JPH0565159B2

JPH0565159B2 -

Info

Publication number: JPH0565159B2
Application number: JP11020885A
Authority: JP
Inventors: Sumitaka Kokusho; Akira Tsunoda; Shinjiro Iwasaki
Original assignee: Meito Sangyo KK
Current assignee: Meito Sangyo KK
Priority date: 1985-05-24
Filing date: 1985-05-24
Publication date: 1993-09-17
Also published as: JPS61268192A

Description

【発明の詳細な説明】

〔産業上の利用分野〕本発明は、糖類脂肪酸エステル化合物の製造
法、更に詳しくはリパーゼを用いて高収率で容易
に糖類脂肪酸エステルを製造する方法に関する。〔従来の技術〕化学的合成法にもとづく糖類脂肪酸エステルと
しては、しよ糖が高純度で安価に大量生産される
こともあつて、しよ糖脂肪酸エステルが工業的に
生産されている。現在、しよ糖脂肪酸エステルの
生産は有機合成法で行われており、その方法につ
いては、例えばシユネル法、ネブラスカ・シユネ
ル法、アメリカ農務省により開発されたUSDA
法など今日多数提案されているが、実用化されて
いる基本的方法はいづれもしよ糖と脂肪酸の低級
アルコールエステルとの高温でのエステル交換反
応である。一方、リパーゼの加水分解反応とは逆反応であ
るエステル合成能を利用し、酵素的に糖と脂肪酸
のエステルを合成することが試みられている。即ち、清野、内掘らは糖としてしよ糖、グルコ
ース、フラクトース、ソルビトールを、脂肪酸と
してオレイン酸、ステアリン酸を合成基質の対象
とし、リゾプス（Rhyzopus）、エンテロバクテリ
ウム（Enterobacterium）、アスペルギルス
（Aspergillus）、シユードモナス
（Pseudomonas）、クロモバクテリウム
（Chrmobacterium）、キヤンデイダ（Candida）、
ムコール（Mucor）、及びペニシリウム
（Penicillium）の生産するリパーゼを用いて水溶
媒系でのエステル合成を試みたことを報告してい
る〔J.Amer.Oil Chem.Soc.，61，（11），1761
（1984）〕。この報告によれば、極めて低い基質濃度、即ち
0.36〜1.7％の糖と2.26〜5.7％のオレイン酸とを
含む水溶液（PH5.4）にリパーゼを４ｇ／添加
し、40℃で72時間反応を行つたと記述している。
その結果、リパーゼとしてはキヤンデイダ・シリ
ンドラセ（Candida cylindracea）のリパーゼ
（リパーゼMY）が良く、それよりは劣るがシユ
ードモナス（Pseudomonas）とエンテロバクテ
リウム（Enterobacterium）のリパーゼも合成活
性を示したと述べている。そしてこの報告では、
水系での酵素によるエステル合成法は著しく収率
の低いことを示している。〔発明が解決しようとする問題点〕シユネル法、ネブラスカ・シユネル法、
USDA法などの化学合成法においては、いずれ
も高温でエステル交換反応が行われるために、糖
の一部に分子内脱水などによる構造的変化や分解
を起こし、生成物の機能に好ましくない影響をあ
たえ、また反応に多量の熱エネルギーを必要と
し、省エネルギー的な観点からも、これらの方法
は満足すべき方法とは言えない。一方、リパーゼを用いる酵素合成法は、常温常
圧の温和な条件での反応が可能であり、糖や生成
物エステルの劣化を引き起こさず、優れた性質の
糖エステルを作ることができる。しかし、本来リパーゼは、プロテアーゼやアミ
ラーゼとならぶ代表的加水分解酵素として知られ
ており、その一般的機能としては多量の水の存在
下ではエステルを合成する方向への働きを低下さ
せ、従つて多量に水を加えた反応系では、リパー
ゼを用いた場合、満足すべきエステル合成を得る
ことは難しく、折角生成したエステルの再分解を
防ぐことはできない。事実、清野らの報告によれば、約92〜97％もの
水の存在下に0.36〜1.7％の糖濃度でのエステル
化反応をキヤンデイダ・シリンドラセのリパーゼ
を用いて行い、反応系全体の中に約１％前後の糖
エステルが生じたことを示唆しているのである。かくして、水溶媒系を用いる欠点なく、高い収
率で酵素法により糖類脂肪酸エステル化合物を容
易に得る方法が望まれていたのであり、この問題
を解決したのが本発明である。〔問題点を解決するための手段〕本発明者らは、上記した事情に鑑み、従来のご
とく酵素の作用が水の存在と不可分であるとして
水系での反応を考えるかぎりにおいて、エステル
合成反応は必然的に加水分解反応と合成反応との
反応平衡則に従わざるを得ず、低い合成率や再分
解をまぬがれ得ないとの考えに立ち、従来概念に
とらわれずに、有機溶媒系での糖類脂肪酸エステ
ル生成を可能にするリパーゼについて研究した。その結果、リパーゼとして例えばアクロモバク
ター（Achromobacter）属の微生物の生産する
