた、 ＴＩＬを含有する腫瘍からＴＩＬが十分に成長したときにガス透過性バッグ内で 培養を開始し、次いで、切除生検の日の２３日後に中空糸リアクターに接種した 。−〇−０−０−は、ガス透過性バッグ内において成長した細胞の成長曲線を示 す。

これは、日単位で横座標に対してプロットされる培養期間対右側の縦座標に対し てプロットされる細胞数の増加により評価されている。初期遅滞期の後、患者Ｗ より得られる細胞（Ｗ−ＴｉＬ）の数は、期間中指数的に増加した。時間＝Ｏは 切除生検の日を示す。ＴＩＬ細胞は、２３日目に１つのバックから引き出してＣ Ｅ　Ｌ　ＬＭＡＸ”Ｉ’１ｌＥｌ空糸バイオリアクターに接種し、４４日目に回 収した（−ムームーム−）。グルコース消費は、時間に伴い対数的に増加した（ −〇−〇−０−＞。

これは、左側の縦座標に対してプロットされる、バイオリアクター潅流液中のグ ルコース濃度の減少対横座標の培養日数により評価されている。＋は中空糸外空 間（ＥＦＳ）の新鮮な完全培地での置換を示す。２３日目に中空糸に４．３Ｘ　 １０”個の細胞を接種することにより、回収時に５．４Ｘ　１０１０個の細胞が 得られた。

図２は、切除生検の日からの経過時間に対して数が増加するＧ−ＴＩＬ（患者Ｇ より得られたＴＩＬ）を示す成長曲線を表わす。−〇−０−０−は、ガス透過性 バッグ中で成長した細胞を細胞数の増加で表わした成長曲線を示す。初期遅滞期 の後、患者Ｇより得られた細胞の数は、切除生検の日から測定期間中指数的に増 加した。１６日目に１つのバッグからＴＩＬを引き出してＣＥＬＬＭＡＸＴＭ中 空糸バイオリアクターに接種し、３０日目に回収した（−ムームームー）。ゲル コール消費は時間に伴い対数的に増加した。これは、左側の縦座標に対してプロ ットされる、バイオリアクター潅流液中のグルコース濃度の減少対培養期間によ り評価されている。＋は中空糸外空間（ＥＦＳ）の新鮮な完全培地での置換を示 す。

１．０Ｘ１０　個のＴＩＬを接種することにより、１．５Ｘ　１０１０個のＴＩ Ｌが回収された。中空糸バイオリアクターの潅流は、第１回の回収日である３０ 日目に再設定し、残留するＴＩＬは再び増殖させて５１日目の第２回の回収時に １．５ＸｌＯ個１０を回収した。潅流を再び再設定し、残留する細胞を今一度増 殖させて７３日目の第３回目の回収時に２．ｌＸ１０１０個の細胞を回収した。

図３は、ＣＥＬＬＭＡＸ”中空糸バイオリアクターの中空糸外空間内においてこ の発明の方法により成長した患者ＷからのＴＩＬ細胞の走査電子顕微鏡写真を示 す。

図３ａにおいて、巨大な卵型中空糸の間の空間は、はぼ固形塊状のＴＩＬで埋め られている。通常円筒形の中空糸の弁型形状およびＴＩＬ塊と中空糸表面との間 の空間は、組織学的調整による人工的なものである。

図３ｂは、単一の中空糸の外表面近傍の個々の細胞を見ることができるようなよ り高い倍率を示す。

好ましい態様の説明 他に定義しない限り、ここに使用される技術および科学用語は、この発明が属す る分野の当業者に通常理解される意味を有する。ここに言及する全ての刊行物は 、参照することによりここに組み込まれる。

ここで用いられる場合には、リンパ性細胞には、リンパ性細胞が存在するいかな る組織由来のリンパ性細胞も含まれる。

一般に、リンパ性細胞は、処置しようとする個体から除去される。リンパ性細胞 は、腫瘍、末梢血、またはリンパ性細胞を保有もしくは製造するリンパ節および 牌臓のような他の組織由来のものであってもよい。

ここで用いられる場合には、養子免疫療法は、それにより生体外増殖リンパ性細 胞を個体もしくはホストに移送、投与もしくは導入するプロセスである。

リンパ性細胞をイン・ビトロで適当な条件下において培養したとき、それらの特 定の亜集団が選択的に増殖する。生成した、細胞の増殖並集団を、ここでは生体 外増殖リンパ性細胞と呼ぶ。この細胞の亜集団は、一般に、異なる表現型を有す る細胞の不均一な混合物であるが、細胞の均一な集団からなることもある。生成 した細胞の特定の混合物は、出発物質およびそのような細胞か生成する条件の作 用（ｆｕｎｅ＋ｉｎ）である。増殖並集団は養子免疫療法プロトコルに用いるこ とができる。処置しようとする個体に導入することにより、細胞の増殖並集団は 、ホストの冒された細胞を特異的に認識しかつある意味でその破壊に介在し、お よび／または治療上有効な作用物質を生成する。そのような細胞が生成する条件 には、ＩＬ−２、！Ｌ−１、ＩＬ−６およびＩＬ−４のようなサイトカインもし くはサイトカインの混合物の存在下における成長が含まれる。リンパ性細胞がサ イトカインの存在下において培養された場合には、生成されるリンパ性細胞の生 体外増殖並集団には活性化リンパ性細胞が含まれ、および、それらの源および用 いられるサイトカインに依存して、ＬＡＫ細胞およびＴＩＬ細胞が含まれること がある。サイトカインの存在下において増殖するリンパ性細胞が腫瘍由来である 場合には、生成する細胞の増殖リンパ性亜集団をＴＩＬ細胞と呼ぶ。リンパ性細 胞がサイトカインおよび標的抗原の存在下において増殖される場合には、生成す る細胞をここでは活性化リンパ性細胞と呼ぶ。標的抗原が癌性細胞上に存在し、 もしくはそれら由来である場合には、活性化リンパ性細胞の生体外増殖リンパ性 亜集団はＴＩＬ細胞である。

ここで用いられる場合には、生体外増殖リンパ性細胞の治療上有用な亜集団は、 養子免疫療法に用いることができる亜集団である。

ここで用いられる場合には、生体外増殖リンパ性細胞は、養子免疫療法に用いる ために培養される細胞である。そのような細胞は、リンパ性細胞の少なくとも１ 種の特定並集団の増殖を誘導する特定の介在物の存在下においてリンパ性細胞を 培養する場合に生成するリンパ性細胞の亜集団に相当する。

そのような亜集団には、罹患患者の冒された細胞と免疫学的な反応性を有するも のが含まれる。そのような細胞が治療剤として用いられる場合には、ここではそ れらを免疫学的反応性リンパ性細胞と呼ぶ。癌の養子免疫療法に用いられる場合 には、免疫学的反応性細胞の例はＴＩＬおよびＬＡＫ細胞である。生体外増殖リ ンパ性細胞の他の亜集団には、遺伝子工学により通常はそのリンパ性細胞では生 成されないタンパク質をコードするＤＮＡを含むよう変性されたリンパ性細胞が 含まれる。そのようなタンパク質の例には、追跡可能な外来マーカータンパク質 、およびＨＩＶが結合するＣＤ４および抗癌剤のような治療上有効な物質が含ま れる。加えて、そのような細胞は、イン・ビボで選択的に増殖もしくは破壊され るように、薬剤耐性もしくは薬剤感受性をコードするＤＮＡを有するように遺伝 的に処理されていてもよい。他の亜集団には、イン・ビトロで特異的な標的抗原 の存在下において培養されたリンパ性細胞が含まれる。標的抗原（単独もしくは 複数）は、腫瘍細胞のような細胞の表面上に存在してもよく、細胞から、または 合成により調製して組織培養培地に導入されてもよい。標的抗原は、ペプチド合 成法により、もしくは遺伝子工学により合成されたものでもよい。一般に、生体 外増殖リンパ性細胞は、標的抗原の存在下において培養され、標的抗原に冒され た細胞を特異的に認識しかつその破壊にある意味で介在し、または標的抗原に冒 された細胞に治療剤を配送する細胞である。

ここで用いられる場合には、標的抗原は、生体外増殖リンパ性細胞の亜集団によ って特異的に認識される抗原である。

少なくとも１種の標的抗原に対する有効量は、この抗原を特異的に認識する生体 外増殖リンパ球の少なくとも１種の亜集団を選択するに十分な量である。

ここで用いられる場合には、腫瘍特異性生体外増殖リンパ性細胞は、腫瘍細胞上 もしくは腫瘍細胞内に存在する標的抗原を特異的に認識する細胞である。ＴＩＬ 細胞は腫瘍特異性リンパ性細胞である。ここで用いる場合には、腫瘍特異抗原は 、腫瘍細胞の表面もしくは内部に存在する抗原である。腫瘍特異抗原は、照射腫 瘍細胞上で純粋な形で用いることができ、または腫瘍細胞から精製することによ り、もしくは遺伝子工学のような方法によってイン・ビトロで合成することによ り得ることができる。

二こで用いられる場合には、成長促進物質は、細胞の成長および／または分裂に ある意味で関与し、もしくは誘導する物質である。成長促進物質には、マイトジ ェンおよびサイトカインが含まれる。成長促進物質の例には、線維芽細胞成長因 子、表皮成長因子、癌遺伝子の生成物、インターロイキン、コロニー刺激因子、 および当業者に公知の他の因子が含まれる。

ここで用いられる場合、マイトジェンは細胞の分裂を誘導する物質であり、特に 、ここで用いられる場合、抗原依存様式でリンパ性集団を刺激し、成長させ、か つエフェクター細胞に分化させる物質である。

