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JPH0565490B2 - - Google Patents
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JPH0565490B2 - - Google Patents

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JPH0565490B2
JPH0565490B2 JP1052497A JP5249789A JPH0565490B2 JP H0565490 B2 JPH0565490 B2 JP H0565490B2 JP 1052497 A JP1052497 A JP 1052497A JP 5249789 A JP5249789 A JP 5249789A JP H0565490 B2 JPH0565490 B2 JP H0565490B2
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saxifrage
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chloroform
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Yutaka Ando
Yoshitaka Ando
Yukinaga Nishibe
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Ichimaru Pharcos Co Ltd
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Ichimaru Pharcos Co Ltd
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  • Cosmetics (AREA)
  • Medicines Containing Plant Substances (AREA)
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Description

【発明の詳細な説明】
「発明の目的」 本発明は、ユキノシタ由来の抗紫外線誘発突然
変異作用剤(バイオアンチミユータジエン)に関
する。 さらに詳しくは、原料起源がユキノシタ科植物
のユキノシタ(Saxifraga stlonifera Meerb.)
の全草から抽出された、ある特定な理化学的性質
を有する縮合型タンニン分画を有効成分とする新
規な抗紫外線誘発突然変異作用剤に関する。 「産業上の利用分野」 本発明による、ユキノシタ由来の縮合型タンニ
ン分画は、紫外線によつて損傷をきたしたDNA
に対し、優れた修復・改善作用を有する。 よつて本剤は、例えば、医薬品、医薬部外品、
化粧品、食品(健康食品)または発酵工業、遺伝
子工学分野等に用いることが可能である。 具体的には、人体用の医薬品、健康食品(機能
性食品)、化粧品などに配合して用いるなど、紫
外線により変異した組織細胞に対しての改善や、
あるいはその予防を期待して利用することができ
る。 更に、動物用の医薬品や飼料に添加して利用す
ることなどももちろん可能である。 「従来の技術」 細胞の突然変異に関する研究は、これまでに
数々の研究者らによつて行われており、既に、
種々の変異原性因子が確認されてきている。これ
ら因子が一つの原因となつて細胞の癌化を誘発す
ることは、広く認識されている通りである。 一方、最近では、こうした研究によつて抗変異
原性作用を有した物質の存在も発見されてきてお
り、この分野における研究動向は、非常に注目さ
れるようになつてきた。 例えば、DNA修復に関するこれまでの研究動
向は、武部啓著「DNA修復」,財団法人東京大学
出版会(1987年3月31日)などに詳しく説明され
ている。 この分野の研究においては、特に、大腸菌を用
いた研究が進んでおり、分子レベルでの修復メカ
ニズムといつたことまで解明されてきた。 そして、種々の研究結果から、大腸菌とヒト細
胞では突然変異及びその修復機構にいくらかの共
通性が認められることが示唆されたという興味深
い知見についても報告されている。 こうした研究成果によつて、微生物を用いた簡
易な抗突然変異因子の検索法が提唱され、現在に
至り、これに関する研究は、がんの予防や抑制へ
の可能性といつたことなどから重要なテーマとし
てとり上げられ広く行われるようになつてきた。 突然変異頻度の測定法については、例えば、望
月、賀田らによる研究論文(Mutation
Research,95,P457(1982))や、能美らによる
記事(トキシコロジーフオーラム,9(2)P189
−198(1986))などにも詳しく説明されており、
特に、大腸菌が用いた検討法が代表的な一つとし
て示されている。 そこで、本発明者らは、種々の変異原性因子の
中でも、最も広く一般に被線している環境因子の
紫外線をとり上げ、これによつて誘発した大腸菌
の突然変異に対し、その修復・改善的作用を有す
る物質の検索に着手し、表記のような利用分野に