リパーゼ（特公昭49−32080号公報）、カルカリゲ
ネス（Alcaligenes）属の微生物の生産するリパ
ーゼ（特公昭58−36953号公報、特開昭53−59093
号公報）などの微生物アルカリ性リパーゼを、有
機溶媒の存在下に作用させると、従来全く指摘さ
れたことのない広範囲な糖類と脂肪酸との間に高
濃度のエステルを生成するという驚くべき現象の
あることを見出した。本発明はこの発見に基いて
完成されたものである。即ち、本発明は、少なくとも２ケ以上の水酸基
を有する炭素数C₅〜C₇の単糖類（この単糖類は、
メチル基、フエニル基、ニトロフエニル基、フエ
ノール基、ヒドロキシメチルフエニル基、メルカ
プト基、ハロゲン、アセチルアミノ基、アミノ
基、ウラシル基、チミン基、もしくはアデニン基
で置換されていてもよい）、ヘキソールからなる
２糖類、炭素数C₄〜C₆の糖アルコール、炭素数
C₆〜C₇の糖ラクトンからなる群から選ばれる糖
類と、飽和もしくは不飽和の炭素数C₂〜C₂₂の脂
肪酸（この脂肪酸は、水酸基、カルボキシル基、
もしくはフエニル基で置換されていてもよい）又
はC₁〜C₄の低級アルコールとエステルを形成し
ている上記脂肪酸とに、有機溶媒（但し第１級ア
ルコール溶媒を除く）の存在下で、脱水しまたは
脱水しないで、アクロモバクター属又はアルカリ
ゲネス属に属する微生物が生産するアルカリ性リ
パーゼを作用させることを特徴とする糖類脂肪酸
エステル化合物の製造法であつて、その目的とす
るところは、幅広い糖類と脂肪酸から高い収率で
容易に糖類脂肪酸エステル化合物を得る方法を提
供することにある。なお、本発明で糖類脂肪酸エステルとは、リパ
ーゼの作用により糖類と脂肪酸より生成するエス
テルだけでなく、脂肪酸の低級アルコールエステ
ルと糖類の間で生成する糖類脂肪酸エステルをも
包含する。以下、本発明について詳細に説明する。本発明で用いる糖類とは、少なくとも２ケ以上
の水酸基を有する炭素数C₅〜C₇の単糖類（この
単糖類は、メチル基、フエニル基、ニトロフエニ
ル基、フエノール基、ヒドロキシメチルフエニル
基、メルカプト基、ハロゲン、アセチルアミノ
基、アミノ基、ウラシル基、チミン基、もしくは
アデニン基で置換されていてもよい）、ヘキソー
ルからなる２糖類、炭素数C₄〜C₆の糖アルコー
ル、炭素数C₆〜C₇糖ラクトンからなる群から選
ばれる糖類であつて、本発明で糖類とは単にアル
ドース又はケトースだけでなく、これらより誘導
される上記の糖アルコールおよび糖ラクトンを含
めて糖類という。置換基を有しない単糖類の具体例として、炭素
数がC₅の単糖としては、例えばアラビノース、
リボース、キシロース、リキソース、キシリロー
ス、リブロース、２−デオキシリボースなどが挙
げられ、C₆の単糖としては、例えばグルコース、
ガラクトース、フラクトース、マンノース、ソル
ボース、タロース、２−デオキシグルコース、６
−デオキシガラクトース、６−デオキシマンノー
ス、２−デオキシガラクトースなどが挙げられ、
C₇の単糖としては、例えばグルコヘプトース、
セドヘプツロース、マンノヘプツロース、グルコ
ヘプツロースなどが挙げられる。また、置換基を有する単糖類の具体例として
は、置換基としてメチル基を有するものとして
は、例えばα−メチルリボシド、β−メチルリボ
シド、β−メチルアラビノシド、２−ｏ−メチル
キシロース、α−メチルキシロシド、α−メチル
グルコシド、β−メチルグルコシド、α−メチル
マンノシド、β−メチルマンノシド、α−メチル
ガラクトシド、β−メチルガラクトシド、３−ｏ
−メチルグルコースなどが挙げられ、置換基とし
てフエニル基を有するものとしては、例えばフエ
ニル−α−グルコシド、フエニル−β−グルコシ
ド、フエニル−α−ガラクトシド、フエニル−β
−ガラクトシドなどが挙げられ、置換基としてニ
トロフエニル基を有するものとしては、例えばｏ
−ニトロフエニル−α−ガラクトシド、ｏ−ニト
ロフエニル−β−ガラクトシド、ｍ−ニトロフエ
ニル−β−ガラクトシド、ｐ−ニトロフエニル−
β−ガラクトシド、ｏ−ニトロフエニル−β−グ
ルコシド、ｐ−ニトロフエニル−β−グルコシ
ド、ｐ−ニトロフエニル−α−グルコシド、ｏ−
ニトロフエニル−β−キシロシド、ｐ−ニトロフ
エニル−β−キシロシド、ｐ−ニトロフエニル−
α−マンノシド、ｐ−ニトロフエニル−β−マン
ノシドなどが挙げられ、置換基としてフエノール
基を有するものとしては、例えばアルブチンなど
が挙げられ、置換基としてヒドロキシメチルフエ
ニル基を有するものとしては、例えばサリシンな
どが挙げられ、置換基としてメルカプト基を有す
るものとしては、例えば１−チオグルコース、１
−チオガラクトースなどが挙げられ、置換基とし
てハロゲンを有するものとしては、例えばクラロ
ースなどが挙げられ、置換基としてアセチルアミ
ノ基を有するものとしては、例えばＮ−アセチル
グルコサミン、Ｎ−アセチルガラクトサン、Ｎ−
アセチルマンノサミンなどが挙げられ、置換基と
してアミノ基を有するものとしては、例えばグル
コサミン、ガラクトサミンなどが挙げられ、置換
基としてアデニン基を有するものとしては、例え
ばアデノシン、デオキシアデノシン、８−ブロモ
