JPH0558000B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、インターフエロンの可溶化方法およ
び水に易溶なインターフエロン含有組成物に関す
る。 インターフエロンは、抗ウイルス，抗ガン等の
生物学的活性のゆえに医薬としての用途が期待さ
れている生理活性物質であり、生理学的、理化学
的性質ならびに起源により、α型、β型、γ型な
どの分類がなされている。従来、インターフエロ
ンは動物とくに、ヒトの細胞を培養することによ
つて製造されてきたが、供給量に限りがあるた
め、組換えDNA技術により、インターフエロン
遺伝子をクローン化し、微生物、たとえば大腸菌
に導入して、その微生物を培養することによりイ
ンターフエロンを生産する方法が開発された。 インターフエロンはいずれも、水に離溶性であ
るため、培養物中から単離・精製することが困難
であり、インターフエロンを可溶化する手段が求
められている。 インターフエロン−βを精製する際、ブルーセ
フアロースカラムを用いる方法が知られており、
この方法では溶出液中にはエチレングリコールを
用いてインターフエロンの可溶化を行つている
〔Jankowski，W.J.et al，Biochemistry 155182
（1976），Knight，E.Jr，Science 207 525
（1980）〕が、いまだ充分な成果は得られていな
い。 本発明者らは、インターフエロンの可溶化につ
いて種々研究を重ねた結果、アルギニン，ヒスチ
ジンなどのアミノ酸類を用いることにより、イン
ターフエロンの溶解性を著しく増大することがで
きることを見出し、本発明を完成した。これらの
アミノ酸類は、生体に無害な物質であり、インタ
ーフエロン製剤にもそのまま利用できるので、非
常に便利である。 以下本発明を詳細に説明する。 本発明は、インターフエロンの溶解性を、アミ
ノ酸類を用いて増大させる方法を提供する。 インターフエロンとしては、天然のインターフ
エロン、動物細胞の培養によつて製造されるイン
ターフエロン、組換えDNA技術によつて得られ
る微生物によつて製造されるインターフエロンな
どが含まれる。またα，β，γのいずれの型のイ
ンターフエロンも含まれる。 本発明ではとくに、組換えDNA技術によつて
得られるインターフエロン−γ（以下“Ｇ−γ−
IFN”と略記する）において優れた効果が得られ
る。 アミノ酸としては、アルギニン，ヒスチジン，
リジン，ヒドロキシリジン，オルニチン，γ−ア
ミノブチル酸，ε−アミノカプロイン酸またはそ
れらの塩などが用いられるが、とくにアルギニン
塩酸塩，ヒスチジン，リジン塩酸塩，ヒドロキシ
リジン，オルニチンアセテートは可溶化効果が著
しい。 インターフエロンの可溶化効果はインターフエ
ロン100万単位当り約５×10^-6モル〜約５×10^-3
モルのアミノ酸を添加することにより現れるが、
約2.5×10^-5モル〜約２×10^-3モルで効果が著し
い。 アミノ酸類は、血清アルブミン、無機塩類、多
糖類、界面活性剤、抗生物質、キレート剤などと
併用することにより著しく効果を増大することが
できる。 従来の血清アルブミン添加のＧ−γ−IFN凍結
乾燥品は、水で溶解後、25℃、６時間で溶液中に
白色の不溶性物質を生じる。しかし、３％（Ｗ／
Ｖ）アミノ酸溶液を用いて溶解するとき、25℃、
６時間後でも、不溶性物質を生じない。 また、アルブミンとアミノ酸を添加したＧ−γ
−IFN凍結乾燥品を水に溶解するとき、25℃、６
時間後でも不溶性物質は生じない。 本発明は、可溶化剤としてアミノ酸類を含む、
インターフエロン含有組成物を提供する。 組成物中のインターフエロンおよびアミノ酸
類、ならびに無機塩類の添加量などについては上
記可溶化方法の場合と同様である。該組成物中に
は医薬品として許容される、一般的保存剤、安定
剤、賦形剤、結合剤、崩壊剤、湿潤剤、滑沢剤、
着色剤、芳香剤、矯味剤、剤皮、懸濁化剤、乳化
剤、溶解補助剤、緩衝剤、等張剤、塑性剤、プラ
スチツク界面活性剤などを含ませることができ
る。 以下本発明の実施例を示す。 実施例 １ 試料の調製 Ｇ−γ−IFN（下記参考例の方法により製造し
た。以下同じ）３×10⁶単位に対し、血清アルブ
ミン５mgおよび水３％、アミノ酸３％またはプロ
ピレングリコール５％を添加したものを凍結乾燥
した。 不溶性物質の測定 Ｇ−γ−IFN凍結乾燥品の溶解液中の不溶性物
質量を、400nmの吸光度を測定することにより求
めた。 溶解は、溶液５mlを用いて行い、溶解度25℃の
恒温槽に入れ６時間後に溶液を１cm石英セルに入
れ400nmの吸光度を測定した。 結果を表１に示す。