役立つような製剤の開発にあたつた。 「発明が解決しようとする課題」 すなわち、本発明者らは、抗紫外線誘発突然変
異作用(バイオアンチミユータジエン)をもつた
物質を天然物:植物に求め、それに関する製剤の
開発に当ることを課題となし研究を続けてきたの
である。 その結果、ユキノシタ科の植物であるユキノシ
タの全草から得られた抽出物中に、効率の良い
DNA修復作用をもつバイオアンチミユータジエ
ンが存在することを見出すに至つたのである。 そこで、この物質が如何なる成分であるのか、
その同定に当つたところ、以下に示すごとくの理
化学的手段をもつて特定することができ、本発明
を完成するに至つた。 〔発明の構成〕 本発明はユキノシタ科植物のユキノシタの全草
から得られた、次の(a)〜(d)の特性を有する縮合型
タンニンを有効成分とする、抗紫外線誘発突然変
異剤をもつてなる。 (a) 溶媒に対する溶解性 水とエタノールの混液に易溶、 水、エタノールの単独にはやや難溶、 クロロホルムには不溶 (b) 分子量 10000以下 (c) 薄層クロマトグラム 下記の条件下におけるRf値が0.87 薄層版:254nmUV光下蛍光発色型親水性シ
リカゲルプレート 展開溶媒:エタノール:クロロホルム:水:
酢酸(8:4:2:1)混液 下記の条件下におけるRf値が0.89 薄層版:254nmUV光下蛍光発色型親水性シ
リカゲルプレート 展開溶媒:n−ブタノール:メタノール:酢
酸:水(20:20:5:4)混液 下記の条件下におけるRf値が0.82 薄層版:254nmUV光下蛍光発色型親水性シ
リカゲルプレート 展開溶媒:メタノール:クロロホルム:水
(4:2:1) (d) タンニン反応確認試験が陽性 「課題を解決するための手段」 〔1〕 出発原料 本発明による抗紫外線誘発突然変異作用物質は
ユキノシタ科植物のユキノシタ(Saxifraga
stlonifera Meerb.)、または、生薬名:虎耳草を
出発原料となし、抽出、並びに、精製することに
よつて製造出来る。 その際の出発原料は、組織培養法によつて得ら
れたユキノシタあるいは虎耳草を用いることでも
できる。 〔2〕 粗抽出法 ユキノシタの全草を粉砕して、室温下で無水エ
タノールなど(無水エタノールに特定する必要は
なく、他の公知な親水性有機溶媒、例えば、1,
3−ブチレングリコール、プロピレングリコー
ル、ポリエチレングリコールなどのポリオール系
有機溶媒、あるいは、グリセリン、アセトン、メ
タノールの単独、又はそれらの混液、さらには、
水と前記各々の溶媒と任意に混合した溶液を用い
ることも可能である。)を加えて、2〜3日間浸
漬した後、濾過を行つて濾液を分取する。 濾過の際に得られた残渣物を、再び、上記操作
に従い2回繰り返して、得られた濾液を上記操作
で得られた濾液と混合して、減圧濃縮を行う(減
圧濃縮は濾液中に含有される各種有機溶媒が完全
に除去されるまで行い、水懸濁液又は乾固した状
態にする)。 この操作により、緑褐色の水懸濁化物又は乾燥
物を得る。 次に、この水懸濁化物又は乾燥物に対して、ク
ロロホルムを加えて、室温下で充分撹拌後、濾過
を行い、残渣部を分取して、再度、減圧濃縮によ
る乾燥を行つて、茶褐色の粗抽出物を得る。 〔3〕 精製分離法 前記工程で得られた粗抽出物を、80%エタノー
ル水溶液に溶解させた後、これに対し3部の酢酸
エチルを加えて室温下で充分撹拌した後、遠心分
離して、その上清部(上層部)を分取、減圧乾燥
する。 次に、ここで得られた減圧乾燥物に少量の無水
エタノールを加えて溶解させた後、さらに、クロ
ロホルムと水の割合が2対1の混液を加えて撹拌
後、遠心分離して上層部(水層部)を分取、そし
てこれを再度、減圧乾燥してユキノシタ由来の抗
紫外線誘発突然変異作用物質を得る(以下、便宜
上、この物質をユキノシタ物質という。)。 尚、本発明における抗紫外線誘発突然変異作用
物質は、次のような理化学的性質を有するもので
あるが、応用に当つては必ずしも精製する必要は
なく前項の粗抽出物であつてもよい。 〔4〕 理化学的性質に関する試験結果 〈A〉 溶剤に対する溶解性試験 ユキノシタ物質は、水とエタノールの混液に易
溶であり、水、エタノールの単独では、やや難溶
クロロホルムに不溶であることが確認された。 〈B〉 分子量 ユキノシタ物質の水溶液は、ザリトリウス社製
のセントリザルトI(分子量10000を分別する限外
濾過膜)を全通することから、その分子量は、
10000以下と確認された。 〈C〉 薄層クロマトグラム試験 薄層版に254nm UV光下蛍光発色型親水性シ
リカゲルプレート(商品名:シリカゲル60F254
を用い、展開溶媒として、 (1) エタノール:クロロホルム:水:酢酸(8:
4:2:1)の混液を使用した場合のRf値は0.87
と確認された。 (2) n−ブタノール:メタノール:酢酸:水(20:
20:5:4)の混液を使用した場合のRf値は0.89
と確認された。 (3) メタノール:クロロホルム:水(4:2:1)
の混液を使用した場合のRf値は0.82であることが
確認された。 (4) メタノール:クロロホルム:水:アンモニア水
(8:4:2:1)を使用した場合、原点に留ま
り、クロマトグラム展開後、ヨウ素蒸気中で赤色
に変色することが確認された。 〈D〉 縮合型タンニン反応試験 ユキノシタ物質は、塩化第二鉄試液により藍灰
色を呈する。又、n−ブタノール中において、塩