ここで用いられる場合、サイトカインは他の細胞に影響を及ぼす細胞によって生 成される因子、例えば、リンホカインもしくはモノカインである。

ここで用いられる場合、リンホカインはＴリンパ球によって生成および分泌され 、他のタイプの細胞に影響を及ぼす物質である。腫瘍壊死因子、インターロイキ ンおよびインターフェロンはリンホカインの例である。モノカインは単球もしく はマクロファージによって分泌され、他の細胞に影響を及ぼす物質である。

ここで用いられる場合、生体外増殖リンパ性細胞の治療上有効な数は、細胞を特 定の養子免疫療法に用いた際に、少なくとも所望の治療効果を達成するに十分な 細胞の数である。

例えば、転移癌を患っている患者の１回の治療のためのＴ１Ｌの治療上有効な量 は、少なくとも約１０　個ないし１０１１個の細胞である。

ここで用いられる場合には、中空糸培養システムは、このシステムを通して培地 を潅流させるポンピング手段、培地を供給および収集する貯蔵手段、および電気 制御、記録および感知装置を含む他の要素の他に、中空糸バイオリアクターから なる。中空糸パイリアクターは、中空シェル内に収められた多数の半透過性の管 状ファイバーからなるカートリッジである。中空糸リアクターおよび中空糸バイ オリアクターという用語は交換可能に用いられる。

ここで用いられる場合には、中空糸外空間（Ｅ　Ｆ　Ｓ）は細胞が成長する空間 であって、中空糸バイオリアクターのシェル内であり、かつ半透過性ファイバー の外部の空間である。

ここで用いられる場合には、ＥＦＳ細胞上清は、ＥＦＳ内の細胞が成長している 培地である。これは、分泌された細胞性の生成物、拡散し得る栄養物、および生 体外増殖リンパ性細胞亜集団の特異的な増殖に介在する、リンホカインおよびサ イトカインのような成長促進物質を含有する。

ここで用いられる場合には、ＥＦＳＨ整培地は、遠心して細胞および特定の物質 を除去し、組織培養培地に対して透析した後のＥＦＳ細胞上清である。

ここで用いられる場合には、選択培地は、生体外増殖リンパ性細胞が生成する組 織培養培地であって、所望の成長促進物質（単独もしくは複数）および他の選択 剤、例えば、標的抗原もしくは遺伝子処理を施した細胞が成長するように選ばれ た作用物質である。

ここで用いられる場合には、完全Ａ　Ｉ　Ｍ−Ｖは商標権を有する処方Ａ　Ｉ　 Ｍ−Ｖ　（ＧＩＢＣＯ５Ｇｒａｎｄ　ｌ５ｌａｎｄ、　Ｎ、　Ｙ、　）からなり 、さらに１０００ユニツト／　ｍ　１　１　Ｌ　−２（Ｃｅｊｕｓ社製、Ｅｍｅ ｒｙｖｉｌｌｅ、　ＣＡ、　）　、１０μｇ／ｍ　１ジエンタマイシン（ＧＩＢ ＣＯ）、５０μｇ／ｍｌストレプトマイシン（ＧＩＢＣＯ）　、１．２５ａ　ｇ ／ｍｌファンジャイゾン（ｆＢｉｚｏｎｅ　）　ＣＦＩｏｗ　Ｌａｂｏｒａｌｏ ｒｌｅｓ　。

ＭａｃＬｅａａ　、　ＶＡ、　）　、２．９５ｍ　ｇ／ｒｎ　１グルコ−支およ び２ｍＭグルタミン（Ｆｌｏｖ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　）を含有する選択 培地である。補足完全Ａ　Ｉ　Ｍ−Ｖ培地は、自己由来ＬＡＫ細胞培養物から得 た２０％ＡＩＭ−Ｖ上清で補足された完全Ａ　Ｉ　Ｍ−Ｖからなる。

ここで用いられる場合には、ＡＩＭ−Ｖ上清はＭｕｕｌ　ら（１９８６）　１． 　１ｍｍｕｎｏ１１Ｍｅｔｈｏｄｓ　８８　：　２６５に記載の通りに調製され る。簡単に述べると、ＬＡＫ　ＡＩＭ−Ｖ上清は、末梢血リンパ球をＡ　Ｉ　Ｍ −Ｖもしくは他の適切な組織培養培地でＩＬ−２の存在下において２ないし３日 成長させ、遠心により細胞を除去して上清を得ることにより調製する。

他の適切な組織培養培地は当業者には公知であって、容易に利用可能であり、容 易にＡ　Ｉ　Ｍ−Ｖと置き換えることができる。例えば、１０％熱不活性化ヒト 血清を含有する完全ＡＩＭ−ＶとＲＰＭＩとの５０−５０混合物からなる培地、 およびＬＡＫ上清でさらに補足した培地を用いることができる。

ここに開示される発明の態様を実施するに当り、第１の工程として、所望の生体 外増殖リンパ性細胞亜集団の生成に用いることができるリンパ性細胞を、一般に 病気を患い、養子免疫療法を用いて処置しようとする個体から除去しなければな らない。リンパ性細胞は、ＰＢＬ、リンパ節、肺臓細胞および免疫応答が備えら れている組織を含む体の多くの組織に存在する。この発明において使用が期待さ れるリンパ性細胞は、その分化および成長が、養子免疫療法に適切な生体外増殖 リンパ性細胞を製造するための適当な成長促進物質によって制御され得るもので ある。

患者から得られた細胞は、哺乳動物細胞の成長の維持に適した細胞培養培地に懸 濁させる。細胞懸濁液は、腫瘍もしくは他の冒された組織から、またはリンパ性 細胞から調製することもできる。そのような培地は容易に利用し得るものであり 、適当な培地の選択はこの分野の技術レベルの範囲内である。その後、所望の免 疫反応性リンパ球皿集団の選択的増殖に必要な成長促進物質（複数）をも含有す る選択培地においてさらに増殖させるために、細胞を培養プレート、または当業 者に公知の他の適切な手段に入れる。この培地は標的抗原を含有してもよい。細 胞を培養し、十分な数が得られるまで数を増殖させる。しばしばこの時点で、細 胞をガス透過性バッグに接種し、所望の成長促進物質および他の所望の選択剤を 含有する選択培地中で、少なくとも約１０８個の細胞が生成するまで成長させる 。選択培地中で細胞を培養するので、懸濁液中の細胞には主として興味の対象と なる亜集団が含まれる。生成した細胞は、中空糸バイオリアクターに注入し、養 子免疫療法に使用することが可能な、それらの亜集団を増殖させることを意図す る条件下において培養する。

中空糸バイオリアクター（ここではＨＦと呼ぶ）は当業者に公知である（例えば 、Ｘｎ１ｚｅｋら、米国特許４．２２０．７２５号、４、２０６．０１５号、４ ．２００．６８９号、３．８８３．３９３号、および３．８２１１０８７号を参 照、これらの開示は参照することによりここに組み込まれる）。中空糸バイオリ アクターは、哺乳動物細胞の成長およびそれらにより分泌される生物学的に活性 な生成物の生成に用いられている（例えば、前述のＫｎｕｅｋらを参照、その他 Ｙｏｓｈｉｄａら、米国特許４．３９１．９１２号ＨＭｅｙｅｒｓ　ら、米国特 許４．５４６．０８３号；およびＭａｒｋｕｓ　ら、米国特許４゜３０１．２４ ９号参照）。

この発明を実施するに当たって利用しようとする中空糸バイオリアクターは、中 空シェルに収められた多数の管状半透膜（以下、ファイバーと呼ぶ）を有してい る。培養細胞は成長してファイバー間の空間を埋め、膜の内腔を通して潅流する 培地からの栄養物の拡散もしくは流れが供給される。この発明を実施するに当た り用いることができる中空糸パイリアクターの例は、中空糸バイオリアクター、 Ｂ３、Ｃｅ１ｌｃ。

Ａｄｖａｎｃｅｄ　Ｂｉｏｒｇａｃｔｏｒｓ、　Ｉｎｃ、、ＫｅＩｌｓｉＢｊｏ ｎ、　ＭＤ、（それらの完全な記述は、前述の米国特許出願０７／２３８．４４ ５を参照）。

バイオリアクター、Ｂ３は、約８０００の管状半透膜を有し、それらは１．１ｍ ２の表面積を与える。各々約２５０μｍ径のファイバーは長さ約１２インチのポ リカーボネートチューブを通して引かれ、さらに、ファイバーの内腔を通しての み液体が流れ、シェルの対向する端部で排出されるように各端部が密封される。

ファイバー壁は、所望のカットオフ範囲未満の分子量を有する物質の通過を名目 上は制限する。ファイバーはカートリッジを、典型的には約５０ｍ１の体積の中 空糸外空間（ＥＦＳ）およびファイバー内腔の体積に分割する。ファイバーおよ びシェルは中空糸カートリッジを形成する。中空糸外空間内では最小限の液体の バルク流れが起こる。この空間を外部キャピラリーもしくはシェル−サイド空間 とも呼ぶ。

所望であれば、使用前に、選択された標的抗原および／または成長促進物質をフ ァイバーに持ち込んでもよい。ファイバーは、標的抗原および／または成長促進 物質が結合することができるように選択されなければならない。結合は、架橋剤 の使用によって、もしくは当業者に公知の他の方法によって達成されて不可逆的 であってもよく、または抗原もしくは物質のファイバーへの吸着によるもののよ うに可逆的であってもよい。

