JPH0560357B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

〔産業上の利用分野〕 本発明はリン脂質の製造方法に関し、更に詳し
くは、微生物乾燥菌体により塩基構造が変換され
たリン脂質を製造する方法に関する。 リン脂質は、単に乳化剤に用い得るのみならず
リポソームの基材として薬剤運搬体、人工血液、
人工細胞、あるいは免疫診断等への応用が近年注
目されており、また、それ自体生理活性・薬理活
性を持つものとして、医学・薬学・工学分野等に
おいて様々な用途が考えられている。このような
多用な要求に対応するために、種々の用途に応じ
た構造を有するリン脂質を効率良く製造する方法
を開発することは、産業上非常に意義のあること
である。 〔従来の技術と発明が解決しようとする問題点〕 従来、このようなリン脂質を製造する方法とし
ては、キヤベツ由来あるいは微生物由来の種々の
精製ホスホリパーゼＤ酵素を直接あるいは固定化
等を行つて反応させる方法が提案されている（特
開昭63−36790、同63−36792、同63−91087）。し
かしながら、このような抽出酵素あるいは精製酵
素は酵素の製造プロセスのコストが高く、経済的
に大きな課題となつている。更に、酵素をセライ
ト等の担体に固定化する方法は反応物質が担体上
の酵素まで拡散しにくく、特に担体の細孔内に吸
着された酵素は反応には実質的に関与せず、有効
に働く酵素が減少する等の問題があり、企業化を
企てる上で大きな障害となつている。また、ゲル
化剤等により包括固定化法は固定化の操作が複雑
で、しかも拡散律速による反応速度の低下等の不
都合な点が多く、改善が望まれている。 本発明は、ホスホリパーゼＤを有する乾燥菌体
を直接反応を供すことにより、これらの欠点を改
善し、高収率で目的物が得られるリン脂質の塩基
交換反応法を提供することを目的とする。 〔問題点を解決するための手段〕 即ち、本発明は塩基構造が変換されたリン脂質
を製造するにあたり、原料リン脂質と水酸基を有
する受容体とを、ホスホリパーゼＤを有する放線
菌の乾燥菌体に接触させて反応を行うことを特徴
とするリン脂質の製造方法を内容とするものであ
る。 本発明において用いられる原料リン脂質として
は、ホスホリパーゼＤの基質となり得るものであ
れば、天然から抽出したもの、または抽出後精製
したもの、あるいは合成したものの如何を問わず
使用できる。また、市販のもの、あるいは公知の
方法で調製したものを使用してもよい。例えば、
脱脂大豆レシチン、卵黄レシチン、ホスフアチジ
ルコリン、ホスフアチジルエタノールアミン、ホ
スフアチジルセリン、ホスフアチジルグリセロー
ル等、またはそれらの混合物等が挙げられる。本
発明の効果を最大に発揮するためには、原料リン
脂質として精製したもの、ないしは組成の単純な
ものを用いた方が純粋な反応生成物が得られる面
で都合が良い。また、原料コストと入手の容易さ
及び酵素に対する反応性の面から、特にホスフア
チジルコリン、ホスフアチジルエタノールアミン
またはホスフアチジルセリンが工業的に効果が高
く好適である。 本発明における受容体としては、コリン、エタ
ノールアミン、セリン、Ｎ−メチルエタノールア
ミン、Ｎ、Ｎ−ジメチルエタノールアミンなどの
含窒素アルコール類やグリセロール、グルコー
ス、フラクトース等のポリオール、単糖類などを
挙げることができる。 反応は、原料リン脂質を溶解または懸濁させる
有機溶媒の存在下で行うことが好ましく、微生物
酵素を失活させることの少ない溶媒系であればい
ずれも使用できる。例えば石油エーテル、ジエチ
ルエーテル、メチルエチルエーテル、ジイソプロ
ピルエーテル、クロロホルム、ジクロロメタン、
四塩化炭素、ジクロロエタン、ｎ−ヘキサン、シ
クロヘキサン、ｎ−オクタン、イソオクタン、酢
酸エチル、ジオキサン、ベンゼン等の溶媒、また
はこれらの混合溶媒系、またはこれにアセトン、
アセトニトリル等の極性溶媒を混合した混合溶媒
系が挙げられる。ただし、アルコール類は目的反
応の基質となるため、基質として添加する以外に
用いることはあまり好ましくない。 本発明において用いられる放線菌としては、ホ
スホリパーゼＤを生成するものであれば全て用い
ることができるが、特にストレプトマイセス
（Streptomyces）属やストレプトバーチシリウム
（Streptoverticillium）属、ミクロモノスポラ
（Micromonospora）属、ノカルデイア
（Nocardia）属、ノカルデイオプシス
（Nocardiopsis）属、アクチノマヂユーラ
（Actinomadura）属等に属する微生物を挙げる
ことができる。より具体的には、ストレプトマイ
セス・クロモフアスカス（St・chromofuscus
IFO 12851）、ストレプトマイセス・メデイオシ
デカス（St.mediocidicus IFO 13202）、ストレ
プトマイセス・ラベンジユラエ（St.lavendulae
subsp.lavendulae IFO 12789）、ストレプトマイ
セス・プルニカラー（St.prunicolor IFO
13075）、ストレプトマイセス・アンチバイオテイ
カス（St.antibioticus IFO 12652）、ストレプト
バーチシリウム・グリゼオカルネウム（Stv.
