JPH0559701B2 - - Google Patents
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- JPH0559701B2 JPH0559701B2 JP20136684A JP20136684A JPH0559701B2 JP H0559701 B2 JPH0559701 B2 JP H0559701B2 JP 20136684 A JP20136684 A JP 20136684A JP 20136684 A JP20136684 A JP 20136684A JP H0559701 B2 JPH0559701 B2 JP H0559701B2
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- JP
- Japan
- Prior art keywords
- human lysozyme
- gene
- producing human
- plasmid vector
- host cell
- Prior art date
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
- C12N9/2462—Lysozyme (3.2.1.17)
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- Health & Medical Sciences (AREA)
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- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
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- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
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- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Description
発明の背景
本発明は化学的に合成したヒトリゾチーム遺伝
子を用いた遺伝子工学的手法によるヒトリゾチー
ムの製造法に関する。 ヒトリゾチームはヒトの涙、唾液、鼻粘液、
乳、リンパ腺、白血球、血漿、軟骨、肺、腎臓、
脾臓、肝臓、腸管、耳下腺、皮膚、精液、白血病
患者の尿中等に見い出される酵素蛋白質であり、
Ｎ−アセチルグリコサミンとＮ−アセチルムラミ
ン酸間のβ−１，４結合を加水分解するムラミダ
ーゼ（muramidase）としての酵素活性を有して
いる事が知られている。 またヒト乳由来のリゾチームは下記の配列で示
される130個のアミノ酸からなる事が知られてい
る（例えば、船津ら「溶菌酵素」55〜58頁、講談
社サイエンテイフイク（1977）参照）。
子を用いた遺伝子工学的手法によるヒトリゾチー
ムの製造法に関する。 ヒトリゾチームはヒトの涙、唾液、鼻粘液、
乳、リンパ腺、白血球、血漿、軟骨、肺、腎臓、
脾臓、肝臓、腸管、耳下腺、皮膚、精液、白血病
患者の尿中等に見い出される酵素蛋白質であり、
Ｎ−アセチルグリコサミンとＮ−アセチルムラミ
ン酸間のβ−１，４結合を加水分解するムラミダ
ーゼ（muramidase）としての酵素活性を有して
いる事が知られている。 またヒト乳由来のリゾチームは下記の配列で示
される130個のアミノ酸からなる事が知られてい
る（例えば、船津ら「溶菌酵素」55〜58頁、講談
社サイエンテイフイク（1977）参照）。
【表】
【表】
リゾチームは種々の細菌を溶解する作用を有す
るので、食品等の防腐剤あるいは医薬品として、
リゾチーム単独又は抗生物質との併用による抗菌
剤として使用する事ができる。 また、血液凝固及び止血作用、抗炎症作用、呼
吸器疾患者に対する喀痰喀出作用等をも有するの
でそれらを対象とした医薬品としても利用する事
ができる。 ヒトリゾチームはヒトの乳、尿等から単離する
事ができるが医療等を目的とする工業的生産の要
求を満すには効率が悪く実用的ではない。本発明
は組換えDNA技術により、安価にしかも多量に
純粋なヒトリゾチームを生産する事を可能にした
ものである。 合成ヒトリゾチーム遺伝子を用いて組換え
DNA技術によりヒトリゾチームを製造する方法
は後により詳しく記述するが基本的には下記の工
程より成る。 (1) 遺伝子の設計 (2) 遺伝子の化学合成 (3) 適当な発現用ベクターへの遺伝子の組込み (4) 得られた組換えプラズミドに依る適当な宿主
の形質転換 (5) 形質転換体の培養によるヒトリゾチームの産
生及び回収 遺伝子の設計において、ヒトリゾチームのアミ
ノ酸配列からそれに対応する遺伝子のヌクレオチ
ド配列（本文では以下これを構造遺伝子と呼ぶ）
を決定するにあたつては、大部分のアミノ酸に関
してはそれに対応する遺伝子暗号（コドン）が２
個以上存在するので130個のアミノ酸より成る配
列に対して極めて多数のヌクレオチド配列を考え
る事が可能である。 この多数の可能性の中から望ましい配列を決定
するに当つての判断基準として、例えば、使用す
べき宿主細胞に於いて多頻度に使用されているコ
ドンを使用すべきであること、構造遺伝子を含む
配列の両端および内部に適当な制限酵素認識部位
を持たせてプラズミドへの挿入、解析を行う事を
容易にすること、化学合成の過程に於いて遺伝子
断片の集合及び連結が容易にできる様に各構成断
片間で不必要な相互作用が最小になる様にコドン
を選択することなどがあげられるが、これらの条
件が相反する場合があり、自明な論理による推論
によつて望ましい配列に到達できるのではなく、
試行錯誤を含む種々の実験的検証が必要である。 さて、所望の構造遺伝子を設計合成したとし
て、次にこれを宿主細胞内で発現させるためには
大別して２つの方法があり、本文ではそれらをキ
メラ発現法及び直接発現法と呼ぶことにする。こ
こでいうキメラ発現法とは、用いる宿主の内在性
遺伝子（その宿主の野性株に本来存在する遺伝
子）に所望の遺伝子を接続させた遺伝子（これを
キメラ遺伝子と呼ぶ）を作製し、このキメラ遺伝
子を適当なベクターに組込み、次に宿主を形質転
換して発現させる方法があり、発現された産物は
対応する内在性のポリペプチドと所望の遺伝子に
コードされたポリペプチドが融合した形で生産さ
れる（これをキメラポリペプチドと呼ぶ）。 キメラ発現法は、内在性遺伝子の発現機構を用
いて発現させるので、外来遺伝子を比較的容易に
発現させることができる場合が多いが所望のポリ
ペプチドのみを単離する為にはキメラポリペプチ
ドを化学的、酵素的に処理して、所望のポリペプ
チドを特異的に切り出し精製することが必要があ
り製造工程がより長く複雑になるという欠点を有
している。 一方もう一つの発現法である直接発現法とは、
所望の構造遺伝子を翻訳開始信号（通常ATG）
の直後に接続し、得られた配列を発現用ベクター
の転写及び翻訳を支配する領域の適切な位置に挿
入した組換えプラズミドを作成し、次にその組換
えプラズミドを用いて形質転換して発現させる方
法であり、外来ポリペプチドは単独の完成した分
子として産生されるのでキメラ発現法に比し製造
工程がより単純であり実用的に有利である。 しかしながら、直接発現法の場合外来遺伝子を
効率良く発現させるためには発現用ベクター内の
転写と翻訳を支配している領域（以下5′端の非翻
訳領域と呼ぶ）の適切な位置に外来遺伝子を挿入
する必要があるが、この5′端の非翻訳領域の望ま
しい化学構造（即ちヌクレチオド配列）は、大腸
菌、酵母等の宿主細胞に依つて大きく異なつてい
るのみならず同一宿主細胞であつても所与の構造
遺伝子によつて異なるものである事が知られて来
つつあり、任意の構造遺伝子に対して望ましい非
翻訳領域の構造を予知する事は困難であつて、試
行錯誤的に最適構造を深索しなければならないと
いう困難さを伴つている。 さらに、直接発現法によつて、本来溶菌酵素で
あるヒトリゾールチームを微生物で生産する事に
関しては、発現したヒトリゾチームに依つて組換
え体が溶菌してしまう事も考えられ、その可能性
に概念のさしはさまれる所であつた。 本発明者らは、この様な状況の中でヒトリゾチ
ームの直接発現法による生産を目的として、構造
遺伝子の設計、5′端の非翻訳領域、宿主細胞及び
その培養法等に詳細な工夫を重ね研究を続けた結
果、本発明化合物であるヒトリゾチーム遺伝子を
用いればヒトリゾチームを高レベルで直接発現さ
せる事が可能である事を確認し、本発明を完成す
るに至つた。 発明の構成 １ 遺伝子の取得 本発明のヒトリゾチーム遺伝子は通常用いられ
ているヌクレオチド合成法によつて取得される。 宿主細胞によつて種々の条件が考慮され得る
が、通常最も一般的に用いられている大腸菌（E.