中空糸バイオリアクターは中空糸細胞培養システムの１構成要素である。前述の Ｋｎａｘｅｋら、米国特許出願０７／２３８．４４５号に開示され、その開示全 体が参照することによりここに組み込まれているＣＥＬＬＭＡＸ　１１００Ｔ中 空糸細胞培養システム（Ｃｅｌｌｃｏ　Ａｄｖａｎｃｅｄ　Ｂｉｏｒｅａｃｔｏ ｔｓ　、　Ｉｎｃ、、Ｋｅｎｓｉｎｇｉｏ３　ＭＤ５）のような典型的な中空糸 細胞培養システムは、貯蔵器として機能する標準ガラス培地ボトル、ステンレス 鋼／リドン（Ｒｙｔｏｎ　）ギアポンプ、ファイバーおよびシェルケーシングか らなりその内部で細胞が培養される加圧滅菌可能な（ａｌ。

ｃｌａｖａｂｌｅ）中空糸バイオリアクター、および培養培地の適当なｐＨおよ びｐＯ２を維持するためのガス交換器として機能する医用グレードのシリコーン ラバーチューブ、または他の接続手段からなる。全ての要素は、システムを標準 組織培養インキュベーター内に適合可能とするに十分少さな寸法のステンレス鋼 トレイに固定されている。ポンプ速度および流れの向きの自動反転は、インキュ ベーターの外部に設置され、インキュベーターのドアのガスケットを通過するフ ラットリボンによりポンプモーターに接続されている電子制御ユニットにより決 定される。ポンプモーターはポンプに磁気的に結合しており、蒸気加圧滅菌（＋ ｔｅａｍ　ａｕｔｏｃｌａｖｉＢ　）の前にシステムから持ち上げる。標的抗原 および／またはＩＬ−２のような成長促進物質を含有していてもよい組織培養培 地は、貯蔵器から吸い上げられて中空糸内腔を通して汲み上げられ、その後、ガ ス交換管系を通り、そこで貯蔵器に戻る前に次の再循環のために再酸素処理およ びｐＨの再調整を受ける。流速は、時間に伴って増加する細胞数に従って増加さ せることができる。典型的には、培地の初期流速は約４０ｍ１／分に調節されて おり、時間に関して増加して約３００ｍ　１７分となる。

中空糸内腔を通過する培地の潅流の方向は、中空糸を取り巻く空間内の栄養供給 物、廃棄希釈および細胞のより均一な分配を得るために、周期的に、かつ自動的 に、典型的には毎１０分ごとに反転する。

システム全体は細胞のインキュベーションの前に滅菌され、ために設計されてい る。接種の際、細胞は中空糸の表面上に配置される。栄養物はこの中空糸を通し て細胞に供給され、代謝廃棄生成物は中空糸の内部に入って大容量の再循環潅流 液中で希釈される。選択されたファイバーは、栄養物のＥＦＳ内への通過が可能 になるように半透過性であるべきであり、その表面もしくはその近傍で細胞が成 長可能である材質のものであるべきである。ファイバーは、多孔性であり、かっ 哺乳動物細胞の成長に適した、ＤＥＡＥ−セルロースもしくはポリプロピレンの ような材料からなる。例えば、その壁が名目上３０００ダルトン未満の分子量を 有する物質の拡散を制限する、長さ１２インチのセルロース性中空糸は、この発 明の実施に当り利用するに適している。この発明のいくつかの態様において、免 疫活性細胞により認識される抗原の存在下においてリンパ性細胞が恒常的に成長 するように、腫瘍細胞も［７くは標的抗原が可逆的もしくは非可逆的にファイバ ーに結合されている。他の態様においては、成長促進物質がファイバーに結合さ れている。結合は、吸着によるもののように可逆であり、または、抗原もしくは 成長促進物質をファイバーに永久に結合させるために架橋剤が用いられるならば 不可逆である。これに代えて、成長促進物質および／または抗原を潅流液および ／またはＥＦＳに含有させることもできる。

細胞懸濁液は中空糸パイリアクターの中空糸外空間（ＥＦＳ）内に、典型的には ２つのサイドポートのうちの１つを通して接種される。内腔は細胞培養培地が潅 流する。この培地は、拡散し得る栄養物を含有し、養子免疫療法に用いることが できるリンパ球の亜集団を特異的に増殖させる成長促進物質（複数）を含有して もよく、かつ標的抗原を含有してもよ１ないし２以上の成長促進物質を選択する ことは、所望のリンパ球細胞亜集団の一機能である。この選択は当該分野の技術 水準の範囲であり、所望である特定のリンパ球細胞亜集団によって指図されるも のである。例えば、ＴＩＬ細胞が成長していれば、いくつかの方法で腫瘍組織か らのＴＩＬ細胞の成長（ｇｒｏｗｔｈ）　、及びことによると増殖（ｄｅｖｅｌ ｏｐｍｅｎｔ　）、の管理において機能するＩ　Ｌ−２が培養培地中に含まれて いるはずである。Ｉ　Ｌ−２を含むリンフ才力イン等の成長促進物質は当業者に とって入手可能である。Ｉ　Ｌ−２などの多くはクローン化され、生物学的に活 性な型で発現する。組み換えによって生産された成長促進物質、例えば、組み換 えによって生産されたインターロイキンは、本発明において使用するのに好まし い。このような蛋白質をコードするＤＮＡをクローン化する手段及びこのクロー ン化されたＤＮＡから生物活性蛋白質を生産するための手段は当該分野の技術範 囲である。例えば、インターロイキンエないし６はクローン化されている。種々 の成長促進物質及びこれらの組み合わせは、所望のリンパ球細胞亜集団を増殖さ せるために用いてもよい。

本発明の典型的な態様においては、細胞を、少なくとも１種の免疫反応性リンパ 球細胞亜集団を特異的に増殖させる少なくとも１種の成長促進物質の存在下にお いて、イン・ビトロでの哺乳動物細胞の成長に適切であることが当業者において 既知であるいずれかの培地中で培養する。好適な培養培地を選択することは当該 分野の技術水準の範囲である。本発明における使用が期待される成長促進物質は 、癌化或いはウィルス感染細胞等患者を苦しめる細胞を特異的に認識し、破壊す るリンパ球細胞亜集団をイン・ビトロで増殖させる能力によって選択される。本 発明の他の態様においては、細胞を、少なくとも１種の成長促進物質に加えて、 少なくとも１種の標的抗原存在下で成長させる。本発明の更に他の態様において は、リンパ球細胞を単離し、遺伝子工学的方法を用いて変性し、中空糸バイオリ アクターの中空糸外空間に注入し、遺伝学的に変性された亜集団が増殖するよう に計画した条件下で培養する。

接種後、ポンプ等で外から圧力をかけることによって中空糸バイオリアクターを 通して培地を継続的に潅流させる。ガラス貯蔵器、中空糸バイオリアクター、及 びポンプ手段を配管、典型的にはシリコーンゴムによって連結する。この配管は 、酸素を補充するために、また培地が重炭酸塩によって緩衝されているのであれ ば、潅流培地へのＣＯ２輸送を介してｐＨを維持するために、膜ガス交換器とし て同時に作動する。

生体外増殖リンパ球細胞は中空糸外空間の大部分を満たすまで、成長し、分裂し 、互いに重なりあって、はぼ細胞の塊を形成する。細胞が成長し、分裂するに伴 って、潅流液を交換し、ＥＦＳを定期的に排液することができる。

潅流培地は、貯蔵器ボトルを交換することによって、変えることができる。細胞 の成長が安定した後は、潅流培地中にヒト血清アルブミンを含ませる必要がない ことを見い出した。

ＥＦＳは、上清を回収するために及び／又は細胞をサンプリングするために定期 的に排液することができる。ＥＦＳを排液したときに、排出されたいずれの細胞 も回収し、中空糸バイオリアクターに再接種し、完全Ａ　Ｉ　Ｍ−Ｖ或いは他の 血清ないし１０１１個の細胞を含むまで、中空糸バイオリアクターで培養される 。バイオリアクターを振盪させ、細胞をＥＦＳ培地とともに側口ボトル中に注入 することによって、細胞を回収することができる。更に、Ｉ　Ｌ−２受容体及び イン・ビトロにおいて所望のリンパ球細胞亜集団を増殖させるために有用な他の 成長促進物質のような有用な生物活性因子を含み、非拡散性或いは拡散性に乏し い細胞生成物に富んだＥＦＳ細胞上清は、更に処理を行なって前記生物学的活性 作用物質を精製或いは部分的に精製するために、回収することができる。

細胞は、遠心機を用いて、或いは当業者に既知の他の手段を用いて回転、沈殿さ せ、細胞ペレット、並びにＩ　Ｌ−２受容体及び成長促進物質などの生物活性分 子に富んだＥＦＳ細胞上清を得ることかできる。

細胞を回収した後、成長促進物質を含んだ培養培地の潅流を再開することによっ て、バイオリアクターに残った細胞を再び成長させることができる。細胞はその 後分裂を続け、回収することができる。この工程は多数回反復することができる 。

回収し、細胞を沈殿させた後、ＥＦＳ調整培地を生成するために、新しい組織培 養培地に対するＥＦＳ細胞上清の透析を行なうことができる。このＥＦＳｍ整培 地は、その後見に処理することもできるし、ＴＩＬ細胞等の細胞の成長を刺激す るために、直接、或いは希釈して用いることもできる。

