JPH0568480B2 - - Google Patents
Info
- Publication number
- JPH0568480B2 JPH0568480B2 JP84187301A JP18730184A JPH0568480B2 JP H0568480 B2 JPH0568480 B2 JP H0568480B2 JP 84187301 A JP84187301 A JP 84187301A JP 18730184 A JP18730184 A JP 18730184A JP H0568480 B2 JPH0568480 B2 JP H0568480B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- interferon
- ifn
- dna
- amino acid
- codon
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/54—Interleukins [IL]
- C07K14/55—IL-2
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/555—Interferons [IFN]
- C07K14/565—IFN-beta
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/102—Mutagenizing nucleic acids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
- Y10S530/808—Materials and products related to genetic engineering or hybrid or fused cell technology, e.g. hybridoma, monoclonal products
- Y10S530/809—Fused cells, e.g. hybridoma
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S930/00—Peptide or protein sequence
- Y10S930/01—Peptide or protein sequence
- Y10S930/14—Lymphokine; related peptides
- Y10S930/141—Interleukin
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S930/00—Peptide or protein sequence
- Y10S930/01—Peptide or protein sequence
- Y10S930/14—Lymphokine; related peptides
- Y10S930/142—Interferon
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Oncology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Virology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
本発明は組換えDNA技術の一般的分野に関す
る。更に詳しくは、本発明はシステイン残基の一
つないしそれ以上の置換／欠損によつて親類似体
（parent analogs）とは異なつた突然変異的に改
変された生物学的に活性のある蛋白質に関する。 （従来の技術及び発明が解決しようとする問題
点） 組換えDNA（rDNA）技術によつて微生物学的
につくられる生物学的に活性な蛋白質は、システ
イン残基を含有しており、それらは活性に本質的
なものではないが、分子間または分子内の望まし
くない結合を自由に形成する。このような一つの
蛋白質は、微生物学的につくられるヒトのベータ
インターフエロン（IFN−β）である。rDNA技
術によつてIFN−βをつくる過程で、高濃度の
IFN−βを含有する大腸菌（E.Coli）抽出物中
に、微生物学的につくられるIFN−βのダイマー
とオリゴマーが形成されることが見い出された。
このマルチマー形成のため、IFN−βの精製と分
離が非常な手間と時間のかかるものとなり、精製
中に蛋白質を還元し、次いで元のコンフオメーシ
ヨンに戻すためにこれを再酸化するというよう
に、精製単離手順に追加の段階が幾つか必要にな
り、それによつて不正確なジスルフイド結合形成
の可能性が高まる。更に、おそらくはマルテイマ
ー形成又はランダムな分子内ジスルフイド架橋形
成のため、微生物学的につくられるIFN−βは一
貫して低い比活性を示すともわかつた。従つて、
IFN−βのように微生物学的につくられ生物活性
のある蛋白質を、その活性に悪影響を及ぼさず、
しかも蛋白質が望ましくない三次構造（例えば蛋
白質の活性を低下させるようなコンフオメーシヨ
ン）を有する結果になるような分子間架橋や分子
内結合の形成能力を減少し、又は排除する形で改
変するのが望ましいであろう。 （問題点を解決するための手段） 本発明は定方向突然変異（directed
mutagenesis）により、親構造類似体（parent
analogs）の活性を保持するが、分子間ジスルフ
イド結合や望ましくない分子内ジスルフイド結合
の形成能力を欠いている突然変異的に改変された
生物学的活性蛋白質の製造に関する〔このような
蛋白質を「ムテイン」（mutein）という。「遺伝
学・細胞遺伝学用語辞典」（Glossary of
genetics and Cytogenetics）第４版、381頁、ス
プリンジヤー・バーラグ（1976年）〕。これに関
し、エツチ・エム・シエパード（Shepard，H.
M.）等〔Nature（1981年）294巻 563〜565頁〕
はIFN−βについて、そのアミノ酸配列の141位
置のシステインがチロシンでおき代えられたムテ
インを記述している〔ヒトIFN−βには17，31及
び141位置にシステインがある。Gene（1980年）
10巻11〜15頁及びNature（1980年）285巻 542〜
547頁〕。このムテインは、IFN−β遺伝子のヌク
レオチド485にＧ→Ａ転位をもつ部分的IFN−β
cDNAクローンから構築された雑種遺伝子の細
菌による発現によつてつくられた。このムテイン
は本来のIFN−βの生物学的活性を失つており、
著者らは置き換えられたシステインが活性に本質
的であつたと結論するに至つた。 定方向突然変異（directed mutagenesis）技法
は周知であり、アール・エフ・レイサー
（Lather，R.F.）及びジエイ・ピー・レコツク
（Lecoq，J.P.）ジエネテイツク・エンジニアリン
グ（Genetic Engineering）、アカデミツクプレ
ス社（1983年）31−50頁、に検討されている。オ
リゴヌクレオチドに指示された突然変異はエム・
スミス（Smith，M.）及びエス・ギラム
（Gillam，S.）、ジエネテイツク・エンジニアリ
ング：原理と方法、プレナムプレス社（1981年）
３巻１−32頁に具体的に検討されている。 本発明は、天然インターフエロン−βの17位の
システイン残基が他のアミノ酸残基により置き換
えられているか又は欠失しており、且つ天然イン
ターフエロン−βの生物学的活性を有する変形さ
れたインターフエロン−β、及びその製造方法に
関する。この変形されたインターフエロン−βは
一般に次の様にして製造することができる。 (a) 親蛋白質をコードした構造遺伝子の１本鎖か
らなる単鎖DNAを突然変異オリゴヌクレオチ
ドプライマーとハイブリダイズさせ（このプラ
イマーは、欠損又は代替えすべきシステイン用
コドン、又は場合によりこのコドンと対合をつ
くるアンチセンス・トリプレツトを包含する領
域に対して相補的なものであるが、当該コドン
の欠損又は他のアミノ酸をコードするトリプレ
ツトを規定するコドン又はアンチセンス・トリ
プレツトとは不一致（mismatch）である。）、 (b) DNAポリメラーゼによりプライマーを伸長
させ、突然変異性ヘテロデユプレツクス
（heteroduplex）を形成させ、そして、 (c) この突然変異性ヘテロデユプレツクスを複製
する。 本方法で用いられる突然変異株オリゴヌクレオ
チドプライマーは本発明のもう一つの面である。 本発明は、生物学的に活性な蛋白質の生物学的
活性に本質的ではないシステイン残基が、分子間
架橋又はまちがつた分子内にジスルフイド結合の
形成サイトを排除するために、計画的に欠損又は
他のアミノ酸でおき代えられているムテイン類、
このようなムテイン類をコードする突然変異遺伝
子、及びこのようなムテイン類をつくる手段を提
供する。 本発明によつて突然変異的に改変できる蛋白質
は、生物学的に活性な蛋白質のシステイン含量、
及びシステイン残基が活性と三次構造に関して果
たす役割について入手可能な情報から確認でき
る。文献ではこのような情報が入手できない蛋白
質については、本明細書に記載の手順によつて蛋
白質のシステイン残基の各々を系統的に変更し、
生ずるムテイン類の生物学的活性及びそれらが望
ましくない分子間は分子内ジスルフイド結合を形
成する傾向について試験を行なうことによつて、
この情報は決定できる。従つて、本発明はIFN−
β及びIL−２のムテイン類に関して下に特に説
明、例示されているが、望ましくないジスルフイ
ド結合の形成に対して蛋白質を感受性にするよう
な、機能的に本質的ではないシステイン残基を含
有する生物学的に活性な任意のその他の蛋白質に
以下の教示が当てはまることが認められよう。
IFN−βとIL−２以外に本発明による突然変異性
改変の候補となる蛋白質の例は、リンフオトキシ
ン（腫瘍壊死因子）とコロニー刺激因子−１、そ
れにIFN−α1である。候補蛋白質は、ふつうに
は奇数のシステイン残基をもつている。 IFN−βの場合、ブリコシル化IFNと未グリコ
シル化IFNがいずれも定量的に同様な特異的活性
を示すこと、従つて、グリコシル部分はIFN−β
の生物学的活性に関与も貢献もしていないことが
報告された。しかし、細菌でつくられるゴリコシ
ル化されていないIFN−βは、グリコシル化され
た天然IFN−βより量的に低い比活性を一貫して
示す。IFN−βは、17，31及び141の位置にシス
テイン残基をもつことが知られている。システイ
ン141は、シエパードら（前掲）により、生物学
的活性に本質的であることが立証された。４個の
システイン残基を含有するIFN−αでは、二つの
分子間−Ｓ−Ｓ−結合があり、一つはcys29と
cys138の間、他はcys1とcys98の間である。IFN
−βとIFN−αとの相同性に基づいて、IFN−β
のcys141はcys31と分子内−Ｓ−Ｓ−結合にして
おり、cys17は自由に分子間架橋を形成できるで
あろう。cys17を欠失させるか、これを別のアミ
ノ酸と置換することによつて、cys17が生物学的
活性に本質的であるかどうか、また−Ｓ−Ｓ−結
合形成におけるその役割を決定できる。cys17が
蛋白質の生物学的活性に本質的でないならば、生
ずるcys17を欠損し又はcys17が置換された蛋白質
は、自然のIFN−βのそれに近い比活性を示し、
またおそらく蛋白質の単離精製を容易にもするで
あろう。 IFN−β遺伝子のcys17用コドン（codon）の
領域に対して相補的であるがこのコドン中に１又
は複数の塩基変化を含有する合成オリゴヌクレオ
チドプライマーを用いるオリゴヌクレオチドで指
示される突然変異誘発手順を使用してデザイナー
遺伝子がつくられ、こうしてcys17がその他任意
の選択されたアミノ酸でおき代えられる。欠損を
望む場合には、cys17用コドンを欠いたオリゴヌ
クレオチドプライマーを用いる。cys17をグリシ
ン、バリン、アラニン、ロイシン、イソロイシ
ン、チロシン、フエニルアラニン、ヒスチジン、
トリプロフアン、セリン、スレオニン及びメチオ
ニンのような中性アミノ酸へ変換するのが好まし
い方法である。セリン及びスレオニンは、システ
インと化学的類似性を有するため最も好ましい代
替え物である。システインを欠失させる時は、成
熟ムテインは自然の親蛋白質又は微生物でつくら
れるIFN−βよりアミノ酸１個だけ短い。 ヒトIL−２は、蛋白質の58，105及び125位に
システイン残基をもつと報告されている。IFN−
βの場合のように、IL−２は細菌の菌体から単
離される時は集合したオリゴマー型になつてい
て、細菌抽出物から良好な収量を得るためには、
還元剤で還元しなければならない。そのうえ、精
製され還元されたIL−２は不安定であり、貯蔵
時にオリゴマー不活性型へ容易に再酸化される。
３個のシステインが存在することは、天然分子に
見られるように正しい架橋は１個だけなのに、再
酸化時に蛋白質が３個の可能な分子内ジスルフイ
ド架橋の１個を無作為に形成しうることを意味し
ている。天然IL−２蛋白質のジスルフイド構造
がいかなるものか知られていないから、IL−２
遺伝子のコドン58，105及び125に突然変異をつく
り、どのシステイン残基か活性にとつて必要であ
るか、従つてまた自然のジスルフイド架橋形成に
関与している可能性が最も大きいかを確認するた
めに本発明を使用できる。同様に、活性にとつて
必要でないシステイン残基を修飾することによつ
てまちがつた分子内ジスルフイド架橋の形成を防
ぎ、そして遊離システイン残基の除去又は置き換
えによつて分子内間ジスルフイド架橋の機会を最
小限に抑えることができる。 オリゴヌクレオチドプライマーの大きさは、突
然変異を導入すべき遺伝子領域へのプライマーの
安定なハイブリツド形成に必要な条件により、ま
た現在利用可能なオリゴヌクレオチド合成法の限
界によつて決まる。オリゴヌクレオチドで指示さ
れる突然変異誘発に使用するオリゴヌクレオチド
を設計するに当たつて、考慮すべき因子（例えば
全体の大きさ、突然変異サイトを迂回する部分の
大きさ）は、エム・スミス及びエス・ギラム（前
掲）によつて記述されている。概して、オリゴヌ
クレオチドの全長は、突然変異サイトでの安定で
ユニークな雑種形成を最適化するような長さであ
り、突然変異サイトから5′及3′末端までの伸長部
分（extensions）は、DNAポリメラーゼのエキ
ソヌクレアーゼ活性による突然変異の作用をさけ
るのに十分な大きさとする。本発明に従つて突然
変異誘発に使用されるオリゴヌクレオチドは、通
常、約12個ないし約24個の塩基、好ましくは約14
個ないし約20個の塩基、更に好ましくは約14個な
いし18個の塩基を含有する。これらは通常、変更
又は欠失されるコドンの少なくとも約３個の塩基
3′を含有する。 変更されたIFN−β遺伝子をつくる方法は、大
体において、コドン17を消失させるか、又はそれ
が別のアミノ酸をコードするように変更する合成
ヌクレオチドプライマーを使用して、IFN−β遺
伝子のコドン17（TGT）に部位特異的突然変異を
誘発せしめるものである。システインをスレオニ
ンに変え、プライマーをIFN−β遺伝子のアンチ
センス鎖にハイブリツド形成させる場合、好まし
いヌクレオチドプライマーはGCAATTTTC
ACTCAGである（下線は変更されたコドンを示
す）。システインを欠失させるのが望ましい時は、
好ましいプライマーは
AGCAATTTTCAGCAGAAGCTCCTGであ
り、これはcysに対するTGTコドンを喪失してい
る。システインをセリンに代える時は、セリン用
のAGTコドンを含んだ17−ヌクレオチドプライ
マーGCAATTTTCAGAGTCAGが選択される。
cys17で第一塩基Ｔ→Ａの転位により、システイ
ンからセリンへの変化が起る。欠失を導入する時
には、所望の蛋白質の発現のために、DNA配列
の適正のリーデイングフレームを保持しなければ
ならない点を認識しなければならない。 プライマーはIFN−β遺伝子の１本鎖がクロー
ニングされたM13，fd，又はφ×174のような１
本鎖フアージへハイブリツド形成される。フアー
ジが遺伝子のセンス鎖、アンチセンス鎖のいずれ
でも担持できることは認められよう。フアージが
アンチセンス鎖を担持する場合には、プライマー
は、コドンの欠損、又は別のアミノ酸をコードす
るトリプレツトを規定するこのコドンとは一致し
ないが、突然変異させるコドンを含有するセンス
鎖の領域と同一である。フアージがセンス鎖を担
持する場合は、欠失させるコドンと対合するトリ
プレツト中では適当に不一致であるが、突然変異
させるコドンを含有するセンス鎖の領域に対して
相補的である。ハイブリツド形成に使用される条
件はエム・スミス及びエス・ギラム（前掲）によ
つて記述されている。温度は通常、約０℃ないし
70℃、もつと一般的には約10℃ないし50℃の範囲
にある。ハイブリツド形成後、プライマーは
DNAポリメラーゼＩ、T4DNAポリメラーゼ、
逆転写酵素又は他の適当なDNAポリメラーゼと
の反応によつてフアージDNA上で伸長される。
生ずるdsDNAは、T4DNAリガーゼのような
DNAリガーゼでの処理によつて閉環状dsDNAへ
変換される。１本鎖領域を含有するDNA分子は
S1エンドヌクレアーゼ処理によつて破壊できる。 オリゴヌクレアーゼで指示される突然変異誘発
は、IL−２活性をもつがcys125からセリン125へ
変更されたムテインをコードする突然変異IL−
２遺伝子をつくるにも同様に使用できる。フアー
ジが遺伝子のセンス鎖を担持する場合に、この突
然変異IL−２遺伝子をつくるのに使われる好ま
しいオリゴヌクレオチドプライマーは
GATGATGCTTCTGAGAAAAGGTAATCで
ある。このオリゴヌクレオチドは、IL−２遺伝
子のコドン125と対合するトリプレツトのまん中
の塩基にＣ→Ｇの変化を有する。 得られた突然変異性ヘテロデイプレツクスは、
コンピテント宿主生物又は細胞を形質転換するの
に使用される。宿主によるヘテロデユプレツクス
の複製により、双方の鎖から子孫鎖ができる。複
製に続いて、突然変異鎖の子孫から突然変異遺伝
子を単離し、適当なベクターへ挿入し、このベク
ターを適当な宿主生物又は細胞の形質転換に使用
する。好ましいベクター類はプラスミド
pBR322，pCR1及びそれらの変異体、合成ベク
ター等である。適当な宿主生物はE.コリ（E.