coli）の場合について述べれば下記の通りであ
る。 (1) 遺伝子の設計 構造遺伝子 ヒトリゾチームを構成するアミノ酸を指定
するいくつかのコドンのうちから下記の条件
を満すものを選んでDNAを合成する。 (A) Ｇ−Ｃ塩基対に富む領域に続いてＡ−Ｔ
塩基対に富む領域が続かない様にする。 (B) 後記する各々の合成フラグメントが分子
内あるいは分子間で望まない相補性配列を
持たない様にする。 また翻訳を開始終結せしめるため構造遺
伝子の5′端に翻訳開始信号を3′端に翻訳終
止信号を付け加える。 リボゾーム結合部位を含む5′端非翻訳領域 リボゾーム結合部位（以下SD配列と称す）
を含む5′端非翻訳領域のDNAを下記の条件
を満す様に合成する。 (A) プロモーターから適当な距離をおいて
SD配列が配置される様にする。 (B) 合成SD配列は天然に存在するSD配列と
共通な塩基配列を有する部分を持ちかつ適
当な長さのヌクレオチド配列である様にす
る。 (C) SD配列から適当な距離をおいて翻訳開
始信号が配置される様にする。 遺伝子全体 SD配列を含む5′端非翻訳領域及び翻訳開
始、翻訳終止信号を含む構造遺伝子からなる
ヒトリゾチーム遺伝子は (A) プラズミドへの組込み、プラスミドから
の切り出しを容易にするため5′、3′両端に
制限酵素認識配列をもたせる。 (B) 形質転換体の検索を容易にするため遺伝
子内に一つ又は二つ以上の制限酵素認識配
列をもたせる。 (C) 翻訳開始信号から始まる構造遺伝子部分
のみの利用も可能にするため翻訳開始信号
の直前で遺伝子を切断できる様に制限酵素
認識配列をもたせる。 ことが望ましい。 この様にして設計された構造遺伝子の一具体例
は下記のヌクレオチド配列式(1)で表わされる遺伝
子であり、同遺伝子を適当な発現ベクターに組込
む事により大腸菌で発現させる事が可能である。 ヌクレオチド配列式 (1)
るので、食品等の防腐剤あるいは医薬品として、
リゾチーム単独又は抗生物質との併用による抗菌
剤として使用する事ができる。 また、血液凝固及び止血作用、抗炎症作用、呼
吸器疾患者に対する喀痰喀出作用等をも有するの
でそれらを対象とした医薬品としても利用する事
ができる。 ヒトリゾチームはヒトの乳、尿等から単離する
事ができるが医療等を目的とする工業的生産の要
求を満すには効率が悪く実用的ではない。本発明
は組換えDNA技術により、安価にしかも多量に
純粋なヒトリゾチームを生産する事を可能にした
ものである。 合成ヒトリゾチーム遺伝子を用いて組換え
DNA技術によりヒトリゾチームを製造する方法
は後により詳しく記述するが基本的には下記の工
程より成る。 (1) 遺伝子の設計 (2) 遺伝子の化学合成 (3) 適当な発現用ベクターへの遺伝子の組込み (4) 得られた組換えプラズミドに依る適当な宿主
の形質転換 (5) 形質転換体の培養によるヒトリゾチームの産
生及び回収 遺伝子の設計において、ヒトリゾチームのアミ
ノ酸配列からそれに対応する遺伝子のヌクレオチ
ド配列（本文では以下これを構造遺伝子と呼ぶ）
を決定するにあたつては、大部分のアミノ酸に関
してはそれに対応する遺伝子暗号（コドン）が２
個以上存在するので130個のアミノ酸より成る配
列に対して極めて多数のヌクレオチド配列を考え
る事が可能である。 この多数の可能性の中から望ましい配列を決定
するに当つての判断基準として、例えば、使用す
べき宿主細胞に於いて多頻度に使用されているコ
ドンを使用すべきであること、構造遺伝子を含む
配列の両端および内部に適当な制限酵素認識部位
を持たせてプラズミドへの挿入、解析を行う事を
容易にすること、化学合成の過程に於いて遺伝子
断片の集合及び連結が容易にできる様に各構成断
片間で不必要な相互作用が最小になる様にコドン
を選択することなどがあげられるが、これらの条
件が相反する場合があり、自明な論理による推論
によつて望ましい配列に到達できるのではなく、
試行錯誤を含む種々の実験的検証が必要である。 さて、所望の構造遺伝子を設計合成したとし
て、次にこれを宿主細胞内で発現させるためには
大別して２つの方法があり、本文ではそれらをキ
メラ発現法及び直接発現法と呼ぶことにする。こ
こでいうキメラ発現法とは、用いる宿主の内在性
遺伝子（その宿主の野性株に本来存在する遺伝
子）に所望の遺伝子を接続させた遺伝子（これを
キメラ遺伝子と呼ぶ）を作製し、このキメラ遺伝
子を適当なベクターに組込み、次に宿主を形質転
換して発現させる方法があり、発現された産物は
対応する内在性のポリペプチドと所望の遺伝子に
コードされたポリペプチドが融合した形で生産さ
れる（これをキメラポリペプチドと呼ぶ）。 キメラ発現法は、内在性遺伝子の発現機構を用
いて発現させるので、外来遺伝子を比較的容易に
発現させることができる場合が多いが所望のポリ
ペプチドのみを単離する為にはキメラポリペプチ
ドを化学的、酵素的に処理して、所望のポリペプ
チドを特異的に切り出し精製することが必要があ
り製造工程がより長く複雑になるという欠点を有
している。 一方もう一つの発現法である直接発現法とは、
所望の構造遺伝子を翻訳開始信号（通常ATG）
の直後に接続し、得られた配列を発現用ベクター
の転写及び翻訳を支配する領域の適切な位置に挿
入した組換えプラズミドを作成し、次にその組換
えプラズミドを用いて形質転換して発現させる方
法であり、外来ポリペプチドは単独の完成した分
子として産生されるのでキメラ発現法に比し製造
工程がより単純であり実用的に有利である。 しかしながら、直接発現法の場合外来遺伝子を
効率良く発現させるためには発現用ベクター内の
転写と翻訳を支配している領域（以下5′端の非翻
訳領域と呼ぶ）の適切な位置に外来遺伝子を挿入
する必要があるが、この5′端の非翻訳領域の望ま
しい化学構造（即ちヌクレチオド配列）は、大腸
菌、酵母等の宿主細胞に依つて大きく異なつてい
るのみならず同一宿主細胞であつても所与の構造
遺伝子によつて異なるものである事が知られて来
つつあり、任意の構造遺伝子に対して望ましい非
翻訳領域の構造を予知する事は困難であつて、試
行錯誤的に最適構造を深索しなければならないと
いう困難さを伴つている。 さらに、直接発現法によつて、本来溶菌酵素で
あるヒトリゾールチームを微生物で生産する事に
関しては、発現したヒトリゾチームに依つて組換
え体が溶菌してしまう事も考えられ、その可能性
に概念のさしはさまれる所であつた。 本発明者らは、この様な状況の中でヒトリゾチ
ームの直接発現法による生産を目的として、構造
遺伝子の設計、5′端の非翻訳領域、宿主細胞及び
その培養法等に詳細な工夫を重ね研究を続けた結
果、本発明化合物であるヒトリゾチーム遺伝子を
用いればヒトリゾチームを高レベルで直接発現さ
せる事が可能である事を確認し、本発明を完成す
るに至つた。 発明の構成 １ 遺伝子の取得 本発明のヒトリゾチーム遺伝子は通常用いられ
ているヌクレオチド合成法によつて取得される。 宿主細胞によつて種々の条件が考慮され得る
が、通常最も一般的に用いられている大腸菌（E.