griseocarneum IFO 12776）、ストレプトバーチ
シリウム・シンナモネウム（Stv.cinnamoneum
subsp.cinnamomeum IFO 12852）、ストレプト
バーチシリウム・ハチジヨーエンセ（Stv.
hachijoense IFO 12782）、ミクロモノスポラ・
チヤルセア（M.chalcea ATCC 12452）、ノカル
デイア・メデイテラーネイ（Nocardia
mediterranei IFO 13142）、ノカルデイオプシ
ス・ダソンビレイ（Nocardiopsis dassonvillei
IFO 13908）、アクチノマヂユーラ・リバノチカ
（Actinomadura libanotica IFO 14095）等が挙
げられ、これらの他にも公知の微生物が適用され
る。 上記微生物を反応の触媒として効率良く働かせ
るには、微生物内にホスホリパーゼＤを多量に含
有させる培養方法、および菌体内ホスホリパーゼ
Ｄを受容体と接触し易く、しかも活性をできるだ
け低下させない乾燥条件が重要となる。 培養に用いる倍地としては、微生物の培養に通
常用いられるのが広く使用され得る。炭素源とし
ては同化可能な炭素化合物、例えばブドウ糖、シ
ヨ糖、乳糖、麦芽糖、でんぷん、デキストリン、
糖蜜、グリセリン等や炭化水素類が使用される。
窒素源としては利用可能な窒素化合物であればよ
く、特にコーンスチープリカー、大豆粉、小麦グ
ルテン、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、麦芽
エキス、カゼイン加水分解物等の有機化合物が好
ましい。その他、リン酸塩、マグネシウウ、カル
シウム、カリウム、鉄、マンガン、亜鉛等の塩類
が必要に応じて使用される。 培養温度は菌が発育し、ホスホリパーゼＤを生
産する範囲内で適宜採用し得るが、通常15〜40℃
で培養される。培養時間は条件によつて異なり、
菌体内ホスホリパーゼＤ活性が最大となる時点で
培養を終了すればよく、通常は１〜６日程度であ
る。 また、本発明においては、多孔質体からなる微
生物保持体と共に培養を行い、該保持体に微生物
を付着・増殖させ、得られた菌体を使用すること
ができる。このような方法においては、保持体の
表層付近に生物膜状菌体が形成され、これによつ
てホスホリパーゼＤがより安定で、しかも連続生
産や繰返し回分生産などの有効な反応システムに
応用できるので、生産性が大幅に向上し極めて好
都合である。上記微生物保持体としては、微生物
の持つ粘着力、吸着力により微生物の吸着増殖を
可能ならしめる任意の材料が適用できる。例え
ば、高分子多孔質材料としては、ポリエチレン、
ポリプロピレンなどのポリオレフイン系；ブタジ
エンまたはイソプレンなどのジエン系；ポリ塩化
ビニル、ポリビニルアルコール、アクリルアミド
またはポリスチレンなどのビニル系重合体；ポリ
エーテル、ポリエステル、ポリカーボネートまた
はポリアミド等の縮合系；ポリウレタン、シリコ
ンおよびフツ素系樹脂などの材料、また無機材料
としては、セラミツク、ガラス、活性炭、および
多孔質金属や金属加工材料などが適用できる。い
ずれの材料においても該保持体に微生物を良好に
固定化させるため、空〓率が60〜90％、孔の径が
２〜2000μｍの範囲にある多孔質材料や、空〓率
が60〜99％である金属加工材料等を使用するのが
好ましい。 このような種々の保持体は、微生物の種類およ
び培養条件等によつて適宜選択でき、形状につい
ては例えば球状、ブロツク状あるいはシート状等
に加工して使用することができる。寸法について
は、微生物の種類、培養条件、反応器の種類等に
よつて適宜決定されるが、球状であれば直径が概
ね１〜100mm、ブロツク状のものであれば一辺が