酸を加えて加熱するとき、アントシアニジン様の
淡赤色を呈することが確認された。 よつて、同物質は縮合型タンニンであることが
確認された。 〈E〉 赤外線吸収スペクトル試験 ユキノシタ物質のKBr法による赤外線吸収ス
ペクトル(第1図に示す)からは、水酸基、カル
ボニル基、ベンゼン環の有する特有のピークが確
認された。 〔5〕 作用又は効果に関する試験 本発明によるユキノシタ物質について、その抗
紫外線誘発突然変異作用の測定を、望月、賀田の
方法(Mutation Reseach,vol.95,P457
(1982))に従い、紫外線照射方法及び検査を加え
た後の浸とう時間についてを、一部改良して実施
した。 (1) 測定法 (a) 使用菌株 Escherichia Coli B/rWP2 trp-を使用した。 (b) 紫外線照射法 一晩、前培養した菌を100mMリン酸ナトリウ
ム緩衝液(PH7.0に調整)で3回洗浄し、同緩衝
液中で撹拌しながら、48.6J/m2の紫外線を照射
して(直径90mmのシヤーレ、液層は、約2mm)行
つた。 (c) 検体(ユキノシタ物質)の調整 滅菌した試験管に一定量の検体を入れ、30μ
のDMSOと500μの100mMリン酸ナトリウム緩
衝液を加える。 (d) 変異原性の測定 前記(c)で調整した溶液に、前記(b)で得られた菌
懸濁液100μを加え、37℃、30分間振とうを行
い、次に、2.5mlの軟寒天を加えて、最小グルコ
ース寒天培地に広げた後、37℃で48時間の培養を
行い、育成したコロニーをもつて突然変異した菌
と判定する。 尚、生菌数の判定は、37℃、30分間振とうした
後の混液を、100mMリン酸ナトリウム緩衝液で
10の6剰倍(106倍)に希釈して、前培養用液体
培地に寒天を加えて作つた培地に広げ、37℃、24
時間の培養後のコロニー数を生菌数とした。 (2) 試験結果 ユキノシタ物質の抗突然変異作用について、そ
の結果を次表(第1表)もつて示す。 尚、第1表中の生存率は、紫外線無照射におい
てユキノシタ物質無添加時の生菌数を100%とな
し、これを基準に求めた。 一方、第1表中の突然変異率は、紫外線照射に
おいてユキノシタ物質無添加時の突然変異頻度を
100%となし、これを基準に求めた。 すなわち、本発明において得られたユキノシタ
物質は、系中に添加することによつて明らかに突
然変異率が減少すること。 その生菌数の増加は、添加量100μg/plateに
おいて、紫外線照射前と同じレベルにまで回復す
ることが確認された。
【表】 〔6〕 発明の効果 本発明により得られたユキノシタ物質は、前記
第1表に示したごとく、抗突然変異作用物質(バ
イオアンチミユータジエンとして評価された。 又、その作用についてまとめてみると、次のご
とく述べることが出来る。 (1) ユキノシタ物質は、紫外線の照射によつて誘発
される、突然変異を著明に抑制すること。 (2) ユキノシタ物質は、紫外線照射により突然変異
した大腸菌の生存率を著明に上昇させること。 (3) したがつて、この作用は紫外線によつて誘発さ
れたDNAの突然変異を効率よく修復し、正常に
戻すためと考えられた。 すなわち、ユキノシタ科の植物:ユキノシタの
全草から抽出したエキス中に、抗紫外線誘発突然
変異作用(バイオアンチミユータジエン)を有す
る物質が存在することを発見し、これが如何なる
物質であるのか、その追求、研究に当り、単離と
同定に成功して本発明を完成するに至つた。 従来、ユキノシタ植物には抗紫外線誘発突然変
異作用があることは全く知られておらず、本発明
の成功は、植物(天然産物)の有効利用を促進す
るものとして、そのもたらす効果は大きく、発酵
工業、遺伝子工学を用いた医薬品の開発や医薬部
外品、化粧品、食品等の分野への応用が可能であ
り、また生命工学、生物学、生体学など、種々の
分野に渡り利用することが出来るものと考える。
【図面の簡単な説明】
第1図は、ユキノシタ物質の赤外線吸収スペク
トルである。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 1 ユキノシタ科植物のユキノシタの全草から抽
    出された次の(a)〜(d)の特性を有する縮合型タンニ
    ン分画を有効成分とする、抗紫外線誘発突然変異
    作用剤。 (a) 溶媒に対する溶解性 水とエタノールの混液に易溶、 水、エタノールの単独にはやや難溶、 クロロホルムには不溶 (b) 分子量 10000以下 (c) 薄層クロマトグラム 下記の条件下におけるRf値が0.87 薄層版:254nmUV光下蛍光発色型親水性シ
    リカゲルプレート 展開溶媒:エタノール:クロロホルム:水:
    酢酸(8:4:2:1)混液 下記の条件下におけるRf値が0.89 薄層版:254nmUV光下蛍光発色型親水性シ
    リカゲルプレート 展開溶媒:n−ブタノール:メタノール:酢
    酸:水(20:20:5:4)混液 下記の条件下におけるRf値が0.82 薄層版:254nmUV光下蛍光発色型親水性シ
    リカゲルプレート 展開溶媒:メタノール:クロロホルム:水
    (4:2:1) (d) タンニン反応確認試験が陽性。
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