本発明の方法を用いた１つの典型的な手順において、悪性メラノーマの患者から 腫瘍を切除し、小断片に細断し、コラゲナーゼ１０ｍｇ／ｍｌ、デオキシリボヌ クレアーゼ１ｍｇ／　ｍ　１　、及びヒアルロニダーゼ２．５ユニット／ｍｌ（ シグマ）を含有するＲＰＭｌ　１６４０組織培養培地（バイオフルイッズ、ロッ クビル、エム・ディー）に懸濁する。細胞を扱う全ての操作は、層流フード中で 無菌技術を用いて遂行する。

懸濁液を一晩攪拌後、ナイテックス（Ｎｉｔｅｘ）メツシュを通して濾過し、Ｉ 　Ｌ−２を含む完全ＡＩＭ−Ｖ培地が補充されたＬＡＫ上清中に再懸濁して培養 し、その後、整された細胞を更に成長させた後、約５０ｍ１を中空糸バイオリア クターに接種する。使用する前に中空糸培養システムを加圧滅菌し、再循環して いる脱イオン水１．３リツトルを用いて継続的に潅流し、排液し、洗い流し、Ｅ ＦＳ及び潅流路の両方を完全ＡＩＭ−Ｖ培地を用いて潅流する。

接種されたバイオリアクターを標準インキュベーターに移個に達するまで、少な くとも約１０日から約３０日までの間インキュベーションし続ける。インキュベ ーション期間中、ＥＦＳ中のグルコース及び他の拡散性滋養物を十分高い濃度で 維持するために潅流培地を含む貯蔵器を交換する。所望であるならば、インキュ ベーション期間中、細胞をサンプリングし、或いはＥＦＳ細胞上清を集めるため に、ＥＦＳを定期的に排液することができる。

所望の細胞濃度に達したとき、中空糸バイオリアクターを強く振盪し、ＥＦＳを 排液することによって、細胞を回収する。細胞を沈殿させ、ＥＦＳ細胞上清を更 に処理するために集める。回収された細胞は、ＴＩＬ細胞の形態学的及び生物学 的特性を有している。

ＥＦＳ細胞上清は、ＥＦＳ調整培地を生成するために新鮮な組織培養培地に対し て再透析し、新しくまいた細胞の成長を刺激するために、新しくまいた細胞に添 加することかできる。ＥＦＳはまた、細胞を回収した後、成長を再開するときに 、その中に残っている細胞の成長を刺激するために、中空糸バイオリアクターに 添加することもできる。

以下の実施例は、説明を目的とするものであり、本発明の範囲を限定することを 意図するものではない。

例　１ 使用する前に、８個の中空糸培養システムを１２１℃で２０分間加圧滅菌し、そ の後、３７℃で一晩脱イオン水１．３リツトルで潅流した。貯蔵器を新鮮で暖か い完全培地１リツトルボトルと交換する前に、各システムの潅流路及び中空糸外 空間を排液し、完全Ａ　Ｉ　Ｍ−Ｖ培地で洗い流した。

すべての操作は、無菌層流フード中で行われた。

転移性メラノーマを有する８人の患者から腫瘍を切除した（表１の１列目に記載 されている）。腫瘍を、手術室から各患者の細胞か別々に処理される層流フード に無菌的に運搬した。各患者の腫瘍組織を１ｍｍないし２ｍｍ片に細断し、コラ ゲナーゼ１０ｍｇ／ｍｌ、デオキシリボヌクレアーゼ１ｍ　ｇ　／　ｍ　１　、 及びヒアルロニダーゼ２．５ユニット／ｍｌ（シグマ）を含有するＲＰＭ１１６ ４０組織培養培地（バイオフルイッズ、ロックビル、エム・ディー）約２００な いし５００ｍ１に懸濁した。各懸濁液を室温で一晩ゆっくり攪拌後、無菌ナイテ ックス（Ｎｉｔｅｘ）メツシュを通して濾過し、二回洗浄し、ＬＡＫ上清補足完 全ＡＩＭ−Ｖ培地、或いは１０％熱不活性化ヒト血清、２０％ＬＡＫ上清及びＩ Ｌ−２（１０００ユニツト／　ｍ　１　）を含有する完全ＡＩＭ−Ｖ及びＲＰＭ Ｉの５０　：　５０混合液のいずれかに再懸濁した。

細胞の各懸濁液を約５ｘ１０５個／ｍｌの濃度で６穴培養プレート（コスタ−社 、ケンブリッジ、エム・ニー）にまいた。約−週間後或いはＴＩＬ細胞の細胞濃 度が約１〜２Ｘｍ１の濃度で新鮮な培地中にまき直した。更に増殖させた後、細 胞を完全ＡＩＭ−Ｖ培地０．　５ないし１．５リツトル中に、５×１０５細胞／ ｍｌの濃度に希釈した。その後全量を１．５リツトルのポリオレフィン培養バッ グ（ＰＬ−７３２プラスチツク、フエンウォル・ラボラトリーズ・ディアフイー ルド、アイ・エル）に注入し、有孔棚上に、フラット位置で、攪拌することなく ３７℃で３〜４日間、加湿された５％ＣＯ２／空気インキュベーターでインキュ ベートした。細胞が増殖するに伴い、定期的に新しいバッグの完全ＡＩＭ−Ｖ培 地中で１：３〜４倍に希釈した。バッグに接種すると、細胞は、初期潜伏期後、 対数増殖期に入った。

バッグ中の細胞が対数増殖期にある間、腫瘍′の切開後１７ないし３３日目に、 少量の細胞懸濁液を４００Ｘｇで室温て１０分間遠心した。沈殿した細胞を１０ ０ｍ１ガラス製側ロボトル（ｓｉｄｅ　ｐｏｒｔ　ｂｏｔｔｌｅ）の完全Ａ　Ｉ 　Ｍ−Ｖ培地中に再懸濁した。転移性メラノーマを有する８人の各患者の細胞を 中空糸培養システムに接種した。バッグで培養を継続している細胞は、本発明の 方法に従って培養された細胞との比較のための対照として使用した。

各患者（Ｂ、　Ｍ、Ｓ、　Ｋ、Ｊ、　Ｈ，Ｗ及びＧ）から得られた細胞をそれぞ れ中空糸カートリッジ及びバッグに接種１−だ。

接種した細胞は０．３５ないし４．３Ｘ１０８個の範囲であった。細胞を、ＴＩ Ｌ細胞か懸濁されている１　００　ｍ　ｌガラス製ボトルにそれぞれ連結されて いる側口を通して中空糸バイオリアクターの中空糸外空間中に注入した。２０　 ｍ　ｌプラスチックシリンジでボトルにゆっくり圧力をかけ、細胞懸濁液を中空 糸外空間に押し込んだ。細胞は、潅流液からの拡散流によって滋養供給を受けて いるファイバ上或いはその近くに定着した。それと同時に、低分子量代謝物が細 胞から放出され、ファイバを通して潅流液により希釈された。

８培養のうちの２つであるＳ及びＪ　（表１参照）は中空糸培養及び対照バッグ において増殖を停止した。中空糸培養及びバッグ培養は別々のインキュベーター で維持されていたので、増殖の停止は細胞に関連するものであり、細胞を培養す る方法に関連するものではないように思われる。残りの６つの置培養物は、中空 糸培養システム及びバッグの両方でよく増殖した。図１は患者Ｗから得られた細 胞の増殖カーブを表している。

システムは３７℃の加湿された５％ＣＯ２／空気インキュベーター内で作動した 。処理期間中、潅流培地である完全ＡＩＭ−Ｖを含む貯蔵ボトルを、そのグルコ ース濃度が１００〜Ｌ５０ｍｇ／ｄｉの範囲にまで減少したときに定期的に交換 した。他の滋養物もグルコースと同様に、培地を含むボトルを予め暖められた新 鮮な培地を含むボトルに交換することによって補充した。ボトルを交換した回数 は、表１の８列目に示しである。従って、各培養に対して使用された培地量は、 消費されたグルコース量に依存し、中空糸培養システム当たり８〜２７リツトル の範囲である。これは回収されたＴＩＬ１０１０個当たり完全Ａ　Ｉ　Ｍ−Ｖ約 ２，４〜６．６リツトルに相当する（表１下欄参照）。貯蔵ボトルを交換するの に必要な時間は５分未満であった。

一度中空糸バイオリアクターで細胞培養を開始すれば、もはや潅流培地にヒト血 清アルブミンを添加する必要がないことを見い出した。細胞は、潅流中にヒト血 清アルブミンが存在しない場合にも、存在する場合と実質的に同じように増殖し た。

中空糸外空間を定期的に排液し、ＴＩＬ細胞によって分泌される非拡散性生成物 に富んだ培養培地を回収し、或いは細胞数及び機能的特性を評価するために細胞 をサンプリングした。各培養に対してＥＦＳを排出した回数は、表１の９列目に 示す。ＥＦＳの培地は培養Ｇを除いて、平均２．２日毎に交換した。培養ＧのＥ ＦＳはそれぞれ１４及び２１日の培養期間内に２及び０回交換した。

２つのローディング側口ボトルの１つにファイバ外液をゆっくり排液することに より、中空糸外空間を層流フードで内排液した。ＥＦＳから排液した培地を、２ ００×ｇで室温で１０分間遠心し、細胞の沈殿を新鮮な完全Ａ　Ｉ　Ｍ−Ｖ培地 に再懸濁し、中空糸バイオリアクターのＥＦＳ中に再接種した。

従って、洗い流されたいずれのＴＩＬも廃棄されなかった。

ＥＦＳ細胞上清を更に処理するために蓄えた。バイオリアクターの排液、沈殿、 再懸濁、及び再接種に２０〜３０分を要した。

バイオリアクター中の細胞数か増加するに従って、潅流液の流速を４０ｍ１から ３００ｍ１／分に上げた。潅流の方向を１０分ごとに逆にした。細胞を回収する 用意ができる１４日から３２日まで（表１参照）接種を継続した。