アデノシンなどが挙げられ、置換基としてウラシ
ル基を有するものとしては、例えばウリジン、デ
オキシウリジンなどが挙げられ、置換基としてチ
ミン基を有するものとしては、例えばチミジンな
どが挙げられる。また、ヘキソースからなる２糖類としては、例
えばマルトース、シユクロースなどが挙げられ、
炭素数C₄〜C₆からなる糖アルコールとしては、
例えばエリスリトール、リビトール、キシリトー
ル、アラビトール、ソルビトール、マンニトー
ル、ガラクチトールなどが挙げられ、炭素数C₆
〜C₇からなる糖ラクトンとしては、例えばグル
コノラクトン、グルコノ−δ−ラクトン、ガラク
トノ−γ−ラクトン、グルコヘプトニツクアシツ
ド−γ−ラクトンなどが挙げられる。上記の如き糖類を例示することができるが、本
発明においては糖類の選択に制限はない。つぎに、本発明で用いる脂肪酸とは、飽和もし
くは不飽和の炭素数C₂〜C₂₂の脂肪酸（この脂肪
酸は水酸基、カルボキシル基、もしくはフエニル
基で置換されていてもよい）であつて、本発明で
脂肪酸とは、単に油脂類中に存在する酸を意味す
るだけでなく、それ以外の有機酸をも含めて脂肪
酸と言う。そして置換基を持たない炭素数C₂〜C₂₂の脂肪
酸としては、例えば酢酸、プロピオン酸、アクリ
ル酸、ブタン酸、クロトン酸、メタクリル酸、バ
レリン酸、カプロン酸、２−メチルバレリン酸、
ソルビン酸、カプリル酸、カプリン酸、ラウリン
酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン
酸、イソステアリン酸、オレイン酸、リノール
酸、リノレイン酸、エイコサン酸、ドコサン酸、
アラキドン酸などが挙げられる。また置換基を持つ脂肪酸のうち、水酸基を有す
るものとしては、例えばリシノレイン酸、ジヒド
ロキシステアリン酸などが挙げられ、カルボキシ
ル基を持つものとしては、例えばマロン酸、マレ
イン酸、コハク酸、グルタル酸、アジピン酸、ピ
メリン酸、スベリン酸、アゼライン酸、セバシン
酸、テトラデカンジオン酸などが挙げられ、フエ
ニル基を持つものとしては、例えばフエニル酢
酸、ケイ皮酸、３−フエニルプロピオン酸などが
挙げられる。更に、上記脂肪酸はC₁〜C₄の低級アルコール
類とエステルを形成していてもよく、このC₁〜
C₄の低級アルコールとしては、例えばメタノー
ル、エタノール、プロパノール、プロピレングリ
コール、グリセリン、イソプロパノール、ブタノ
ールなどが挙げられ、これらの脂肪酸エステルの
具体例としては、例えばメチルラウレート、メチ
ルミリステート、メチルパルミテート、メチルス
テアレート、エチルラウレート、エチルパルミテ
ート、エチルステアレート、エチルオレート、ラ
ウリン酸イソプロピル、ミリスチン酸イソプロピ
ル、パルミチン酸イソプロピル、ラウリン酸ブチ
ル、ステアリン酸ブチル、オレイン酸ブチル、プ
ロピレングリコールモノステアレート、プロピレ
ングリコールジパルミテート、グリセリンモノラ
ウレート、グリセリンモノステアレート、グリセ
リンモノオレート、グリセリンジパルミテート、
グリセリンジステアレート、グリセリンジオレー
ト、グリセリントリステアレート、グリセリント
リオレート、ヤシ油、大豆油、綿実油、パーム
油、牛脂、豚脂、オリーブ油などが例示できる。上記の如き脂肪酸及びその低級アルコールが例
示できるが、本発明においては、脂肪酸及びその
低級アルコールエステルの選択に制限はない。つぎに本発明を実施するのに用いられる微生物
アルカル性リパーゼについては、微生物アルカリ
性リパーゼであれば任意のものを使用することが
できるが、例えばアクロモバクター
（Achromobacter）属に属する名糖−AL−865号
（微工研菌寄第1213号）の生産するリパーゼ（特
公昭49−32080号公報）（以下、リパーゼ−ALと
いう）、アルカリゲネス（Alcaligenes）属に属す
る名糖PL−266号〔微工研条寄第2985号（微工研
菌寄第3187号）〕の生産するリパーゼ（特公昭58
−36953号公報）（以下、リパーゼ−PL266とい
う）、同じくアルカリゲネス属に属する名糖PL−
679号（微工研菌寄第3783号）の生産するリパー
ゼ（特開昭53−59093号公報）（以下、リパーゼ−
PL679という）などが特に溶剤耐性及びエステル
合成能にすぐれた有効なリパーゼの具体例として
挙げることができる。この点に関し実験例を示して説明する。実験例１溶媒中での安定性リパーゼ−PL679（名糖産業）、リパーゼ−
PL266（名糖産業）、リパーゼ−AL（名糖産業）の
粉末25mgずつを７ml栓付き遠沈管に取り、これに
各種溶媒、即ちヘキサン、アセトニトリル、第３
級ブチルアルコール、アセトン、第３級アミルア
ルコール、ジアセトンアルコール、水２ml加え、
充分攪拌し、37℃で24時間振蘯し、残存活性をリ
パーゼ力価測定法で測定した。リパーゼの測定は、リパーゼ−PL679、リパー
ゼ−PL266については国生等の方法〔Agric.Biol.
Chem.46（７）、第1743頁、1982〕、リパーゼ−
ALについて国生等の方法〔油化学23（２）、第98
頁、1974〕で行なつた。その結果を第１表に示
す。