Coli）、シユードモーナス（Pseudomonas）、バ
シルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）、バシ
ルス・スリンギエンシス（Bacillus
thuringiensis）、種々の酵母菌株、バシルス・サ
ーモフイルス（Bacillus thermophilus）、ハツカ
ネズミやラツト、チヤイニーズハムスターの卵巣
（CHO）細胞のような動物細胞、植物細胞、動植
物宿主等である。選んだ宿主をベクターで形質転
換する場合に、ムテインが発現されるために適当
なプロモータ・オペレーター配列も導入されるこ
とは認識されなければならない。宿主は原核生物
でも真核生物でも良い。（真核細胞へDNAを挿入
する方法は1981年９月３日公表されたPCT出願
番号US81／00239及びUS81／00240に記述されて
いる）。E.コリとCHO細胞が好ましい宿主であ
る。本発明に従つて得られるムテイン類は、天然
の親蛋白質に生ずるグリコシル化およびムテイン
調製に使われる宿主生物に依存してグリコシル化
される場合もされない場合もある。所望により、
宿主としてE.コリ（E.Coli）及びバシルス
（Bacillus）を使用する場合に得られる未グリコ
シル化ムテインを、この技術分野で知られている
科学的、酵素的及びその他の変法によつて生体外
で任意にグリコシル化してよい。 IFN−βに関する本発明の好ましい態様におい
ては、第１図に示すように、IFN−βのアミノ酸
配列において17位のシステイン残基は、成熟IFN
−βをコードするDNA配列のセンス鎖のコドン
17の第一塩基のＴ→Ａ転位によつて、セリンへ変
えられる。この部位特異的な突然変異誘発は、合
成17−ヌクレオチドプライマー
GCAATTTTCAGAGTCAGを使用して誘発さ
れ、このプライマーはコドン17の第一塩基に一個
の塩基の不一致がある以外は、コドン17の領域に
おけるIFN−βのセンス鎖上の17の個ヌクレオチ
ド配列と同一である。この不一致はプライマーの
ヌクレオチド12にある。遺伝暗号（コドン）は縮
重（degenerate）しており、アミノ酸の多くは
一つ以上のコドンによつて暗号づけられることが
認識されなければならない。例えばセリンの塩基
暗号は、TCT，TCG，TCC，TCA，AGT，及
びACGというコドンがいずれもセリンをコード
するように、６通りの縮重である。便宜上、好ま
しい態様としてAGTコドンが選ばれた。同様に、
スレオニンはACT，ACA，ACC及びACGのコ
ドンのどの一つによつてもコードされる。特定ア
ミノ酸に対して１コドンを特定する時は、これが
そのアミノ酸をコードするすべての縮重コドンを
包含することが意図されている。17−merは、
IFN−β遺伝子のアンチセンス鎖を担持する１本
鎖M13フアージDNAにハイブリツド形成される。
次に、DNAポリメラーゼＩ Klenow断片を使
用して、オリゴヌ然変異性ヘテロデユプレツクス
の複製によつて、不一致を含有するDNA鎖から
クローンが得られる。突然変異クローンは、特定
の制限位置の存在又は不存在、抗生物質耐性もし
くは感受性、又はこの技術分野において知られた
その他の方法によつて確認され、スクリーニング
される。システインをセリンによりおき代える場
合は、第２図に示されるＴ→Ａ転位によつて、構
造遺伝子の中に新しいHinf制限部位がつくら
れる。突然変異クローンは、突然変異したフアー
ジプラークのハイブリツド形成スクリーニングに
おけるプローブとしてオリゴヌクレオチドプライ
マーを使用して同定される。第２図に示されるよ
うに、プライマーは親とハイブリツド形成される
時は唯一の不一致を有するが、突然変異したフア
ージDNAにハイブリツド形成される時は完全は
一致を有するであろう。オリゴヌクレオチドプラ
イマーを親DNAよりも突然変異DNAへ優先的に
ハイブリツド形成させるようなハイブリツド形成
の条件を工夫できる。新しく発生したHinf部
位も、IFN−β遺伝子の単一塩基の突然変異を確
認する手段として役立つ。 突然変異した遺伝子を担持するM13フアージ
DNAを単離し、プラスミドpTrp3のような適当
な発現ベクター中へ組み入れ、このベクターで大
腸菌MM294株を形質転換させる。形質転換体と
その子孫を培養するのに適した生育培地が当業者
に知られている。IFN−βの発現されたムテイン
を単離精製し、特徴づける。 以下の実施例は本発明の一層の理解を助けるた
め、また例示だけの目的で提示されている。これ
らはいかなる形においても本発明の範囲を限定す
るものと考えられてはならない。実施例１〜９は
IFN−βのムテインの調製を記述している。実施
例10〜15はIL−２のムテインの調製を記述して
いる。 実施例１ IFN−β遺伝子のM13ベクターへのク
ローニング １本鎖DNA鋳型の給源としてM13フアージベ
クターを使用することは、ジー・エフ・テンプル
（G.F.Temple）ら、Nature（1982年）296巻 537
−540頁で実証された。大腸菌trpプロモーターの
制御下にIFN−β遺伝子を含有するプラスミド
pβ1trp（第３図）を制限酵素Hind及びXhoで
消化した。なお前記プラスミドpβ1trpは、プラス
ミドpBR322のEcoR部位とHind部位との間
にＥ．coli trpプロモーターを挿入することに
よりプラスミドpTrp3を得、このプラスミドの
Hind部位とBam部位との間にヒトの成熟繊
維芽細胞インターフエロンをコードするDNA断
片を挿入することにより作製したものである
（D.F.Mark等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA，
Vol81，5662−5666，1984）。M13mp8〔ジエイ・
メツシング（J.Messing）．「巨大分子に関する第
３回クリーブランド・シンポジウム：組換え
DNA」エイ・ウオールトン編、エルザビアプレ
ス社、143−153頁（1981年）〕複製型（RF）
DNA（第４図）を制限酵素Hind及びBamH
で消化し、予めHind及びXhoで消化してお
いたpβ1trpDNAと混合した。次に混合物を
T4DNAニガーゼで連結し、連結DNAを大腸菌
−JM103株（Maniatis等、Molecular Cloning
Ａ Laboratory Mannual，Cold Spring
Harbor Laboratory，1982，Appendix Ｃ，506
頁を参照のこと）のコンピテント細胞中へ形質転
換させ、Xgalインデイケータープレート上に播
いた〔ジエイ・メツシング等、Nucleic Acids
Res（1981年）９巻 309−321頁〕。組換えフアー
ジを含有するプラーク（白いプラーク）を取り上
げ、新鮮なJM103の培養物に接種し、そして感染
細胞からRF分子のミニプレツプを調製した（エ
ツチ・デイー・バーンボイム（H.D.Birnboim）
及びジエイ・ドリイ（J.Doly）、Nucleic Acid
Res（1979年）７巻 1513−1523頁）。IFN−β挿
入部を含有するクローンを同定するために、RF
分子を種々の制限酵素で消化した。このような１
クローン（M13−β1）の制限地図を第５図に示
す。M13−β1クローンから１本鎖（ss）フアージ
DNAをつくり、合成オリゴヌクレオチドを使用
する部位特異的突然変異誘発の鋳型として用い
た。 実施例２ 部位特異的突然変異誘発 0.1mMアデノシン三燐酸（ATP）、50mMヒド
ロキシメチルアミノメタン塩酸塩（トリス−塩
酸）PH8.0、10mM塩化マグネシウム、5mMジチ
オスレイトール（DDT）及びT4キナーゼ９単位
の存在下に、50μ中で合成オリゴヌクレオチド
GCAATTTTCAGAGTCAG（プライマー）40ピ
コモルをT4キナーゼにより37℃で１時間処理し
た。50mM塩化ナトリウム、10mMトリス−塩
酸、PH8.0、10mM塩化マグネシウム及び10mMβ
−メルカプトエタノールを含有する混合物50μ
中で、このキナーゼ処理されたプライマー（12ピ
コモル）を67℃で５分、及び42℃で25分加熱する
ことによつて１本鎖（ss）M13−β1DNA5μｇに
ハイブリツド形成させた。アニーリングした混合
物を次に氷上で冷却し、0.5mM各デオキシヌク
レオチド三燐酸（dNTP）、80mMトリス−塩酸、
PH7.4、8mM塩化マグネシウム、100mM塩化ナ
トリウム、DNAポリメラーゼ Klenow断片
９単位、0.5mMATP及びT4DNAリガーゼ２単
位を含有する反応混合物50μに添加し、37℃で
３時間及び25℃で２時間インキユベートした。次
にフエノール抽出とエタノール沈澱によつて反応
を停止させた。DNAを10mMトリス−塩酸、PH
8.0、10mMエチレンジアミン四酢酸（EDTA）、
50％蔗糖及び0.05％ブロモフエニルブルー中に溶
解し、臭化エチジウム2μｇ／mlの存在下、0.8％
アガロースゲル上の電気泳動にかけた。M13−
β1のRF型に対応するDNAバンドをパーコレート
法〔アール・ダブリユー・デービス（R.W.
Davis）３、「高等細菌遺伝学」（Advanced
Bacterial Genetics）、コールド・スプリング・
ハーバー研究所、N.Y.178〜179頁（1980年）〕に
よつてゲルスライスから溶離した。溶離された
DNAをコンピテントJM103細胞の形質転換に使
用し、菌を一夜生育させ、培養基上澄液から
ssDNAを単離した。このssDNAをプライマー伸
張の第二サイクルに鋳型として使用し、ゲル精製
されたRF型DNAをコンピテントJM103細胞中へ
形質転換させ、寒天プレート上に播き、一夜培養
するとフアージプラークが得られる。 実施例３ 部位特異的突然変異誘発 上の実施例２の実験をくり返す。但し、合成オ
リゴヌクレオチドプライマーとして、システイン
をコードするものからスレオニンをコードするも
のへIFN−β遺伝子のコドン17を変えるのに
GCAATTTTCAGACTCAGを使用する。 実施例４ 部位特異的欠損 上の実施例２の実験をくり返す。但し合成オリ
ゴヌクレオチドプライマーとしてはIFN−β遺伝
子のコドン17を欠損させるのに
AGCAATTTTCAGCAGAAGCTCCTGを使用
する。 実施例５ 突然変異誘発されたプラークのスクリ
ーニング及び同定 突然変異させたM13−β1プラークの入つたプ
レート（実施例１）並びに突然変異しないM13−
β1フアージプラークの入つた２枚のプレートを
４℃に冷却し、各プレートからのプラークを２枚
のニトロセルロース円形フイルター上へ、第一フ
イルターの場合には乾燥フイルターを寒天プレー
ト上へ５分間重ね、第二フイルターの場合は15分
間重ねて移した。次に0.2NNaOH、1.5M塩化ナ
トリウム及び0.2％トリトンＸ−100に浸した厚手
の濾紙上へフイルター類を５分間置き、次に
0.5Mトリス−塩酸、PH7.5、及び1.5M塩化ナトリ
ウムに浸した濾紙上へ更に５分間重ねて中和し
た。フイルターを同様なやり方で、２×SSC（標
準くえん酸塩）に浸したフイルター上で２回洗
い、乾燥し、真空乾燥炉内で80℃で２時間乾燥さ
せた。重複フイルターをフイルター当たり10mlの
DNAハイブリツド形成緩衝液（５×SSC），PH
7.0，４×デンハード液（ポリビニルピロリドン，
フイコール及び牛血清アルブミン，１×＝各0.02
％）、0.1％ドデシル硫酸ナトリウム（SDS），
50mM燐酸ナトリウム緩衝液、PH7.0及び100μ
ｇ／mlの変性サケ精子DNAにより、55℃で４時
間、事前ハイブリツド形成させた。オリゴヌクレ
オチドプライマーを32Pで標識した。ATPでキナ
ーゼ下に処理することによつて32Pで標識したプ
ローブをつくつた。フイルター当たり５mlの
DNAハイブリド形成緩衝液中でフイルターを32P
で標識したプライマー3.5×105cps／mlに55℃で
24時間ハイブリツド形成させた。0.1％SDSと減
少する量のSSCを含有する洗浄用緩衝液中でそれ
ぞれ30分。55℃でフイルター類を洗つた。フイル
ター類を、初めに２×SSCを含んだ緩衝液で洗
い、そして突然変異していないM13−β1プラー
クを含有する対照フイルターはガイガー計数管を
用いて放射能の存在について検査した。SSC濃度
を段階的に低下させ、未突然変異M13−β1プラ
ークをもつ対照フイルター上に検出可能な放射能
が残らなくなるまでフイルターを洗つた。SSCの
使用最低濃度は0.1×SSCであつた。フイルター
を空気乾燥し、−70℃で２〜３日オートラジオグ
ラフ処理した。突然変異したM13−β1のプラー
ク480個と突然変異していない対照プラーク100個
をキナーゼ処理したオリゴヌクレオチドプローブ
によつてスクリーニングした。対照プラークでは
プローブとハイブリツド形成したものが全く存在
せず、一方突然変異したM13−β1プラーク５個
がプローブとハイブリツドを形成した。 ５個の突然変異M13−β1プラークの１個
（M13−SY2501）を取り上げ、JM103培養基へ接
種した。上澄液からssDNAを調製し、そして細
胞ペレツトから２本鎖（ds）DNAを調製した。
M13ユニバーサルプライマーを使用して、クロー
ンのジデオキシ配列決定用の鋳型としてssDNA
を使用した。配列決定分析の結果を第６図に示
す。この結果は、TGTcysコドンがAGTserコド
ンへ変換されたことを確証している。 実施例６ 大腸菌における突然変異IFN−βの発
現 M13−SY2501からのRF DNAを制限酵素
Hind及びXhoで消化し、520bpの挿入断片を
１％アガロースゲル上で精製した。大腸菌trpプ
ロモーターを含有するプラスミドpTrp3（第７図）
を酵素Hind及びBamHで消化し、精製した
M13−SY2501断片と混合し、T4DNAリガーゼ
の存在下に連結した。なお、前記プラスミド
pTrp3はプラスミドpBR322のEcoR部位と
Hind部位との間にＥ．coli trpプロモーター
を挿入することにより作製したものである。（D.
F.Mark等、Pro.Natl.Acad.Sci.USA，Vol81，
5662−5666，1984を参照のこと）。連結DNAをE.
コリMM294株へ形質転換した。アンピシリン耐
性形質転換体を薬剤テトラサイクリンに対する感
受性の点からスクリーニングした。アンピシリン
耐性でテトラサイクリン感受性の５クローンから
のプラスミドDNAを、M13−SY2501挿入部の存
在についてスクリーニングするためHinfで消
化した。第８ａ図は、クローンの一つ
（pSY2501）のHinf制限パターンを示すが、図
ではこれを元のIFN−βクローンすなわちpβ1trp
のHinfパターンを比較している。予想のよう
に、pSY2501に追加のHinfサイトがあり、
197bpのIFN−β内部断片が169bpの断片と28bp
の断片に切れている（第８ｂ図）。クローン
pSY2501の制限地図を第９図に示す。突然変異
IFN−β遺伝子の完全なDNA配列を、予測され
たアミノ酸配列と一緒に第１０図に示す。クロー
ンpSY2501と称するプラスミドは60604イリノイ
州ペオリア，ノース・ユニバーシテイ・ストリー
ト1815番地、米国農務省、科学教育局北部研究セ
ンター、発酵研究所のアグリカルチユラル・リサ
ーチ・カルチヤーコレクシヨン（NRRL）に寄
託されている。指定された寄託番号は
CMCC1533号及びNRRLB−15356号である。 pSY2501及びpβ1trp（子孫を含む）の培養物を
1.0の光学密度（OD600）まで生育させた。無細胞
抽出物をつくり、IFN−βの抗ウイルス活性量を
微量力価検定法でGM2767細胞によつて検定し
た。クローンpSY2501の抽出物はpβ1trpより３〜
10倍高い活性を示し（第１表）、クローン
pSY2501がIFN−β活性を示す蛋白質をより多量
に合成しているか、又はつくられた蛋白質がより
高い比活性をもつているかのいずれかであること
が示される。 第 １ 表抽出物 抗ウイルス活性（単位／ml） pSY2501 ６×105 pβ1trp １×105 ptrp3（対照） 30 クローンpSY2501が数倍多い活性蛋白を合成し
ていたかどうか決定するため、両クローンの抽出
物を対照抽出物と共にSDSポリアクリルアミドゲ
ル上の電気泳動にかけ、ゲルをクーマーシーブル
ーで染色して蛋白質を発色させた。第１１図に示
すように、クローンpSY2501とpβ1trpの抽出物中
に存在するが対照のptrp3抽出物中にはない約
18000ダルトンの蛋白質に対応する蛋白質バンド
が一つだけあつた。この蛋白質は約20000ダルト
ンの分子量をもつが、18000ダルトンの蛋白質の
ゲル移動パターンを示しており、pβ1trpの抽出物
からこの蛋白質を精製することによつてIFN−β
であることが予めわかつていた。pSY2501抽出物
中にはpβ1trpの抽出物中よりこの蛋白質の量が少
ないから、クローンpSY2501抽出物中の蛋白質の
比活性はクローンpβ1trpのそれより高い。 実施例７ IFM−βser17の精製 IFN−βser17をつくるように形質転換されたE.