例２ １４日〜３２日間後、すべての中空糸培養システムをインキュベーターから除去 し、層流フード内に設置した。その後、電子制御ユニットをポンプモーターに再 連結し、回収手続の間に培養細胞が酸素欠乏状態になるのを防ぐために約４０ｍ １／分の割合で潅流を継続した。ファイバ外培地の約１／３を重力によってロー ディング側口ボトルに排液した。

ファイバーから細胞を分離させるために、中空糸リアクターを力強く振盪させた 。残りの培地及び懸濁液中の細胞を側口ボトルに排液した。その後、この手順を ３回繰り返した。これは、バイオリアクターを振盪するに先立ち、側口に新鮮な 完全培地３５ｍ１を入れ、中空糸外空間に注入することにより行なった。手動バ イブレータ−を用いてカートリッジを１分間振盪させることによって最後の２回 の洗浄を完了し、かなりしっかりと接着した細胞を除去した。中空糸カートリッ ジの細胞は最終的に約１５５〜２５０ｍ１ｆｉ中に含まれた。

一方、バッグで増殖した等しい数の細胞は、少なくとも約１０〜２０の気体透過 性バッグ、或いは約１５〜３０リツトルの培地に含まれている。

回収後、各バイオリアクターからの細胞を遠心し、最終的なペレットを形成した 。これは次に利用するための準備である。全回収手順には約３０分間を要し、バ イオリアクター中の約９５％の細胞が回収した。各中空糸バイオリアクターは１ ．５〜５．４×１０１０個の細胞を生産した。

８人の各患者の細胞のデータを表１にまとめる。各中空糸培養システムから回収 された細胞数を５列目に示す。

例３ 患者Ｇからの１．５Ｘ１０１Ｏ個のＴＩＬを３０日目、すなわちバイオリアクタ ーに接種してから１５日目にバイオリアクターから回収した。完全ＡＩＭ−Ｖを 用いてバイオリアクターの潅流を再開した。ＥＦＳ中の残りの細胞は分裂及び増 殖し続け、２１日目に更に１．５×１０１０個の細胞を生産した（表１及び図２ 参照）。潅流を再び再開して残りの細胞をもう一度増殖させ、３回目の回収とし て７３日目に２．１×１０１０の細胞を回収した。

最後の回収後、すべてのセラマックス（商檜）中空糸培養システムを１２１°Ｃ で２０分間加圧滅菌した。その後システムを脱イオン水で洗い流し、シリコーン ゴム配管及び中空糸バイオリアクターを廃棄した。異なる患者に再使用する前の 適切な時期に、新しい配管及びバイオリアクターの洗浄、再組み立て及び再加圧 滅菌を行った。

例４ バイオリアクターから回収され、サンプル化された細胞懸濁液のインビトロにお ける機能的特性を、バッグから回収され、サンプル化された対応する懸濁液と比 較した。

サンプルを最終濃度が０．０４％ｇｍ／ｄｉになるようにトリパンブルー／通常 の生理食塩水（シグマ）中に希釈することによって、定期的に及び回収後に、細 胞の生存率のアッセイを行なった。生存率は、マイクロスコープ検査の下で観察 された色素の排除によって評価した。表１に示される細胞の生存率は患者間で変 化した。中空糸培養システムで増殖した細胞の平均生存率は９０％を越えていた 。

培養期間中、グルコース及びラクトース濃度を決定するために、潅流の一部をア ッセイした（イエロー・スプリングス・インスツルメント社、イエロー・スプリ ングス、オー・エイチ）。これによりそれぞれ消費速度及び生産速度を測定する ことができる。図１及び図２を参照すると、異なる患者のＴＩＬによるグルコー ス消費速度は、０．４５〜２．２ｇ／１０１０ＴＩ　Ｌ／２４時間の間で変化し た（表１．７列目）。

乳酸の生産速度はほぼグルコースの消費速度に近かった。この割合は、対数的増 加を呈し、１．５〜３．６日毎に倍加する。これらの倍加時間は、バッグで増殖 した細胞の倍加時間である１、５〜３．２日と釣り合った。

細胞の細胞障害性を、自己腫瘍細胞、同種異型腫瘍細胞、ＮＫ高感受性に５６２ 赤白血症細胞系、及びＮＫ耐性ダウディＢ細胞リンパ腫系からなる標的に対して 試験されたクロム放出アッセイによって評価した（例えば、Ｔｏｐａｌｉａｎ　 ｅｌ　ａｌ。

（１９８７）　Ｊ、　１ｍｍｕｎｏ１．　Ｍｅｔｈ、　１０２：１２７　参照） 。細胞障害研究の結果を表２に記載する。これはバッグ及び中空糸培養の、同時 に採取したアリコートから得られた３種のＴＩＬ希釈液の細胞溶解能力測定結果 を示している。

増殖期間中の異なる時期に患者Ｍ、に、Ｈ，Ｗ及びＧから採取されたＴＩＬ細胞 の種々のサンプルによるに５６２細胞、ダウディ細胞、自己腫瘍細胞、及び同種 異型腫瘍細胞の特異的な溶解のパーセンテージを、クロム放出アッセイによって 測定した。自己腫瘍細胞、及び同種異型腫瘍細胞の他に、すべての細胞系に対し て溶解能力を有するＬＡＫ細胞の特異的な溶解のパーセンテージも測定した。

Ｋ５６２細胞系はＮＫ高感受性なので、各患者から得られた生体外増殖リンパ系 細胞のＮＫ細胞活性を評価するのに役に立つ。ＮＫＨＩ＋は非特異的障害活性の 原因である。ＮＫ耐性であるがＬＫＡ高感受性なダウディ細胞系は、与えられた サンプル中に存在するＬＫＡ活性の相対量を示す。

約１０８個の標的細胞を０．７ｍｌ中の４００μＣｉのＮン、エム・ニー）で１ 時間ラベルし、３回洗浄し、更に３７℃で３０分間インキュベートし、使用する 前に２回洗浄した。

サンプリングしたエフェクター細胞の系列希釈液を５×１０８個の標的細胞と共 に、９６ウエル・ラウンド・ボトム・マイクロタイタ・プレート（コスタ−社） の培養培地合計１５０μｌ中に、エフェクター：標的細胞を８０：１．２０：１ 、及び５：１の３通りの比率でまき、４時間インキュベートした。その後、上清 をスカトロノータイタテックφシステム（スカトロン、リール、ノルウェー）で 回収し、ガンマ−・カウンター（ＬＫＢインスッルメンツ、ガイタースブルグ、 エム・ディー）でカウントした。エフェクター細胞の不存在下で腫瘍標的細胞を インキュベートすることによって、自然に発生する標的の溶解によって放出され る放射能量を測定した。標的を２％ＳＤＳでインキュベートすることによって、 最大の細胞溶解を示す放出放射能の最大量を測定した。

特異的な溶解のパーセンテージは、従って、（実験的放出−自然発生的放出）Ｘ １００最大放出−自然発生的放出　に等しい。

実験は多少範囲か制限されるが、表２に示されたデータから、中空糸バイオリア クターで増殖したＴＩＬ細胞調製液中に存在する異なる細胞型の相対活性は患者 間で変化し、また１人の患者においても時間によって変化するように思われる。

例えば、Ｗ−ＴＩＬに対して得られた表２に記載のデータを参照にしてみよう。

ここでは、最初の組が中空糸バイオリアクターに接種後７日目に測定され、第二 の組が２８日目に測定されている。しかしながら、同日に採取された１人の患者 の細胞についてバッグ或いはＩＦから得られた各サンプルに対するデータを比較 すると、ＨＦ及びバッグ中で培養された細胞間のある一定の相違が明らかになる 。ＮＫ活性及びＬＡＫ細胞活性はバッグで増殖した細胞よりもＨＦで増殖した細 胞の方が低いように見える。更にこれらの相違は、ＴＩＬ活性においてこれに付 随し対応する減少と相関がないように思われる。従って、本発明の方法によって 増殖した細胞は、ＴＩＬに未関連な活性のパーセンテージが低いように思われる 。

またバッグ及び中空糸リアクターからサンプリングされ、回収された細胞の表現 型も比較した。患者Ｋ及びＧに対するこれらの実験の結果を表３に示す。

サンプリングされ、或いは回収された細胞を、冷染色培地（フェノールレッドを 含まず、５％熱不活性化胎児牛血清及び０．０２％アジ化ナトリウムを含むハン クス緩衝用生理食塩水）で洗浄し、約１×１０６ないし１×１０７細胞／ｍｌの 濃度で培地中に再懸濁した。未希釈のヒト単核細胞抗原に対するフルオレセイン 結合モノクローナル抗体（ベクトノーデキンソン、マウンテン・ビュー、シー・ ニー）を５％（Ｖ／　Ｖ　）濃度で細胞懸濁液か１００μｌｆｉになるまで添加 した。