coli）の場合について述べれば下記の通りであ
る。 (1) 遺伝子の設計 構造遺伝子 ヒトリゾチームを構成するアミノ酸を指定
するいくつかのコドンのうちから下記の条件
を満すものを選んでDNAを合成する。 (A) Ｇ−Ｃ塩基対に富む領域に続いてＡ−Ｔ
塩基対に富む領域が続かない様にする。 (B) 後記する各々の合成フラグメントが分子
内あるいは分子間で望まない相補性配列を
持たない様にする。 また翻訳を開始終結せしめるため構造遺
伝子の5′端に翻訳開始信号を3′端に翻訳終
止信号を付け加える。 リボゾーム結合部位を含む5′端非翻訳領域 リボゾーム結合部位（以下SD配列と称す）
を含む5′端非翻訳領域のDNAを下記の条件
を満す様に合成する。 (A) プロモーターから適当な距離をおいて
SD配列が配置される様にする。 (B) 合成SD配列は天然に存在するSD配列と
共通な塩基配列を有する部分を持ちかつ適
当な長さのヌクレオチド配列である様にす
る。 (C) SD配列から適当な距離をおいて翻訳開
始信号が配置される様にする。 遺伝子全体 SD配列を含む5′端非翻訳領域及び翻訳開
始、翻訳終止信号を含む構造遺伝子からなる
ヒトリゾチーム遺伝子は (A) プラズミドへの組込み、プラスミドから
の切り出しを容易にするため5′、3′両端に
制限酵素認識配列をもたせる。 (B) 形質転換体の検索を容易にするため遺伝
子内に一つ又は二つ以上の制限酵素認識配
列をもたせる。 (C) 翻訳開始信号から始まる構造遺伝子部分
のみの利用も可能にするため翻訳開始信号
の直前で遺伝子を切断できる様に制限酵素
認識配列をもたせる。 ことが望ましい。 この様にして設計された構造遺伝子の一具体例
は下記のヌクレオチド配列式(1)で表わされる遺伝
子であり、同遺伝子を適当な発現ベクターに組込
む事により大腸菌で発現させる事が可能である。 ヌクレオチド配列式 (1)
【表】
【表】
前記のヌクレオチド配列式(1)で表わされる構造
遺伝子に前記のリボゾーム結合部位を含む5′端非
翻訳領域のヌクレオチド配列及び翻訳終止信号を
含む3′端の制限酵素認識配列を付加した一例が下
記のヌクレオチド配列式(2)で表わされる遺伝子で
あり、同遺伝子は翻訳開始信号、翻訳終止信号及
びSD配列を自からの内に含んでいるため大腸菌
に於いて使用し得る発現ベクターの制限がより少
なくなつている。また同遺伝子を、例えばCla
等の適当な制限酵素（後記の表１を参照）で処理
して適当な発現ベクターに挿入する事も可能であ
る。 ヌクレオチド配列式 (2)
遺伝子に前記のリボゾーム結合部位を含む5′端非
翻訳領域のヌクレオチド配列及び翻訳終止信号を
含む3′端の制限酵素認識配列を付加した一例が下
記のヌクレオチド配列式(2)で表わされる遺伝子で
あり、同遺伝子は翻訳開始信号、翻訳終止信号及
びSD配列を自からの内に含んでいるため大腸菌
に於いて使用し得る発現ベクターの制限がより少
なくなつている。また同遺伝子を、例えばCla
等の適当な制限酵素（後記の表１を参照）で処理
して適当な発現ベクターに挿入する事も可能であ
る。 ヌクレオチド配列式 (2)
【表】
【表】
【表】
(2) 遺伝子の合成
上記のように設計した遺伝子を合成するには、
＋，−両鎖のそれぞれについて、これをいくつか
のフラグメントに分けて、それらを化学的に合成
し各々のフラグメントを連結する方法によれば良
い。 各鎖は11〜19塩基からなり各々が少くとも６塩
基づつ重なる様に56個程度のフラグメントに分け
るのが好ましい。 フラグメントの合成、精製、5′−水酸基のリン
酸化及びフラグメントの連結はそれ自体公知の方
法に従つて行う事ができる。具体的事項に関して
は後記の実施例を参照されたい。 ２ 組換えプラズミドの調製 (1)ヒトリゾチーム遺伝子のプラズミドベクター
への導入 前記の様にして合成したヒトリゾチーム遺
伝子を宿主内で増殖可能なプラズミドベクタ
ー又は宿主内で増殖、発現が可能な様に構成
されたプラズミドベクターの適当な挿入部位
に組込む。 組込み操作そのものは分子生物学の分野で
公知の常法に従つて行うことができる。具体
的な方法については後記の実施例を参照され
たい。 本発明によるヒトリゾチーム遺伝子の増殖
はpBR322，pAT153（例えばTwiggら、
Nature，283，216〜218（1980）参照）等の
公知の種々のプラズミドベクターを用いて行
う事ができる。また、プラズミドDNAの単
離精製も分子生物学の分野で公知の常法に従
つて行う事ができる。 本発明遺伝子によるヒトリゾチームの直接
発現は宿主細胞によつて適宜の方法をとり得
るが大腸菌に於いてはlacプロモーター（例
えばFuller，Gene，，19，48〜54（1982）参
照〕、trpプロモーター（例えばWindassら、
Nucleic Acids Res.，10，6839〜6657
（1982）参照）、tacプロモーター（例えば
Boyerら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA.80，21
〜25（1983）参照）、Ｐプロモーター（例えば
deHasethら、Nucleic Acids Res.，11，
773〜787，（1983）参照）、PLプロモーター
（例えばDeromら、Gene，17，45〜54（1982）
参照）及び1ppプロモーター（例えば
Nakamuraら、EMBOJ１771〜775（1982）
参照）等を有する公知の種々の発現ベクター
（例えば中村、化学と生物2047〜58（1982）及
びManiatisらMolecular Cloning 403〜433
（1982）参照）を用いて行うことができる。 これらの発現ベクターのうちの一具体例は
pMY12−６ Amp−１及びpSM240である。 pMY12−６ Amp−１はpMY12−６（例
えばTsurimotoら、Mol.Gen.Genet.18779〜
86（1982）参照）とpBV234（例えばOhtsubo
ら、Gene20245〜254（1982）参照）とから以
下のようにして造成する事ができる。 pBV234をPstで切断しアンピシリン耐
性遺伝子の一部を含む約2.6Kbpの断片をと
り出し、pMY12−６のPst切断部位にアン
ピシリン耐性遺伝子が再生する様に挿入して
pMY12−6Ampを得る。pMY12−6AmPを
BamHで限定分解した後、その粘着末端
をDNAポリメラーゼ（クレノーフラグメン
ト）を用いて修復し、DMAリガーゼで連結
して、pBV23.4由来のDNA断片中に含まれ
るBamH切断部位のみが消失したpMY12
−6Amp−１を得る。 pSM240はpDR540（例えばRussellら、
Gene20231〜248（1982）参照）及びpIN−
−A1（例えばMasuiら、Biotechnology２81
〜85（1984）参照）から造成する事ができ、
pDR540のBamH及びPst部位間のtacプ
ロモーターを含約1.2Kbp断片とpIN−−
A1のBamH及びPst部位間のlaci遺伝子
を含む約6.2Kbp断片を連結する事によつて
造成する事ができる。 具体的には実施例及び図面２を参照された
い。 (2)方向性の判定 プラズミドに組込まれたヒトリゾチーム遺
伝子の方向性の判定は遺伝子内に含まれる特
定の塩基配列を認識する制限酵素（例えば、
Cla，BStE，Xba等であり、後記の表
１を参照されたい） でその部位を切断し、遺伝子外の特定部位を
別の制限酵素を用いて切断して、得られた断
片のサイズをアガロースゲル電気泳動等の通
常用いられている方法で分析する事により行
う事ができる。 ８ 形質転換 (1) 宿主菌 ヒトリゾチーム遺伝子を組込んだ組換えプ
ラズミドを用いて形質転換させる宿主細胞の
大腸菌での一具体例はE.coli C600（例えば
NelsonらVirology108338〜350（1981）参照）
である。 ヒトリゾチーム遺伝子を組込んだ組換えプ
ラスミドによる形質転換は上記の宿主に限定
されるものではなく、公知の種々のE.coli
Ｋ−12株誘導体（例えばBachmann，
Bacteriol.Rev.36525〜557（1972）参照）を
使用することができる。 これらのE.coli Ｋ−12株誘導体の多くの
ものは公認の微生物機関、例えばAmerican
Type Culture Collection（ATCC），に寄託
されておりそこから分譲が可能である（例え
ばATCCカタログ参照）。 また分子生物学の分野で公知の如く、適当
なベクターを選べばより広範囲の細菌種より
適当な宿主を選択する事も可能である。 (2) 形質転換 形質転換操作そのものは、分子生物学の分
野で公知の常法に従つて行う事ができる。
（例えばCohenら、Rroc.Natl.Acad.Sci.USA
692110〜2114（1972）及びManiatisら、
Molecular Cloning 249〜253（1982）参照）。 (3) 形質転換体 大腸菌に於ける形質転換体の具体例は、E.
coli C600をpPLHLY−１、又はpTCHLY
−１で形質転換させて得た形質転換体であつ
て、本発明ではそれらをE.coliC600
（pPLHLY−１），E.coliC600（pTCHLY−
１）と命名した。 ４ ヒトリゾチームの生産 この様にして得た形質転換体を分子生物学及
び発酵学の分野で公知の常法に従つて培養すれ
ばヒトリゾチームが生産される。 ヒトリゾチーム遺伝子の発現は、試験管内無
細胞タンパク質合成系（例えばZubay，
Methods in Enzymology 65856（1980）参
照）及びMaxicell法（例えばSancarら、J.
Mol.Biol.148 45（1981）参照）等の公知の方
法を用いて確認する事ができる。 ヒトリゾチームは公知のラジオイムノアツセ
イ（例えばYuzurihaらChem.Pharm.Bull.27
2802〜2806（1979）及びYuzurihaらChem.
Pharm.Bull.26 908〜914（1978）参照）、酵素
活性測定法（例えばSidhanら、Agric.Biol.