コリからIFN−βser17を回収した。E.コリを次の
生育培地中で、680nmで10〜11の光学密度（乾燥
重量8.4ｇ／）まで生育させた。 成分 濃度 塩化アンモニウム 20mM 硫酸カリウム 16.1mM 燐酸一カリウム 7.8mM 燐酸二ナトリウム 12.2mM 硫酸マグネシウム・七水和物 3mM クエン酸三ナトリウム・二水和物 1.5mM 硫酸マンガン・四水和物 30μM 硫酸亜鉛・七水和物 30μM 硫酸銅・五水和物 3μM Ｌ−トリプトフアン 70mg／ 硫酸第一鉄・七水和物 72μM チアミン塩酸塩 20mg／ グルコース 40ｇ／ アンモニアでPH調製 形質転換ずみE.コリの収穫物9.9（9.9Kg）を
20℃に冷却し、濾液重量が８，８Kgになるまで、
収穫物を−110kpaの平均圧力損失と毎分260mlの
定常濾液流量でクロスフローフイルターに通すこ
とにより濃縮した。濃縮液（約１）を容器に流
し込み、15℃に冷却した。濃縮液を５℃、約
69000kpaでマントン＝ゴーリンホモジナイザー
に通すことによつて濃縮液中の菌体を破砕した。
燐酸塩で緩衝化された食塩水、PH7.4（PBS）１
でホモジナイザーを洗い、洗浄液を破砕物に加え
ると、２の最終容量が得られた。この容量を毎
分50mlの流量で12000xgの連続遠心分離にかけ
た。固体を上澄液から分離し、２重量％SDSを含
有するPBS4に再懸濁させた。この懸濁液を室
温で15分かきまぜたあと、目に見える懸濁物はな
かつた。次に溶液を２−ブタノールで、２−ブタ
ノール：溶液の１：１容量比で抽出した。液−液
相分離装置中で毎分200mlの流量を用いて抽出を
行なつた。次に有機相を分離し、そして蒸発乾固
させることにより蛋白質21.3ｇを得た。これを蒸
留水に１：10の容量比で再懸濁した。 回収された生成物は、ウイルスの細胞病理作用
（CPE）に対する防護に基づく検定を用いて、ヒ
トIFN−β活性について検定された。ミクロタイ
タープレート内でこの検定を行なつた。最小基本
培地50μを各容器に仕込み、第一容器には資料
25μを入れ、つぎ容器以降には１：３の容量の
希釈を連続的に行なつた。ウイルス（水泡性口内
炎）、細胞（ヒト線維芽細胞GM−2767系統）及
び標準IFN−β対照群を各プレートに収容せしめ
た。ml当たり100単位の標準IFN−βを使用した。
次にプレートに紫外線を10分間照射した。照射
後、細胞懸濁液（ml当たり細胞1.2×105）100μ
を各容器に加え、トレーを18−24時間インキユベ
ートした。細胞当たり１プラーク形成単位でウイ
ルス液を細胞対照プレートを除く各容器に加え
た。ウイルス対照が100％のCPEを示すまでトレ
ーをインキユベートした。これは、ウイルス液を
加えてから通常18〜24時間で生じた。標準IFN−
β対照の50％CPE容器の位置の点から検定結果
を解釈した。この点からプレート上の全試料につ
いてのインターフエロンの力価を測定した。回収
された生成物の比活性は５×107Ｕ／mlと決定さ
れた。 実施例８ 酸沈澱及びクロマトグラフイによる精
製 実施例７の方法をくり返したが、但し、抽出、
水相と有機相の分離、及び有機相とPBSとの容
量比３：１での混合の後、氷酢酸の添加によつて
混合物のPHを約５に下げた。生じた沈澱物を
10000〜17000xg，15分間の遠心分離によつて分
離し、ペレツトを10％Ｗ／Ｖ SDS，10mM
DTT，50mM酢酸ナトリウム緩衝液，PH5.5に再
溶解し、80℃に５分間加熱した。 次に、溶液を、ベツクマン勾配系を使用して、
ブラウンリーRP−300，10mM，「アクアポア」
カラムにかけた。緩衝液Ａは水中0.1％トリフル
オロ酢酸（TFA）であり、緩衝液Ｂはアセトニ
トリル中0.1％TFAとした。検出は280nmでの紫
外線吸光度によつた。溶媒プログラムは３時間で
０％緩衝液Ｂから100％緩衝液Ｂへの線形勾配と
した。最高のインターフエロン活性を含有するフ
ラクシヨンをプールし、このプールされたインタ
ーフエロン調製物の比活性は、天然のIFN−βに
おける蛋白質mg当たり約２×108国際単位に比べ、
9.0×107ないし3.8×108Ｕ／mlと決定された。 実施例９ IFN−βser17の生化学的特徴付け 5.7NHCl，0.1％フエノールの200μ中におい
て試料40μｇを108℃で24〜72時間の加水分解に
かけた後、アミノ酸組成を決定した。プロリンと
システインは、過蟻酸酸化後、同じやり方で決定
された。この場合、フエノールを加水分解から省
略した。トリプトフアンは、5.7N塩酸，10％メ
ルカプト酢酸（フエノールなし）中で試料400μ
を24時間加水分解した後に分析した。分析は、
AA10樹脂の単一カラムを使用するベツクマン
121MBアミノ酸分析装置で行なつた。精製IFN
−βser17の代表的な24−，48−，72−時間の酸加
水分解から計算されるアミノ酸組成は、Ｎ−末端
メチオニンが欠けているほかは、クローンIFN遺
伝子のDNA配列によつて予測されるものとよく
一致している。精製IFNのアミノ酸末端
（terminus）からの最初の58残基のアミノ酸配列
は、試料0.7mgから、ベツクマン890C配列測定装
置で0.1Mクアドロール緩衝液を使つて決定され
た。PTHアミノ酸は、アルテツクスウルトラス
フエアーODSカラム（4.6×250mm）による逆相高
圧液体クロマトグラフイ（HPLC）に45℃でか
け、40％緩衝液Ｂで1.3分、40〜70％緩衝液Ｂで
8.4分溶出することにより決定された。ここで緩
衝液Ａは0.0115M酢酸ナトリウム，５％テトラヒ
ドロフラン（THF），PH5.11であり、緩衝液Ｂは
アセトニトリル中10％THFであつた。 決定されたIFN−βser17のＮ末端アミノ酸配列
は、Ｎ−末端メチオニンの不在を除き、DNA配
列から予測される予測配列に一致している。 上に示したように、IFN−βser17調製物は天然
のIFN−βの比活性レベルに非常に近いか、それ
よりすぐれた活性を示す。IFN−βser17は遊離ス
ルフヒドリル基をもたないが、31及び141位にだ
け残つているシステイン間に１個の−Ｓ−Ｓ−結
合を示す。蛋白質は容易にオリゴマーをつくら
ず、実質的にモノマー型にあると考えられる。本
発明に従つて得られるIFN−βser17は単一生成物
として又は種々の型の混合物として不活性，無毒
性，非アレルギー性で、生理的に許容される担体
媒体中における医薬として受け入れられる製剤へ
処方でき、がん療法で、又はインターフエロン療
法が指示される症状における臨床用，治療用に、
またウイルス感染用に使用できる。このような媒
体は蒸留水，生理食塩水，リンゲル液，ハンク液
等をを包含するが、これらに限定はされない。デ
キストロース，HSA（ヒト血清アルブミン）等の
ような他の無毒性の安定化・可溶化用の添加物も
最適に包含してよい。治療処方剤は、経口で、又
は静脈内，筋肉内，腹腔内及び皮下投与のような
非経口で投与できる。本発明の変形IFN−β製剤
は、局所用に通常利用される適当な媒体中で局所
適用のためにも使用できる。 上記のIFN−βムテインの主な利点は、IFN−
βの17位の遊離スルフヒドリル基（−SH基）を
排除されているところにあり、これによつてムテ
インにcys31とcys141の間に正しいジスルフイド
結合を形成させ、十分な生物学的活性に明白に必
要なコンフオメーシヨンを取らせている。IFN−
βser17の増大した比活性のため、治療用により少
ない投与量が使える。17位置のシステインを欠失
させ、遊離−SH基を排除することによつて、
IFN−βser17蛋白質は微生物でつくられるIFN−
βほどたやすくダイマーやオリゴマーを形成しな
い。これが蛋白質の精製を容易にし、その安定性
を強める。 実施例10 （参考例） ヒトIL−２をコードするcDNAクローンのヌ
クレオチド配列、IL−2cDNAライブラリーをつ
くる手順、これをIL−２についてスクリーニン
グ手順はテイー・タニグチ（Taniguchi，T.），
Nature（1983年）24巻 305頁以降に記述されて
いる。 有力なIL−2cDNAクローンに関して濃縮され
たcDNAライブラリーは、慣用手順により、誘導
された末梢血液リンパ球（PBL）とジヤーカツ
ト細胞から得られる濃縮されたIL−2mRNAフラ
クシヨンからつくられた。IL−２用mRNAの濃
縮は、mRNAを分画し、フラクシヨンをキセノ
プス・ラエビス（Xenopus laevis）の未成熟卵
母細胞に注入し、卵母細胞の溶解物のIL−２活
性をHT−２細胞で検定し、IL−2mRNA活性を
もつフラクシヨンを確認することによつて行つた
〔ジエイ・ワトソン（J.Watoson），J.Exp.Med.
（1979年）150巻1570〜1519頁及びエス・ギリス
（S.Gillis）等、J.Immun.（1978年）120巻2027〜
2032頁〕 実施例11（参考例） IL−2cDNAクローンのス
クリーニングと同定 コロニーハイブリツド形成法を用いて、IL−
2cDNAライブラリーをスクリーニングした。各
ミクロタイタープレートを重層したニトロセルロ
ース濾紙（Ｓ＆ＳタイプBA−85）上にレプリカ
法で写取り、アンピシリン50μｇ／mlを含有する
Ｌ寒天上で37℃，14〜16時間生育させた。コロニ
ーを溶解し、500mM水酸化ナトリウム，1.5M塩
化ナトリウムで５分の連続処理することによつて
DNAをフイルターに固定し、５×標準クエン酸
塩溶液（SSC）で５分ずつ２回洗つた。フイルタ
ーを空気乾燥し、80℃で２時間炉乾燥した。重層
フイルターをフイルター当たり10mlのDNAハイ
ブリツド形成緩衝液（50％ホルムアミド，５×
SSC，PH7.0，５×デンハード液（ポリビニルピ
ロリジン，フイコール及び牛血清アルブミン；１
×＝各0.2％），PH7.0の50mM燐酸ナトリウム緩衝
液，0.2％SDS，20μｇ／mlポリＵ及び50μｇ／ml
の変形サケ精子DNAにより、42℃で６〜８時間
事前ハイブリツド形成させた。 タニグチ（前掲）に報告されたIL−２遺伝子
配列に基づいて32Pで標識された20−merオリゴ
ヌクレオチドプローブをつくつた。プローブのヌ
クレオチド配列は
GTGGCCTTCTTGGGCATGTAであつた。 32PcDNAプローブを含有するフイルター当た
り５mlのDNAハイブリツド形成緩衝液で、試料
を42℃で24〜36時間ハイブリツド形成させた。フ
イルターを２×SSC，0.1％SDS，で30分間ずつ
２回50℃で洗い、次に１×SSCと0.1％SDSで90
分ずつ２回50℃で洗い、空気乾燥し、−70℃で２
〜３日間オートラジオグラフにかけた。陽性のク
ローンを同定し、プローブで再度スクリーニング
した。十分な長さのクローンが、制限酵素地図作
製、及びタニグチら（前掲）が報告したIL−
2cDNAクローンの配列との比較から確認された。 実施例12（参考例） M13ベクターへのIL−２遺
伝子のクローニング 大腸菌trpプロモーターの制御下にIL−２遺伝
子を含有するプラスミドpLW1（第１２図）を使
用して、実施例１に記載のと同様にIL−２遺伝
子をM13mp9へクローニングした。pLW1の試料
は1983年８月４日、20852合衆国メリーランド州
ロツクビル，パークローン・ドライブ12301番地，
アメリカタイプ・カルチヤー・コレクシヨンに預
託され、ATCC39，405号と指定を受けた。IL−
２挿入部を含有する１クローン（M13−IL−２
と称する）の制限地図を第１３図に示す。１本鎖
フアージDNAをクローンM13−IL−２からつく
り、オロゴヌクレオチドで指示される突然変異誘
発用の鋳型として使用した。 実施例13（参考例） オリゴヌクレオチドで指示
された突然変異誘発 前記のとおり、IL−２はアミノ酸位置58，105
及び125にシステイン残基を含んでいる。IL−２
遺伝子中でこれらの３個のシステイン残基用コド
ンを含有する部分のヌクレオチド配列に基づい
て、三つのオリゴヌクレオチドプライマーを設計
し、これらの残基用コドンをセリン用コドンへ突
然変異せしめるために合成した。これらのオリゴ
ヌクレオチドは次の配列をもつている。 cys58を変える CTTCTAGAGACTGCAGA
TGTTTC （DM27） cys105を変える CATCAGCATACTCAGA
CATGAATG （DM28） cys125を変える GATGATGCTCTGAGA
AAAGGTAATC （DM29） 0.1mM ATD，50mMトリス−塩酸，PH8.0，
10mM塩化マグネシウム，5mM DTT及びT4キ
ナーゼ９単位の存在下に、50μ中で各オリゴヌ
クレオチド40ピコモルを別々に37℃で１時間キナ
ーゼ処理した。キナーゼ処理されたプライマー
（10ピコモル）の各々を、100mM塩化ナトリウ
ム，20mMトリス−塩酸，PH7.9，20mM塩化マ
グネシウム及び20mMβ−メルカプトエタノール
を含有する混合物15μ中で、67℃で５分及び42
℃で25分加熱することによつてssM13−IL−
2DNA2.6μｇへハイブリツド形成した。アニーリ
ングされた混合物を氷上で冷却し、次に0.5mM
各dNTP，17mMトリス−塩酸（PH7.9），17mM
塩化マグネシウム，83mM塩化ナトリウム，
17mMβ−メルカプトエタノール、DNAポリメラ
ーゼIKlenow断片５単位，0.5mMATP，及び
T4DNAリガーゼ２単位を含有する反応混合物
25μの最終容量まで調製し、37℃で５時間イン
キユベートした。80℃に加熱して反応を停止さ
せ、反応混合物をコンピテントJM103細胞の形質
転換に使用し、寒天プレート上に播いて一夜培養
すると、フアージプラークが得られた。 実施例14（参考例） 突然変異誘発されたフアー
ジプラークのスクリーニングと同定 突然変異誘発されたM13−IL−２プラークを
含んだプレートと、突然変異誘発されないM13−
IL−２フアージプラークを含んだプレート２枚
とを４℃に冷却し、各プレートからのフアージプ
ラークを２枚のニトロセルロース円形フイルター
上へ、第一フイルターの場合には乾燥フイルター
を寒天プレート上へ５分間重ね、第二フイルター
の場合には15分間重ねて移した。次に0.2N水酸
化ナトリウム，15M塩化ナトリウム及び0.2％ト
リトンに浸した厚手の濾紙上にフイルターを５分
間置き、次に0.5Mトリス−HCl（PH7.5）と
1.5MNaClに浸した濾紙上へさらに５分間重ねて
中和した。フイルターを同様なやり方で、２×
SSCに浸したフイルター上で２回洗い、乾燥して
から真空乾燥炉内で80℃で２時間乾燥した。重層
フイルターをフイルター当たり10mlのDNAハイ
ブリツド形成緩衝液（５×SSC），PH7.0，４×デ
ンハード液（ポリビニルピロリジン，フイコール
及び牛血清アルブミン，１×＝各0.02％），0.1％
SDS，50mM燐酸ナトリウム緩衝液（PH7.0）及
び100μｇ／ml変性サケ精子DNAにより、42℃で
４時間事前ハイブリツド形成させた。標識をつけ
たATPでオリゴヌクレオチドプライマーをキナ
ーゼ処理することによつて、32Pで標識をつけたプ
ローブをつくつた。フイルター当たり５mlの
DNAハイブリツド形成緩衝液中で42℃で８時間、
32Pで標識したプライマー0.1×105cpm／mlにフ
イルターをハイブリツド形成させた。0.1％SDS
及び２×SSCを含有する洗浄緩衝液中で50℃でそ
れぞれ30分ずつ２回、次に0.1％SDS及び0.2×
SSCで50℃でそれぞれ30分ずつ２回フイルターを
洗つた。フイルターを空気乾燥し、−70℃で２〜
３日オートラジオグラフイにかけた。 オリゴヌクレオチドプライマーDM28及び
DM29は、突然変異誘発されたクローンに新しい
Dde制限部位を創出するように設計されている
から（第14表）、これらのキナーゼ処理されたプ
ライマーとハイブリツド形成された幾つかのクロ
ーンからのRF−DNAを制限酵素Ddeで消化し
た。プライマーDM28とハイブリツド形成し、新
しいDde制限部位をもつ突然変異誘発された
M13−IL−２プラークの一つ（M13−LW44）を
取り上げ、JM103培養物へ接種し、培養上澄液か
らssDNAを調製し、細胞ペレツトからdsRF−
DNAを調製した。同じく、プライマーDM29と
ハイブリツド形成させたプラーク（M13−
LW46）を取り上げ、これからssDNAとRF−
DNAを調製した。オリゴヌクレオチドプライマ
ーDM27はDde位置の代わりに新しいPst制
限部位を創出するように設計されている。従つ
て、このプライマーにハイブリツド形成されたプ
ラークを新しいPst部位の存在の点からスクリ
ーニングした。このような一つのフアージプラー
クを同定し（M13−LW42），ssDNA及びRF−
DNAをこれから調製した。目標のシステイン用
TGTコドンがセリン用TCTコドンへ転化された
ことを確認するため、これらの３クローン全部か
ら得たDNAの配列を決定した。 実施例15（参考例） 大腸菌における発現のため
の突然変異誘発IL−２遺伝子の再クローニン
グ M13−LW42，M13−LW44，及び13−LW46
からのRF−DNAをそれぞれ制限酵素Hind及
びBanで消化し、挿入断片を１％アガロースゲ
ルから精製した。同様に、プラスミドpTrp3（第
７図）をHind及びBanで消化し、trpプロモ
ータを含有する大きなプラスミド断片をアガロー
スゲル上で精製し、M13−LW42，M13−LW44
及びM13−LW46から単離された挿入断片の各々
と連結した。連結したプラスミドをコンピテント
大腸菌Ｋ−12MM294株へ形質転換した。これら
の形質転換体からのプラスミドDNAを制限酵素
地図作成によつて分析し、プラスミドpLW42，
pLW44，及びpLW46の存在を確かめた、第１４
図はpLW46の制限地図である。trpプロモーター
を誘導するために、トリプトフアンの不在下にこ
れらの個々のクローンの各々を生育させ、無細胞
抽出液をSDS−ポリアクリルアミドゲル上で分析
し、３クローンpLW42，pLW44及びpLW46の全
部が、14.4Kd IL−２蛋白質を合成することが立
証された陽性対照のpLW21に見られるものと同
様な14.5Kd蛋白を合成することが示された。こ
れらの同じ抽出液をマウスHT−２細胞でIL−２
活性について検定すると、クローンpLW21（陽性
対照）とpLW46のみが有意義量のIL−２活性を
示し（下の第２表）、cys58とcys105は生物学的活
性に必要なものであり、これをセリンに変えるこ
と（それぞれpLW42とpLW44）によつて生物学
的活性が失われることを意味している。一方
cys125は、これをser125（pLW46）へ変えても生
物学的活性に影響しないから、活性にとつて不要
であるに違いない。 第 ２ 表 クローン IL−２活性（μ／ml） PIL2−７（陽性対照） １ PLW21 （陽性対照） 113000 PLW42 660 PLW44 1990 PLW46 123000 第１５ａ図は、クローンpLW46のコード鎖の
ヌクレオチド配列を示す。天然のヒトIL−２遺
伝子のコード鎖に比べ、クローンpLW46はヌク
レオチド374にＧ→Ｃの一つの塩基の変化をもつ。
第１５ｂ図は、pLW46でコードされたIL−２ム
テインの対応するアミノ酸配列を示す。このムテ
インをIL−2ser125と称する。天然のIL−２に比
べ、ムテインは125位にシステインの代わりにセ
リンをもつている。 pLW46で形質転換されたE.コリＫ−12MM294
株の試料は、1983年９月26日，合衆国，20852メ
リーランド州ロツクビル，パークローン・ドライ
ブ12301番地，アメリカン・タイプ・カルチヤ
ー・コレクシヨン（Americam Type Culture
Collection）に寄託され、ATCC39，452号に指
定された。 ムテインIL−2ser125のように125位のシステイ
ンが欠損した又は別のアミノ酸でおき代えられた
IL−２ムテイン類は、IL−２活性を保持してい
る。従つて、これらを天然のIL−２と同じよう
に処方、使用できる。従つて、このようなムテイ
ン類は細菌，ウイルス，寄生虫，原生動物，及び
カビの感染の診断と処置、リンフオカイン又は免
疫不全の発現に、老令のヒト及び動物における通
常の免疫機能の再構成に、酵素増幅，放射能標
識，放射能映像化，及び病的状態のIL−２水準
をモニターするこの技術で知られたその他の方法
など、診断検定法の開発に、リンフオカイン類の
受容体部位を遮断する治療及び診断用に生体外で
のＴ細胞生育の促進のため、またその他種々の治
療，診断，研究への応用に有用である。ヒトIL
−２の種々の治療・診断への応用については、エ
ス・エイ・ローゼンバーグ（S.A.Rosenberg），
イー・エイ・グリム（E.A.Grim）ら、エイ・マ
ザムダー（A.Mazumder）ら、及びイー・エ
イ・グリムとエス・エイ・ローゼンバーグが研究
報告している。IL−２はそれ自体、又は他の免
疫学的に関連のあるＢ又はＴ細胞又はその他の治
療剤と組み合わせて使用できる。治療又は診断用
には、蒸留水，リンゲル液，ハンク液，生理的食
塩水などの無毒生、非アレルギー性の生理学的に
許容される担体媒体中にこれらを処方できる。ヒ
ト又は動物へのIL−２ムテイン類の投与は、医
師が適当と考えるところにより、経口、又は腹腔
内又は筋肉内又は皮下でありうる。関連細胞の例
はＢ又はＴ細胞、天然のキラー細胞等であり、本
発明のポリペプチド類と組み合わせて使用できる
治療用試薬の例は、種々のインターフエロン類、
特にガンマインターフエロン，Ｂ細胞生長因子，
IL−１等である。
る。更に詳しくは、本発明はシステイン残基の一
つないしそれ以上の置換／欠損によつて親類似体
（parent analogs）とは異なつた突然変異的に改
変された生物学的に活性のある蛋白質に関する。 （従来の技術及び発明が解決しようとする問題
点） 組換えDNA（rDNA）技術によつて微生物学的
につくられる生物学的に活性な蛋白質は、システ
イン残基を含有しており、それらは活性に本質的
なものではないが、分子間または分子内の望まし
くない結合を自由に形成する。このような一つの
蛋白質は、微生物学的につくられるヒトのベータ
インターフエロン（IFN−β）である。rDNA技
術によつてIFN−βをつくる過程で、高濃度の
IFN−βを含有する大腸菌（E.Coli）抽出物中
に、微生物学的につくられるIFN−βのダイマー
とオリゴマーが形成されることが見い出された。
このマルチマー形成のため、IFN−βの精製と分
離が非常な手間と時間のかかるものとなり、精製
中に蛋白質を還元し、次いで元のコンフオメーシ
ヨンに戻すためにこれを再酸化するというよう
に、精製単離手順に追加の段階が幾つか必要にな
り、それによつて不正確なジスルフイド結合形成
の可能性が高まる。更に、おそらくはマルテイマ
ー形成又はランダムな分子内ジスルフイド架橋形
成のため、微生物学的につくられるIFN−βは一
貫して低い比活性を示すともわかつた。従つて、
IFN−βのように微生物学的につくられ生物活性
のある蛋白質を、その活性に悪影響を及ぼさず、
しかも蛋白質が望ましくない三次構造（例えば蛋
白質の活性を低下させるようなコンフオメーシヨ
ン）を有する結果になるような分子間架橋や分子
内結合の形成能力を減少し、又は排除する形で改
変するのが望ましいであろう。 （問題点を解決するための手段） 本発明は定方向突然変異（directed
mutagenesis）により、親構造類似体（parent
analogs）の活性を保持するが、分子間ジスルフ
イド結合や望ましくない分子内ジスルフイド結合
の形成能力を欠いている突然変異的に改変された
生物学的活性蛋白質の製造に関する〔このような
蛋白質を「ムテイン」（mutein）という。「遺伝
学・細胞遺伝学用語辞典」（Glossary of
genetics and Cytogenetics）第４版、381頁、ス
プリンジヤー・バーラグ（1976年）〕。これに関
し、エツチ・エム・シエパード（Shepard，H.