モノクローナル抗体を用いて、細胞表面上に存在し、かつ細胞を機能的に特徴づ ける表面抗原を確認した。試験された抗体は、Ｔ細胞に対して反応する抗−Ｌｅ ｕ−４、Ｔヘルパー／誘発細胞に対して反応する抗−Ｌｅｕ−３ａｓ　Ｔ細胞障 害／抑制細胞に対して反応する抗−Ｌｅｕ−２ｂｘ　Ｅロゼツト受容体を含む細 胞に対して反応する抗−Ｌｅｕ’−５ｂ、ＮＫ及びいくつかのＴ細胞に対して反 応する抗−Ｌｅｕ−７、ＮＫ細胞及び好中球に対して反応する抗−Ｌ　ｅ　ｕ　 １１　ａ　ＳＢ細胞に対して反応する抗−Ｌｅｕ−１４及び抗−Ｌｅｕ−１６、 活性化されたＴ細胞、Ｂ細胞、及び単球／マクロファージに対して反応する抗− ＨＬＡ−ＤＲ，活性化されたＴ細胞に対して反応する抗−Ｉ　Ｌ−２受容体、及 び単球／マクロファージに対して反応する抗−Ｌｅｕ−Ｍ３である。対照として 用いられた抗体は、マウスＴ細胞及びフィコエリトロジン（ｐｈｙｃｏｅｒｔｈ ｒｏｓｉｎ）に対して反応する抗−Ｔｈｙ−１，２を含む。４℃で３０〜６０分 間染色した後、細胞を染色培地で洗浄し、１％バラホルムアルデヒドで固定し、 再び洗浄し、染色培地に再懸濁した。このようにラベルした細胞を４°Ｃで１〜 ７日間貯蔵した。コンソート４０コンピユーター（ベクトノーデキンソン）がイ ンターフェースするＦＡＣＳ４４０マイクロフルオロメーターを用いて蛍光分析 を遂行した。

これらの実験の結果は、本発明の方法で増殖した細胞の表面抗原のプロフィール 及びバッグ中の細胞の表面抗原のプロフィールが実質的に同一であることを示し ている。バッグ中で増殖した細胞の表面に存在する表面抗原もまた本発明の方法 によって増殖した細胞の表面に存在し、バッグ中で増殖した細胞上に実質的に存 在しない表面抗原は、また本発明の方法で増殖した細胞表面にも実質的に存在し ない。

ＴＩＬ　ＩＩＦ　培養　接種細　回収細　生存率　グルコ５リザ＃裏　総培地　 培地量Ｂ　３３　２１　０．５　４．５　８５　３．６　１２　１０　１１．３ 　２．５Ｍ　３１　３２　０．３５　４．１　９７　３．５　２５　１４　２７ 　６．６Ｓ　１．３　− Ｋ　５８　２９　１０．０　２６ｍ１　１．９　１２　１０　１３Ｊ　０．４　 − ［１２４２６１，８２，８９１１，７９１２１０３，６Ｗ　２４　２２　４．３ 　５．４　９３　２．４　１２　７　１３　２．４Ｇ　１７　１４　１．０　１ ．５　８７　２．９　７　２　１＋　５．０Ｇ　３１　２１　残渣　１．５　８ ９　３．３　８　０　８．８　５．８＊ＨＦ＝ホローフアイバ培養システム。

ＴｒＬ＝＝ＴＩＬを生産するために腫瘍が切除された患者。

患者Ｓ及びＪの細胞はバッグ或いはＨＦのいずれにおいても増殖しなかった。

ＨＦ接種日数＝患者から腫瘍を切開し、細胞をＨＦ装置に接種した後の日数。

生存率＝回収時に生存していたパーセンテージ。

グルコースｇｍ／ｄ＝回収した細胞のグルコース消費鵬＃リザバーボトルの交換 回数＝ＨＦ培養期間中にリザバーの培地を交換した回数。

：ＥＦＳの交換回数＝ＨＦ培養期間中にファイバ外空間を交換した回数。

表２ エフニク９−　Ｋ５６２　ダウディ　自己由来　、同種異型：ａｍ　８０：ｌ　 ２０：１　５：１　８０：１　２０：１　５：ｌ　８０：１　２０：１　５：１ 　８０：１　２０＋１　ｓａｔエフェクター絋胞 鉱Ｊ４４．４１２．９６．９２８．４９．１５．７Ｍ−置（Ｉｌ［Ｆ）　６．６ 　５．３　．８　２．５　１．１　４．１に−ＴＩＬ（Ｂａｇ）５８．７３３． ０１１５１９．Ｉｎ、５３．７に一部（ＨＦ）２１．６１１．２７．４４．８５ ．０４．５ＬＡＫ６５．２２３．０７．３４３．６１４．１８．４１７．２８． ９４．３４．６１．１３，６Ｈ−Ｔｎ、ＣＪ３ａｇ：）　７．４　５．８　．８ 　２．５　５．６　６．６　５０．２　５７，１　３３．７　Ｂ、６　．１　７ ．３Ｈ−ＴＩＬ（ＥＩＦ）　２．３　．９　．７　．８　２．８　２．８　４９ ．９　４２．９　３９．６　．８　５．０　．６に−ＴＩＬ（ＨＦ）４．２１． ３．８１．８２．１３．１３．６４．９．１Ｌλに８１．０４４．０１８．０３ ８．８１８．６６．０５．１．９２．０９．１６．６．９Ｙ−ＴＩＬ（Ｂａｇ） ３０．５２４，５２２．７６４，０５３．２２９．２３０，６１４．９３．２４ ．８６．８４．５Ｗ−ＴＩ１３）２２，５１１．２１２．５５５．１４５．０１ ９．８１９．４１１．９４．４２．０４．１５．８ＬＡに８［ｉ、１１７５．６ ２７．４６９．８４５．８１７．２３４．３１３．ｆｌｉ４，１２６．０１１． ７４．５Ｗ−Ｔｎ、（Ｂａｇ）１５．０６．９．９７２．２５３．１２１，７１ ５．４７．９２．８５．５１２．７２．５Ｗ−Ｔｎ、（ＪＩＦ）８．６２．５， ３５５．９４１．３１７．０１１．５０２．０３．９５．４５．０ＬＡＫ７４． ３５６．１４９．９５９．７４５，９４０，０６９．９４１，３１８，１３７， １４３，１１７．７Ｇ−ＴＩＬ（Ｂａｇ）１３．５８．５５，２２１．３４．９ ２，６５１，１３２．０２２．３３．９２．９２．５Ｇ−ＴＩＬ（Ｕ）１１．１ １０．１６．１３．９９．６７．６５０，４４０，４３８．２３．４３．２３． ６旦 ４　９４．１　９４．７　８５．３　９１．４例　５ 例１の様に、中空糸培養システムを１２１°Ｃで２０分スチームオートクレーブ で処理した。次に、１．３リツトルの脱イオン水を３７６Ｃで一夜潅流した。そ れぞれの系の潅流路及び中空糸外空間を排水し、貯蔵容器を新たに加温した１す ・ソトル容器の完全培地と置換する前に、完全ＡＩＭ−Ｖ培地でフラッシュした 。全ての操作は、無菌状の層流フード中で行った。

腫瘍は癌患者から切除され、手術室から層流フードに無菌で運んだ。ここで、腫 瘍からの細胞は１ｍｍから２ｍｍの細片に切断し、大体２００から５００ｍ１の ＲＰＭＩ　１６４０組織培養培地（Ｂｉｏｆｌｕｉｄｓ、　Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ 、　ＭＤ）中に懸濁した。

この組織培養培地には、１ｍｌ当たり１０ｍｇのコラ−ゲナーゼ、１　ｍ　１当 たり１ｍｇのデオキシリボヌクレアーゼ、及び１　ｍ　１当たり２．５単位のヒ アルロニダーゼ（Ｓ　ｉ　ｇｍａ）が含まれる。懸濁液は、−夜室温で穏やかに 攪拌された。次ぎに、該懸濁液を殺菌したニテックス（Ｎｉｔｅｘ）メ・ンシュ を通して濾過し、２回洗浄し、例１で述べたような、ＬＡＫ上清を添加した完全 ＡＩＭ−Ｖ培地中に再度懸濁した。

懸濁液の一部、即ち、少なくとも５０ｍ１が腫瘍細胞を不活性にするのに十分な 時間、Ｘ線又は他の適当な方法で照射した。照射された懸濁液は、当業者に公知 の凍らない媒体中、液体窒素で保存された。使用する直前にこの懸濁液を約３７ ℃に加温する。

残りの懸濁された細胞の一部を、約５×１０５細胞／　ｍ　１の濃度で６個のウ ェルのある培養プレート（Ｃｏｓｌａｒ　Ｃｏｒｐ、。

Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、　ＭＡ）に蒔いた。約−週間後か、又は、ＴＩＬ細胞の細 胞濃度が約１−２Ｘ１０６細胞／ｍｌに達したとき、該細胞を約５×１０５細胞 ／ｍｌで新しい培地に蒔き、少なくとも１０７から１０８の細胞が生じるまで培 養した。細胞をペレットにし、照射した腫瘍細胞を含む懸濁液に再度懸濁させた 。容積を、完全ＡＩＭ　Ｖ培地で約１００ｍ１に調整した。この混合物を、例１ に述べたように中空糸培養システムのＥＦＳに植え付けた。細胞は、該中空糸表 面またはその近傍に定着した。

培養システムは、例１で述べたように操作した。まず、潅流培地は完全ＡＩＭ− Ｖであり、これは、そのグルコースの濃度が１リツトル当たり約１から１．５グ ラムに減少したとき、周期的に置換した。細胞培養が中空糸バイオリアクター中 で確立されれば、もはやヒト血清アルブミンを潅流培地に添加する必要はない。

バイオリアクター中の細胞数が期間中ずつと増加するように、潅流物の流速を４ ０から３００ｍ１／分まで増加させる。

潅流の方向は、１０分ごとに逆転させる。１４から３２日間培養を続け、この期 間に細胞を例１で述べたようにして取り例１の様に、中空糸培養システムを１２ １°Ｃで２０分、スチームオートクレーブで処理した。次ぎに、１，３リツトル の脱イオン水を３７℃で一夜潅流した。それぞれの系の潅流路及び中空糸外空間 を排水し、貯蔵容器を新たに加温した１リツトル容器の完全培地と置換する前に 、完全ＡＩＭ−Ｖ培地でフラッシュした。すべての操作は、無菌状の層流フード 中で行った。