【表】実験例２各種リパーゼの溶媒中でのエステル合成能各種リパーゼ、即ちアルカリ性リパーゼである
リパーゼ−PL679（名糖産業）、リパーゼ−PL266
（名糖産業）、リパーゼ−AL（名糖産業）、そして
アルカル性リパーゼでないリパーゼ−MY（名糖
産業）、リパーゼ−MAP4（天野製薬）、リパーゼ
AP10（天野製薬）、オリパーゼ2S（大坂細研）、タ
リパーゼ（田辺製薬）等のリパーゼを、各種溶
媒、即ちヘキサン、アセトニトリル、第３級ブチ
ルアルコール、アセトン、第３級アミルアルコー
ル、ジアセトンアルコール、水の存在下に、糖と
してフラクトース、脂肪酸としてオレイン酸に37
℃で24時間作用させてエステル合成を行ない、糖
エステルの合成を薄層クロマトグラフイー
（TLC）で確認した。その結果を第２表に示す。
なお、第２表中の記号は次の意義を有する。＋＋＋：エステル合成が非常に良く起つた＋＋：エステル合成が良く起つた＋：エステル合成が起つた − ：エステル合成が起らなかつた

〔実施例〕

以下に本発明の実施例を示すが、本発明はこれ
により制限されるものではない。実施例１オレイン酸0.5ｇ、フラクトース0.5ｇ、モレキ
ユラーシーブス3A（和光純薬販売脱水剤）0.5ｇ、
第３級ブチルアルコール５ml、リパーゼ−PL679
粉末0.1ｇを共栓付き試験管に取り、よく混合し
た後、37℃で24時間振蘯反応した。反応後、反応液10μをシリカゲル薄層（メル
ク社製シリカゲル60TLCプレートNo.5721，20×
20cm）にスポツトし、クロロホルム−メタノール
−酢酸、−水（80：10：８：2V／Ｖ）を展開溶媒
として展開した。スポツトの検出には、50％硫酸
（有機物の検出）とナフトレゾルシンリン酸試薬
（糖の検出）を用いた。即ち、50％硫酸を用いる
と、未反応のフラクトース、未反応のオレイン酸
と２つの未知のスポツトが検出され、またナフト
レゾルシンリン酸試薬を用いると、未反応のフラ
クトースと２つの未知のスポツトが検出された。
そしてこの２つの未知のスポツトのRf値は上記
２つの検出方法で一致したので、これらのスポツ
トをフラクトースのオレイン酸エステルであるフ
ラクトースオレートとした。なお２つのフラクト
ースオレートのスポツトのうち、Rf値0.33のスポ
ツトをスポツト１とし、Rf値0.75のスポツトをス
ポツト２とすると、TLCの検出では圧倒的にス
ポツト１が大きかつたので、２つのフラクトース
オレートのうちスポツト１を精製することにし
た。フラクトースオレートは分取用TLCを用いて
精製した。シリカゲル薄層（メルク社製シリガケ
ルTLCプレートNo.13894、0.5mm，20×20cm）に前
記反応液0.5mlをライン状にスポツトし、クロロ
ホルム−メタノール−酢酸−水（80：10：８：
2V／Ｖ）を展開溶媒として展開した。展開後、
50％硫酸とナフトレゾルシンリン酸試薬で発色
し、フラクトースオレートをTLCプレートから
かき取り、シリカゲルを10mlのクロロホルム−メ
タノール（２：1V／Ｖ）で抽出した。抽出液を
No.5Cの紙で過し、シルカゲルを除いた後、
３mlの水で３回洗い、クロロホルム層を分取し
た。分取したクロロホルム層を30℃で減圧下乾固
した。得られたフラクトースオレートの収量は３
mgでTLC上は単一であつた。フラクトースオレートのIRスペクトルは日本
分光A202型赤外分光光度計を用い、液膜法で測
定した。この結果を第３表に示す（RunNo.９）。さらに他の糖類を用いて上記と同様に行い糖類
のオレイン酸エステルを得た。そのIRスペクト
ルを第３表に示す（RunNo.１〜８及びNo.10〜44）。ただし、糖アルコールのエステル、糖ラクトン
のエステル、及び置換基を有する糖類のエステル
の検出には50％硫酸と過ヨウ素酸ベンチジン試薬
を用いた。