【表】 実施例 ２ Ｇ−γ−IFN3×10⁶単位に血清アルブミン５
mg、アミノ酸類を50mg添加し凍結乾燥した。 凍結乾燥品を蒸留水５mlで溶解し25℃の恒温槽
に入れ、６時間後に400nmの吸光度を測定した。 結果を表２に示す。

【表】 実施例 ３ 溶解液中のアミノ酸類の濃度を変えて、実施例
１と同様にＧ−γ−IFN凍結乾燥品の溶解後、25
℃、６時間後の400nmの吸光度を測定した。 結果を表３に示す。

【表】 実施例 ４ Ｇ−γ−IFN3×10⁶単位に血清アルブミン５mg
添加したものを凍結乾燥した。蒸留水、アルブミ
ン溶液およびアルブミンとアミノ酸の混合溶液を
５ml用いて上記凍結乾燥品を溶解し、25℃恒温槽
に入れ６時間後に400nmの吸光度を測定した。結
果を表４に示す。

【表】 実施例 ５ Ｇ−γ−IFN3×10⁶単位に血清アルブミン５mg
およびアルギニン塩酸塩30mg添加し、溶液の量を
２mlになるよう蒸留水で調整し、バイアルに入
れ、凍結乾燥した。 実施例 ６ Ｇ−γ−IFN3×10⁶単位に血清アルブミン５mg
および塩化ナトリウム５mgおよびアルギニン塩酸
塩30mg添加し、溶液の量を２mlになるよう蒸留水
で調整し、バイアルに入れ凍結乾燥した。 実施例 ７ Ｇ−γ−IFN3×10⁶単位に血清アルブミン５mg
およびリジン塩酸塩30mg添加し溶液の量を２mlに
なるよう蒸留水で調整し、バイアルに入れ、凍結
乾燥した。 実施例 ８ Ｇ−γ−IFN2×10⁶単位に対し、血清アルブミ
ン30mg、塩化ナトリウム９mgおよびアルギニン塩
酸塩０mg、10mg、20mg、40mg添加したものを凍結
乾燥した。 Ｇ−γ−IFN凍結乾燥品を60℃恒温槽中、１カ
月および６カ月し、その保存安定性試験を行つ
た。 インターフエロン活性の測定は、FL細胞を用
いたSindbisウイルスによる細胞変性阻止、色素
取り込み法〔別冊、蛋白質・核酸・酵素No.25イン
ターフエロン研究の進歩、335−363（1981）〕を用
い、標準Ｇ−γ−IFNを同時に測定して相対力価
を求めた。 結果を表５に示す。

【表】 参考例 Escherichia coli IGKA−２によるインターフ
エロン−γの生産： 組換え体プラスミドpGKA−２をもつ
Escherichia coli IGKA−２（FERM BP−496）
をLG培地〔トリプトフアン10ｇ，酵母エキス５
ｇ，NaCl5ｇ，グルコース２ｇを水１にとかし
NaOHにてPHを7.0とする。〕で37℃、18時間培養
し、この培養液４mlを200mlのMCG培地
〔Na₂HPO₄0.6％，KH₂PO₄0.3％，NaCl0.5％，
NH₄Cl0.1％，グルコース0.5％，カザミノ酸0.5
％，MgSO₄1mM，ビタミンB₁4μｇ／ml，PH7.2〕
に接種し、30℃で４〜８時間培養後、トリプトフ
アン遺伝子のインデユーサーであるインドールア
クリル酸を10μｇ／ml加え、さらに２〜12時間培
養を続ける。培養液を8000rpm、10分間遠心して
集菌し、30mMNaCl，30mM Tris−HCl（PH7.5）
緩衝液で洗浄する。洗浄菌体を上記緩衝液20mlに
懸濁し、４mgのリゾチーム、0.25M EDTA（エチ
レンジアミンテトラ酢酸）を0.1ml加えて30分間
０℃に放置した後、凍結・融解を３回くり返して
菌体をこわす。これを15000rpm、30分間遠心し
て上清を得、上清を硫安沈殿、セフアデツクスＧ
−75によるゲル濾過およびイオン交換クロマトグ
ラフイーなどの処理をして、インターフエロン−
γ約２×10⁶単位を得る。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 可溶化剤として分子中にSH基を持たないア
   ミノ酸を用いるインターフエロンの可溶化方法。 ２ アミノ酸が、アルギニン、ヒスチジン、リジ
   ン、ヒドロキシリジン、オルニチン、グルタミ
   ン、γ−アミノブチル酸、ε−アミノカプロン
   酸、およびそれらの塩から選ばれるアミノ酸であ
   る特許請求の範囲１記載のインターフエロンの可
   溶化方法。