M.）等〔Nature（1981年）294巻 563〜565頁〕
はIFN−βについて、そのアミノ酸配列の141位
置のシステインがチロシンでおき代えられたムテ
インを記述している〔ヒトIFN−βには17，31及
び141位置にシステインがある。Gene（1980年）
10巻11〜15頁及びNature（1980年）285巻 542〜
547頁〕。このムテインは、IFN−β遺伝子のヌク
レオチド485にＧ→Ａ転位をもつ部分的IFN−β
cDNAクローンから構築された雑種遺伝子の細
菌による発現によつてつくられた。このムテイン
は本来のIFN−βの生物学的活性を失つており、
著者らは置き換えられたシステインが活性に本質
的であつたと結論するに至つた。 定方向突然変異（directed mutagenesis）技法
は周知であり、アール・エフ・レイサー
（Lather，R.F.）及びジエイ・ピー・レコツク
（Lecoq，J.P.）ジエネテイツク・エンジニアリン
グ（Genetic Engineering）、アカデミツクプレ
ス社（1983年）31−50頁、に検討されている。オ
リゴヌクレオチドに指示された突然変異はエム・
スミス（Smith，M.）及びエス・ギラム
（Gillam，S.）、ジエネテイツク・エンジニアリ
ング：原理と方法、プレナムプレス社（1981年）
３巻１−32頁に具体的に検討されている。 本発明は、天然インターフエロン−βの17位の
システイン残基が他のアミノ酸残基により置き換
えられているか又は欠失しており、且つ天然イン
ターフエロン−βの生物学的活性を有する変形さ
れたインターフエロン−β、及びその製造方法に
関する。この変形されたインターフエロン−βは
一般に次の様にして製造することができる。 (a) 親蛋白質をコードした構造遺伝子の１本鎖か
らなる単鎖DNAを突然変異オリゴヌクレオチ
ドプライマーとハイブリダイズさせ（このプラ
イマーは、欠損又は代替えすべきシステイン用
コドン、又は場合によりこのコドンと対合をつ
くるアンチセンス・トリプレツトを包含する領
域に対して相補的なものであるが、当該コドン
の欠損又は他のアミノ酸をコードするトリプレ
ツトを規定するコドン又はアンチセンス・トリ
プレツトとは不一致（mismatch）である。）、 (b) DNAポリメラーゼによりプライマーを伸長
させ、突然変異性ヘテロデユプレツクス
（heteroduplex）を形成させ、そして、 (c) この突然変異性ヘテロデユプレツクスを複製
する。 本方法で用いられる突然変異株オリゴヌクレオ
チドプライマーは本発明のもう一つの面である。 本発明は、生物学的に活性な蛋白質の生物学的
活性に本質的ではないシステイン残基が、分子間
架橋又はまちがつた分子内にジスルフイド結合の
形成サイトを排除するために、計画的に欠損又は
他のアミノ酸でおき代えられているムテイン類、
このようなムテイン類をコードする突然変異遺伝
子、及びこのようなムテイン類をつくる手段を提
供する。 本発明によつて突然変異的に改変できる蛋白質
は、生物学的に活性な蛋白質のシステイン含量、
及びシステイン残基が活性と三次構造に関して果
たす役割について入手可能な情報から確認でき
る。文献ではこのような情報が入手できない蛋白
質については、本明細書に記載の手順によつて蛋
白質のシステイン残基の各々を系統的に変更し、
生ずるムテイン類の生物学的活性及びそれらが望
ましくない分子間は分子内ジスルフイド結合を形
成する傾向について試験を行なうことによつて、
この情報は決定できる。従つて、本発明はIFN−
β及びIL−２のムテイン類に関して下に特に説
明、例示されているが、望ましくないジスルフイ
ド結合の形成に対して蛋白質を感受性にするよう
な、機能的に本質的ではないシステイン残基を含
有する生物学的に活性な任意のその他の蛋白質に
以下の教示が当てはまることが認められよう。
IFN−βとIL−２以外に本発明による突然変異性
改変の候補となる蛋白質の例は、リンフオトキシ
ン（腫瘍壊死因子）とコロニー刺激因子−１、そ
れにIFN−α1である。候補蛋白質は、ふつうに
は奇数のシステイン残基をもつている。 IFN−βの場合、ブリコシル化IFNと未グリコ
シル化IFNがいずれも定量的に同様な特異的活性
を示すこと、従つて、グリコシル部分はIFN−β
の生物学的活性に関与も貢献もしていないことが
報告された。しかし、細菌でつくられるゴリコシ
ル化されていないIFN−βは、グリコシル化され
た天然IFN−βより量的に低い比活性を一貫して
示す。IFN−βは、17，31及び141の位置にシス
テイン残基をもつことが知られている。システイ
ン141は、シエパードら（前掲）により、生物学
的活性に本質的であることが立証された。４個の
システイン残基を含有するIFN−αでは、二つの
分子間−Ｓ−Ｓ−結合があり、一つはcys29と
cys138の間、他はcys1とcys98の間である。IFN
−βとIFN−αとの相同性に基づいて、IFN−β
のcys141はcys31と分子内−Ｓ−Ｓ−結合にして
おり、cys17は自由に分子間架橋を形成できるで
あろう。cys17を欠失させるか、これを別のアミ
ノ酸と置換することによつて、cys17が生物学的
活性に本質的であるかどうか、また−Ｓ−Ｓ−結
合形成におけるその役割を決定できる。cys17が
蛋白質の生物学的活性に本質的でないならば、生
ずるcys17を欠損し又はcys17が置換された蛋白質
は、自然のIFN−βのそれに近い比活性を示し、
またおそらく蛋白質の単離精製を容易にもするで
あろう。 IFN−β遺伝子のcys17用コドン（codon）の
領域に対して相補的であるがこのコドン中に１又
は複数の塩基変化を含有する合成オリゴヌクレオ
チドプライマーを用いるオリゴヌクレオチドで指
示される突然変異誘発手順を使用してデザイナー
遺伝子がつくられ、こうしてcys17がその他任意
の選択されたアミノ酸でおき代えられる。欠損を
望む場合には、cys17用コドンを欠いたオリゴヌ
クレオチドプライマーを用いる。cys17をグリシ
ン、バリン、アラニン、ロイシン、イソロイシ
ン、チロシン、フエニルアラニン、ヒスチジン、
トリプロフアン、セリン、スレオニン及びメチオ
ニンのような中性アミノ酸へ変換するのが好まし
い方法である。セリン及びスレオニンは、システ
インと化学的類似性を有するため最も好ましい代
替え物である。システインを欠失させる時は、成
熟ムテインは自然の親蛋白質又は微生物でつくら
れるIFN−βよりアミノ酸１個だけ短い。 ヒトIL−２は、蛋白質の58，105及び125位に
システイン残基をもつと報告されている。IFN−
βの場合のように、IL−２は細菌の菌体から単
離される時は集合したオリゴマー型になつてい
て、細菌抽出物から良好な収量を得るためには、
還元剤で還元しなければならない。そのうえ、精
製され還元されたIL−２は不安定であり、貯蔵
時にオリゴマー不活性型へ容易に再酸化される。
３個のシステインが存在することは、天然分子に
見られるように正しい架橋は１個だけなのに、再
酸化時に蛋白質が３個の可能な分子内ジスルフイ
ド架橋の１個を無作為に形成しうることを意味し
ている。天然IL−２蛋白質のジスルフイド構造
がいかなるものか知られていないから、IL−２
遺伝子のコドン58，105及び125に突然変異をつく
り、どのシステイン残基か活性にとつて必要であ
るか、従つてまた自然のジスルフイド架橋形成に
関与している可能性が最も大きいかを確認するた
めに本発明を使用できる。同様に、活性にとつて
必要でないシステイン残基を修飾することによつ
てまちがつた分子内ジスルフイド架橋の形成を防
ぎ、そして遊離システイン残基の除去又は置き換
えによつて分子内間ジスルフイド架橋の機会を最
小限に抑えることができる。 オリゴヌクレオチドプライマーの大きさは、突
然変異を導入すべき遺伝子領域へのプライマーの
安定なハイブリツド形成に必要な条件により、ま
た現在利用可能なオリゴヌクレオチド合成法の限
界によつて決まる。オリゴヌクレオチドで指示さ
れる突然変異誘発に使用するオリゴヌクレオチド
を設計するに当たつて、考慮すべき因子（例えば
全体の大きさ、突然変異サイトを迂回する部分の
大きさ）は、エム・スミス及びエス・ギラム（前
掲）によつて記述されている。概して、オリゴヌ
クレオチドの全長は、突然変異サイトでの安定で
ユニークな雑種形成を最適化するような長さであ
り、突然変異サイトから5′及3′末端までの伸長部
分（extensions）は、DNAポリメラーゼのエキ
ソヌクレアーゼ活性による突然変異の作用をさけ
るのに十分な大きさとする。本発明に従つて突然
変異誘発に使用されるオリゴヌクレオチドは、通
常、約12個ないし約24個の塩基、好ましくは約14
個ないし約20個の塩基、更に好ましくは約14個な
いし18個の塩基を含有する。これらは通常、変更
又は欠失されるコドンの少なくとも約３個の塩基
3′を含有する。 変更されたIFN−β遺伝子をつくる方法は、大
体において、コドン17を消失させるか、又はそれ
が別のアミノ酸をコードするように変更する合成
ヌクレオチドプライマーを使用して、IFN−β遺
伝子のコドン17（TGT）に部位特異的突然変異を
誘発せしめるものである。システインをスレオニ
ンに変え、プライマーをIFN−β遺伝子のアンチ
センス鎖にハイブリツド形成させる場合、好まし
いヌクレオチドプライマーはGCAATTTTC
ACTCAGである（下線は変更されたコドンを示
す）。システインを欠失させるのが望ましい時は、
好ましいプライマーは
AGCAATTTTCAGCAGAAGCTCCTGであ
り、これはcysに対するTGTコドンを喪失してい
る。システインをセリンに代える時は、セリン用
のAGTコドンを含んだ17−ヌクレオチドプライ
マーGCAATTTTCAGAGTCAGが選択される。
cys17で第一塩基Ｔ→Ａの転位により、システイ
ンからセリンへの変化が起る。欠失を導入する時
には、所望の蛋白質の発現のために、DNA配列
の適正のリーデイングフレームを保持しなければ
ならない点を認識しなければならない。 プライマーはIFN−β遺伝子の１本鎖がクロー
ニングされたM13，fd，又はφ×174のような１
本鎖フアージへハイブリツド形成される。フアー
ジが遺伝子のセンス鎖、アンチセンス鎖のいずれ
でも担持できることは認められよう。フアージが
アンチセンス鎖を担持する場合には、プライマー
は、コドンの欠損、又は別のアミノ酸をコードす
るトリプレツトを規定するこのコドンとは一致し
ないが、突然変異させるコドンを含有するセンス
鎖の領域と同一である。フアージがセンス鎖を担
持する場合は、欠失させるコドンと対合するトリ
プレツト中では適当に不一致であるが、突然変異
させるコドンを含有するセンス鎖の領域に対して
相補的である。ハイブリツド形成に使用される条
件はエム・スミス及びエス・ギラム（前掲）によ
つて記述されている。温度は通常、約０℃ないし
70℃、もつと一般的には約10℃ないし50℃の範囲
にある。ハイブリツド形成後、プライマーは
DNAポリメラーゼＩ、T4DNAポリメラーゼ、
逆転写酵素又は他の適当なDNAポリメラーゼと
の反応によつてフアージDNA上で伸長される。
生ずるdsDNAは、T4DNAリガーゼのような
DNAリガーゼでの処理によつて閉環状dsDNAへ
変換される。１本鎖領域を含有するDNA分子は
S1エンドヌクレアーゼ処理によつて破壊できる。 オリゴヌクレアーゼで指示される突然変異誘発
は、IL−２活性をもつがcys125からセリン125へ
変更されたムテインをコードする突然変異IL−
２遺伝子をつくるにも同様に使用できる。フアー
ジが遺伝子のセンス鎖を担持する場合に、この突
然変異IL−２遺伝子をつくるのに使われる好ま
しいオリゴヌクレオチドプライマーは
GATGATGCTTCTGAGAAAAGGTAATCで
ある。このオリゴヌクレオチドは、IL−２遺伝
子のコドン125と対合するトリプレツトのまん中
の塩基にＣ→Ｇの変化を有する。 得られた突然変異性ヘテロデイプレツクスは、
コンピテント宿主生物又は細胞を形質転換するの
に使用される。宿主によるヘテロデユプレツクス
の複製により、双方の鎖から子孫鎖ができる。複
製に続いて、突然変異鎖の子孫から突然変異遺伝
子を単離し、適当なベクターへ挿入し、このベク
ターを適当な宿主生物又は細胞の形質転換に使用
する。好ましいベクター類はプラスミド
pBR322，pCR1及びそれらの変異体、合成ベク
ター等である。適当な宿主生物はE.コリ（E.