【表】

【表】第３表の結果から、1740カイザー付近にエステ
ル結合の吸収と3400付近に糖の吸収が見られるこ
とから、上記生成物は糖類オレイン酸エステルで
あることがわかる。実施例２ステアリン酸0.5ｇ、フラクトース0.5ｇ、モレ
キユラーシーブス3A0.5ｇ、第３級ブチルアルコ
ール５ml、リパーゼ−PL679粉末0.1ｇを用いて
実施例１と同様の方法で反応、精製を行つた。そ
の結果、２mgのフラクトースステアレートを得
た。この化合物のIRスペクトルを第４表に示す
（RunNo.14）。さらに他の脂肪酸を用いて上記と同様に行いフ
ラクトースの脂肪酸エステルを得た。そのIRス
ペクトルを第４表に示す（RunNo.１〜13及びNo.15
〜25）。またリボースと脂肪酸を用いて上記と同様に行
いリボースの脂肪酸エステルを得た。そのIRス
ペクトルを第４表に示す（RunNo.26〜31）。

【表】

【表】第４表の結果から、1740カイザー付近にエステ
ル結合の吸収と3400カイザー付近に糖の吸収が見
られることから、上記生成物はフラクトースの脂
肪酸エステル及びリボースの脂肪酸エステルであ
ることがわかる。実施例３ステアリン酸0.5ｇ、ゾルビトール0.5ｇ、モレ
キユラーシーブス3A0.5ｇ、第３級ブチルアルコ
ール５ml、リパーゼ−PL679粉末0.1ｇを用いて
実施例１と同様の方法で反応、精製を行つた。そ
の結果３mgのソルビトールステアレートを得た。
この化合物のIRスペクトルを第５表に示す
（RunNo.10）。さらに、他の脂肪酸を用いて上記と同様に行い
ソルビトールの脂肪酸エステルを得た。そのIR
スペクトルを第５表に示す（RunNo.１〜９及びNo.
11〜18）。また、グルコノ−δ−ラクトンと脂肪酸を用い
て上記と同様に行いグルコノ−δ−ラクトンの脂
肪酸エステルを得た。そのIRスペクトルを第５
表に示す（RunNo.19〜23）。

【表】

【表】第５表の結果から、1740カイザー付近にエステ
ル結合の吸収と3400カイザー付近に糖の吸収が見
られることから、上記生成物はソルビトールの脂
肪酸エステル及びグルコノ−δ−ラクトンの脂肪
酸エステルであることがわかる。実施例４メチルオレート0.5ｇ、フラクトース0.5ｇ、第
３級ブチルアルコール５ml、リパーゼ−PL679粉
末0.1ｇを用いて実施例１と同様の方法で反応、
精製を行つた。その結果３mgのフラクトースオレ
ートを得た。この化合物のIRスペクトルを第６
表に示す（RunNo.１）。さらに、他の脂肪酸エステルを用いて上記と同
様に行いフラクトース脂肪酸エステルを得た。そ
のIRスペクトルを第６表に示す（RunNo.２〜
14）。

【表】

【表】第６表の結果から、1740カイザー付近にエステ
ル結合の吸収と3400カイザー付近に糖の吸収が見
られることから、上記生成物はフラクトース脂肪
酸エステルであることがわかる。実施例５メチルオレート0.5ｇ、ソルビトール0.5ｇ、第
３級ブチルアルコール５ml、リパーゼ−PL679粉
末0.1ｇを用いて実施例１と同様の方法で反応、
精製を行つた。その結果3.5mgのソルビトールオ
レートを得た。この化合物のIRスペクトルを第
７表に示す（RunNo.１）。さらに、他の脂肪酸エステルを用いて上記と同
様に行いソルビトール脂肪酸エステルを得た。そ
のIRスペクトルを第７表に示す（RunNo.２〜
14）。