腫瘍は癌患者から切除され、手術室から層流フードに無菌で運んだ。ここで、腫 瘍からの細胞は１ｍｍから２ｍｒｎの細片に切断し、大体２００から５００ｍ１ のＲＰＭＩ　１６４０組織培養培地（Ｂｉｏ［１ｕｉｄｓ、　Ｒｏｃｋｖｉｌｌ ｅ、　ＭＤｌ中に懸濁した。

この組織培養培地には、１ｍｌ当たり１０ｍｇのコラ−ゲナーゼ、１ｍｌ当たり １ｍｇのデオキシリボヌクレアーゼ、及び１ｍｌ当たり２．５単位のヒアルロニ ダーゼ（Ｓ　ｉ　ｇｍａ）が含まれる。懸濁液は、−夜室温で穏やかに攪拌した 。次に、殺菌したニテックス（Ｎｉｔｅｘ）メツシュを通して濾過し、２回洗浄 し、例１で述べたような、ＬＡＫ上清を添加した完全ＡＩＭ−Ｖ培地中に再度懸 濁した。

懸濁液の一部、即ち少なくとも約５０ｍ１を取り除いた。

該懸濁液を微粒子担体ビーズと混合した。この微粒子担体ビーズに前記の細胞が 結合してスラリーを形成する。このスラリーを腫瘍細胞が不活性になるのに十分 な時間、Ｘ線で照射した。次に、このスラリーをバイオリアクターに導入し、微 粒子担体ビーズが中空糸表面又はその近傍に定着されるようにした。

別法として、腫瘍細胞の懸濁液の一部をその腫瘍細胞の増殖が不活発になるのに 十分な時間、Ｘ線で照射した。次に、この腫瘍細胞の懸濁液をＨＦバイオリアク ターのＥＦＳに導入し、微粒子担体ビーズが中空糸表面又はその近傍に定着され るようにした。非毒性の架橋試薬をＥＦＳ中に導入し、腫瘍細胞を中空糸に不可 逆的に固定させた。架橋させた後、ＥＦＳを排水し、完全Ａ　Ｉ　Ｍ−Ｖ培地で 潅流した。

懸濁した細胞の残りの部分は、約５×１０５細胞／ｍｌの濃度で６個のウェルの ある培養プレート（Ｃｏ’５ｔａｒ　Ｃｏｒｐ、。

Ｃａｍｂ　ｒ　ｉ−ｄｇｅ、　ＭＡ）に蒔いた。約−週間後か、又は″、ＴＩＬ 細胞の細胞濃度が約１−２Ｘ１０”細胞／ｍｌに達したとき、該細胞を約５×１ ０５細胞／ｍｌで新しい培地に蒔き、少なくとも１０７から１０８の細胞が生じ るまで培養した。細胞はペレット化し、照射した腫瘍細胞を含む懸濁液に再度懸 濁させた。容積を、完全ＡＩＭ　Ｖ培地で約１００ｍ１に調整した。この混合物 を、例１に述べたように中空糸培養システムのＥＦＳに植え付けた。細胞は、中 空糸表面またはその近傍に定着した。

培養システムは、例１で述べたように操作した。まず、潅流培地は完全ＡＩＭ− Ｖであり、これは、そのグルコースの濃度が１リツトル当たり約１から１．５グ ラムに減少したとき、周期的に置換される。一旦、細胞培養が中空糸バイオリア クター中で始まれば、もはやヒト血清アルブミンを潅流培地に添加する必要はな い。

バイオリアクター中の細胞数が期間中ずつと増加するように、潅流物の流速を４ ０から３００ｍ１／分まで増加させた。

潅流の方向は、１０分ごとに逆転させた。１４から３２日間培養を続け、この期 間に細胞を例１で述べたようにして取り出した。

例１の様に、中空糸培養システムを１２１℃で２０分、スチームオートクレーブ で処理した。次に、１．３す・ソトルの脱イオン水を３７°Ｃで一夜潅流した。

それぞれの系の潅流路及び中空糸外空間を排水し、貯蔵容器を新たに加温した１ リツトル容器の完全培地と置換する前に、完全ＡＩＭ−Ｖ培地でフラッシュした 。全ての操作は、無菌状の層流フード中で行った。

腫瘍は癌患者から切除され、手術室から層流ツー白こ無菌で運んだ。ここで、腫 瘍からの細胞は１　ｍ　ｍ　ｂ喝２　ｍ　ｍの細片に切断し、大体２００から５ ００ｍ１のＲＰＭ１１６４０組織培養培地（Ｂｉｏｆｌｕｉｄｓ、　Ｒａｃｋｖ ｉｌｌｅ、　ＭＤ）中に懸濁した。

この組織培養培地には、１ｍｌ当たり１０ｍｇのコラ−ゲナーゼ、ｌ　ｍ　１当 たり１ｍｇのデオキシリボヌクレアーゼ、及び１　ｍ　１当たり２．５単位のヒ アルロニダーゼ（Ｓｉｇｍａ）が含まれる。懸濁液は、−夜室温で穏やかに攪拌 した。次【こ、殺菌したニテックス（Ｎｉｔｅｘ）メ・ンシュを通して濾過し、 ２回洗浄し、例１で述べたような、ＬＡＫ上清を添加した完全Ａｌ１１−Ｖ培地 中に再度懸濁した。

この細胞懸濁液を、約５Ｘ１０５細胞／ｍｌの濃度で６個のウェルのある培養プ レート（Ｃｏｓｔａｒ　Ｃｏｒｐ、、Ｃａｍｂｒｉ−ｄＢ。

ＭＡ）に蒔いた。約−週間後か、又は、ＴＩＬ細胞の細胞濃度から１０８の細胞 が生じるまで培養した。細胞をペレット化し、更に１０００単位／ｍｌのＩＬ− ４を含む完全ＡＩＭＶ培地に再度懸濁した。この混合物を、例１で述べたように 中空糸培養システムのＥＦＳに植え付けた。細胞は、中空糸表面またはその近傍 に定着した。

培養システムは、例１で述べたように操作した。初めに潅流培地を完全ＡＩＭ− Ｖ又は１０００単位／ｍｌのＩＬ−４も含んだ完全ＡＩＭ−Ｖのどちらかにした 。潅流培地はそのグルコース濃度が１リツトル当たり約１から１．５グラムに減 少したときに周期的に置換した。一旦、細胞培養が中空糸バイオリアクター中で 始まれば、もはやヒト血清アルブミンを潅流培地に添加する必要はない。

バイオリアクター中の細胞数が期間中ずっと増加するように、潅流物の流速を４ ０から３００ｍ１／分まで増加させた。

潅流の方向は、１０分ごとに逆転させた。１４から３２日間培養を続け、この期 間に細胞を例１で述べたようにして取り中空糸バイオリアクターから例１と同様 に培養した細胞及びＥＦＳ培地を除去した後、ＥＦＳ及び細胞を２００Ｘｇで遠 心分離機にかけ、細胞をペレット化した。ＥＦＳ細胞培養上澄を新鮮な完全ＡＩ Ｍ　Ｖ培地に対して２４時間、４°Ｃで透析し、ＥＦＳならし培地と呼ばれるも のを生産した。

１０４の取得した細胞をフラスコ中に植え付け、完全ＡＩＭＶで１：１０若しく は１　：　１００に希釈したＥＦＳならし培地の５ｍｌ中か、又は、透析した完 全ＡＩＭ　Ｖの５ｍｌ中で、細胞数が二倍になるまで増殖させた。ＥＦＳならし 培地は、細胞の増殖を刺激することが見出された。データを表４に示した。

表４ ＥＦＳ細胞培養上澄によるＴＩＬの増殖の刺激ＥＦＳの希釈度 １：１００　１：１０ ＥＦＳならし培地での増殖　２０　１２．７細胞数ＸＩＯ’　１６．８　１２． ７ 透析した培地での増殖　９．２１０．０細胞数ｘｌＯ’　９．　０　１３．　２ 変更は当業者に明らかであるから、この発明は、添付された特許請求の範囲のみ に制限されるはずである。

培養期間（日） ＦＩＧ、　２ 補正書の翻訳文提出書（特許法第１８４条の８）平成４年３月１６日

Claims (40)