Coli）、シユードモーナス（Pseudomonas）、バ
シルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）、バシ
ルス・スリンギエンシス（Bacillus
thuringiensis）、種々の酵母菌株、バシルス・サ
ーモフイルス（Bacillus thermophilus）、ハツカ
ネズミやラツト、チヤイニーズハムスターの卵巣
（CHO）細胞のような動物細胞、植物細胞、動植
物宿主等である。選んだ宿主をベクターで形質転
換する場合に、ムテインが発現されるために適当
なプロモータ・オペレーター配列も導入されるこ
とは認識されなければならない。宿主は原核生物
でも真核生物でも良い。（真核細胞へDNAを挿入
する方法は1981年９月３日公表されたPCT出願
番号US81／00239及びUS81／00240に記述されて
いる）。E.コリとCHO細胞が好ましい宿主であ
る。本発明に従つて得られるムテイン類は、天然
の親蛋白質に生ずるグリコシル化およびムテイン
調製に使われる宿主生物に依存してグリコシル化
される場合もされない場合もある。所望により、
宿主としてE.コリ（E.Coli）及びバシルス
（Bacillus）を使用する場合に得られる未グリコ
シル化ムテインを、この技術分野で知られている
科学的、酵素的及びその他の変法によつて生体外
で任意にグリコシル化してよい。 IFN−βに関する本発明の好ましい態様におい
ては、第１図に示すように、IFN−βのアミノ酸
配列において17位のシステイン残基は、成熟IFN
−βをコードするDNA配列のセンス鎖のコドン
17の第一塩基のＴ→Ａ転位によつて、セリンへ変
えられる。この部位特異的な突然変異誘発は、合
成17−ヌクレオチドプライマー
GCAATTTTCAGAGTCAGを使用して誘発さ
れ、このプライマーはコドン17の第一塩基に一個
の塩基の不一致がある以外は、コドン17の領域に
おけるIFN−βのセンス鎖上の17の個ヌクレオチ
ド配列と同一である。この不一致はプライマーの
ヌクレオチド12にある。遺伝暗号（コドン）は縮
重（degenerate）しており、アミノ酸の多くは
一つ以上のコドンによつて暗号づけられることが
認識されなければならない。例えばセリンの塩基
暗号は、TCT，TCG，TCC，TCA，AGT，及
びACGというコドンがいずれもセリンをコード
するように、６通りの縮重である。便宜上、好ま
しい態様としてAGTコドンが選ばれた。同様に、
スレオニンはACT，ACA，ACC及びACGのコ
ドンのどの一つによつてもコードされる。特定ア
ミノ酸に対して１コドンを特定する時は、これが
そのアミノ酸をコードするすべての縮重コドンを
包含することが意図されている。17−merは、
IFN−β遺伝子のアンチセンス鎖を担持する１本
鎖M13フアージDNAにハイブリツド形成される。
次に、DNAポリメラーゼＩ Klenow断片を使
用して、オリゴヌ然変異性ヘテロデユプレツクス
の複製によつて、不一致を含有するDNA鎖から
クローンが得られる。突然変異クローンは、特定
の制限位置の存在又は不存在、抗生物質耐性もし
くは感受性、又はこの技術分野において知られた
その他の方法によつて確認され、スクリーニング
される。システインをセリンによりおき代える場
合は、第２図に示されるＴ→Ａ転位によつて、構
造遺伝子の中に新しいHinf制限部位がつくら
れる。突然変異クローンは、突然変異したフアー
ジプラークのハイブリツド形成スクリーニングに
おけるプローブとしてオリゴヌクレオチドプライ
マーを使用して同定される。第２図に示されるよ
うに、プライマーは親とハイブリツド形成される
時は唯一の不一致を有するが、突然変異したフア
ージDNAにハイブリツド形成される時は完全は
一致を有するであろう。オリゴヌクレオチドプラ
イマーを親DNAよりも突然変異DNAへ優先的に
ハイブリツド形成させるようなハイブリツド形成
の条件を工夫できる。新しく発生したHinf部
位も、IFN−β遺伝子の単一塩基の突然変異を確
認する手段として役立つ。 突然変異した遺伝子を担持するM13フアージ
DNAを単離し、プラスミドpTrp3のような適当
な発現ベクター中へ組み入れ、このベクターで大
腸菌MM294株を形質転換させる。形質転換体と
その子孫を培養するのに適した生育培地が当業者
に知られている。IFN−βの発現されたムテイン
を単離精製し、特徴づける。 以下の実施例は本発明の一層の理解を助けるた
め、また例示だけの目的で提示されている。これ
らはいかなる形においても本発明の範囲を限定す
るものと考えられてはならない。実施例１〜９は
IFN−βのムテインの調製を記述している。実施
例10〜15はIL−２のムテインの調製を記述して
いる。 実施例１ IFN−β遺伝子のM13ベクターへのク
ローニング １本鎖DNA鋳型の給源としてM13フアージベ
クターを使用することは、ジー・エフ・テンプル
（G.F.Temple）ら、Nature（1982年）296巻 537
−540頁で実証された。大腸菌trpプロモーターの
制御下にIFN−β遺伝子を含有するプラスミド
pβ1trp（第３図）を制限酵素Hind及びXhoで
消化した。なお前記プラスミドpβ1trpは、プラス
ミドpBR322のEcoR部位とHind部位との間
にＥ．coli trpプロモーターを挿入することに
よりプラスミドpTrp3を得、このプラスミドの
Hind部位とBam部位との間にヒトの成熟繊
維芽細胞インターフエロンをコードするDNA断
片を挿入することにより作製したものである
（D.F.Mark等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA，
Vol81，5662−5666，1984）。M13mp8〔ジエイ・
メツシング（J.Messing）．「巨大分子に関する第
３回クリーブランド・シンポジウム：組換え
DNA」エイ・ウオールトン編、エルザビアプレ
ス社、143−153頁（1981年）〕複製型（RF）
DNA（第４図）を制限酵素Hind及びBamH
で消化し、予めHind及びXhoで消化してお
いたpβ1trpDNAと混合した。次に混合物を
T4DNAニガーゼで連結し、連結DNAを大腸菌
−JM103株（Maniatis等、Molecular Cloning
Ａ Laboratory Mannual，Cold Spring
Harbor Laboratory，1982，Appendix Ｃ，506
頁を参照のこと）のコンピテント細胞中へ形質転
換させ、Xgalインデイケータープレート上に播
いた〔ジエイ・メツシング等、Nucleic Acids
Res（1981年）９巻 309−321頁〕。組換えフアー
ジを含有するプラーク（白いプラーク）を取り上
げ、新鮮なJM103の培養物に接種し、そして感染
細胞からRF分子のミニプレツプを調製した（エ
ツチ・デイー・バーンボイム（H.D.Birnboim）
及びジエイ・ドリイ（J.Doly）、Nucleic Acid
Res（1979年）７巻 1513−1523頁）。IFN−β挿
入部を含有するクローンを同定するために、RF
分子を種々の制限酵素で消化した。このような１
クローン（M13−β1）の制限地図を第５図に示
す。M13−β1クローンから１本鎖（ss）フアージ
DNAをつくり、合成オリゴヌクレオチドを使用
する部位特異的突然変異誘発の鋳型として用い
た。 実施例２ 部位特異的突然変異誘発 0.1mMアデノシン三燐酸（ATP）、50mMヒド
ロキシメチルアミノメタン塩酸塩（トリス−塩
酸）PH8.0、10mM塩化マグネシウム、5mMジチ
オスレイトール（DDT）及びT4キナーゼ９単位
の存在下に、50μ中で合成オリゴヌクレオチド
GCAATTTTCAGAGTCAG（プライマー）40ピ
コモルをT4キナーゼにより37℃で１時間処理し
た。50mM塩化ナトリウム、10mMトリス−塩
酸、PH8.0、10mM塩化マグネシウム及び10mMβ
−メルカプトエタノールを含有する混合物50μ
中で、このキナーゼ処理されたプライマー（12ピ
コモル）を67℃で５分、及び42℃で25分加熱する
ことによつて１本鎖（ss）M13−β1DNA5μｇに
ハイブリツド形成させた。アニーリングした混合
物を次に氷上で冷却し、0.5mM各デオキシヌク
レオチド三燐酸（dNTP）、80mMトリス−塩酸、
PH7.4、8mM塩化マグネシウム、100mM塩化ナ
トリウム、DNAポリメラーゼ Klenow断片
９単位、0.5mMATP及びT4DNAリガーゼ２単
位を含有する反応混合物50μに添加し、37℃で
３時間及び25℃で２時間インキユベートした。次
にフエノール抽出とエタノール沈澱によつて反応
を停止させた。DNAを10mMトリス−塩酸、PH
8.0、10mMエチレンジアミン四酢酸（EDTA）、
50％蔗糖及び0.05％ブロモフエニルブルー中に溶
解し、臭化エチジウム2μｇ／mlの存在下、0.8％
アガロースゲル上の電気泳動にかけた。M13−
β1のRF型に対応するDNAバンドをパーコレート
法〔アール・ダブリユー・デービス（R.W.
Davis）３、「高等細菌遺伝学」（Advanced
Bacterial Genetics）、コールド・スプリング・
ハーバー研究所、N.Y.178〜179頁（1980年）〕に
よつてゲルスライスから溶離した。溶離された
DNAをコンピテントJM103細胞の形質転換に使
用し、菌を一夜生育させ、培養基上澄液から
ssDNAを単離した。このssDNAをプライマー伸
張の第二サイクルに鋳型として使用し、ゲル精製
されたRF型DNAをコンピテントJM103細胞中へ
形質転換させ、寒天プレート上に播き、一夜培養
するとフアージプラークが得られる。 実施例３ 部位特異的突然変異誘発 上の実施例２の実験をくり返す。但し、合成オ
リゴヌクレオチドプライマーとして、システイン
をコードするものからスレオニンをコードするも
のへIFN−β遺伝子のコドン17を変えるのに
GCAATTTTCAGACTCAGを使用する。 実施例４ 部位特異的欠損 上の実施例２の実験をくり返す。但し合成オリ
ゴヌクレオチドプライマーとしてはIFN−β遺伝
子のコドン17を欠損させるのに
AGCAATTTTCAGCAGAAGCTCCTGを使用
する。 実施例５ 突然変異誘発されたプラークのスクリ
ーニング及び同定 突然変異させたM13−β1プラークの入つたプ
レート（実施例１）並びに突然変異しないM13−
β1フアージプラークの入つた２枚のプレートを
４℃に冷却し、各プレートからのプラークを２枚
のニトロセルロース円形フイルター上へ、第一フ
イルターの場合には乾燥フイルターを寒天プレー
ト上へ５分間重ね、第二フイルターの場合は15分
間重ねて移した。次に0.2NNaOH、1.5M塩化ナ
トリウム及び0.2％トリトンＸ−100に浸した厚手
の濾紙上へフイルター類を５分間置き、次に
0.5Mトリス−塩酸、PH7.5、及び1.5M塩化ナトリ
ウムに浸した濾紙上へ更に５分間重ねて中和し
た。フイルターを同様なやり方で、２×SSC（標
準くえん酸塩）に浸したフイルター上で２回洗
い、乾燥し、真空乾燥炉内で80℃で２時間乾燥さ
せた。重複フイルターをフイルター当たり10mlの
DNAハイブリツド形成緩衝液（５×SSC），PH
7.0，４×デンハード液（ポリビニルピロリドン，
フイコール及び牛血清アルブミン，１×＝各0.02
％）、0.1％ドデシル硫酸ナトリウム（SDS），
50mM燐酸ナトリウム緩衝液、PH7.0及び100μ
ｇ／mlの変性サケ精子DNAにより、55℃で４時
間、事前ハイブリツド形成させた。オリゴヌクレ
オチドプライマーを32Pで標識した。ATPでキナ
ーゼ下に処理することによつて32Pで標識したプ
ローブをつくつた。フイルター当たり５mlの
DNAハイブリド形成緩衝液中でフイルターを32P
で標識したプライマー3.5×105cps／mlに55℃で
24時間ハイブリツド形成させた。0.1％SDSと減
少する量のSSCを含有する洗浄用緩衝液中でそれ
ぞれ30分。55℃でフイルター類を洗つた。フイル
ター類を、初めに２×SSCを含んだ緩衝液で洗
い、そして突然変異していないM13−β1プラー
クを含有する対照フイルターはガイガー計数管を
用いて放射能の存在について検査した。SSC濃度
を段階的に低下させ、未突然変異M13−β1プラ
ークをもつ対照フイルター上に検出可能な放射能
が残らなくなるまでフイルターを洗つた。SSCの
使用最低濃度は0.1×SSCであつた。フイルター
を空気乾燥し、−70℃で２〜３日オートラジオグ
ラフ処理した。突然変異したM13−β1のプラー
ク480個と突然変異していない対照プラーク100個
をキナーゼ処理したオリゴヌクレオチドプローブ
によつてスクリーニングした。対照プラークでは
プローブとハイブリツド形成したものが全く存在
せず、一方突然変異したM13−β1プラーク５個
がプローブとハイブリツドを形成した。 ５個の突然変異M13−β1プラークの１個
（M13−SY2501）を取り上げ、JM103培養基へ接
種した。上澄液からssDNAを調製し、そして細
胞ペレツトから２本鎖（ds）DNAを調製した。
M13ユニバーサルプライマーを使用して、クロー
ンのジデオキシ配列決定用の鋳型としてssDNA
を使用した。配列決定分析の結果を第６図に示
す。この結果は、TGTcysコドンがAGTserコド
ンへ変換されたことを確証している。 実施例６ 大腸菌における突然変異IFN−βの発
現 M13−SY2501からのRF DNAを制限酵素
Hind及びXhoで消化し、520bpの挿入断片を
１％アガロースゲル上で精製した。大腸菌trpプ
ロモーターを含有するプラスミドpTrp3（第７図）
を酵素Hind及びBamHで消化し、精製した
M13−SY2501断片と混合し、T4DNAリガーゼ
の存在下に連結した。なお、前記プラスミド
pTrp3はプラスミドpBR322のEcoR部位と
Hind部位との間にＥ．coli trpプロモーター
を挿入することにより作製したものである。（D.
F.Mark等、Pro.Natl.Acad.Sci.USA，Vol81，
5662−5666，1984を参照のこと）。連結DNAをE.
コリMM294株へ形質転換した。アンピシリン耐
性形質転換体を薬剤テトラサイクリンに対する感
受性の点からスクリーニングした。アンピシリン
耐性でテトラサイクリン感受性の５クローンから
のプラスミドDNAを、M13−SY2501挿入部の存
在についてスクリーニングするためHinfで消
化した。第８ａ図は、クローンの一つ
（pSY2501）のHinf制限パターンを示すが、図
ではこれを元のIFN−βクローンすなわちpβ1trp
のHinfパターンを比較している。予想のよう
に、pSY2501に追加のHinfサイトがあり、
197bpのIFN−β内部断片が169bpの断片と28bp
の断片に切れている（第８ｂ図）。クローン
pSY2501の制限地図を第９図に示す。突然変異
IFN−β遺伝子の完全なDNA配列を、予測され
たアミノ酸配列と一緒に第１０図に示す。クロー
ンpSY2501と称するプラスミドは60604イリノイ
州ペオリア，ノース・ユニバーシテイ・ストリー
ト1815番地、米国農務省、科学教育局北部研究セ
ンター、発酵研究所のアグリカルチユラル・リサ
ーチ・カルチヤーコレクシヨン（NRRL）に寄
託されている。指定された寄託番号は
CMCC1533号及びNRRLB−15356号である。 pSY2501及びpβ1trp（子孫を含む）の培養物を
1.0の光学密度（OD600）まで生育させた。無細胞
抽出物をつくり、IFN−βの抗ウイルス活性量を
微量力価検定法でGM2767細胞によつて検定し
た。クローンpSY2501の抽出物はpβ1trpより３〜
10倍高い活性を示し（第１表）、クローン
pSY2501がIFN−β活性を示す蛋白質をより多量
に合成しているか、又はつくられた蛋白質がより
高い比活性をもつているかのいずれかであること
が示される。 第 １ 表抽出物 抗ウイルス活性（単位／ml） pSY2501 ６×105 pβ1trp １×105 ptrp3（対照） 30 クローンpSY2501が数倍多い活性蛋白を合成し
ていたかどうか決定するため、両クローンの抽出
物を対照抽出物と共にSDSポリアクリルアミドゲ
ル上の電気泳動にかけ、ゲルをクーマーシーブル
ーで染色して蛋白質を発色させた。第１１図に示
すように、クローンpSY2501とpβ1trpの抽出物中
に存在するが対照のptrp3抽出物中にはない約
18000ダルトンの蛋白質に対応する蛋白質バンド
が一つだけあつた。この蛋白質は約20000ダルト
ンの分子量をもつが、18000ダルトンの蛋白質の
ゲル移動パターンを示しており、pβ1trpの抽出物
からこの蛋白質を精製することによつてIFN−β
であることが予めわかつていた。pSY2501抽出物
中にはpβ1trpの抽出物中よりこの蛋白質の量が少
ないから、クローンpSY2501抽出物中の蛋白質の
比活性はクローンpβ1trpのそれより高い。 実施例７ IFM−βser17の精製 IFN−βser17をつくるように形質転換されたE.