【表】

【表】第７表の結果から、1740カイザー付近にエステ
ル結合の吸収と3400カイザー付近に糖の吸収が見
られることから、上記生成物はソルビトール脂肪
酸エステルであることがわかる。実施例６フラクトース１ｇ、オレイン酸６ｇ、リパーゼ
−AL粉末70mg、第３級ブチルアルコール15mlを
50ml容三角フラスコに採り、30℃にて24時間往復
振蘯した。遠心分離にて不溶物を除いた反応液を
ロータリーエバポレーターにて濃縮し、溶媒を除
去した。この残渣にクロロホルム20mlを加え溶解
した後、不溶物を遠心分離にて除去した。この上
澄液を、予めクロロホルムにて充填、洗浄したイ
アトロビーズ6RS−80100（株式会社ヤトロン製）
のカラム（２×30cm）に吸着せしめた。このカラ
ムをクロロホルム200mlにて洗浄した後、アセト
ン100mlにて上記反応で生成したフラクトースオ
レートを溶出した。このアセトン溶出画分をロー
タリーエバポレーターにて濃縮後、減圧乾燥しフ
ラクトースオレート410mgを得た。このフラクトースオレートの少量をクロロホル
ムに溶かし、実施例１に記載したと同様に薄層ク
ロマトグラフイー（TLC）を行い50％硫酸によ
る検出を行つたところ、実施例１に記載したと同
様に２つのスポツトが検出され、TLC上の移動
度（Rf値）からこれらの２つのスポツトは実施
例１に記載したスポツト１とスポツト２と同一で
あることが確認された。上記のようにして得たフラクトースオレート約
50mgを調製用TLC（Merck社製シリカゲル60No.
13895）にスポツトし、クロロホルム：メタノー
ル：酢酸：水＝80：10：８：２の展開溶媒を用い
て約10cm展開した。このプレートを乾燥した後、
実施例１に記載したスポツト１とスポツト２に相
当する二成分をUVライトでモニターしながらク
ロロホルム：メタノール＝２：１の溶液で抽出し
スポツト１成分を32mg、スポツト２成分を６mg得
た。このようにして得た２種のサンプルにつき、
それぞれ次のような操作を行い該フラクトースオ
レートを構成するフラクトースとオレイン酸のモ
ル比を求めた。即ち、サンプル約５mgを５mlのクロロホルムに
溶かした後、１mlずつ２本のキヤツプ付き試験管
（ＡとＢとする）に採る。ＡとＢとも減圧下、ク
ロロホルムを除いた後、0.1Nカセイソーダ／90
％メタノール溶液１mlを加えてキヤツプをし、50
℃で３分間加熱した。しかる後、Ａには1N塩酸0.1mlを加えて中和し
た。このサンプルを減圧乾固した後、水に溶かし
２mlとした。この溶液中に含まれるフラクトース
を酵素法（H.U.Bergmeyer編、Methods of
Enzymatic Analysis、第３版、第６巻、p321，
Verlag Chemie GmbH，Weinheim，1984）に
て定量した。一方、Ｂについては基準油脂分析試験法（日本
油化学協会編）の２，４，20，２−77脂肪酸メチ
ルエステルの調製方法（三フツ化ホウ素−メタノ
ール法）に準拠してサンプル中に含まれるオレイ
ン酸をメチルオレートとした後、常法によりガス
クロマトグラフイーによりメチルステアレートを
内部標準として定量した。このようにしてスポツト１とスポツト２の両成
分についてそれらを構成するフラクトースとオレ
イン酸のモル比を求めたところ、スポツト１につ
いてはその比は約１：１であり、これはフラクト
ースオレートのモノエステルであることが判明し
た。また同様にスポツト２については、その比が
約１：２であり、これはフラクトースオレートの
ジエステルであることが判明した。またフラクトースオレート５mgをクロロホルム
0.5mlに溶かし、その１マイクロリツトルをイア
トロスキヤン（株式会社ヤトロン社製）のクロマ
トロツトSII（ヤトロン社製シリカゲルロツト）に
チヤージし、クロロホルム：メタノール：酢酸：
水＝80：10：８：２の展開溶媒で約10cm展開し
た。しかる後、このロツトをイアトロスキヤンに
かけたところ、フラクトースモノオレートとフラ
クトースジオレートの２つのピークが得られ、こ
れらの重量比はピーク面積の比から約５：１であ
つた。実施例７フラクトース１ｇ、オレイン酸６ｇ、リパーゼ
−AL粉末70mg、アセトニトリル20mlを50ml容三
角フラスコに採り、30℃にて24時間往復振蘯し
た。以後、実施例６の場合と同様に精製しフラク
トースオレート427mgを得た。実施例８フラクトース１ｇ、オレイン酸６ｇ、リパーゼ
−AL粉末70mg、モレキユラーシーブス3A2ｇ、