Chem.45 1817〜1828（1981）及びMorsky
Anal.Biochem.128 77〜85（1983）参照）等を
用いて検出、定量することができる。 また生産したヒトリゾチームは生化学及び醗
酵学の分野で公知の常法を適宜組合わせて回
収、精製することができる。 具体的事項に関しては後記の実施例を参照さ
れたい。 実施例 ヒトリゾチーム遺伝子の設計 下記の表１に示した塩基配列の遺伝子を設計し
た。設計の手順は下記の通りである。 (1) コドンの選定 ヒトリゾチーム構造遺伝子のコドンを表１に
示した通りに選ぶ。 (2) 構造遺伝子の5′端に翻訳開始コドンATGを
付加し、3′端に２個の翻訳終止コドン（TAA
及びTGA）を付加する。 (3) ATGの上流にmRNAのリボゾーム結合部位
に対応する配列を含み、同時に翻訳開始コドン
ATGの直前にCla認識配列が配置される様な
配列 GTTAGGAGTTTAATCGを付加する。 (4) BamH認識配列の粘着末端に相当する配
列を5′端にSau3A認識配列の粘着末端に相当
する配列を3′端に付加する。 以上の様にして設計された遺伝子は、構造遺伝
子内部にCla，Taq，Bal，Hae，Mbo
，BstE，Msp，Hinf，Alu，Hpa，
Hph，Xba，Nar，Hinc，BstN，
EcoR，Bbe，Hpa，Hga及びDde認
識配列を含むものである。
＋，−両鎖のそれぞれについて、これをいくつか
のフラグメントに分けて、それらを化学的に合成
し各々のフラグメントを連結する方法によれば良
い。 各鎖は11〜19塩基からなり各々が少くとも６塩
基づつ重なる様に56個程度のフラグメントに分け
るのが好ましい。 フラグメントの合成、精製、5′−水酸基のリン
酸化及びフラグメントの連結はそれ自体公知の方
法に従つて行う事ができる。具体的事項に関して
は後記の実施例を参照されたい。 ２ 組換えプラズミドの調製 (1)ヒトリゾチーム遺伝子のプラズミドベクター
への導入 前記の様にして合成したヒトリゾチーム遺
伝子を宿主内で増殖可能なプラズミドベクタ
ー又は宿主内で増殖、発現が可能な様に構成
されたプラズミドベクターの適当な挿入部位
に組込む。 組込み操作そのものは分子生物学の分野で
公知の常法に従つて行うことができる。具体
的な方法については後記の実施例を参照され
たい。 本発明によるヒトリゾチーム遺伝子の増殖
はpBR322，pAT153（例えばTwiggら、
Nature，283，216〜218（1980）参照）等の
公知の種々のプラズミドベクターを用いて行
う事ができる。また、プラズミドDNAの単
離精製も分子生物学の分野で公知の常法に従
つて行う事ができる。 本発明遺伝子によるヒトリゾチームの直接
発現は宿主細胞によつて適宜の方法をとり得
るが大腸菌に於いてはlacプロモーター（例
えばFuller，Gene，，19，48〜54（1982）参
照〕、trpプロモーター（例えばWindassら、
Nucleic Acids Res.，10，6839〜6657
（1982）参照）、tacプロモーター（例えば
Boyerら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA.80，21
〜25（1983）参照）、Ｐプロモーター（例えば
deHasethら、Nucleic Acids Res.，11，
773〜787，（1983）参照）、PLプロモーター
（例えばDeromら、Gene，17，45〜54（1982）
参照）及び1ppプロモーター（例えば
Nakamuraら、EMBOJ１771〜775（1982）
参照）等を有する公知の種々の発現ベクター
（例えば中村、化学と生物2047〜58（1982）及
びManiatisらMolecular Cloning 403〜433
（1982）参照）を用いて行うことができる。 これらの発現ベクターのうちの一具体例は
pMY12−６ Amp−１及びpSM240である。 pMY12−６ Amp−１はpMY12−６（例
えばTsurimotoら、Mol.Gen.Genet.18779〜
86（1982）参照）とpBV234（例えばOhtsubo
ら、Gene20245〜254（1982）参照）とから以
下のようにして造成する事ができる。 pBV234をPstで切断しアンピシリン耐
性遺伝子の一部を含む約2.6Kbpの断片をと
り出し、pMY12−６のPst切断部位にアン
ピシリン耐性遺伝子が再生する様に挿入して
pMY12−6Ampを得る。pMY12−6AmPを
BamHで限定分解した後、その粘着末端
をDNAポリメラーゼ（クレノーフラグメン
ト）を用いて修復し、DMAリガーゼで連結
して、pBV23.4由来のDNA断片中に含まれ
るBamH切断部位のみが消失したpMY12
−6Amp−１を得る。 pSM240はpDR540（例えばRussellら、
Gene20231〜248（1982）参照）及びpIN−
−A1（例えばMasuiら、Biotechnology２81
〜85（1984）参照）から造成する事ができ、
pDR540のBamH及びPst部位間のtacプ
ロモーターを含約1.2Kbp断片とpIN−−
A1のBamH及びPst部位間のlaci遺伝子
を含む約6.2Kbp断片を連結する事によつて
造成する事ができる。 具体的には実施例及び図面２を参照された
い。 (2)方向性の判定 プラズミドに組込まれたヒトリゾチーム遺
伝子の方向性の判定は遺伝子内に含まれる特
定の塩基配列を認識する制限酵素（例えば、
Cla，BStE，Xba等であり、後記の表
１を参照されたい） でその部位を切断し、遺伝子外の特定部位を
別の制限酵素を用いて切断して、得られた断
片のサイズをアガロースゲル電気泳動等の通
常用いられている方法で分析する事により行
う事ができる。 ８ 形質転換 (1) 宿主菌 ヒトリゾチーム遺伝子を組込んだ組換えプ
ラズミドを用いて形質転換させる宿主細胞の
大腸菌での一具体例はE.coli C600（例えば
NelsonらVirology108338〜350（1981）参照）
である。 ヒトリゾチーム遺伝子を組込んだ組換えプ
ラスミドによる形質転換は上記の宿主に限定
されるものではなく、公知の種々のE.coli
Ｋ−12株誘導体（例えばBachmann，
Bacteriol.Rev.36525〜557（1972）参照）を
使用することができる。 これらのE.coli Ｋ−12株誘導体の多くの
ものは公認の微生物機関、例えばAmerican
Type Culture Collection（ATCC），に寄託
されておりそこから分譲が可能である（例え
ばATCCカタログ参照）。 また分子生物学の分野で公知の如く、適当
なベクターを選べばより広範囲の細菌種より
適当な宿主を選択する事も可能である。 (2) 形質転換 形質転換操作そのものは、分子生物学の分
野で公知の常法に従つて行う事ができる。
（例えばCohenら、Rroc.Natl.Acad.Sci.USA
692110〜2114（1972）及びManiatisら、
Molecular Cloning 249〜253（1982）参照）。 (3) 形質転換体 大腸菌に於ける形質転換体の具体例は、E.
coli C600をpPLHLY−１、又はpTCHLY
−１で形質転換させて得た形質転換体であつ
て、本発明ではそれらをE.coliC600
（pPLHLY−１），E.coliC600（pTCHLY−
１）と命名した。 ４ ヒトリゾチームの生産 この様にして得た形質転換体を分子生物学及
び発酵学の分野で公知の常法に従つて培養すれ
ばヒトリゾチームが生産される。 ヒトリゾチーム遺伝子の発現は、試験管内無
細胞タンパク質合成系（例えばZubay，
Methods in Enzymology 65856（1980）参
照）及びMaxicell法（例えばSancarら、J.
Mol.Biol.148 45（1981）参照）等の公知の方
法を用いて確認する事ができる。 ヒトリゾチームは公知のラジオイムノアツセ
イ（例えばYuzurihaらChem.Pharm.Bull.27
2802〜2806（1979）及びYuzurihaらChem.
Pharm.Bull.26 908〜914（1978）参照）、酵素
活性測定法（例えばSidhanら、Agric.Biol.