コリからIFN−βser17を回収した。E.コリを次の
生育培地中で、680nmで10〜11の光学密度（乾燥
重量8.4ｇ／）まで生育させた。 成分 濃度 塩化アンモニウム 20mM 硫酸カリウム 16.1mM 燐酸一カリウム 7.8mM 燐酸二ナトリウム 12.2mM 硫酸マグネシウム・七水和物 3mM クエン酸三ナトリウム・二水和物 1.5mM 硫酸マンガン・四水和物 30μM 硫酸亜鉛・七水和物 30μM 硫酸銅・五水和物 3μM Ｌ−トリプトフアン 70mg／ 硫酸第一鉄・七水和物 72μM チアミン塩酸塩 20mg／ グルコース 40ｇ／ アンモニアでPH調製 形質転換ずみE.コリの収穫物9.9（9.9Kg）を
20℃に冷却し、濾液重量が８，８Kgになるまで、
収穫物を−110kpaの平均圧力損失と毎分260mlの
定常濾液流量でクロスフローフイルターに通すこ
とにより濃縮した。濃縮液（約１）を容器に流
し込み、15℃に冷却した。濃縮液を５℃、約
69000kpaでマントン＝ゴーリンホモジナイザー
に通すことによつて濃縮液中の菌体を破砕した。
燐酸塩で緩衝化された食塩水、PH7.4（PBS）１
でホモジナイザーを洗い、洗浄液を破砕物に加え
ると、２の最終容量が得られた。この容量を毎
分50mlの流量で12000xgの連続遠心分離にかけ
た。固体を上澄液から分離し、２重量％SDSを含
有するPBS4に再懸濁させた。この懸濁液を室
温で15分かきまぜたあと、目に見える懸濁物はな
かつた。次に溶液を２−ブタノールで、２−ブタ
ノール：溶液の１：１容量比で抽出した。液−液
相分離装置中で毎分200mlの流量を用いて抽出を
行なつた。次に有機相を分離し、そして蒸発乾固
させることにより蛋白質21.3ｇを得た。これを蒸
留水に１：10の容量比で再懸濁した。 回収された生成物は、ウイルスの細胞病理作用
（CPE）に対する防護に基づく検定を用いて、ヒ
トIFN−β活性について検定された。ミクロタイ
タープレート内でこの検定を行なつた。最小基本
培地50μを各容器に仕込み、第一容器には資料
25μを入れ、つぎ容器以降には１：３の容量の
希釈を連続的に行なつた。ウイルス（水泡性口内
炎）、細胞（ヒト線維芽細胞GM−2767系統）及
び標準IFN−β対照群を各プレートに収容せしめ
た。ml当たり100単位の標準IFN−βを使用した。
次にプレートに紫外線を10分間照射した。照射
後、細胞懸濁液（ml当たり細胞1.2×105）100μ
を各容器に加え、トレーを18−24時間インキユベ
ートした。細胞当たり１プラーク形成単位でウイ
ルス液を細胞対照プレートを除く各容器に加え
た。ウイルス対照が100％のCPEを示すまでトレ
ーをインキユベートした。これは、ウイルス液を
加えてから通常18〜24時間で生じた。標準IFN−
β対照の50％CPE容器の位置の点から検定結果
を解釈した。この点からプレート上の全試料につ
いてのインターフエロンの力価を測定した。回収
された生成物の比活性は５×107Ｕ／mlと決定さ
れた。 実施例８ 酸沈澱及びクロマトグラフイによる精
製 実施例７の方法をくり返したが、但し、抽出、
水相と有機相の分離、及び有機相とPBSとの容
量比３：１での混合の後、氷酢酸の添加によつて
混合物のPHを約５に下げた。生じた沈澱物を
10000〜17000xg，15分間の遠心分離によつて分
離し、ペレツトを10％Ｗ／Ｖ SDS，10mM
DTT，50mM酢酸ナトリウム緩衝液，PH5.5に再
溶解し、80℃に５分間加熱した。 次に、溶液を、ベツクマン勾配系を使用して、
ブラウンリーRP−300，10mM，「アクアポア」
カラムにかけた。緩衝液Ａは水中0.1％トリフル
オロ酢酸（TFA）であり、緩衝液Ｂはアセトニ
トリル中0.1％TFAとした。検出は280nmでの紫
外線吸光度によつた。溶媒プログラムは３時間で
０％緩衝液Ｂから100％緩衝液Ｂへの線形勾配と
した。最高のインターフエロン活性を含有するフ
ラクシヨンをプールし、このプールされたインタ
ーフエロン調製物の比活性は、天然のIFN−βに
おける蛋白質mg当たり約２×108国際単位に比べ、
9.0×107ないし3.8×108Ｕ／mlと決定された。 実施例９ IFN−βser17の生化学的特徴付け 5.7NHCl，0.1％フエノールの200μ中におい
て試料40μｇを108℃で24〜72時間の加水分解に
かけた後、アミノ酸組成を決定した。プロリンと
システインは、過蟻酸酸化後、同じやり方で決定
された。この場合、フエノールを加水分解から省
略した。トリプトフアンは、5.7N塩酸，10％メ
ルカプト酢酸（フエノールなし）中で試料400μ
を24時間加水分解した後に分析した。分析は、
AA10樹脂の単一カラムを使用するベツクマン
121MBアミノ酸分析装置で行なつた。精製IFN
−βser17の代表的な24−，48−，72−時間の酸加
水分解から計算されるアミノ酸組成は、Ｎ−末端
メチオニンが欠けているほかは、クローンIFN遺
伝子のDNA配列によつて予測されるものとよく
一致している。精製IFNのアミノ酸末端
（terminus）からの最初の58残基のアミノ酸配列
は、試料0.7mgから、ベツクマン890C配列測定装
置で0.1Mクアドロール緩衝液を使つて決定され
た。PTHアミノ酸は、アルテツクスウルトラス
フエアーODSカラム（4.6×250mm）による逆相高
圧液体クロマトグラフイ（HPLC）に45℃でか
け、40％緩衝液Ｂで1.3分、40〜70％緩衝液Ｂで
8.4分溶出することにより決定された。ここで緩
衝液Ａは0.0115M酢酸ナトリウム，５％テトラヒ
ドロフラン（THF），PH5.11であり、緩衝液Ｂは
アセトニトリル中10％THFであつた。 決定されたIFN−βser17のＮ末端アミノ酸配列
は、Ｎ−末端メチオニンの不在を除き、DNA配
列から予測される予測配列に一致している。 上に示したように、IFN−βser17調製物は天然
のIFN−βの比活性レベルに非常に近いか、それ
よりすぐれた活性を示す。IFN−βser17は遊離ス
ルフヒドリル基をもたないが、31及び141位にだ
け残つているシステイン間に１個の−Ｓ−Ｓ−結
合を示す。蛋白質は容易にオリゴマーをつくら
ず、実質的にモノマー型にあると考えられる。本
発明に従つて得られるIFN−βser17は単一生成物
として又は種々の型の混合物として不活性，無毒
性，非アレルギー性で、生理的に許容される担体
媒体中における医薬として受け入れられる製剤へ
処方でき、がん療法で、又はインターフエロン療
法が指示される症状における臨床用，治療用に、
またウイルス感染用に使用できる。このような媒
体は蒸留水，生理食塩水，リンゲル液，ハンク液
等をを包含するが、これらに限定はされない。デ
キストロース，HSA（ヒト血清アルブミン）等の
ような他の無毒性の安定化・可溶化用の添加物も
最適に包含してよい。治療処方剤は、経口で、又
は静脈内，筋肉内，腹腔内及び皮下投与のような
非経口で投与できる。本発明の変形IFN−β製剤
は、局所用に通常利用される適当な媒体中で局所
適用のためにも使用できる。 上記のIFN−βムテインの主な利点は、IFN−
βの17位の遊離スルフヒドリル基（−SH基）を
排除されているところにあり、これによつてムテ
インにcys31とcys141の間に正しいジスルフイド
結合を形成させ、十分な生物学的活性に明白に必
要なコンフオメーシヨンを取らせている。IFN−
βser17の増大した比活性のため、治療用により少
ない投与量が使える。17位置のシステインを欠失
させ、遊離−SH基を排除することによつて、
IFN−βser17蛋白質は微生物でつくられるIFN−
βほどたやすくダイマーやオリゴマーを形成しな
い。これが蛋白質の精製を容易にし、その安定性
を強める。 実施例10 （参考例） ヒトIL−２をコードするcDNAクローンのヌ
クレオチド配列、IL−2cDNAライブラリーをつ
くる手順、これをIL−２についてスクリーニン
グ手順はテイー・タニグチ（Taniguchi，T.），
Nature（1983年）24巻 305頁以降に記述されて
いる。 有力なIL−2cDNAクローンに関して濃縮され
たcDNAライブラリーは、慣用手順により、誘導
された末梢血液リンパ球（PBL）とジヤーカツ
ト細胞から得られる濃縮されたIL−2mRNAフラ
クシヨンからつくられた。IL−２用mRNAの濃
縮は、mRNAを分画し、フラクシヨンをキセノ
プス・ラエビス（Xenopus laevis）の未成熟卵
母細胞に注入し、卵母細胞の溶解物のIL−２活
性をHT−２細胞で検定し、IL−2mRNA活性を
もつフラクシヨンを確認することによつて行つた
〔ジエイ・ワトソン（J.Watoson），J.Exp.Med.
（1979年）150巻1570〜1519頁及びエス・ギリス
（S.Gillis）等、J.Immun.（1978年）120巻2027〜
2032頁〕 実施例11（参考例） IL−2cDNAクローンのス
クリーニングと同定 コロニーハイブリツド形成法を用いて、IL−
2cDNAライブラリーをスクリーニングした。各
ミクロタイタープレートを重層したニトロセルロ
ース濾紙（Ｓ＆ＳタイプBA−85）上にレプリカ
法で写取り、アンピシリン50μｇ／mlを含有する
Ｌ寒天上で37℃，14〜16時間生育させた。コロニ
ーを溶解し、500mM水酸化ナトリウム，1.5M塩
化ナトリウムで５分の連続処理することによつて
DNAをフイルターに固定し、５×標準クエン酸
塩溶液（SSC）で５分ずつ２回洗つた。フイルタ
ーを空気乾燥し、80℃で２時間炉乾燥した。重層
フイルターをフイルター当たり10mlのDNAハイ
ブリツド形成緩衝液（50％ホルムアミド，５×
SSC，PH7.0，５×デンハード液（ポリビニルピ
ロリジン，フイコール及び牛血清アルブミン；１
×＝各0.2％），PH7.0の50mM燐酸ナトリウム緩衝
液，0.2％SDS，20μｇ／mlポリＵ及び50μｇ／ml
の変形サケ精子DNAにより、42℃で６〜８時間
事前ハイブリツド形成させた。 タニグチ（前掲）に報告されたIL−２遺伝子
配列に基づいて32Pで標識された20−merオリゴ
ヌクレオチドプローブをつくつた。プローブのヌ
クレオチド配列は
GTGGCCTTCTTGGGCATGTAであつた。 32PcDNAプローブを含有するフイルター当た
り５mlのDNAハイブリツド形成緩衝液で、試料
を42℃で24〜36時間ハイブリツド形成させた。フ
イルターを２×SSC，0.1％SDS，で30分間ずつ
２回50℃で洗い、次に１×SSCと0.1％SDSで90
分ずつ２回50℃で洗い、空気乾燥し、−70℃で２
〜３日間オートラジオグラフにかけた。陽性のク
ローンを同定し、プローブで再度スクリーニング
した。十分な長さのクローンが、制限酵素地図作
製、及びタニグチら（前掲）が報告したIL−
2cDNAクローンの配列との比較から確認された。 実施例12（参考例） M13ベクターへのIL−２遺
伝子のクローニング 大腸菌trpプロモーターの制御下にIL−２遺伝
子を含有するプラスミドpLW1（第１２図）を使
用して、実施例１に記載のと同様にIL−２遺伝
子をM13mp9へクローニングした。pLW1の試料
は1983年８月４日、20852合衆国メリーランド州
ロツクビル，パークローン・ドライブ12301番地，
アメリカタイプ・カルチヤー・コレクシヨンに預
託され、ATCC39，405号と指定を受けた。IL−
２挿入部を含有する１クローン（M13−IL−２
と称する）の制限地図を第１３図に示す。１本鎖
フアージDNAをクローンM13−IL−２からつく
り、オロゴヌクレオチドで指示される突然変異誘
発用の鋳型として使用した。 実施例13（参考例） オリゴヌクレオチドで指示
された突然変異誘発 前記のとおり、IL−２はアミノ酸位置58，105
及び125にシステイン残基を含んでいる。IL−２
遺伝子中でこれらの３個のシステイン残基用コド
ンを含有する部分のヌクレオチド配列に基づい
て、三つのオリゴヌクレオチドプライマーを設計
し、これらの残基用コドンをセリン用コドンへ突
然変異せしめるために合成した。これらのオリゴ
ヌクレオチドは次の配列をもつている。 cys58を変える CTTCTAGAGACTGCAGA
TGTTTC （DM27） cys105を変える CATCAGCATACTCAGA
CATGAATG （DM28） cys125を変える GATGATGCTCTGAGA
AAAGGTAATC （DM29） 0.1mM ATD，50mMトリス−塩酸，PH8.0，
10mM塩化マグネシウム，5mM DTT及びT4キ
ナーゼ９単位の存在下に、50μ中で各オリゴヌ
クレオチド40ピコモルを別々に37℃で１時間キナ
ーゼ処理した。キナーゼ処理されたプライマー
（10ピコモル）の各々を、100mM塩化ナトリウ
ム，20mMトリス−塩酸，PH7.9，20mM塩化マ
グネシウム及び20mMβ−メルカプトエタノール
を含有する混合物15μ中で、67℃で５分及び42
℃で25分加熱することによつてssM13−IL−
2DNA2.6μｇへハイブリツド形成した。アニーリ
ングされた混合物を氷上で冷却し、次に0.5mM
各dNTP，17mMトリス−塩酸（PH7.9），17mM
塩化マグネシウム，83mM塩化ナトリウム，
17mMβ−メルカプトエタノール、DNAポリメラ
ーゼIKlenow断片５単位，0.5mMATP，及び
T4DNAリガーゼ２単位を含有する反応混合物
25μの最終容量まで調製し、37℃で５時間イン
キユベートした。80℃に加熱して反応を停止さ
せ、反応混合物をコンピテントJM103細胞の形質
転換に使用し、寒天プレート上に播いて一夜培養
すると、フアージプラークが得られた。 実施例14（参考例） 突然変異誘発されたフアー
ジプラークのスクリーニングと同定 突然変異誘発されたM13−IL−２プラークを
含んだプレートと、突然変異誘発されないM13−
IL−２フアージプラークを含んだプレート２枚
とを４℃に冷却し、各プレートからのフアージプ
ラークを２枚のニトロセルロース円形フイルター
上へ、第一フイルターの場合には乾燥フイルター
を寒天プレート上へ５分間重ね、第二フイルター
の場合には15分間重ねて移した。次に0.2N水酸
化ナトリウム，15M塩化ナトリウム及び0.2％ト
リトンに浸した厚手の濾紙上にフイルターを５分
間置き、次に0.5Mトリス−HCl（PH7.5）と
1.5MNaClに浸した濾紙上へさらに５分間重ねて
中和した。フイルターを同様なやり方で、２×
SSCに浸したフイルター上で２回洗い、乾燥して
から真空乾燥炉内で80℃で２時間乾燥した。重層
フイルターをフイルター当たり10mlのDNAハイ
ブリツド形成緩衝液（５×SSC），PH7.0，４×デ
ンハード液（ポリビニルピロリジン，フイコール
及び牛血清アルブミン，１×＝各0.02％），0.1％
SDS，50mM燐酸ナトリウム緩衝液（PH7.0）及
び100μｇ／ml変性サケ精子DNAにより、42℃で
４時間事前ハイブリツド形成させた。標識をつけ
たATPでオリゴヌクレオチドプライマーをキナ
ーゼ処理することによつて、32Pで標識をつけたプ
ローブをつくつた。フイルター当たり５mlの
DNAハイブリツド形成緩衝液中で42℃で８時間、
32Pで標識したプライマー0.1×105cpm／mlにフ
イルターをハイブリツド形成させた。0.1％SDS
及び２×SSCを含有する洗浄緩衝液中で50℃でそ
れぞれ30分ずつ２回、次に0.1％SDS及び0.2×
SSCで50℃でそれぞれ30分ずつ２回フイルターを
洗つた。フイルターを空気乾燥し、−70℃で２〜
３日オートラジオグラフイにかけた。 オリゴヌクレオチドプライマーDM28及び
DM29は、突然変異誘発されたクローンに新しい
Dde制限部位を創出するように設計されている
から（第14表）、これらのキナーゼ処理されたプ
ライマーとハイブリツド形成された幾つかのクロ
ーンからのRF−DNAを制限酵素Ddeで消化し
た。プライマーDM28とハイブリツド形成し、新
しいDde制限部位をもつ突然変異誘発された
M13−IL−２プラークの一つ（M13−LW44）を
取り上げ、JM103培養物へ接種し、培養上澄液か
らssDNAを調製し、細胞ペレツトからdsRF−
DNAを調製した。同じく、プライマーDM29と
ハイブリツド形成させたプラーク（M13−
LW46）を取り上げ、これからssDNAとRF−
DNAを調製した。オリゴヌクレオチドプライマ
ーDM27はDde位置の代わりに新しいPst制
限部位を創出するように設計されている。従つ
て、このプライマーにハイブリツド形成されたプ
ラークを新しいPst部位の存在の点からスクリ
ーニングした。このような一つのフアージプラー
クを同定し（M13−LW42），ssDNA及びRF−
DNAをこれから調製した。目標のシステイン用
TGTコドンがセリン用TCTコドンへ転化された
ことを確認するため、これらの３クローン全部か
ら得たDNAの配列を決定した。 実施例15（参考例） 大腸菌における発現のため
の突然変異誘発IL−２遺伝子の再クローニン
グ M13−LW42，M13−LW44，及び13−LW46
からのRF−DNAをそれぞれ制限酵素Hind及
びBanで消化し、挿入断片を１％アガロースゲ
ルから精製した。同様に、プラスミドpTrp3（第
７図）をHind及びBanで消化し、trpプロモ
ータを含有する大きなプラスミド断片をアガロー
スゲル上で精製し、M13−LW42，M13−LW44
及びM13−LW46から単離された挿入断片の各々
と連結した。連結したプラスミドをコンピテント
大腸菌Ｋ−12MM294株へ形質転換した。これら
の形質転換体からのプラスミドDNAを制限酵素
地図作成によつて分析し、プラスミドpLW42，
pLW44，及びpLW46の存在を確かめた、第１４
図はpLW46の制限地図である。trpプロモーター
を誘導するために、トリプトフアンの不在下にこ
れらの個々のクローンの各々を生育させ、無細胞
抽出液をSDS−ポリアクリルアミドゲル上で分析
し、３クローンpLW42，pLW44及びpLW46の全
部が、14.4Kd IL−２蛋白質を合成することが立
証された陽性対照のpLW21に見られるものと同
様な14.5Kd蛋白を合成することが示された。こ
れらの同じ抽出液をマウスHT−２細胞でIL−２
活性について検定すると、クローンpLW21（陽性
対照）とpLW46のみが有意義量のIL−２活性を
示し（下の第２表）、cys58とcys105は生物学的活
性に必要なものであり、これをセリンに変えるこ
と（それぞれpLW42とpLW44）によつて生物学
的活性が失われることを意味している。一方
cys125は、これをser125（pLW46）へ変えても生
物学的活性に影響しないから、活性にとつて不要
であるに違いない。 第 ２ 表 クローン IL−２活性（μ／ml） PIL2−７（陽性対照） １ PLW21 （陽性対照） 113000 PLW42 660 PLW44 1990 PLW46 123000 第１５ａ図は、クローンpLW46のコード鎖の
ヌクレオチド配列を示す。天然のヒトIL−２遺
伝子のコード鎖に比べ、クローンpLW46はヌク
レオチド374にＧ→Ｃの一つの塩基の変化をもつ。
第１５ｂ図は、pLW46でコードされたIL−２ム
テインの対応するアミノ酸配列を示す。このムテ
インをIL−2ser125と称する。天然のIL−２に比
べ、ムテインは125位にシステインの代わりにセ
リンをもつている。 pLW46で形質転換されたE.コリＫ−12MM294
株の試料は、1983年９月26日，合衆国，20852メ
リーランド州ロツクビル，パークローン・ドライ
ブ12301番地，アメリカン・タイプ・カルチヤ
ー・コレクシヨン（Americam Type Culture
Collection）に寄託され、ATCC39，452号に指
定された。 ムテインIL−2ser125のように125位のシステイ
ンが欠損した又は別のアミノ酸でおき代えられた
IL−２ムテイン類は、IL−２活性を保持してい
る。従つて、これらを天然のIL−２と同じよう
に処方、使用できる。従つて、このようなムテイ
ン類は細菌，ウイルス，寄生虫，原生動物，及び
カビの感染の診断と処置、リンフオカイン又は免
疫不全の発現に、老令のヒト及び動物における通
常の免疫機能の再構成に、酵素増幅，放射能標
識，放射能映像化，及び病的状態のIL−２水準
をモニターするこの技術で知られたその他の方法
など、診断検定法の開発に、リンフオカイン類の
受容体部位を遮断する治療及び診断用に生体外で
のＴ細胞生育の促進のため、またその他種々の治
療，診断，研究への応用に有用である。ヒトIL
−２の種々の治療・診断への応用については、エ
ス・エイ・ローゼンバーグ（S.A.Rosenberg），
イー・エイ・グリム（E.A.Grim）ら、エイ・マ
ザムダー（A.Mazumder）ら、及びイー・エ
イ・グリムとエス・エイ・ローゼンバーグが研究
報告している。IL−２はそれ自体、又は他の免
疫学的に関連のあるＢ又はＴ細胞又はその他の治
療剤と組み合わせて使用できる。治療又は診断用
には、蒸留水，リンゲル液，ハンク液，生理的食
塩水などの無毒生、非アレルギー性の生理学的に
許容される担体媒体中にこれらを処方できる。ヒ
ト又は動物へのIL−２ムテイン類の投与は、医
師が適当と考えるところにより、経口、又は腹腔
内又は筋肉内又は皮下でありうる。関連細胞の例
はＢ又はＴ細胞、天然のキラー細胞等であり、本
発明のポリペプチド類と組み合わせて使用できる
治療用試薬の例は、種々のインターフエロン類、
特にガンマインターフエロン，Ｂ細胞生長因子，
IL−１等である。
第１図は、IFN−βのアミノ酸配列図である。
第２図は、オリゴヌクレアーゼ指示された突然変
異誘発による突然変異株IFN−β遺伝子の調製を
示す略図である。第３図は、IFN−β遺伝子を含
むプラスミドpβ1trpの図である。第４図は、クロ
ーニングベクターM13mp8フアージの図である。
第５図は、クローンM13−β1の制限地図を示す。
第６図は、コード領域で一つの塩基の変化を示す
突然変異IFN−βser17遺伝子の配列順序決定ゲル
パターンを示す。第７図は、発現プラスミド
pTrp3の図である。第８ａ図は、クローン
pSY2501のHinf制限パターンを示し、第８ｂ
図は生ずるその二つの169bp及び28bp断片を示
す。第９図は、クローンpSY2501の制限地図であ
る。第１０図は、ムテインIFN−βser17を暗号づ
けるDNA配列と、これに対応するアミノ酸配列
を示す。第１１図は、クローンpSY2501及び
pβ1trpの抽出液におけるIFN−βser17に対応する
単一の18000ダルトンの蛋白質バンドを示す。第
１２図は、E.コリtrp プロモーターの制御下に
ヒトインターロイキン−２（IL−２）遺伝子を含
有するプラスミドpLW1の図である。第１３図
は、フアージクローンM13−IL2の制限地図であ
る。第１４図は、プラスミドpLW46の制限地図
である。第１５ａ及び１５ｂ図は、クローン
pLW46のコード鎖のヌクレオチド配列、及びIL
−2ser125と称するIL−２ムテイの対応するアミ
ノ酸配列をそれぞれ示す。
第２図は、オリゴヌクレアーゼ指示された突然変
異誘発による突然変異株IFN−β遺伝子の調製を
示す略図である。第３図は、IFN−β遺伝子を含
むプラスミドpβ1trpの図である。第４図は、クロ
ーニングベクターM13mp8フアージの図である。
第５図は、クローンM13−β1の制限地図を示す。
第６図は、コード領域で一つの塩基の変化を示す
突然変異IFN−βser17遺伝子の配列順序決定ゲル
パターンを示す。第７図は、発現プラスミド
pTrp3の図である。第８ａ図は、クローン
pSY2501のHinf制限パターンを示し、第８ｂ
図は生ずるその二つの169bp及び28bp断片を示
す。第９図は、クローンpSY2501の制限地図であ
る。第１０図は、ムテインIFN−βser17を暗号づ
けるDNA配列と、これに対応するアミノ酸配列
を示す。第１１図は、クローンpSY2501及び
pβ1trpの抽出液におけるIFN−βser17に対応する
単一の18000ダルトンの蛋白質バンドを示す。第
１２図は、E.コリtrp プロモーターの制御下に
ヒトインターロイキン−２（IL−２）遺伝子を含
有するプラスミドpLW1の図である。第１３図
は、フアージクローンM13−IL2の制限地図であ
る。第１４図は、プラスミドpLW46の制限地図
である。第１５ａ及び１５ｂ図は、クローン
pLW46のコード鎖のヌクレオチド配列、及びIL
−2ser125と称するIL−２ムテイの対応するアミ
ノ酸配列をそれぞれ示す。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 天然インターフエロン−βの17位のシステイ
ン残基が他のアミノ酸残基により置き換えられて
いるか、又は欠失しており、且つ天然インターフ
エロン−βの生物学的活性を有する変形されたイ
ンターフエロン−β。 ２ 前記システイン残基がセリン、スレオニン、
グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロ
イシン、ヒスチジン、チロシン、フエニルアラニ
ン、トリプトフアン又はメチオニンで置き換えら
れていることを特徴とする特許請求の範囲第１項
記載の変形されたインターフエロン−β。 ３ インターフエロン−βがグリコシル化されて
いないことを特徴とする特許請求の範囲第１項に
記載の変形されたインターフエロン−β。 ４ 前記システイン残基がセリン残基により置き
換えられており、そしてインターフエロン−βが
グリコシル化されていないことを特徴とする特許
請求の範囲第１項に記載の変形されたインターフ
エロン−β。 ５ 天然インターフエロン−βの17位のシステイ
ン残基が他のアミノ酸残基により置き換えられて
いるか又は欠失しており、且つ天然インターフエ
ロン−βの生物学的活性を有する変形されたイン
ターフエロン−βの製造方法であつて、 (1) 天然インターフエロン−βをコードする
DNAを断片を用意し； (2) インターフエロン−βの17位のアミノ酸をコ
ードするコドンがシステイン以外のアミノ酸を
コードするコドンに置き換えられているか又は
該コドンが欠失しているオリゴヌクレオチドプ
ライマー、又は該プライマーに対して相補的な
オリゴヌクレオチドプライマーと、DNAポリ
メラーゼとを用いる鎖延長反応により、前記天
然インターフエロン−βをコードするDNAを
変異せしめることによりインターフエロン−β
の17位のアミノ酸をコードするコドンがシステ
イン以外のアミノ酸のコドンであるか又は該コ
ドンが欠失しているDNA断片を得、 (3) 前記変異したDNA断片をベクターに挿入す
ることにより発現ベクターを得、これを用いて
宿主を形質転換することにより形質転換体を
得、そして (4) 前記形質転換体を培養することにより前記変
形されたインターフエロン−βを生産させ、該
変形されたインターフエロン−βを採取するこ
とを特徴とする方法。
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US43515482A | 1982-10-19 | 1982-10-19 | |
| US435154 | 1982-10-19 | ||
| US48616283A | 1983-04-15 | 1983-04-15 | |
| US486162 | 1983-04-15 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6128392A JPS6128392A (ja) | 1986-02-08 |
| JPH0568480B2 true JPH0568480B2 (ja) | 1993-09-29 |
Family