【特許請求の範囲】
1. １．養子免疫療法に用いることができる生体外増殖リンパ性細胞の製造方法であ って、 （ａ）中空糸培養システムの１構成要素である中空糸バイオリアクターの中空糸 外空間に、リンパ性細胞の懸濁液を接種し、 （ｂ）該リンパ性細胞の治療上有用な亜集団を特異的に増殖させる成長促進物質 の少なくとも１種を有効量含有する組織培養培地で該バイオリアクターを灌流し 、ここで、該有効量は該特異的増殖を行なうに十分な量であり、該組織培養培地 は該亜集団の細胞分裂および成長を維持し、かつ該治療上の利用は養子免疫療法 であり、および（ｃ）該バイオリアクター中の該細胞を、該成長促進物質の存在 下において、治療上有効な数の該生体外増殖リンパ性細胞を得るに十分な時間培 養し、ここで、該治療上有効な数は、該細胞を養子免疫療法に用いた場合に少な くとも治療効果を達成するに十分な細胞の数であることを具備する製造方法。
2. ２．成長促進物質が、マイトジェンおよびサイトカインからなる群より選ばれる 物質の少なくとも１種である請求の範囲第１項記載の方法。
3. ３．前記サイトカインが、インターロイキン−１、インターロイキン−２、イン ターロイキン−４およびインターロイキン−６からなる群より選ばれるサイトカ インの少なくとも１種である請求の範囲第２項記載の方法。
4. ４．バイオリアクターの中空糸外空間の内容物を回収することをさらに含む請求 の範囲第１項記載の方法であって、該内容物が前記生体外増殖リンパ性細胞およ び中空糸外空間細胞上清を含む方法。
5. ５．バイオリアクターの中空糸外空間の内容物を回収することをさらに含む請求 の範囲第３項記載の方法であって、該内容物が前記生体外増殖リンパ性細胞およ び中空糸外空間細胞上清を含む方法。
6. ６．前記バイオリアクターの灌流の再設定、および前記第１の回収の後前記バイ オリアクターの中空糸外空間に残存する残留細胞を治療上有効な量の前記細胞を 得るに十分な時間培養することをさらに含む請求の範囲第４項記載の方法であっ て、該灌流および回収が少なくとも１回再設定される方法。
7. ７．前記バイオリアクターの灌流の再設定、および前記第１の回収の後前記装置 の中空糸外空間に残存する残留細胞を治療上有効な量の前記細胞を得るに十分な 時間培養することをさらに含む請求の範囲第５項記載の方法であって、該灌流お よび回収が少なくとも１回再設定される方法。
8. ８．前記培地が少なくとも１種の標的抗原の有効量をも含有する請求の範囲第１ 項記載の方法であって、該有効量が、少なくとも、該抗原を特異的に認識する少 なくとも１種の生体外増殖リンパ性細胞亜集団の増殖を選択するに十分である方 法。
9. ９．前記標的抗原の少なくとも１種が腫瘍特異性抗原からなる群より選ばれる請 求の範囲第８項記載の方法。
10. １０．標的抗原が、前記バイオリアクターの中空糸外空間内の培地中にのみ存在 する請求の範囲第８項記載の方法。
11. １１．前記標的抗原の少なくとも１種が腫瘍特異性抗原からなる群より選ばれる 請求の範囲第１０項記載の方法。
12. １２．細胞をペレット化して前記中空糸外空間の内容物から除去し、中空糸外空 間細胞上清を製造することをさらに含む請求の範囲第４項記載の方法。
13. １３．前記中空糸外空間細胞上清を組織培養培地に対して透析し、中空糸外空間 調整培地を製造することをさらに含む請求の範囲第１２項記載の方法。
14. １４．前記リンパ性細胞のゲノムが、前記細胞を養子免疫療法に用いた際に発現 するタンパク質をコードするクローン化ＤＮＡを挿入することにより変性されて いる請求の範囲第１項記載の方法。
15. １５．前記クローン化ＤＮＡが、追跡可能なマーカータンパク質、治療上有効な タンパク質、および薬剤耐性および感受性の原因となり得るタンパク質からなる 群より選ばれるタンパク質の少なくとも１種をコードする請求の範囲第１４項記 載の方法。
16. １６．生体外増殖リンパ性細胞を成長させるための改良法であって、該細胞が腫 瘍浸潤リンパ球であり、（ａ）切除腫瘍組織由来の細胞を細胞組織培養培地に懸 濁させ、 （ｂ）腫瘍浸潤リンパ球の増殖を促進し得る少なくとも１種のサイトカインの有 効量の存在下において該懸濁液を培養し、ここで、該有効量は、該懸濁液中の腫 瘍浸潤リンパ球の増殖を行なうに十分な量であり、 （ｃ）腫瘍浸潤リンパ球の該培養懸濁液を、中空糸培養システムの１構成要素で ある中空糸リアクターの中空糸外空間に接種し、 （ｄ）該バイオリアクターを、腫瘍浸潤リンパ球の増殖を促進し得る少なくとも １種のサイトカインの有効量を含有する組織培養培地で灌流し、ここで、該有効 量は該特異的増殖を行なうに十分な量であり、かつ該組織培養培地は該腫瘍浸潤 リンパ球の細胞分裂および成長を維持し、および（ｅ）該腫瘍浸潤リンパ球を、 該バイオリアクター内で、該組織培養培地の存在下において、治療上有効な数の 該腫瘍浸潤リンパ球を得るに十分な時間培養し、ここで、該治療上の有効数は、 少なくとも、該細胞を養子免疫療法に用いた場合に治療効果を達成するに十分な 該細胞の数である、ことを具備する方法。
17. １７．前記サイトカインが、インターロイキン−１、インターロイキン−２、イ ンターロイキン−４およびインターロイキン−６からなる群より選ばれるサイト カインの少なくとも１種である請求の範囲第１６項記載の方法。
18. １８．バイオリアクターの中空糸外空間の内容物を回収することをさらに含む請 求の範囲第１６項記載の方法であって、該内容物が前記腫瘍浸潤リンパ球および 中空糸外空間上清を含む方法。
19. １９．前記バイオリアクターの灌流の再設定、および前記第１の回収の後前記バ イオリアクターの中空糸外空間に残存する残留腫瘍浸潤リンパ球を前記腫瘍浸潤 リンパ球の治療上有効な量を得るに十分な時間培養することをさらに含む請求の 範囲第１８項記載の方法であって、該灌流および回収が少なくとも１回再設定さ れる方法。
20. ２０．前記培地が少なくとも１種の腫瘍特異性標的抗原の有効量をも含有する請 求の範囲第１８項記載の方法であって、該有効量が、少なくとも、該抗原を特異 的に認識する少なくとも１種の腫瘍浸潤リンパ球亜集団の増殖を選択するに十分 である方法。
21. ２１．前記標的抗原が、前記バイオリアクターの中空糸外空間内の培地中にのみ 導入される請求の範囲第２０項記載の方法。
22. ２２．細胞をペレット化して前記中空糸外空間の内容物から除去し、中空糸外空 間細胞上清を製造することをさらに含む請求の範囲第１８項記載の方法。
23. ２３．前記中空糸外空間細胞上清を組織培養培地に対して透析し、中空糸外空間 調整培地を製造することをさらに含む請求の範囲第２２項記載の方法。
24. ２４．前記腫瘍浸潤リンパ球のゲノムが、前記リンパ球を養子免疫療法に用いた 際に発現するタンパク質をコードするクローン化ＤＮＡを挿入することにより変 性されている請求の範囲第１項記載の方法。
25. ２５．前記クローン化ＤＮＡが、追跡可能なマーカータンパク質、治療上有効な タンパク質、および薬剤耐性および感受性の原因となり得るタンパク質からなる 群より選ばれるタンパク質の少なくとも１種をコードする請求の範囲第２４項記 載の方法。
26. ２６．（ａ）哺乳動物細胞の成長に適した中空シェル、（ｂ）該シェル内に収め られた複数の中空糸であって、該中空糸が半透過性であり、かつそれらの表面上 および近傍での哺乳動物細胞の成長に適している中空糸、（ｃ）該中空糸の表面 上もしくは近傍のリンパ性細胞であって、該細胞の少なくとも１種の亜集団の増 殖を特異的に促進する少なくとも１種の成長促進物質の有効量の存在下において 培養され、該亜集団は養子免疫療法に用いることが可能であるリンパ性細胞、お よび （ｄ）該シェル内部で該中空糸を取り巻いている組織培養培地であって、該リン パ性細胞の治療上有用な亜集団を特異的に増殖させる少なくとも１種の成長促進 物質の有効量を含有し、該有効量は該特異的増殖を行なうに十分な量であり、該 組織培養培地は該亜集団の細胞分裂および成長を維持し、および該治療上の利用 は養子免疫である培養培地、を具備する中空糸バイオリアクター。
27. ２７．前記成長促進物質が、マイトジェンおよびサイトカインからなる群より選 ばれる物質の少なくとも１種である請求の範囲第２６項記載のバイオリアクター 。
28. ２８．前記サイトカインが、インターロイキン−１、インターロイキン−２、イ ンターロイキン−４およびインターロイキン−６からなる群より選ばれるサイト カインの少なくとも１種である請求の範囲第２７項記載のバイオリアクター。
29. ２９．前記リンパ性細胞が腫瘍浸潤リンパ球である請求項２６記載のバイオリア クター。
30. ３０．請求の範囲第１項記載の方法により製造された生体外増殖リンパ性細胞。
31. ３１．請求の範囲第６項記載の方法により製造された生体外増殖リンパ性細胞。
32. ３２．請求の範囲第１４項記載の方法により製造された生体外増殖リンパ性細胞 。
33. ３３．請求の範囲第１６項記載の方法により製造された腫瘍浸潤リンパ球。
34. ３４．請求の範囲第１９項記載の方法により製造された腫瘍浸潤リンパ球。
35. ３５．請求の範囲第２４項記載の方法により製造された腫瘍浸潤リンパ球。
36. ３６．請求の範囲第１２項記載の方法により製造された中空糸外空間細胞上溝。
37. ３７．請求の範囲第１３項記載の方法により製造された中空糸外空間調整培地。
38. ３８．請求の範囲第２２項記載の方法により製造された中空糸外空間細胞上清。
39. ３９．請求の範囲第２３項記載の方法により製造された中空糸外空間調整培地。
40. ４０．生体外増殖リンパ性細胞を製造するための改良法であって、有効量の中空 糸外空間調整培地の存在下において該細胞を培養することを具備し、該量が、該 増殖細胞の成長速度を刺激して、それが存在しない場合の該細胞の成長よりも少 なくとも約５０％増加させる方法。