Chem.45 1817〜1828（1981）及びMorsky
Anal.Biochem.128 77〜85（1983）参照）等を
用いて検出、定量することができる。 また生産したヒトリゾチームは生化学及び醗
酵学の分野で公知の常法を適宜組合わせて回
収、精製することができる。 具体的事項に関しては後記の実施例を参照さ
れたい。 実施例 ヒトリゾチーム遺伝子の設計 下記の表１に示した塩基配列の遺伝子を設計し
た。設計の手順は下記の通りである。 (1) コドンの選定 ヒトリゾチーム構造遺伝子のコドンを表１に
示した通りに選ぶ。 (2) 構造遺伝子の5′端に翻訳開始コドンATGを
付加し、3′端に２個の翻訳終止コドン（TAA
及びTGA）を付加する。 (3) ATGの上流にmRNAのリボゾーム結合部位
に対応する配列を含み、同時に翻訳開始コドン
ATGの直前にCla認識配列が配置される様な
配列 GTTAGGAGTTTAATCGを付加する。 (4) BamH認識配列の粘着末端に相当する配
列を5′端にSau3A認識配列の粘着末端に相当
する配列を3′端に付加する。 以上の様にして設計された遺伝子は、構造遺伝
子内部にCla，Taq，Bal，Hae，Mbo
，BstE，Msp，Hinf，Alu，Hpa，
Hph，Xba，Nar，Hinc，BstN，
EcoR，Bbe，Hpa，Hga及びDde認
識配列を含むものである。
【表】
【表】
【表】
フラグメントの化学合成
前記のようにして設計したヒトリゾチーム遺伝
子は、表−２に示す56個のフラグメントに分けて
合成した。 これらのオリゴヌクレオチドフラグメントは公
知の方法（例えば、Itakuraら、Nucleic.Acids
Res.101755（1982）参照）に準じ固相合成法によ
り合成した。 ヌクレオシドを導入した架橋度１％のポリスチ
レン樹脂は市販のパツケム社製のものを用いた。 完全に保護したジヌクレオチドは市販の日本ゼ
オン社製、ヤマサ社製及び公知の方法（例えば
Gaitら、Nucleic Acids Res ９ 1691（1981）
参照）に準じ自ら合成したものを用いた。 オリゴヌクレオチドフラグメントの合成法をペ
ンタデカヌクレオチド GpApTpCpCpGpTpTpApGpGpApGpTpTの
合成の場合について述べれば下記の通りである。 完全に保護したチミジン4μmolをリンカーを介
して結合したポリスチレン樹脂40mgを1M臭化亜
鉛を含む塩化メチレン：イソプロパノール（85：
15，ｖ／ｖ）溶液１mlでジメトキシトリチルカチ
オンの赤色がほぼ生じなくなるまで30秒間ずつ６
回ないし７回処理することにより5′水酸基のジメ
トキシトリチル保護基を除去した。次に完全に保
護したジヌクレオチドGpTp（以下保護基を省略
して略記する）25mgをトリエチルアミン：ピリジ
ン（１：１，ｖ／ｖ）溶液２mlで室温１時間処理
して3′端リン酸のシアノエチル基を除去し、ピリ
ジンと共沸することにより水分を除去した後、
２，４，６−トリメチルベンゼンスルホニル−３
−ニトロトリアゾリド30mg存在下無水ピリジン
0.2ml中で上記のポリスチレン樹脂に導入したチ
ミジンと40℃、30分間縮合させた。 ピリジン２mlを樹脂を洗浄後、50mgのジメチル
アミノピリジンを含むピリジン−無水酢酸（９：
１，ｖ／ｖ）溶液１mlで処理して未反応のチミジ
ンの5′位水酸基をアセチル化した。 以下完全に保護したジヌクレオチドとして
GpAp，ApGp，TpTp，CpGp，TpCp及び
GpAp各々25mgを順次使用し、脱ジメトキシトリ
チル化と縮合反応を繰返すことにより保護したペ
ンタデカマーを合成した。 最終縮合後樹脂をピリジン２mlを洗浄し、次い
で0.5Mピリジンアルドキシム及びテトラメチル
グアニジンを含む90％ピリジン水１mlで40℃、１
日間処理してオリゴマーを樹脂から切り離し、28
％アンモニア水３mlで60℃、４時間処理すること
により5′端のジメトキシトリチル基以外はすべて
脱保護されたペンタデカマーを得た。同ペンタデ
カマーを高速液体クロマトグラフイーで逆相系担
体（Cosmosil 5C18：半井化学社製）を用い
0.1M酢酸−トリエチルアミン緩衝液（PH6.5）中
アセトニトリルの直線濃度勾配による溶出にて精
製した。 上記精製液を減圧留去にて約500μに濃縮し
た後、最終濃度80％となるように氷酢酸を加え、
室温15分間処理することによりジメトキシトリチ
ル基を除去した。これを上記の方法により高速液
体クロマトグラフイーで精製し、10 OD260単位
の完全に脱保護したペンタデカマーを得た。 同様の方法で表−２に示した他の55個のフラグ
メントを合成した。
子は、表−２に示す56個のフラグメントに分けて
合成した。 これらのオリゴヌクレオチドフラグメントは公
知の方法（例えば、Itakuraら、Nucleic.Acids
Res.101755（1982）参照）に準じ固相合成法によ
り合成した。 ヌクレオシドを導入した架橋度１％のポリスチ
レン樹脂は市販のパツケム社製のものを用いた。 完全に保護したジヌクレオチドは市販の日本ゼ
オン社製、ヤマサ社製及び公知の方法（例えば
Gaitら、Nucleic Acids Res ９ 1691（1981）
参照）に準じ自ら合成したものを用いた。 オリゴヌクレオチドフラグメントの合成法をペ
ンタデカヌクレオチド GpApTpCpCpGpTpTpApGpGpApGpTpTの
合成の場合について述べれば下記の通りである。 完全に保護したチミジン4μmolをリンカーを介
して結合したポリスチレン樹脂40mgを1M臭化亜
鉛を含む塩化メチレン：イソプロパノール（85：
15，ｖ／ｖ）溶液１mlでジメトキシトリチルカチ
オンの赤色がほぼ生じなくなるまで30秒間ずつ６
回ないし７回処理することにより5′水酸基のジメ
トキシトリチル保護基を除去した。次に完全に保
護したジヌクレオチドGpTp（以下保護基を省略
して略記する）25mgをトリエチルアミン：ピリジ
ン（１：１，ｖ／ｖ）溶液２mlで室温１時間処理
して3′端リン酸のシアノエチル基を除去し、ピリ
ジンと共沸することにより水分を除去した後、
２，４，６−トリメチルベンゼンスルホニル−３
−ニトロトリアゾリド30mg存在下無水ピリジン
0.2ml中で上記のポリスチレン樹脂に導入したチ
ミジンと40℃、30分間縮合させた。 ピリジン２mlを樹脂を洗浄後、50mgのジメチル
アミノピリジンを含むピリジン−無水酢酸（９：
１，ｖ／ｖ）溶液１mlで処理して未反応のチミジ
ンの5′位水酸基をアセチル化した。 以下完全に保護したジヌクレオチドとして
GpAp，ApGp，TpTp，CpGp，TpCp及び
GpAp各々25mgを順次使用し、脱ジメトキシトリ
チル化と縮合反応を繰返すことにより保護したペ
ンタデカマーを合成した。 最終縮合後樹脂をピリジン２mlを洗浄し、次い
で0.5Mピリジンアルドキシム及びテトラメチル
グアニジンを含む90％ピリジン水１mlで40℃、１
日間処理してオリゴマーを樹脂から切り離し、28
％アンモニア水３mlで60℃、４時間処理すること
により5′端のジメトキシトリチル基以外はすべて
脱保護されたペンタデカマーを得た。同ペンタデ
カマーを高速液体クロマトグラフイーで逆相系担
体（Cosmosil 5C18：半井化学社製）を用い
0.1M酢酸−トリエチルアミン緩衝液（PH6.5）中
アセトニトリルの直線濃度勾配による溶出にて精
製した。 上記精製液を減圧留去にて約500μに濃縮し
た後、最終濃度80％となるように氷酢酸を加え、
室温15分間処理することによりジメトキシトリチ
ル基を除去した。これを上記の方法により高速液