ID=27030446
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP18730184A Granted JPS6128392A (ja) | 1982-10-19 | 1984-09-08 | 変形されたインターフェロン―β及びその製造方法 |
| JP63058544A Pending JPS6420096A (en) | 1982-10-19 | 1988-03-14 | Mutein and its production |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63058544A Pending JPS6420096A (en) | 1982-10-19 | 1988-03-14 | Mutein and its production |
Country Status (23)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (4) | EP0109748B1 (ja) |
| JP (2) | JPS6128392A (ja) |
| KR (1) | KR910009900B1 (ja) |
| AT (4) | ATE46539T1 (ja) |
| AU (1) | AU563962B2 (ja) |
| BE (1) | BE898016A (ja) |
| CA (1) | CA1340861C (ja) |
| CH (1) | CH669395A5 (ja) |
| DE (4) | DE3382528D1 (ja) |
| DK (2) | DK168767B1 (ja) |
| ES (4) | ES526541A0 (ja) |
| FI (1) | FI82266C (ja) |
| FR (1) | FR2534594B1 (ja) |
| GB (1) | GB2130219B (ja) |
| GR (1) | GR79408B (ja) |
| IE (1) | IE56026B1 (ja) |
| IL (1) | IL69970A (ja) |
| LU (3) | LU88761I2 (ja) |
| NL (2) | NL930119I2 (ja) |
| NO (1) | NO173740C (ja) |
| NZ (1) | NZ205922A (ja) |
| PH (2) | PH20343A (ja) |
| PT (1) | PT77512B (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2008507297A (ja) * | 2004-07-26 | 2008-03-13 | エンゾン ファーマシューティカルズ，インコーポレーテッド | 最適化されたインターフェロンβ遺伝子 |
Families Citing this family (125)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| IE56026B1 (en) * | 1982-10-19 | 1991-03-27 | Cetus Corp | Cysteine-depleted muteins of biologically active proteins |
| NZ208309A (en) * | 1983-06-01 | 1988-04-29 | Hoffmann La Roche | Recombinant leukocyte, fibroblast, or immune interferons (rifn-#a#, b or #g#) with one cys residue replaced |
| WO1985000817A1 (en) * | 1983-08-10 | 1985-02-28 | Amgen | Microbial expression of interleukin ii |
| GB8334102D0 (en) * | 1983-12-21 | 1984-02-01 | Searle & Co | Interferons with cysteine pattern |
| JPS61500790A (ja) | 1984-03-28 | 1986-04-24 | シタス コ−ポレイシヨン | 微生物的に製造されたインターロイキン―２を含有する組成物 |
| US4530787A (en) * | 1984-03-28 | 1985-07-23 | Cetus Corporation | Controlled oxidation of microbially produced cysteine-containing proteins |
| ATE48641T1 (de) * | 1984-05-08 | 1989-12-15 | Genetics Inst | Ein menschlicher t-zellwachstumsfaktor. |
| GB8412564D0 (en) * | 1984-05-17 | 1984-06-20 | Searle & Co | Structure and properties |
| US5683688A (en) * | 1984-05-31 | 1997-11-04 | Genentech, Inc. | Unglycosylated recombinant human lymphotoxin polypeptides and compositions |
| NZ212207A (en) | 1984-05-31 | 1991-07-26 | Genentech Inc | Recombinant lymphotoxin |
| US5672347A (en) * | 1984-07-05 | 1997-09-30 | Genentech, Inc. | Tumor necrosis factor antagonists and their use |
| CA1275954C (en) | 1984-08-31 | 1990-11-06 | Hing Cheug Wong | 3'-expression enhancing fragments and method |
| WO1986002068A1 (fr) * | 1984-09-26 | 1986-04-10 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Separation mutuelle de proteines |
| IL76360A0 (en) | 1984-09-26 | 1986-01-31 | Takeda Chemical Industries Ltd | Mutual separation of proteins |
| US4606917A (en) * | 1984-10-03 | 1986-08-19 | Syntex (U.S.A) Inc. | Synergistic antiviral composition |
| US4857316A (en) * | 1984-10-03 | 1989-08-15 | Syntex (U.S.A.) Inc. | Synergistic antiviral composition |
| US4959314A (en) | 1984-11-09 | 1990-09-25 | Cetus Corporation | Cysteine-depleted muteins of biologically active proteins |
| US4572798A (en) * | 1984-12-06 | 1986-02-25 | Cetus Corporation | Method for promoting disulfide bond formation in recombinant proteins |
| DK172052B1 (da) * | 1984-12-21 | 1997-09-29 | Otsuka Pharma Co Ltd | Antitumor-aktivt stof, fremgangsmåde til dets fremstilling, lægemiddel indeholdende stoffet, gen kodende for stoffet, vektor indeholdende genet samt rekombinant mikroorganisme transformet med en sådan vektor |
| US6107465A (en) * | 1984-12-21 | 2000-08-22 | Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd. | IL-1β and derivatives thereof and drugs |
| US5342614A (en) * | 1984-12-21 | 1994-08-30 | Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd. | Method of treating arthritus or inflammation with IL-1β or derivatives thereof |
| DE3500681A1 (de) * | 1985-01-11 | 1986-07-17 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt | Verfahren zur isolierung und reinigung von lymphokinen |
| US4863849A (en) * | 1985-07-18 | 1989-09-05 | New York Medical College | Automatable process for sequencing nucleotide |
| US6004548A (en) | 1985-08-23 | 1999-12-21 | Amgen, Inc. | Analogs of pluripotent granulocyte colony-stimulating factor |
| US4810643A (en) * | 1985-08-23 | 1989-03-07 | Kirin- Amgen Inc. | Production of pluripotent granulocyte colony-stimulating factor |
| CA1297003C (en) * | 1985-09-20 | 1992-03-10 | Jack H. Nunberg | Composition and method for treating animals |
| US5359035A (en) * | 1985-12-21 | 1994-10-25 | Hoechst Aktiengesellschaft | Bifunctional proteins including interleukin-2 (IL-2) and granuloctyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) |
| US5008374A (en) * | 1986-03-14 | 1991-04-16 | Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd. | IL-1α derivatives and drugs |
| AU595864B2 (en) * | 1986-03-14 | 1990-04-12 | Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd. | Il-1 alpha derivatives and drugs |
| EP0260350B1 (en) * | 1986-09-05 | 1992-02-12 | Cetus Oncology Corporation | Oxidation-resistant interferon-beta muteins and their production; formulations containing such muteins |
| JP2526965B2 (ja) * | 1987-02-24 | 1996-08-21 | 武田薬品工業株式会社 | ムテイン，ｄｎａおよびその用途 |
| US4987070A (en) * | 1987-03-04 | 1991-01-22 | Suntory Limited | Use of a 97 amino acid leader sequence from the E. coli B-galactosidase gene for the production of hanp and hptc as fusion proteins |
| JP2879148B2 (ja) * | 1987-07-07 | 1999-04-05 | サイオス インコーポレイテッド | 組換え繊維芽細胞成長因子 |
| ATE163013T1 (de) * | 1987-11-04 | 1998-02-15 | Byk Gulden Lomberg Chem Fab | Alveolare oberflächenaktive proteine |
| EP0355460B1 (en) * | 1988-08-24 | 2000-12-27 | American Cyanamid Company | Stabilization of somatotropins by modification of cysteine residues utilizing site directed mutagenesis or chemical derivatization |
| US5079230A (en) * | 1988-09-12 | 1992-01-07 | Pitman-Moore, Inc. | Stable bioactive somatotropins |
| CA2003886A1 (en) * | 1988-12-16 | 1990-06-16 | Anthony F. Purchio | Cloning and expression of simian transforming growth factor-beta 1 |
| JP3207416B2 (ja) * | 1989-01-31 | 2001-09-10 | ファルマシア・アンド・アップジョン・カンパニー | ソマトトロピン・アナログ類 |
| ATE133993T1 (de) * | 1989-02-17 | 1996-02-15 | Merck & Co Inc | Protein-antikrebsmittel |
| US5621078A (en) * | 1989-03-22 | 1997-04-15 | Merck & Co., Inc. | Modified pseudomonas exotoxin PE40 |
| AU5355790A (en) * | 1989-04-19 | 1990-11-16 | Cetus Corporation | Multifunctional m-csf proteins and genes encoding therefor |
| US6207798B1 (en) | 1989-08-03 | 2001-03-27 | Merck & Co., Inc. | Modified PE40 toxin fusion proteins |
| US5173297A (en) * | 1991-07-01 | 1992-12-22 | Quest International Flavors & Food Ingredients Company Division Of Indopco, Inc. | Bacteriocin from lactococcus lactis subspecies lactis |
| IL98528A0 (en) * | 1990-06-21 | 1992-07-15 | Merck & Co Inc | Pharmaceutical compositions containing hybrid for killing bladder cancer cells |
| FR2671554A1 (fr) * | 1991-01-11 | 1992-07-17 | Clonatec Sa | Peptides synthetiques derivant de l'antigene hbc du virus de l'hepatite b, leurs applications a la detection d'une infection par ce virus et a la vaccination contre l'hepatite b. |
| FR2686899B1 (fr) | 1992-01-31 | 1995-09-01 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Nouveaux polypeptides biologiquement actifs, leur preparation et compositions pharmaceutiques les contenant. |
| US5545723A (en) * | 1994-03-15 | 1996-08-13 | Biogen Inc. | Muteins of IFN-β |
| US5814485A (en) * | 1995-06-06 | 1998-09-29 | Chiron Corporation | Production of interferon-β (IFN-β) in E. coli |
| DE19544167A1 (de) * | 1995-11-17 | 1997-05-22 | Schering Ag | Verwendung von Interferon-ß zur Behandlung von Bronchialkarzinom bei Bestrahlungstherapie |
| WO1997048808A1 (en) * | 1996-06-19 | 1997-12-24 | Chiron Corporation | Bacterial production of interferon-beta using low levels of sodium and potassium ions |
| CN1100875C (zh) * | 1998-03-06 | 2003-02-05 | 上海华晨生物技术研究所 | 新型重组人白细胞介素2的制备方法及其表达载体和工程菌 |
| EP2213743A1 (en) | 2000-04-12 | 2010-08-04 | Human Genome Sciences, Inc. | Albumin fusion proteins |
| EP1935431A3 (en) | 2000-05-15 | 2008-08-13 | Health Research, Inc. | Cancer treatments by using a combination of an antibody against her2 and interleukin-2 |
| DE10112825A1 (de) | 2001-03-16 | 2002-10-02 | Fresenius Kabi De Gmbh | HESylierung von Wirkstoffen in wässriger Lösung |
| US6887462B2 (en) | 2001-04-09 | 2005-05-03 | Chiron Corporation | HSA-free formulations of interferon-beta |
| AU2002326991A1 (en) * | 2001-09-18 | 2003-04-01 | Chiron Corporation | Methods for treating multiple sclerosis |
| KR100511749B1 (ko) * | 2001-11-06 | 2005-09-02 | 선바이오(주) | 변형된 인터페론-베타, 및 이의 화학적으로 변형된 배합체 |
| AU2002364586A1 (en) | 2001-12-21 | 2003-07-30 | Delta Biotechnology Limited | Albumin fusion proteins |
| WO2005003296A2 (en) | 2003-01-22 | 2005-01-13 | Human Genome Sciences, Inc. | Albumin fusion proteins |
| DE10209821A1 (de) | 2002-03-06 | 2003-09-25 | Biotechnologie Ges Mittelhesse | Kopplung von Proteinen an ein modifiziertes Polysaccharid |
| DE10209822A1 (de) | 2002-03-06 | 2003-09-25 | Biotechnologie Ges Mittelhesse | Kopplung niedermolekularer Substanzen an ein modifiziertes Polysaccharid |
| BR0314227A (pt) | 2002-09-11 | 2005-10-25 | Fresenius Kabi De Gmbh | Derivados de amido de hidroxialquila |
| US7538092B2 (en) | 2002-10-08 | 2009-05-26 | Fresenius Kabi Deutschland Gmbh | Pharmaceutically active oligosaccharide conjugates |
| WO2005014655A2 (en) | 2003-08-08 | 2005-02-17 | Fresenius Kabi Deutschland Gmbh | Conjugates of hydroxyalkyl starch and a protein |
| ATE447412T1 (de) | 2003-11-04 | 2009-11-15 | Novartis Vaccines & Diagnostic | Antagonist-anti-cd40-monoklonale antikörper und anwendungsverfahren |
| US20060234205A1 (en) * | 2004-03-05 | 2006-10-19 | Chiron Corporation | In vitro test system for predicting patient tolerability of therapeutic agents |
| JP5191729B2 (ja) | 2004-03-11 | 2013-05-08 | フレゼニウス・カビ・ドイチュラント・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング | 還元的アミノ化によって製造される、ヒドロキシアルキルデンプンとタンパク質とのコンジュゲート |
| GB0523282D0 (en) | 2005-11-15 | 2005-12-21 | Isis Innovation | Methods using pores |
| GB2453377A (en) | 2007-10-05 | 2009-04-08 | Isis Innovation | Transmembrane protein pores and molecular adapters therefore. |
| EP2070950A1 (en) | 2007-12-14 | 2009-06-17 | Fresenius Kabi Deutschland GmbH | Hydroxyalkyl starch derivatives and process for their preparation |
| ATE548052T1 (de) | 2008-01-17 | 2012-03-15 | Philogen Spa | Kombination aus einem anti-edb-fibronectin- antikörper-il-2-fusionsprotein und einem b-zellen bindenden molekül, b-zellen-vorläufern und/oder deren krebserregendem gegenspieler |
| US20110229877A1 (en) | 2008-07-07 | 2011-09-22 | Oxford Nanopore Technologies Limited | Enzyme-pore constructs |
| EP2310534B1 (en) | 2008-07-07 | 2018-09-05 | Oxford Nanopore Technologies Limited | Base-detecting pore |
| US9077937B2 (en) * | 2008-11-06 | 2015-07-07 | Alcatel Lucent | Method and apparatus for fast channel change |
| GB0820927D0 (en) | 2008-11-14 | 2008-12-24 | Isis Innovation | Method |
| EP2391732B1 (en) | 2009-01-30 | 2015-05-27 | Oxford Nanopore Technologies Limited | Methods using adaptors for nucleic acid constructs in transmembrane sequencing |
| KR20110125226A (ko) | 2009-01-30 | 2011-11-18 | 옥스포드 나노포어 테크놀로지즈 리미티드 | 혼성화 링커 |
| GB0905140D0 (en) | 2009-03-25 | 2009-05-06 | Isis Innovation | Method |
| KR101939420B1 (ko) | 2011-02-11 | 2019-01-16 | 옥스포드 나노포어 테크놀로지즈 리미티드 | 돌연변이체 세공 |
| DK2683395T3 (en) | 2011-03-11 | 2018-11-19 | Hopitaux Paris Assist Publique | USE OF LOW DOSAGE IL-2 FOR TREATMENT OF TYPE 1 DIABETES |
| JP6298404B2 (ja) | 2011-07-25 | 2018-03-20 | オックスフォード ナノポール テクノロジーズ リミテッド | 膜貫通ポアを用いる二重鎖ポリヌクレオチド配列決定のためのヘアピンループ方法 |
| GB201119244D0 (en) | 2011-11-08 | 2011-12-21 | British American Tobacco Co | Smoking article |
| KR102083695B1 (ko) | 2012-04-10 | 2020-03-02 | 옥스포드 나노포어 테크놀로지즈 리미티드 | 돌연변이체 리세닌 기공 |
| US11155860B2 (en) | 2012-07-19 | 2021-10-26 | Oxford Nanopore Technologies Ltd. | SSB method |