概ね１〜100mmのものが使用される。また、微生
物を上記保持体に固定化させるには、通常公知の
回分、半回分、連続培養等を用いて容易に達成さ
れる。 上記の如く得られた菌体から水分を除去する方
法としては、原則的には酵素が失活しない温度
（40〜60℃）で乾燥すればよいが、単に水分を蒸
発させる方法では細胞組成の収縮が起こり非常に
堅くなり、組織内のホスホリパーゼＤと外界との
接触が断たれ活性を発現することが困難となる。
従つて、菌体を乾燥させることは細胞組織の収縮
を伴わない方法を採用しなければならない。この
ため、水溶性溶媒、例えばアセトンまたはメタノ
ール、エタノール、イソプロパノール等の低級ア
ルコール類中に菌体を浸して組織内を溶媒に置換
した後、溶媒を蒸発させる方法により、細胞組織
の収縮を抑えて乾燥菌体を得ることができる。こ
の場合、乾燥方法としては真空乾燥、凍結乾燥、
低温乾燥等の公知の乾燥法が使用できる。更に、
菌体を溶媒に浸す前に５重量％以下のグルタール
アルデヒド水溶液に浸して細胞組織を固定化する
ことにより、細胞組織の収縮をより効果的に抑え
ることができる。このような方法にて得られた菌
体の水分は、通常１〜20重量％の水分含量ゐ調製
される。 このようにして調製された乾燥菌体を反応物
質、即ち原料リン脂質と受容体の混合物中に懸濁
させ反応させるが、水と有機溶媒の比は水：有機
溶媒を重量比で１：0.5〜0.1：10の範囲で用いる
ことができるが、副反応によつて生じるホスフア
チジン酸の生成を極力防ぐためには水分を40重量
％以下に制御した方が好ましい。 反応温度は用いる菌体内酵素の適切温度であれ
ば良く、通常20〜60℃の範囲である。ただし、用
いる溶媒が低沸点のものである場合等には、この
限りではない。 反応時間については、回分の場合は概ね0.5〜
40時間、半回分法や連続法においても、この反応
条件に見合つた反応時間を設定することにより、
目的とする反応を行わせることができる。また反
応様式としては、容器に入れた溶媒中に微生物菌
体を分散、懸濁し接触反応させればよく、回転攪
拌や超音波による攪拌方法、カラムなどに充填す
る方法、気泡塔型反応器等によつて流動させる方
法等のあらゆる形式の反応様式が適用できる。 〔作用・効果〕 叙上の如き、乾燥菌体の調製法および条件によ
つて、始めて乾燥菌体をリン脂質の塩基交換反応
に使用することができ、このような菌体内酵素に
よつてリン脂質の塩基交換反応を成功させたのは
本発明が最初である。 本発明によれば、培養された微生物菌体の抽出
や精製工程を省略し、直接リン脂質の製造反応に
使用できるため、反応に使用する酵素のコストが
大幅に低減でき、高収率で所望のリン脂質を得る
ことができる。 更に、多孔質の微生物保持体に固定化された乾
燥菌体を使用すれば、菌体内のホスホリパーゼＤ
酵素がより効果的に安定化され、しかも連続ある
いは繰返し回分反応方法が適用できるので、生産
が著しく向上する。 〔実施例〕 以下、実施例に基づいて本発明を具体的に説明
するが、本発明はこれらに限定されるものではな
い。 なお、実施例１〜６においてはリン脂質の組成
分析、純度検定は薄層クロマトグラフイー
（TLC）にて行つた。展開溶媒としては、クロロ
ホルム−アセトン−メタノール−酢酸−水（50：
20：10：15：５）を用い、デイツトマー試薬を用
いて発色させ、デンシトメトリーにより生成物の
組成比を測定した。 また、実施例７〜10においては、リン脂質の組
成分析はイアトロスキヤンにより求めた。即ち、
クロマトロツドSII（ヤトロン社製シリカゲルロツ
ド）にクロロホルム−メタノール（２：１）によ
り抽出したリン脂質溶液をスポツトし、クロロホ
ルム−アセトン−メタノール−酢酸−水（6.5：
２：１：１：0.3）を展開溶媒として約10cm展開