体クロマトグラフイーで精製し、10 OD260単位
の完全に脱保護したペンタデカマーを得た。 同様の方法で表−２に示した他の55個のフラグ
メントを合成した。
【表】
【表】
【表】
リン酸化及びフラグメントの連結反応
上記の化学合成した56個のフラグメントを表１
に示した如くＡ〜Ｉの９つのブロツクに分け、各
ブロツクを連結し、さらに（Ａ〜Ｃ）、（Ｄ〜Ｆ）
及び（Ｇ〜Ｉ）の各ブロツクを連結した後、（Ａ
〜Ｃ）、（Ｄ〜Ｆ）及び（Ｇ〜Ｉ）ブロツクを連結
して全体のヒトリゾチーム遺伝子を合成した。56
個のフラグメントのうち両端に当るHLY−１及
びHLY−56を除く54個のフラグメントをＡ〜Ｉ
の各ブロツクごとにまとめて、その5′端の水酸基
をリン酸化し、ひきつづいて連結反応を行つた。 リン酸化及び連結反応の詳細を表１のブロツク
Ａの場合について述べれば下記の通りである。 リン酸化を行う８個のフラグメント （HLY−２〜HLY−９）各2μｇの混合物を
8.4単位のT4ポリヌクレオチドキナーゼ、35pmol
の〔γ−32p〕ATP（2900Ci／mmol）、1mMスペ
ルミジン、50mMジチオスレイトール（DTTと
略記）、100mMMgCl2，500mMTris−HCl（PH
7.5）及び1mMEDTAを含む70μの反応液中で
37℃，60分間インキユベートした。次に65℃で10
分間インキユベートした後氷冷した。 フラグメントHLY−１ 2μｇを加え
20mMTris−HCl（PH7.5）及び10mMMgCl2とな
るように1MTris−Hcl（PH7.5）及び1MMgCl2を
添加し65℃10分間インキユベートした後37℃、30
分間さらに室温（約25℃）、20分間静置した。 次に、ATP及びDTTを各々0.4mM及び10mM
となるように加え11℃で10分間インキユベートし
た後22単位のT4リガーゼを加え11℃で12時間反
応させ連結させた。 反応終了後フエノール抽出、エタノール沈澱を
行いDNAを回収し50μのTE緩衝液
（10mMTris−HCl PH7.5，1mMEDTA）に溶解
して−20℃で保存した。 同様にしてHLY−10〜HLY−14よりブロツク
Ｂを、HLY−15〜HLY−18よりブロツクＣを、
HLY−19〜HLY−22よりブロツクＤを、HLY
−23〜HLY−26よりブロツクＥを、HLY−27〜
HLY−31よりブロツクＦを、HLY−32〜HLY
−38よりブロツクＧを、HLY−39〜HLY−47よ
りブロツクＨを、HLY−48〜HLY−56よりブロ
ツクを合成した。 ブロツクＡ，Ｂ及びＣの連結反応物のそれぞれ
半量（25μ）を混合しエタノール沈澱により回
収した後、ブロツクＡの連結反応に使用したもの
と同じ組成の反応液中で11℃、12時間反応させ
た。 15％ポリアクリルアミドゲル電気泳動で生成物
を分離して目的の（Ａ〜Ｃ）ブロツクを得た。 同様にしてブロツクＤ〜Ｆよりブロツク（Ｄ〜
Ｆ）を、ブロツクＧ〜Ｉよりブロツク（Ｇ〜Ｉ）
を合成した。 次にブロツク（Ａ〜Ｃ），（Ｄ〜Ｆ）及び（Ｇ〜
Ｉ）を混合し、これをブロツクＡの連結反応に使
用したものと同じ組成の反応液中で11℃、17時間
反応させ全長遺伝子を得た。この全長遺伝子を含
む連結反応混合物をそのままベクターとの結合反
応に使用した。 クローニング プラズミドpBR322 10μｇを10mMTris−HCl
（PH7.5）、50mMNaCl，10mMMgCl2及び50単位
の制限酵素BamHを含む50μの反応液中で37
℃、２時間インキユベートした後フエノール抽
出、エタノール沈澱を行つた。 このDNA3.5μｇと前述のHLY全長遺伝子を含
む連結反応混合物の半量とを混合し、20mMTris
−HClPH7.5、10mMMgCl2、0.4mMATP、
10mMDTT及び13単位のT4DNAリガーゼを含
む200μの反応溶中で11℃、13時間反応させた。 次にこの反応液を用いて大腸菌E.coliC600株を
形質転換し、アンピシリン抵抗性（40μｇ／ml）、
テトラサイクリン感受性（10μｇ／ml）の形質転
換体を得た。これらの形質転換体よりプラズミド
DNAを調製し、制限酵素開裂パターンの分析を
行つて、pBR322のBamH部位に合成ヒトリゾ
チーム遺伝子が図面１で示される様に挿入された
組換えプラズミド（以下このプラズミドをpHLY
−１と呼ぶ）を含む形質転換体を選び出した。 組換えプラズミドpHLY−１をSau 3A，
BamH／Hind及びBamH／Xbaで処理
し８％ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行つて
各々418bp、559bp及び205bpのフラグメントを単
離した。それぞれのヌクレオチド配列をMaxam
−Gilbert法（例えばMaxamら、Proc.Natl.
Acad.Sci.USA 74 560（1977）参照）で解析し
た結果pHLY−１のSau3A 418bpフラグメン
トは表１に示した計画通りのヌクレオチド配列で
あつた。 発現ベクターpSM240の調製 プラズミドpDR540 15μｇを 10mMTris−HCPH7.4、50mMNaCl、
10mMMgSO4，1mMDTT，50単位の制限酵素
BamH及び50単位の制限酵素Pstを含む50μ
の反応液中で37℃、２時間反応させた後１％ア
ガロースゲル電気泳動を行い、tacプロモーター
を含む約1.2Kbpの断片を回収した。 プラズミドPIN−−A118μｇを上記と全く同
様に処理してlacを含む約6.2Kbpの断片を回収
した。 上記のtacプロモーターを含む約1.2Kbp断片
160ngとlacを含む約6.2Kbp断片200ngを
20mMTris−HClPH7.6、10mMMgCl2、
10mMDTT、5mMATP及び３単位のT4DNAリ
ガーゼを含む20μの反応液中で16℃、15時間反
応して連結させた。 次にこの反応液を用いて大腸菌E.coli294株を
形質転換しアンピシリン（50ｇ／ml）抵抗性の形
質転換体を得た。 これらの形質転換体よりプラズミドDNAを調
製し、制限酵素開裂パターンの分析を行つて図面
２に示される様な発現ベクターpSM240を含む形
質転換体を選び出した。 発現用組換え体の作成 プラズミドpMY12−6Amp−120μｇを
10mMTris−HClPH7.5、50mMNaCl、
10mMMgCl2−及び40単位の制限酵素BamHを
含む40μの反応液中で37℃、２時間インキユベ
ートした後エタノール沈澱を行つた。 プラズミドPHHLY−１ 25μｇを10mMTris−
HClPH7.5、100mMNaCl、10mMMgCl2及び64単
位の制限酵素Sau3Aを含む100μの反応液中
で37℃、２時間インキユベートした後５％ポリア
クリルアミドゲル電気泳動を行い418bpの合成
HLY遺伝子を回収した。上記のpMY12−6Amp
−１ 0.2μｇ及びHLY遺伝子1.1μｇを66mMTris
−HClPH7.5、10mMMgCl2、10mMDTT、
3mMATP及び1.5単位のT4DNAリガーゼを含む
20μの反応液中で15℃、14時間反応させた。 次にこの反応液を用いて大腸菌E.coliC600株を
形質転換しアンピシリン抵抗性（80μｇ／mg）の
形質転換体を得た。 これらの形質転換体よりプラズミドDNAを調
製し、制限酵素開裂パターンを分析を行つて図面
３に示される様な組換えプラズミドpPLHLY−
１を含む形質転換体を選び出した。 この形質転換体をE.coliC600（PLHLY−１）
を命名した。 プラズミドpSM240を用いて上記と全く同様に
してそのBamH部位にHLY遺伝子を挿入しE.