第３級アミルアルコール30mlを50ml容三角フラス
コに採り、40℃にて24時間往復振蘯した。以後、
実施例６の場合と同様に精製しフラクトースオレ
ート382mgを得た。実施例９フラクトース１ｇ、オレイン酸６ｇ、リパーゼ
−AL粉末70mg、アセトン25mlを50ml容三角フラ
スコに採り、45℃にて24時間往復振蘯した。以
後、実施例６の場合と同様に精製しフラクトース
オレート396mgを得た。実施例 10 フラクトース１ｇ、オレイン酸６ｇ、リパーゼ
−AL粉末70mg、モレキユラーシーブス3A2ｇ、
ジアセトンアルコール25mlを50ml容三角フラスコ
に採り、45℃にて24時間往復振蘯した。以後、実
施例６の場合と同様に精製しフラクトースオレー
ト280mgを得た。実施例 11 フラクトース１ｇ、オレイン酸６ｇ、リパーゼ
−AL粉末70mg、第３級ブチルアルコール20ml、
Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド５mlを50ml容三角
フラスコに採り、50℃にて24時間往復振蘯した。
以後、実施例６の場合と同様に精製しフラクトー
スオレート287mgを得た。実施例 12 フラクトース１ｇ、オレイン酸６ｇ、リパーゼ
−AL粉末70mg、アセトニトリル10ml、ジメチル
スルホキシド５mlを50ml容三角フラスコに採り、
60℃にて24時間往復振蘯した。以後、実施例６の
場合と同様に精製しフラクトースオレート371mg
を得た。実施例 13 フラクトース１ｇ、セバシン酸５ｇ、リパーゼ
−PL266粉末100mg、モレキユラーシーブス3A2
ｇ、第３級ブチルアルコール15mlを50ml容三角フ
ラスコに採り、40℃にて24時間往復振蘯した。以
後、実施例６の場合と同様に精製しフラクトース
セバシネート50mgを得た。実施例 14 フラクトース１ｇ、オレイン酸２ｇ、リパーゼ
−PL266粉末50mg、モレキユラーシーブス3A2
ｇ、第３級ブチルアルコール15mlを50ml容三角フ
ラスコに採り、40℃にて24時間往復振蘯した。以
後、実施例６の場合と同様に精製しフラクトース
オレート385mgを得た。実施例 15 フラクトース１ｇ、メチルオレート６ｇ、リパ
ーゼ−PL266粉末150mg、第３級ブチルアルコー
ル15mlを50ml容三角フラスコに採り、40℃にて24
時間往復振蘯した。以後、実施例６の場合と同様
に精製しフラクトースオレート537mgを得た。実施例 16 フラクトース１ｇ、ステアリン酸３ｇ、リパー
ゼ−PL266粉末200mg、モレキユラーシーブス
3A2ｇ、第３級ブチルアルコール15mlを50ml容三
角フラスコに採り、40℃にて24時間往復振蘯し
た。以後、実施例６の場合と同様に精製しフラク
トースステアレート372mgを得た。実施例 17 フラクトース１ｇ、パルミチン酸５ｇ、リパー
ゼ−PL266粉末100mg、モレキユラーシーブス
3A2ｇ、第３級ブチルアルコール15mlを50ml容三
角フラスコに採り、40℃にて24時間往復振蘯し
た。以後、実施例６の場合と同様に精製しフラク
トースパルミテート223mgを得た。実施例 18 フラクトース１ｇ、ラウリン酸４ｇ、リパーゼ
−PL266粉末100mg、第３級ブチルアルコール15
mlを50ml容三角フラスコに採り、40℃にて24時間
往復振蘯した。以後、実施例６の場合と同様に精
製しフラクトースラウレート272mgを得た。実施例 19 フラクトース１ｇ、リシノレイン酸３ｇ、リパ
ーゼ−PL266粉末100mg、モレキユラーシーブス
3A2ｇ、第３級ブチルアルコール15mlを50ml容三
角フラスコに採り、40℃にて24時間往復振蘯し
た。以後、実施例６の場合と同様に精製しフラク
トースリシノレート352mgを得た。実施例 20 リボース１ｇ、オレイン酸６ｇ、リパーゼ−
PL679粉末100mg、第３級ブチルアルコール15ml
を50ml容三角フラスコに採り、40℃にて12時間往
復振蘯した。以後、実施例６の場合と同様に精製
しリボースオレート250mgを得た。実施例 21 グルコース１ｇ、オレイン酸６ｇ、リパーゼ−
PL679粉末100ｇ、モレキユラーシーブス3A2ｇ、
第３級ブチルアルコール15mlを50ml容三角フラス
コに採り、40℃にて24時間往復振蘯した。以後、
実施例６の場合と同様に精製しグルコースオレー
ト212mgを得た。実施例 22 グルコヘプトース１ｇ、オレイン酸６ｇ、リパ