し、イアトロスキヤン（ヤトロン社製イアトロス
キヤンTH−10）にかけ、ピーク面積比から重量
比を求めた。 実施例 １ ストレプトマイセス・クロモフアスカス
IFO12851を、グルコース１％（重量％、以下同
じ）肉エキス0.75％、ペプトン0.75％、NaCl0.3
％：MgSO0.1％を含む倍地（PH7.2）で、温度30
℃、約３日間通気培養した。得られた菌体を純水
で２回水洗し、ついて50％アセトン水溶液中に10
分間浸し、さらに100％アセトンに５分間浸した
後濾過し、次いで30℃にて真空乾燥した。かくし
て得られた乾燥菌体の水分含量は約５％であつ
た。 第１図に示す攪拌式反応器に、ホスフアチジル
コリン（旭化成工業株式会社）2.0ｇ、ジエチル
エーテル500ml、1Mエタノールアミン・塩酸バツ
フアー（PH6.0）100ml、乾燥菌体25ｇを加え30℃
にて２時間反応させた。反応終了後クロロホルム
にてリン脂質を抽出し分析した。 分析の結果、ホスフアチジルエタノールアミン
95％、ホスフアチジン酸４％、ホスフアチジルコ
リン１％であつた。 実施例 ２ エタノールアミンの代わりにグリセロールを70
ｍＭ加え、バツフアーとして1M酢酸バツフアー
（PH6.0）100mlを用いた以外の反応条件、操作条
件は実施例１と全く同様に行つた。 分析の結果、ホスフアチジルグリセロール90
％、ホスフアチジン酸５％、ホスフアチジルコリ
ン５％であつた。 実施例 ３ エタノールアミンの代わりにグルコースを150
ｍＭ加え、その他の反応条件、操作条件は実施例
２と全く同様に行つた。 分析の結果、ホスフアチジルグルコース75％、
ホスフアチジン酸12％、ホスフアチジルコリン13
％であつた。 実施例 ４ エタノールアミンの代わりにセリンを100ｍＭ
加え、その他の反応条件、操作条件は実施例２と
全く同様に行つた。 分析の結果、ホスフアチジルセリン85％、ホス
フアチジン酸10％、ホスフアチジルコリン５％で
あつた。 実施例 ５ 実施例１と同様の培地に、一辺４mmのブロツク
状のポリウレタンフオームからなる微生物保持体
（ブリジストン社製、エバーライトHR−40）を
100個／100ml培地となるように加えて培養し、微
生物保持体に菌体を固定化させた。固定化された
菌体は実施例１と同様に乾燥させ、乾燥菌体を調
製した。微生物保持体中の乾燥菌体量は概ね５
mg／個であつた。 実施例１で用いた反応器に乾燥菌体固定化され
た微生物保持体1000個を添加し、実施例１と同様
の反応条件にて反応させた。反応終了後、反応液
を全て抜き出し、再び新しい反応溶液を添加し、
同様の反応を繰返した。このような繰返し反応を
３回行つた。 それぞれの反応で得られた反応液からクロロホ
ルムにで抽出されたリン脂質を分析した。結果を
第１表に示す。

【表】

【表】 第１表から、微生物保持体の固定化された乾燥
菌体の酵素活性は安定で、繰返し使用が可能であ
ることがわかる。 実施例 ６ 実施例１で使用した微生物の代わりにストレプ
トバーチシリウム・シンナモネウムIFO12852を
使用した以外は、実施例１と全く同様の条件で反
応させた。 分析の結果、ホスフアチジルエタノールアミン
86％、ホスフアチジン酸12％、ホスフアジルコリ
ン２％であつた。 実施例 ７ ストレプトバーチシリウム・ハチジヨウエンセ
IFO 12782を、グルコース１％、肉エキス0.75
％、ペプトン0.75％、NaCl0.3％、MgSO₄0.1％
を含む培地（PH7.2）で、温度30℃で、約３日間
通気培養した。得られた菌体を純水で２回水洗
し、ついで50％アセトン水溶液中に10分間浸し、
さらに100％アセトン５分間浸した後濾過し、つ
いで30℃にて真空乾燥した。かくして得られた乾
燥菌体の水分含量は約５％であつた。 容量100mlの分液ロートにグリセロール４ｇ、
フオスフアチジルコリン（PC）200mg、ジエチル
エーテル10ml、0.2M酢酸バツフアー６ml（PH
5.6、0.04M−Caイオン含む）に乾燥菌体0.2ｇを
加え30℃にて７時間振盪器にて反応させた。反応
終了後、クロロホルム−メタノール−（２：１）
にてリン脂質を抽出し分析した。 分析の結果、ホスフアチジルグリセロール
（PG）81％、ホスフアチジン酸（PA）10％、ホ
スフアチジルコリン（PC）９％であつた。 実施例 ８ ストレプトバーチシリウム・ハンジヨウエンセ
IFO 12782の代わりにストレプトマイセス・クロ
モフアスカスIFO 12851、ミクロモノスポラ・チ
ヤルセア ATCC 12452、ノカルデイア・メデイ
テラーネイ IFO 13142、ノカルデイオプシス・
ダソンビレイ IFO 13908、アクチノマヂユー
ラ・リバノチカ IFO 14095を使用した以外は実
施例７と全く同様の操作を行つた。 分析結果は、第２表の通りである。

【表】 実施例 ９ グリセロールの代わりに(A)エタノールアミン60
mg、(B)グルコース500mg、および(C)Ｌ−セリン200
mgを使用した。(A)でバツフアーとして1Mエタノ
ールアミン・塩酸バツフアーを用いた以外は反応
条件、操作条件は実施例７と全く同様に行い、そ
れぞれホスフアチジルエタノールアミン（PE）、
ホスフアチジルグルコース（PGL）、ホスフアチ
ジルセリン（PS）を生産させた。 分析結果は第３表の通りである。

【表】 実施例 10 500ml振盪フラスコを用い、実施例１と同様の
培地100mlに一辺４mmのブロツク状のポリウレタ
ンフオームからなる微生物保持体（ブリジストン
社製、エバーライトHR−40）を100個加えて培
養し、微生物保持体に菌体を固定化させた。固定
化された菌体は実施例７と同様に乾燥させ、乾燥
菌体を調製した。微生物保持体中の乾燥菌体量は
概ね５mg／個であつた。 次いで、第２図に示した反応器に上記固定化さ
れた微生物保持体50個を入れ、実施例７と同様の
反応条件で反応させた。反応終了後、反応液を全
て抜出し、再び新しい反応溶液を添加させ同様の
反応を繰り返した。このような繰り返し反応を３
回行つた。 それぞれの反応で得られた反応液は第４表の通
りであつた。

【表】 第４表の結果から、微生物保持体に固定化され
た乾燥菌体の酵素活性は安定で繰り返し使用が充
分可能であることがわかる。

【図面の簡単な説明】

第１図及び第２図はそれぞれ実施例１及び実施
例10で用いた装置を示す概要図である。 １……攪拌式反応器、２……乾燥菌体、３……
ジヤケツト温水、４……反応器、５……ウオータ
ーバス、６……マグネチツクスターラー、７……
スターラー、８……微生物保持体。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 塩基構造が変換されたリン脂質を製造するに
   あたり、原料リン脂質と水酸基を有する受容体と
   を、ホスホリパーゼＤを有する放線菌の乾燥菌体
   に接触させて反応を行うことを特徴とするリン脂
   質の製造方法。 ２ 多孔質の微生物保持体に微生物が固定化され
   た乾燥菌体を用いる請求項１記載の製造方法。 ３ 放線菌がストレプトマイセス属、ストレプト
   バーチシリウム属、ミクロモノスポラ属、ノカル
   デイア属、ノカルデイオプシス属及びアクチノマ
   ヂユーラ属から選択される少なくとも１種である
   請求項２記載の製造方法。 ４ 乾燥菌体が、菌体を水溶性溶媒に浸して該菌
   体組織内を溶媒置換した後、該溶媒を蒸発させて
   得られたものである請求項１又は２記載の製造方
   法。