coliC600株を形質転換した。 上記と同様にして図面３に示される様な組換え
プラズミドpTCHLY−１を含む形質転換体を選
び出した。 この形質転換体をE.coliC600（pTCHLY−１）
と命名した。 ヒトリゾチーム遺伝子の発現 ヒトリゾチーム遺伝子の発現を下記の方法によ
つて確認した。 (i) 試験管内無細胞タンパク質合成系による方法 無細胞タンパク質合成系及び標識アミノ酸は
各々Amersham社製の PROKARYOTIC DNA−DIRECTED TRANSLATION KIT及びＬ−〔35S〕−メ
チオニンを用い、方法は手順書の記載に従つて
以下のように実施した。 溶液２ 7.5μ、溶液３ 3μ及びＬ−
〔35S〕−メチオニン（33μCi）を混合し、この混
合液にテレプレートDNAとしてpMY12−
6Amp−１（〔Ｄ〕，〔Ｅ〕）又はpPLHLY−１
（〔Ｂ〕，〔Ｃ〕）を2.5μｇを加え、溶液５を総量
が25μになる様に添加した。 また同時にDNAを添加しない試料（〔Ｆ〕）
も対照として調製した。 次に溶液15μを加え28℃（〔Ｃ〕，〔Ｅ〕）又
は42℃（〔Ｂ〕，〔Ｄ〕，〔Ｆ〕）で60分間インキユ
ベートした後溶液75μを加えさらに５分間28
℃又は42℃でインキユベートした。 反応終了後、反応混合物を氷冷し、分子量マ
ーカー（〔Ａ〕）とともにLaemmliの方法
（Laemmli，Nature 227680（1970））に従つて
15％SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を
行いオートラジオグラフイーを行つた、その結
果を図面４に示した。 図面４に示した如く、テンプレートDNAと
してpPLHLY−１を用いた場合にのみ、ヒト
リゾチーム遺伝子産物と考えられる約14.7Kダ
ルトンの蛋白質バンドが検出された。 またこのバンドの強度は28℃で反応させた場
合に比べて42℃で反応させた場合に著しく増大
しており、温度で誘導可能なPLプロモーター
支配下の産物であると考えられた。 (ii) Maxicell法 E.coli CSR603株の形質転換は公知の常法
（掘内、細胞工学２ 832（1988））に従つて行
い、形質転換体は30℃で培養した。 E.coliCSR603（pMY12−6Amp−１）（〔Ａ〕，
〔Ｂ〕）及びE.coliCSR603（pPLHLY−１）
（〔Ｃ〕，〔Ｄ〕）を60μｇ／mlのアンピシリンを
含むＫ培地（１％カザミノ酸、0.1μｇ／mlチア
ミンを含むM9培地）５ml中で28℃で一夜培養
した。 この培養液を50mlのＫ培地に加え28℃で培養
しOD660＝0.2まで増殖させた。各々の培養液20
mlづつを２枚の滅菌シヤーレに移し、ゆるやか
に撹拌しながら紫外線ランプ（東芝製15W）直
下70cmの距離で７秒間（〔Ｂ〕，〔Ｄ〕）又は15秒
間（〔Ａ〕，〔Ｃ〕）照射した。 照射後、培養液を200mlの三角フラスコに移
し28℃２時間培養した。サイクロセリンを
100μｇ／mlになる様に加え28℃15時間培養し
た後2500rpm、10分間の遠心分離を行つて集菌
した。菌体を５mlのHershey saltで２回洗浄
後５mlのHershey培地に懸濁し28℃で１時間培
養した。 Ｌ−〔35S〕−メチオニンを50μCi／mlになるよ
うに加え42℃で１時間培養した後15Krpm、10
分間の遠心により集菌した。これを、分子量マ
ーカー（〔Ｅ〕）とともにLaemmliの方法に従
つて15％SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳
動を行いオートラジオグラフイーを行つた、そ
の結果を図面５に示した。 図面５に示した如く、E.coli CSR603
（pPLHLY−１）にのみヒトリゾチーム遺伝子
産物と考えられる約14.7Kダルトンの蛋白質バ
ンドが検出された。
に示した如くＡ〜Ｉの９つのブロツクに分け、各
ブロツクを連結し、さらに（Ａ〜Ｃ）、（Ｄ〜Ｆ）
及び（Ｇ〜Ｉ）の各ブロツクを連結した後、（Ａ
〜Ｃ）、（Ｄ〜Ｆ）及び（Ｇ〜Ｉ）ブロツクを連結
して全体のヒトリゾチーム遺伝子を合成した。56
個のフラグメントのうち両端に当るHLY−１及
びHLY−56を除く54個のフラグメントをＡ〜Ｉ
の各ブロツクごとにまとめて、その5′端の水酸基
をリン酸化し、ひきつづいて連結反応を行つた。 リン酸化及び連結反応の詳細を表１のブロツク
Ａの場合について述べれば下記の通りである。 リン酸化を行う８個のフラグメント （HLY−２〜HLY−９）各2μｇの混合物を
8.4単位のT4ポリヌクレオチドキナーゼ、35pmol
の〔γ−32p〕ATP（2900Ci／mmol）、1mMスペ
ルミジン、50mMジチオスレイトール（DTTと
略記）、100mMMgCl2，500mMTris−HCl（PH
7.5）及び1mMEDTAを含む70μの反応液中で
37℃，60分間インキユベートした。次に65℃で10
分間インキユベートした後氷冷した。 フラグメントHLY−１ 2μｇを加え
20mMTris−HCl（PH7.5）及び10mMMgCl2とな
るように1MTris−Hcl（PH7.5）及び1MMgCl2を
添加し65℃10分間インキユベートした後37℃、30
分間さらに室温（約25℃）、20分間静置した。 次に、ATP及びDTTを各々0.4mM及び10mM
となるように加え11℃で10分間インキユベートし
た後22単位のT4リガーゼを加え11℃で12時間反
応させ連結させた。 反応終了後フエノール抽出、エタノール沈澱を
行いDNAを回収し50μのTE緩衝液
（10mMTris−HCl PH7.5，1mMEDTA）に溶解
して−20℃で保存した。 同様にしてHLY−10〜HLY−14よりブロツク
Ｂを、HLY−15〜HLY−18よりブロツクＣを、
HLY−19〜HLY−22よりブロツクＤを、HLY
−23〜HLY−26よりブロツクＥを、HLY−27〜
HLY−31よりブロツクＦを、HLY−32〜HLY
−38よりブロツクＧを、HLY−39〜HLY−47よ
りブロツクＨを、HLY−48〜HLY−56よりブロ
ツクを合成した。 ブロツクＡ，Ｂ及びＣの連結反応物のそれぞれ
半量（25μ）を混合しエタノール沈澱により回
収した後、ブロツクＡの連結反応に使用したもの
と同じ組成の反応液中で11℃、12時間反応させ
た。 15％ポリアクリルアミドゲル電気泳動で生成物
を分離して目的の（Ａ〜Ｃ）ブロツクを得た。 同様にしてブロツクＤ〜Ｆよりブロツク（Ｄ〜
Ｆ）を、ブロツクＧ〜Ｉよりブロツク（Ｇ〜Ｉ）
を合成した。 次にブロツク（Ａ〜Ｃ），（Ｄ〜Ｆ）及び（Ｇ〜
Ｉ）を混合し、これをブロツクＡの連結反応に使
用したものと同じ組成の反応液中で11℃、17時間
反応させ全長遺伝子を得た。この全長遺伝子を含
む連結反応混合物をそのままベクターとの結合反
応に使用した。 クローニング プラズミドpBR322 10μｇを10mMTris−HCl
（PH7.5）、50mMNaCl，10mMMgCl2及び50単位
の制限酵素BamHを含む50μの反応液中で37
℃、２時間インキユベートした後フエノール抽
出、エタノール沈澱を行つた。 このDNA3.5μｇと前述のHLY全長遺伝子を含
む連結反応混合物の半量とを混合し、20mMTris
−HClPH7.5、10mMMgCl2、0.4mMATP、
10mMDTT及び13単位のT4DNAリガーゼを含
む200μの反応溶中で11℃、13時間反応させた。 次にこの反応液を用いて大腸菌E.coliC600株を
形質転換し、アンピシリン抵抗性（40μｇ／ml）、
テトラサイクリン感受性（10μｇ／ml）の形質転
換体を得た。これらの形質転換体よりプラズミド
DNAを調製し、制限酵素開裂パターンの分析を
行つて、pBR322のBamH部位に合成ヒトリゾ
チーム遺伝子が図面１で示される様に挿入された
組換えプラズミド（以下このプラズミドをpHLY
−１と呼ぶ）を含む形質転換体を選び出した。 組換えプラズミドpHLY−１をSau 3A，
BamH／Hind及びBamH／Xbaで処理
し８％ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行つて
各々418bp、559bp及び205bpのフラグメントを単
離した。それぞれのヌクレオチド配列をMaxam
−Gilbert法（例えばMaxamら、Proc.Natl.
Acad.Sci.USA 74 560（1977）参照）で解析し
た結果pHLY−１のSau3A 418bpフラグメン
トは表１に示した計画通りのヌクレオチド配列で
あつた。 発現ベクターpSM240の調製 プラズミドpDR540 15μｇを 10mMTris−HCPH7.4、50mMNaCl、
10mMMgSO4，1mMDTT，50単位の制限酵素
BamH及び50単位の制限酵素Pstを含む50μ
の反応液中で37℃、２時間反応させた後１％ア
ガロースゲル電気泳動を行い、tacプロモーター
を含む約1.2Kbpの断片を回収した。 プラズミドPIN−−A118μｇを上記と全く同
様に処理してlacを含む約6.2Kbpの断片を回収
した。 上記のtacプロモーターを含む約1.2Kbp断片
160ngとlacを含む約6.2Kbp断片200ngを
20mMTris−HClPH7.6、10mMMgCl2、
10mMDTT、5mMATP及び３単位のT4DNAリ
ガーゼを含む20μの反応液中で16℃、15時間反
応して連結させた。 次にこの反応液を用いて大腸菌E.coli294株を
形質転換しアンピシリン（50ｇ／ml）抵抗性の形
質転換体を得た。 これらの形質転換体よりプラズミドDNAを調
製し、制限酵素開裂パターンの分析を行つて図面
２に示される様な発現ベクターpSM240を含む形
質転換体を選び出した。 発現用組換え体の作成 プラズミドpMY12−6Amp−120μｇを
10mMTris−HClPH7.5、50mMNaCl、
10mMMgCl2−及び40単位の制限酵素BamHを
含む40μの反応液中で37℃、２時間インキユベ
ートした後エタノール沈澱を行つた。 プラズミドPHHLY−１ 25μｇを10mMTris−
HClPH7.5、100mMNaCl、10mMMgCl2及び64単
位の制限酵素Sau3Aを含む100μの反応液中
で37℃、２時間インキユベートした後５％ポリア
クリルアミドゲル電気泳動を行い418bpの合成
HLY遺伝子を回収した。上記のpMY12−6Amp
−１ 0.2μｇ及びHLY遺伝子1.1μｇを66mMTris
−HClPH7.5、10mMMgCl2、10mMDTT、
3mMATP及び1.5単位のT4DNAリガーゼを含む
20μの反応液中で15℃、14時間反応させた。 次にこの反応液を用いて大腸菌E.coliC600株を
形質転換しアンピシリン抵抗性（80μｇ／mg）の
形質転換体を得た。 これらの形質転換体よりプラズミドDNAを調
製し、制限酵素開裂パターンを分析を行つて図面
３に示される様な組換えプラズミドpPLHLY−
１を含む形質転換体を選び出した。 この形質転換体をE.coliC600（PLHLY−１）
を命名した。 プラズミドpSM240を用いて上記と全く同様に
してそのBamH部位にHLY遺伝子を挿入しE.