ーゼ−PL679粉末100ｇ、第３級ブチルアルコー
ル15mlを50ml容三角フラスコに採り、40℃にて48
時間往復振蘯した。以後、実施例６の場合と同様
に精製しグルコヘプトースオレート62mgを得た。実施例 23 マルトース１ｇ、オレイン酸６ｇ、リパーゼ−
PL679粉末100mg、第３級ブチルアルコール15ml
を50ml容三角フラスコに採り、40℃にて72時間往
復振蘯した。以後、実施例６の場合と同様に精製
しマルトースオレート41mgを得た。実施例 24 メチル−α−グルコシド１ｇ、オレイン酸６
ｇ、リパーゼ−PL679粉末100mg、モレキユラー
シーブス3A2ｇ、第３級ブチルアルコール15mlを
50ml容三角フラスコに採り、40℃にて24時間往復
振蘯した。以後、実施例６の場合と同様に精製し
メチル−α−グルコシドオレート258mgを得た。実施例 25 グルコノ−δ−ラクトン１ｇ、オレイン酸６
ｇ、リパーゼ−PL679粉末100mg、第３級ブチル
アルコール15mlを50ml容三角フラスコに採り、40
℃にて36時間往復振蘯した。以後、実施例６の場
合と同様に精製しグルコノ−δ−ラクトンオレー
ト134mgを得た。実施例 26 ソルビトール１ｇ、オレイン酸６ｇ、リパーゼ
−PL679粉末100mg、第３級ブチルアルコール15
ml、モレキユラーシーブス3A2ｇを50ml容三角フ
ラスコに採り、40℃にて24時間往復振蘯した。以
後、実施例６の場合と同様に精製しソルビトール
オレート620mgを得た。実施例 27 マンニトール１ｇ、オレイン酸６ｇ、リパーゼ
−PL679粉末100mg、第３級ブチルアルコール15
mlを50ml容三角フラスコに採り、40℃にて24時間
往復振蘯した。以後、実施例６の場合と同様に精
製しマンニトールオレート325mgを得た。実施例 28 フラクトース１ｇ、オレイン酸６ｇ、リパーゼ
−AL粉末70mg、第３級ブチルアルコール15ml、
モレキユラーシーブス3A2ｇを50ml容三角フラス
コに採り、30℃にて24時間往復振蘯した。以後、
実施例６の場合と同様に精製しフラクトースオレ
ート480mgを得た。実施例 29 フラクトース１ｇ、オレイン酸６ｇ、リパーゼ
−PL679粉末100mg、第３級ブチルアルコール15
ml、モレキユラーシーブス3A2ｇを50ml容三角フ
ラスコに採り、30℃にて24時間往復振蘯した。以
後、実施例６の場合と同様に精製しフラクトース
オレート620mgを得た。実施例 30 フラクトース１ｇ、オレイン酸６ｇ、リパーゼ
−PL679粉末100mg、第３級ブチルアルコール15
mlを50ml容三角フラスコに採り、40℃にて24時間
往復振蘯した。以後、実施例６の場合と同様に精
製しフラクトースオレート416mgを得た。実施例 31 リパーゼ−PL679粉末１ｇを100ml容三角フラ
スコに採り、蒸留水20mlを加え溶解した後、ベン
トナイト１ｇを加えて室温で30分間攪拌した。遠
心分離にてベントナイトを回収し、これにアセト
ン30mlを加え攪拌し懸濁させた後、再び遠心分離
にてベントナイトを回収した。以後、この操作を
２回繰り返した後、減圧乾燥した。上記方法にてベントナイトに吸着固定化したリ
パーゼーPL679 100mg、フラクトース１ｇ、オレ
イン酸６ｇ、第３級ブチルアルコール15mlを50ml
容三角フラスコに採り、40℃にて24時間往復振蘯
した。以後、実施例６の場合と同様に精製しフラ
クトースオレート526mgを得た。

Claims

【特許請求の範囲】

１少なくとも２ケ以上の水酸基を有する炭素数
C₅〜C₇の単糖類（この単糖類は、メチル基、フ
エニル基、ニトロフエニル基、フエノール基、ヒ
ドロキシメチルフエニル基、メルカプト基、ハロ
ゲン、アセチルアミノ基、アミノ基、ウラシル
基、チミン基、もしくはアデニン基で置換されて
もよい）ヘキソースからなる２糖類、炭素数C₄
〜C₆の糖アルコール、炭素数C₆〜C₇の糖ラクト
ンからなる群から選ばれる糖類と、飽和もしくは
不飽和の炭素数C₂〜C₂₂の脂肪酸（この脂肪酸は、
水酸基、カルボキシル基、もしくはフエニル基で
置換されていていてもよい）又はC₁〜C₄の低級
アルコールとエステルを形成している上記脂肪酸
とに、有機溶媒（但し第１級アルコール溶媒を除
く）の存在下で、脱水しまたは脱水しないで、ア
クロモバクター属又はアルカリゲネス属に属する
微生物が生産するアルカリ性リパーゼを作用させ
ることを特徴とする糖類脂肪酸エステル化合物の
製造法。