| GB201314695D0 (en) | 2013-08-16 | 2013-10-02 | Oxford Nanopore Tech Ltd | Method |
| CA2901545C (en) | 2013-03-08 | 2019-10-08 | Oxford Nanopore Technologies Limited | Use of spacer elements in a nucleic acid to control movement of a helicase |
| GB201313477D0 (en) | 2013-07-29 | 2013-09-11 | Univ Leuven Kath | Nanopore biosensors for detection of proteins and nucleic acids |
| EP3013355B1 (en) | 2013-06-25 | 2019-08-07 | ICM - Institut du Cerveau et da la Moelle Epinière | Il-2 for use in treating alzheimer disease and related disorders |
| GB201403096D0 (en) | 2014-02-21 | 2014-04-09 | Oxford Nanopore Tech Ltd | Sample preparation method |
| EP2918285A1 (en) | 2014-03-11 | 2015-09-16 | Université Pierre et Marie Curie (Paris 6) | Interleukin-2 for treating food allergy |
| EP3137490B1 (en) | 2014-05-02 | 2021-01-27 | Oxford Nanopore Technologies Limited | Mutant pores |
| CA2959220A1 (en) | 2014-09-01 | 2016-03-10 | Vib Vzw | Mutant csgg pores |
| EP3204511B1 (en) | 2014-10-07 | 2021-07-28 | Oxford Nanopore Technologies Limited | Mutant pores |
| GB201418159D0 (en) | 2014-10-14 | 2014-11-26 | Oxford Nanopore Tech Ltd | Method |
| WO2016172445A2 (en) * | 2015-04-24 | 2016-10-27 | The University Of Florida Research Foundation, Inc. | Methods of identifying biologically active random peptides in plants and libraries of plants expressing candidate biologically active random peptides |
| US10801023B2 (en) * | 2015-04-24 | 2020-10-13 | University Of Florida Research Foundation, Inc. | Methods of identifying biologically active random peptides in plants and libraries of plants expressing candidate biologically active random peptides |
| US10876109B2 (en) | 2015-04-24 | 2020-12-29 | University Of Florida Research Foundation, Inc. | Methods of identifying biologically active random peptides in prokaryotic cells and libraries of prokaryotic cells expressing candidate biologically active random peptides |
| ES2982752T3 (es) | 2015-10-22 | 2024-10-17 | Iltoo Pharma | Composiciones farmacéuticas de il-2 |
| GB201609220D0 (en) | 2016-05-25 | 2016-07-06 | Oxford Nanopore Tech Ltd | Method |
| EP3475413B1 (en) | 2016-06-22 | 2024-02-14 | David Klatzmann | Genetically modified t lymphocytes |
| CA3055200A1 (en) | 2017-03-03 | 2018-09-07 | Obsidian Therapeutics, Inc. | Compositions and methods for immunotherapy |
| EP3596108A4 (en) | 2017-03-15 | 2020-12-23 | Pandion Operations, Inc. | TARGETED IMMUNOTOLERANCE |
| US10676516B2 (en) | 2017-05-24 | 2020-06-09 | Pandion Therapeutics, Inc. | Targeted immunotolerance |
| USRE50550E1 (en) | 2017-12-06 | 2025-08-26 | Pandion Operations, Inc. | IL-2 muteins and uses thereof |
| US10946068B2 (en) | 2017-12-06 | 2021-03-16 | Pandion Operations, Inc. | IL-2 muteins and uses thereof |
| US10174092B1 (en) | 2017-12-06 | 2019-01-08 | Pandion Therapeutics, Inc. | IL-2 muteins |
| EP3752178A1 (en) | 2018-02-16 | 2020-12-23 | Iltoo Pharma | Use of interleukin 2 for treating sjögren's syndrome |
| GB201807793D0 (en) | 2018-05-14 | 2018-06-27 | Oxford Nanopore Tech Ltd | Method |
| WO2019241315A1 (en) | 2018-06-12 | 2019-12-19 | Obsidian Therapeutics, Inc. | Pde5 derived regulatory constructs and methods of use in immunotherapy |
| WO2020007937A1 (en) | 2018-07-03 | 2020-01-09 | Iltoo Pharma | Use of interleukin-2 for treating systemic sclerosis |
| US12403181B2 (en) | 2018-08-13 | 2025-09-02 | Iltoo Pharma | Combination of interleukin-2 with an interleukin 1 inhibitor, conjugates and therapeutic uses thereof |
| US12352765B2 (en) | 2018-11-15 | 2025-07-08 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Compositions and methods of prognosis and classification for preeclampsia |
| BR112021023345A2 (pt) | 2019-05-20 | 2022-02-01 | Pandion Operations Inc | Imunotolerância com alvo em madcam |
| BR112022011414A2 (pt) | 2019-12-12 | 2022-08-30 | Iltoo Pharma | Construção quimérica, proteína homodimérica, proteína heterodimérica, ácido nucleico, vetor, célula hospedeira, métodos para produzir uma proteína dimérica e para produzir uma proteína heterodimérica |
| EP4107187A4 (en) | 2020-02-21 | 2024-07-03 | Pandion Operations, Inc. | TISSUE-TARGETED IMMUNOTOLERANCE WITH A CD39 EFFECTOR |
| JP7840267B2 (ja) | 2020-03-06 | 2026-04-03 | サントル、オスピタリエ、ユニヴェルシテール、ド、ニーム | 筋萎縮性側索硬化症の治療のための低用量ヒトインターロイキン－２ |
| JP2023524248A (ja) * | 2020-04-29 | 2023-06-09 | アビオン インク． | 二重突然変異を有するヒトインターフェロン－ベータ変異体及びヒトインターフェロン－ベータ変異体の安全性を向上させる方法 |
| CN116075523A (zh) * | 2020-04-29 | 2023-05-05 | 基因制药株式会社 | 具有融合的干扰素-β突变蛋白和抗体的重组蛋白以及包含其的药物组合物 |
| WO2022045935A1 (en) * | 2020-08-28 | 2022-03-03 | Joint Stock Company "Biocad" | Aav5-based vaccine against sars-cov-2 |
| CN118414160A (zh) | 2021-10-06 | 2024-07-30 | 艾尔图制药公司 | 对发炎组织具有靶向特异性的白介素2嵌合构建体 |
| WO2023226873A1 (en) * | 2022-05-24 | 2023-11-30 | Jhm Biopharmaceutical (Hangzhou) Co., Ltd. | Recombinant botulinum neurotoxin of type a and preparation method thereof |
| US20240076343A1 (en) | 2022-06-16 | 2024-03-07 | Cephalon Llc | Anti-pd-1 antibody-attenuated il-2 immunoconjugates and uses thereof |
| EP4587043A1 (en) | 2022-09-12 | 2025-07-23 | Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM) | Interleukin-2 for use in treating autism spectrum disorder |
| EP4630035A1 (en) | 2022-12-05 | 2025-10-15 | Centre Hospitalier Universitaire de Nimes | Low dose human interleukin-2 for the treatment of amyotrophic lateral sclerosis in a subgroup of patients |
| WO2025032158A1 (en) | 2023-08-08 | 2025-02-13 | Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale | Method to treat tauopathies |
Family Cites Families (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5359688A (en) * | 1976-11-11 | 1978-05-29 | Tanpakushitsu Kenkiyuu Shiyour | Production of novel polypeptide |
| US4399216A (en) * | 1980-02-25 | 1983-08-16 | The Trustees Of Columbia University | Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials |
| EP0041313B1 (en) * | 1980-04-03 | 1990-09-12 | Biogen, Inc. | Dna sequences, recombinant dna molecules and processes for producing human fibroblast interferon |
| JPS58110548A (ja) * | 1981-12-24 | 1983-07-01 | Asahi Chem Ind Co Ltd | 新規な生理活性ペプチド |
| US6936694B1 (en) * | 1982-05-06 | 2005-08-30 | Intermune, Inc. | Manufacture and expression of large structural genes |
| IE56026B1 (en) * | 1982-10-19 | 1991-03-27 | Cetus Corp | Cysteine-depleted muteins of biologically active proteins |
| NZ208309A (en) * | 1983-06-01 | 1988-04-29 | Hoffmann La Roche | Recombinant leukocyte, fibroblast, or immune interferons (rifn-#a#, b or #g#) with one cys residue replaced |
| WO1985000817A1 (en) * | 1983-08-10 | 1985-02-28 | Amgen | Microbial expression of interleukin ii |
| US4959314A (en) * | 1984-11-09 | 1990-09-25 | Cetus Corporation | Cysteine-depleted muteins of biologically active proteins |
-
1983
- 1983-10-10 IE IE2380/83A patent/IE56026B1/en active Protection Beyond IP Right Term
- 1983-10-10 FI FI833681A patent/FI82266C/fi not_active IP Right Cessation
- 1983-10-11 NZ NZ205922A patent/NZ205922A/en unknown
- 1983-10-12 AU AU20086/83A patent/AU563962B2/en not_active Expired
- 1983-10-12 PH PH29685A patent/PH20343A/en unknown
- 1983-10-12 CA CA000438878A patent/CA1340861C/en not_active Expired - Lifetime
- 1983-10-13 DE DE8787103350T patent/DE3382528D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1983-10-13 AT AT86110595T patent/ATE46539T1/de active
- 1983-10-13 EP EP83306221A patent/EP0109748B1/en not_active Expired
- 1983-10-13 AT AT85109295T patent/ATE61407T1/de not_active IP Right Cessation
- 1983-10-13 AT AT87103350T patent/ATE73493T1/de not_active IP Right Cessation
- 1983-10-13 EP EP87103350A patent/EP0234599B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1983-10-13 AT AT83306221T patent/ATE33503T1/de not_active IP Right Cessation
- 1983-10-13 EP EP85109295A patent/EP0192811B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1983-10-13 DE DE8686110595T patent/DE3380598D1/de not_active Expired
- 1983-10-13 DE DE8585109295T patent/DE3382197D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1983-10-13 LU LU88761C patent/LU88761I2/fr unknown
- 1983-10-13 EP EP86110595A patent/EP0218825B1/en not_active Expired
- 1983-10-13 GB GB08327490A patent/GB2130219B/en not_active Expired
- 1983-10-13 DE DE8383306221T patent/DE3376271D1/de not_active Expired
- 1983-10-14 IL IL69970A patent/IL69970A/xx not_active IP Right Cessation
- 1983-10-17 GR GR72712A patent/GR79408B/el unknown
- 1983-10-17 PT PT77512A patent/PT77512B/pt unknown
- 1983-10-18 FR FR8316543A patent/FR2534594B1/fr not_active Expired
- 1983-10-18 CH CH5667/83A patent/CH669395A5/fr not_active IP Right Cessation
- 1983-10-18 KR KR1019830004927A patent/KR910009900B1/ko not_active Expired
- 1983-10-18 NO NO833793A patent/NO173740C/no not_active IP Right Cessation
- 1983-10-18 ES ES526541A patent/ES526541A0/es active Granted
- 1983-10-18 BE BE0/211722A patent/BE898016A/fr not_active IP Right Cessation
- 1983-10-19 DK DK481383A patent/DK168767B1/da not_active IP Right Cessation
-
1984
- 1984-06-01 ES ES533053A patent/ES533053A0/es active Granted
- 1984-06-01 ES ES533054A patent/ES8506801A1/es not_active Expired
- 1984-09-08 JP JP18730184A patent/JPS6128392A/ja active Granted
-
1985
- 1985-05-03 ES ES542829A patent/ES8608043A1/es not_active Expired
-
1986
- 1986-03-13 PH PH33519A patent/PH23702A/en unknown
-
1988
- 1988-03-14 JP JP63058544A patent/JPS6420096A/ja active Pending
-
1992
- 1992-08-26 DK DK105892A patent/DK171681B1/da not_active IP Right Cessation
-
1993
- 1993-06-30 NL NL930119C patent/NL930119I2/nl unknown
- 1993-07-01 LU LU88357C patent/LU88357I2/fr unknown
-
1996
- 1996-05-29 NL NL960013C patent/NL960013I2/nl unknown
-
1999
- 1999-07-07 LU LU90413C patent/LU90413I2/fr unknown
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2008507297A (ja) * | 2004-07-26 | 2008-03-13 | エンゾン ファーマシューティカルズ，インコーポレーテッド | 最適化されたインターフェロンβ遺伝子 |
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JPH0568480B2 (ja) | ||
| US4588585A (en) | Human recombinant cysteine depleted interferon-β muteins | |
| US4518584A (en) | Human recombinant interleukin-2 muteins | |
| US4853332A (en) | Structural genes, plasmids and transformed cells for producing cysteine depleted muteins of biologically active proteins | |
| US4959314A (en) | Cysteine-depleted muteins of biologically active proteins | |
| US4737462A (en) | Structural genes, plasmids and transformed cells for producing cysteine depleted muteins of interferon-β | |
| Goeddel et al. | The structure of eight distinct cloned human leukocyte interferon cDNAs | |
| US4414150A (en) | Hybrid human leukocyte interferons | |
| JP2595206B2 (ja) | 酸化耐性ミユーテイン | |
| JPS6357440B2 (ja) | ||
| EP0098862A1 (en) | Interferon-alpha 76 | |
| EP0098863A1 (en) | Interferon-alpha 61 | |
| EP0099389A1 (en) | Interferon-alpha 54 | |
| EP0098864A1 (en) | Interferon-alpha 74 | |
| Pestka et al. | The human interferons: their purification and sequence, cloning and expression in bacteria, and biological properties | |
| FI87233B (fi) | Gen vilken kodar en mutein. | |
| BG60510B2 (bg) | Структурни гени,плазмиди и трансформирани клетки за получаване на бедни на цистеин мутеини на биологично активни протеини | |
| BG60506B2 (bg) | Човешки рекомбинантни интерлевкин-2 мутеини | |
| CH669394A5 (en) | Synthetic protein analogues lacking cysteine residues | |
| JPH08271A (ja) | 新規なポリペプチド、その製造方法、そのポリペプチドをコードするｄｎａ、そのｄｎａからなるベクター、そのベクターで形質転換された宿主細胞、そのポリペプチドの抗体、およびそのペプチドまたは抗体を含有する薬学的組成物 | |
| NO306951B1 (no) | DNA-sekvens som koder for et modifisert human-IFM-(beta) samt fremgangsmåte for fremstilling derav |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| R153 | Grant of patent term extension |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R153 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20070929 Year of fee payment: 14 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20080929 Year of fee payment: 15 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20080929 Year of fee payment: 15 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090929 Year of fee payment: 16 |
|
| EXPY | Cancellation because of completion of term | ||
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090929 Year of fee payment: 16 |