coliC600株を形質転換した。 上記と同様にして図面３に示される様な組換え
プラズミドpTCHLY−１を含む形質転換体を選
び出した。 この形質転換体をE.coliC600（pTCHLY−１）
と命名した。 ヒトリゾチーム遺伝子の発現 ヒトリゾチーム遺伝子の発現を下記の方法によ
つて確認した。 (i) 試験管内無細胞タンパク質合成系による方法 無細胞タンパク質合成系及び標識アミノ酸は
各々Amersham社製の PROKARYOTIC DNA−DIRECTED TRANSLATION KIT及びＬ−〔35S〕−メ
チオニンを用い、方法は手順書の記載に従つて
以下のように実施した。 溶液２ 7.5μ、溶液３ 3μ及びＬ−
〔35S〕−メチオニン（33μCi）を混合し、この混
合液にテレプレートDNAとしてpMY12−
6Amp−１（〔Ｄ〕，〔Ｅ〕）又はpPLHLY−１
（〔Ｂ〕，〔Ｃ〕）を2.5μｇを加え、溶液５を総量
が25μになる様に添加した。 また同時にDNAを添加しない試料（〔Ｆ〕）
も対照として調製した。 次に溶液15μを加え28℃（〔Ｃ〕，〔Ｅ〕）又
は42℃（〔Ｂ〕，〔Ｄ〕，〔Ｆ〕）で60分間インキユ
ベートした後溶液75μを加えさらに５分間28
℃又は42℃でインキユベートした。 反応終了後、反応混合物を氷冷し、分子量マ
ーカー（〔Ａ〕）とともにLaemmliの方法
（Laemmli，Nature 227680（1970））に従つて
15％SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を
行いオートラジオグラフイーを行つた、その結
果を図面４に示した。 図面４に示した如く、テンプレートDNAと
してpPLHLY−１を用いた場合にのみ、ヒト
リゾチーム遺伝子産物と考えられる約14.7Kダ
ルトンの蛋白質バンドが検出された。 またこのバンドの強度は28℃で反応させた場
合に比べて42℃で反応させた場合に著しく増大
しており、温度で誘導可能なPLプロモーター
支配下の産物であると考えられた。 (ii) Maxicell法 E.coli CSR603株の形質転換は公知の常法
（掘内、細胞工学２ 832（1988））に従つて行
い、形質転換体は30℃で培養した。 E.coliCSR603（pMY12−6Amp−１）（〔Ａ〕，
〔Ｂ〕）及びE.coliCSR603（pPLHLY−１）
（〔Ｃ〕，〔Ｄ〕）を60μｇ／mlのアンピシリンを
含むＫ培地（１％カザミノ酸、0.1μｇ／mlチア
ミンを含むM9培地）５ml中で28℃で一夜培養
した。 この培養液を50mlのＫ培地に加え28℃で培養
しOD660＝0.2まで増殖させた。各々の培養液20
mlづつを２枚の滅菌シヤーレに移し、ゆるやか
に撹拌しながら紫外線ランプ（東芝製15W）直
下70cmの距離で７秒間（〔Ｂ〕，〔Ｄ〕）又は15秒
間（〔Ａ〕，〔Ｃ〕）照射した。 照射後、培養液を200mlの三角フラスコに移
し28℃２時間培養した。サイクロセリンを
100μｇ／mlになる様に加え28℃15時間培養し
た後2500rpm、10分間の遠心分離を行つて集菌
した。菌体を５mlのHershey saltで２回洗浄
後５mlのHershey培地に懸濁し28℃で１時間培
養した。 Ｌ−〔35S〕−メチオニンを50μCi／mlになるよ
うに加え42℃で１時間培養した後15Krpm、10
分間の遠心により集菌した。これを、分子量マ
ーカー（〔Ｅ〕）とともにLaemmliの方法に従
つて15％SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳
動を行いオートラジオグラフイーを行つた、そ
の結果を図面５に示した。 図面５に示した如く、E.coli CSR603
（pPLHLY−１）にのみヒトリゾチーム遺伝子
産物と考えられる約14.7Kダルトンの蛋白質バ
ンドが検出された。
図面１は合成ヒトリゾチーム遺伝子のクローニ
ングを示した図である。図面２は発現用ベクター
pSM240の作成法を示した図である。図面３は発
現用組換えプラズミドpPLHLY−１及び
pTCHLY−１の作成法を示した図である。図面
４は及び図面５はヒトリゾチーム遺伝子の発現を
示した電気泳動の図である。
ングを示した図である。図面２は発現用ベクター
pSM240の作成法を示した図である。図面３は発
現用組換えプラズミドpPLHLY−１及び
pTCHLY−１の作成法を示した図である。図面
４は及び図面５はヒトリゾチーム遺伝子の発現を
示した電気泳動の図である。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 予定した宿主細胞内で増殖可能であつてかつ
挿入された遺伝子の転写、翻訳を可能にするプラ
スミドベクターの適当な挿入部位を化学的に合成
した下記のヌクレオチド配列で表される構造遺伝
子を含むヒトリゾチーム遺伝子を挿入して当該宿
主細胞中で増殖、発現可能な組み換えプラスミド
を作成し、該宿主細胞を形質転換して得られた形
質転換体を適当な培地中で培養し産生されたヒト
リゾチーム蛋白質を回収することからなるヒトリ
ゾチームの製造法。 【表】 【表】 ２ ヒトリゾチーム遺伝子が、構造遺伝子の5′端
及び3′端にそれぞれ翻訳開始信号ATG及び２個
の翻訳終止信号TAATGAを有するヒトリゾチー
ム遺伝子である特許請求の範囲第１項記載のヒト
リゾチーム製造法。 ３ ヒトリゾチーム遺伝子が、構造遺伝子の上流
にリボソーム結合部位に対応する配列を含み同時
に翻訳開始信号の直前に制限酵素Cla認識配列
が又5′端に制限酵素Sau3A認識配列が配置され
る様な配列
GATCCGTTAGGAGTTTAATCGATGを、下
流に翻訳終止信号を含み同時に3′端に制限酵素
Sau3A認識配列が配置される様な配列
TAATGATCを有するヒトリゾチーム遺伝子で
ある特許請求の範囲第１項記載のヒトリゾチーム
の製造法。 ４ 宿主細胞がエシエリシア属に属する大腸菌
（Esherichia coli）である特許請求の範囲第１項
記載のヒトリゾチームの製造法。 ５ 宿主細胞がエシエリシア属に属する大腸菌
（Esherichia coli）である特許請求の範囲第２項
記載のヒトリゾチームの製造法。 ６ 宿主細胞がエシエリシア属に属する大腸菌
（Esherichia coli）である特許請求の範囲第３項
記載のヒトリゾチームの製造法。 ７ プラスミドベクターがλフアージのPLプロ
モーターを含むプラスミドベクターである特許請
求の範囲第６項記載のヒトリゾチームの製造法。 ８ プラスミドベクターがpMY12−6Amp−１
である特許請求の範囲第７項記載のヒトリゾチー
ムの製造法。 ９ プラスミドベクターがpPLHLY−１である
特許請求の範囲８項記載のヒトリゾチームの製造
法。 １０ プラスミドベクターがtacプロモーターを
含むプラスミドベクターである特許請求の範囲６
項記載のヒトリゾチームの製造法。 １１ プラスミドベクターがpSM240である特許
請求の範囲１０項記載のヒトリゾチームの製造
法。 １２ プラスミドベクターがpTCHLY−１であ
る特許請求の範囲１１項記載のヒトリゾチームの
製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP20136684A JPS6178383A (ja) | 1984-09-26 | 1984-09-26 | ヒトリゾチ−ムの微生物学的製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP20136684A JPS6178383A (ja) | 1984-09-26 | 1984-09-26 | ヒトリゾチ−ムの微生物学的製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6178383A JPS6178383A (ja) | 1986-04-21 |
| JPH0559701B2 true JPH0559701B2 (ja) | 1993-08-31 |
Family
ID=16439862
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP20136684A Granted JPS6178383A (ja) | 1984-09-26 | 1984-09-26 | ヒトリゾチ−ムの微生物学的製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6178383A (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3540075A1 (de) * | 1985-11-12 | 1987-05-14 | Boehringer Ingelheim Int | Human-lysozym |
-
1984
- 1984-09-26 JP JP20136684A patent/JPS6178383A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS6178383A (ja) | 1986-04-21 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |