JPH0569585B2

JPH0569585B2 -

Info

Publication number: JPH0569585B2
Application number: JP63297168A
Authority: JP
Inventors: Ruisu Koronbusu Richaado; Roorensu Herufuaa Jefurii; Jakobusu Hooto Johanzu; Aren Ueruman Jefurii
Original assignee: Eastman Kodak Co
Current assignee: Eastman Kodak Co
Priority date: 1987-11-23
Filing date: 1988-11-24
Publication date: 1993-10-01
Also published as: EP0318255B1; EP0318255A2; DE3880632D1; DE3880632T2; US4902624A; JPH01266858A; EP0318255A3

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野）本発明は、中に含まれる液体内で反応を行なう
（特にこれらの反応は注意深い温度調整、限られ
た量の試料、および急速な液体温度変化を必要と
する）キユベツトに関する。

（従来の技術）本発明は核酸拡張に使用するキユベツトに限ら
れるものではないが、これに関連させて説明す
る。

核酸拡張は通常以下の工程を経て進む（第１図
参照）： (1) DNAを拡張する場合、適当な制限酵素を使
つて完全なDNA2重らせんを任意に化学的に切
り取つて関心のある部分を単離する。

(2) 単離した核酸部分（ここでは、DNA）およ
びヌクレチオドの溶液を92〜95℃に加熱しそし
て、例えば約10分以内の間、この温度に保つて
２との核酸ストランドを変性させる（すなわ
ち、これらのらせんをとき、分離し、そして原
型を形成する。） (3) 次に溶液を50〜60℃の帯域に通して冷却して
プライマー核酸ストランドをアニールする、す
なわち２つの原型ストランドのそれぞれにこれ
を結合させる。これが確実に起こるようにする
ために、溶液を適当な温度、例べば約55℃、で
約15秒間、「培養」帯域に保つ。

(4) 次に溶液を約70℃に加熱し、この温度に保つ
て、存在するヌクレオチドを使い、拡張酸素好
ましくはセルマス・アクアテイカス
（thermuS′aquaticus）から単離したポリメラ
ーゼのような熱に安定な酸素、で原型ストラン
ドに結合したプライマーストランドを拡張させ
る。

(5) 完成した新しい対のストランドを再び92〜95
℃に約10〜15秒間加熱して、この対を分離す
る。

(6) 次に適当な数のスライランドが得られるまで
工程(3)〜(5)を何回か繰り返す。（詳細は米国特
許第4683202号参照。）繰り返すほど、多数の核
酸（ここでは、DNA）が生成される。

希望の濃度の核酸が最少の時間に得られるのが
好ましい。

キユベツトは通常、溶液が前記の温度段階を通
過する間溶液を保持するのに使われる。キユベツ
トを速やかに様々な段階に進めることができるか
どうかはキユベツトのデザインによる。これをコ
ントロールする鍵となるものはキユベツトの熱伝
達効率である−−すなわち、キユベツト内の溶液
全体へまた溶液全体から熱を瞬時に伝達するキユ
ベツトの能力である。熱源またはシンクから比較
的離れている溶液部分は望ましい温度に達するの
により時間がかかるので、配置および溶液自体の
熱抵抗が熱伝達に影響を及ぼす主な要素である。

従来使用されてきた最も素朴で初期のタイプの
キユベツトは試験管であり、これは(a)ガラスまた
はプラスチツクのキユベツトの壁が熱エネルギー
をよく伝達しない、および(b)円筒状の液体では液
体すみずみへの熱伝達が比較的不十分であるため
熱伝導効率が不十分である。すなわち、液体の熱
伝達が低いばかりでなく、円筒状の液体は表面対
策容積比（すなわち、約100μの注入に対して
約27in^-1である）が小さい。

DNA拡張における別の問題は、反応の完了後
キユベツトから液体を簡単に取り出せるようにす
ることである。試験管の形はそれが簡単にでき
る。しかしながら、キユベツトをよりよい熱伝導
効率のものに変えると、液体の移動性が悪くな
る。

液体の反応用の最近のキユベツトまた容器につ
いては1984年１月17日発行の米国特許第4426451
号および1972年９月12日発行の米国特許第
3691017号に記載されている。前者では、熱が液
体を通るとき、液体を、急速な加熱が行なえる薄
いフイルム状に散布してる他は、熱伝導効率を高
める試みはほとんどなされていない。金属または
熱伝導性の高い材料でできたキユベツトについて
は何も記載されていない。さらに、上部と下部の
壁との間の間隔は125ミクロン以下であり強力な
毛管効果をもたらすので、そのようにキユベツト
から液体を取り出すのは難しい。もつとも良い状
態であつても、強力な毛管吸引力のため全ての液
体は取り出せない。

米国特許第3691017号のキユベツトの場合は、
DNA拡張により適した特徴を有する。たとえば、
主要面２３と２４との間隔が約５mmであることに
よつて、全ての液体の取り出しがより簡単にで
き、そのような大きな間隔せは毛管吸引力はほと
んど残つていない。さらに、金属層３８Ａがキユ
ベツトの外側にとりつけてあつて加熱装置に接触
している。しかしながら、このキユベツトはいく
つかの理由で熟時定数が小さくない。理由の１つ
は、確実に透明にするために表面２３および２４
が金属でできておらずむしろ絶縁体でできている
からである。その結果、装置の端の周りとキユベ
ツとの容積部分３５のみに金属３８Ａを伸ばすこ
とによつて、熱伝達路を長くすることが必要とな
る。この熱路長さは主要面２３および２４となる
壁の厚さよりはるかに大きいので、これは0.5mm
をはるかに越す値となる。実際は、キユベツトの
容積部分だけが金属熱エネルギー伝達部材と直接
接触している。

第２と理由は、さらに重要なことであり、後で
詳しく述べるがこの米国特許第3991017号のキユ
ベツトはキユベツトの形状から、液体表面／容積
比が小さいので熱抵抗が高いからである。

本発明の目的は、たとえばDNAの部分の複製
化に使用できる選択された液体が入つている場合
の熱時定数によつて判定されるような、急速な熱
伝達特性を有するキユベツトを提供することであ
る。

（発明の構成）本発明の１つの態様によれば、本発明の目的
は、すくなくとも約35℃（たとえば約55〜約90
℃）の温度範囲をサイクルさせる液体成分の制御
反応用の以下の熱サイクルキユベツトによつて達
成される。このキユベツトは２つの間隔をおいて
離れた向かいあつた壁によつて定められた少なく
とも１つの液体を入れておく室を有し、側壁は前
記の２つの向かいあつた壁に接続しているもので
あつて、そして前記の向かいあつた壁および前記
の側壁は、注入容量100〜200μに対し有効温度
調整面容量比が約65〜約130in^-1の室をもたらす
大きさであること、および少なくとも１つの前記
の向かいあつた壁の熱路長さが約0.3mm以下およ
び耐熱度が約0.01℃／ワツト以下であることを特
徴とするものである。

本発明の別の態様によれば、本発明の目的は、
液体成分の制御反応用の以下のキユベツトによつ
て達成される。このキユベツトは反応を行なうた
めの第１および第２の液体を入れておく室を有
し、それぞれの室は２つの間隔をおいて離れた向
かいあつた壁によつて定められており、そして側
壁は前記の２つの向かいあつた壁のそれぞれ接続
しており、前記の各室は液体を入れておく主要面
を提供するものであつて、前記の２つの室は、前
記室の一方の主要面が他方の室の主要面上に配置
されるようになつていることを特徴とし、そのた
め前記主要面が共通面となる前記キユベツトの長
さおよび／または幅が、同等のキユベツトと比べ
て小さくなるものである。

本発明のさらに別の態様によれば、本発明の目
的は、切り離した１ストランドの核酸とモル過剰
のオリゴヌクレオチドプライマーとの混合物をプ
ライマーを前記ストランドに結合させるのに有効
な温度で処理し、この結合したプライマーおよび
ストランドを延長酵素の存在下で加熱してプライ
マーを延長して補足ストランドを形成し、この結
合補足ストランドおよび前記核酸のストランド
を、これらを２つの原型ストラントに分離する温
度で加熱し、その後前記の各工程をこれらの原型
ストランドに繰り返して多数の拡張ストランドを
生成することよりなる核酸配列を拡張する方法に
おいて、さらに以下の各工程：選択したオリゴヌクレオチド配列に結合したヌ
クレオチドの補足配列よりなる検知および捕捉プ
ローブを前記混合物に加える（前記プローブはさ
らに、反応して検知信号を出すことのできる信号
部分またはプローブに結合したストランドを固定
化する捕捉部分のいずれか、または両方を含んで
いる）工程；前記プローブを前記拡張ストランドと反応させ
てプローブを拡張ストランドに結合する工程；結合したプローブおよびストランドを含む混合
物を分離手段に移す工程；そして、この混合物を、そのような捕捉部分と
は結合するがそのような捕捉部分の無いストラン
ドは通過させる物質を含有するフイルターに通す
ことによつて、捕捉プローブを有するストランド
をそのようなプローブの無いストランドから分離
する工程よりなる上記の方法によつて達成される。

本発明は以後、好ましくは、DNAストランド
の複製化に特に有用な少なくとも35℃の範囲に渡
る温度サイクルについて述べる。さらに、これ
は、その中で反応が行なわれるキユベツトの加熱
および冷却を繰り返し行なう必要のある液体成分
および試薬のどのような種類の反応にも有用であ
る。

「上」および「下」のような配置方向は、その
ように使用するのが好ましいキユベツトに関して
用いる。

まず第２〜４図について述べる。本発明によつ
て作つたキユベツト３０は距離t₁の間隔で離れた
２つの向かいあつた壁３４および３６によつて定
められた液体を入れる室３２（第４図）よりな
る。そのような間隔は室３２の向かいあつた端４
２および４４で接合する側壁３８および４０によ
つて得られる（第３図）。最も好ましいのは、側
壁３８および４０の形が徐々にへこんでいく形の
ものであり、そのためこれらの壁は端４２で約
90°の角度アルフアにて分かれ、端４２および４
４の中途の地点から再び約90°の角度で１点に集
まるように近づき始める。距離t₁（第４図）は、
側壁３８および４０の形のありかたを考えた場
合、液体を取り除いたときキユベツトに留まる液
体の量が最少となるような距離を選ぶ。すなわ
ち、毛管状の間隔が液体の除去を妨げることはよ
く知られていることである。従つて、間隔が接近
している壁３４および３６の間の液体の厚さは毛
管状の間隔ではないのが、すなわち間隔0.5mm、
最も好ましくは0.5〜2.5であるのが好ましい。さ
らに正確には、液体容器が特定の形に定められて
いる場合、容器が毛管吸引力のような悪影響を及
ぼすフアクターに対抗して容器を空にする能力は
キヤピラリー・ナンバーＣで表すことができる。
その式はＣ＝μ・Ｖ／ｒである。式中、μは粘度
であり、水溶液の場合これは約0.01ポアズであ
る。ｒは表面張力であり、水溶液の場合これは約
70ダイン／cmである。Ｖは速度（cm／秒）であ
り、空にする全容積を出口の通過面積で割りそし
て空にするのに許容される時間で割ることによつ
て決定される。従つて、速度フアクターについて
熟考する必要がある。空にする容積は200〜100μ
である。許容時間は１〜10秒である。従つて、
Ｖは最高の200／Ａ・１から最低の100／Ａ・10で
ある。本発明の目的の場合、Ａは約5.2×10^-3cm²、
出口の通過面積は60と仮定する。従つて、Ｖは約
3.85〜38.5cm／秒である。つまり、このキユベツ
トのキヤピラリー・ナンバーは約0.0005〜約
0.006である。しかしながら、非毛管状間隔だけ
がそのような速度で空にすることができるので、
これに非毛管状間隔を組み込まなければならな
い。

壁３４および３６は液体と接触する主要面とな
る。そのため、厚さを間隔t₁と考えた場合、それ
らの表面積を、室３２の表面対容積比が高速度の
熱エネルギー伝達に最も適するように選択する。
非常に好ましい例は、各壁３４および３６の露出
表面積が2.4cm²（0.37in²）であり、0.36cm²の接触
面積で側壁の面と接触している場合である。した
がつて、表面対容積比が、注入容積200〜100μ
に対し、それぞれ約65〜130in^-1であるのが最も
好ましい。

液体表面積対容積比がそのように大きいと、急
速な熱エネルギー伝達とは別の利点がもたらされ
る。これはまた、一定の容積に対して、より広い
表面積が塗布試薬に提供されることを意味する。
このことは、早すぎる混合、すなわち、液体を室
に注入する前の混合、を防ぐために表面上の離れ
た位置に塗布しなければならない試薬の場合、特
に重要なことである。また、液体を入れると、こ
れらの試薬はより効果的に溶解される。

従つて、任意に、１つ以上の試薬層５０を、１
層以上が、室３２に挿入する液体試料との反応に
加わるようにする形で壁３６（第４図）の内面に
塗布することができる。従つて「試薬」とは、液
体試料と物理的かつ化学的に互いに作用し合う物
質である。そのような試薬層は噴霧乾燥によるよ
うな従来法で塗布することができる。そのような
試薬にはポリメラーゼ酵素、塩、緩衝剤および安
定剤がある。塗布層にはまた複製化に必要なプラ
イマー・ペアーおよびジヌクレオチドも含まれ
る。

液体出入口６０は端４２に隣接する壁３６に形
成される。この出入口は上部６２および下部６４
を有し、上部を室３２に接続している。好ましく
は、少なくとも上部６２は円錐形であり、その傾
斜は種々の円錐ピペツトＰ（第２図）が合うよう
になつている。

反対の端４４には、米国特許第4426451号に記
載のように空気抜き７０が設けられている。最も
好ましくは、空気抜き７０は通路７２に延び（第
３図）、端４２の隣接点に戻り、出入口６０に隣
接する開口７４で終わる。

単一の密封機構で出入口６０および空気抜き開
口７４を共にシールするには、高くした円筒状ボ
ス８０でこれらを囲む。どのような密封機構（た
とえば栓８２、第１０図）もボス８０に対して有
用である。そのような栓には、ボスの雌ねじ（図
示されていない）に合う雌ねじ８４があつてもよ
く、あるいはボス８０内への押し込み式にしても
よい。

最も好ましいのは、壁３４以外の装置の壁を例
えばポリカーボネートプラスチツクのようなあま
り湿潤性でない材料から作ることである。

本発明の１つの態様では、壁３６の反対側の壁
３４は、熱エネルギー伝達が高速となる予め決め
られた熱路長さおよび熱抵抗を有するように作る
最も好ましいのは、そのような路の長さ（第５図
のt₂）が約0.3mm以下であり、熱抵抗が約0.01℃／
ワツト以下である。このような性質は、厚さ約
0.15mmのアルミニウムのような金属から壁３４を
作ることによつて簡単に得られる。そのようなア
ルミニウムは、厚さＸ・１／（熱伝導率Ｋ・表面
積Ａ）として計算して、約0.003℃／ワツトの熱
抵抗を有する。（これらの値は、約0.24℃の熱抵
抗を有する同じ厚さの普通のガラスと対照的であ
る。）壁３４は側壁３８および４０にどのような適当
な手段で固定してもよい。そのような１つの手段
は、例えば一般的な高温硬化接着剤よりなるプラ
イマーの層９０（第５図）、それに続く一般的な
ポリエステル接着剤の層９２である。場合によつ
ては、層９０および９２は壁３４の表面領域一面
に延ばす必要はない。というのは、このように一
面に延ばすと壁３４の熱抵抗が高まり、室内での
前述の反応が妨げられる場合があるからである。
他方、反応によつては存在する金属イオンが同じ
ように悪影響を及ぼすことがあり、このような反
応の場合、接着剤を壁３４の表面積全体に塗布す
る。

第２〜４図の上記のようなキユベツトでは、そ
こに含まれる液体の熱時定数タウ（τ）が約10秒
以下となることがわかつた。最も好ましいのは、
τが３〜８秒のものである。すなわち、水を入れ
たそのようなキユベツトを壁３４の外側にそつて
加熱し、その温度をＹ点（第４図）で測定するこ
と、熱応答曲線が28℃〜最終温度103℃に生じる
（第６図）。中の液体が76℃〔初期温度28℃、プラ
ス差（103.9−28）の63％〕となるのにかかる時
間がタウのおおよその値である。（おおよその）
この値はよく知られた以下の熱応答式から得られ
る： (1) 温度Ｔ(t)＝最終温度＋（初期温度 −最終温度）・e^-t/〓従つて、式中の時間間隔ｔがタウに等しい場合、
e^-t/〓＝e^-10.37となる。このような場合、Ｔ(t)
（ｔ＝タウでの）は初期温度に（最終温度−初期
温度）の63％を加えたものに等しい温度である。
（第６図のデータの階段の形は記録計によるもの
である。）従つて、上記キユベツトの液体のタウは約3.5
秒である（第６図の応答曲線が上の式(1)に従い、
近似値に十分に近ずけたと仮定する）。

層９０および９２の接着剤を壁３４の表面全体
に広げると、タウは７〜８秒にも増加する。

タウが約3.5秒の値では、同じキユベツトの熱
応答曲線が第１図の説明に従つて加えられる条件
下で予想される。第７図は大体においてＸ印の付
いた第１図の最終部分のみに対するそのような応
答曲線であり、階段部分「Ａ」はタウ３秒の場合
のオーブンまたは培養器温度であり、曲線「Ｂ」
は同様の場合の液体内容物の温度である。（しか
しながら、この実施例では、培養温度は55℃の代
わりに37℃を選んだ。

比較実施例としての米国特許3691017号に記載
のキユベツトは以下の性質を有する。その全体の
厚さは5/16“すなわち0.31”である（第８欄、42
〜44行）。液体が占めるスペースは５mmの厚さで
ある（第８欄、44行）。窓は1/2“×1/4”（45行）
である。そのため１平方インチの単位面積の液体
の容積は約0.197in³であると推測され、そしてキ
ユベツトが接触しているその表面積は約2.79in²
であると推測される。このことから、精々僅か約
14.2in^-1の表面／容積比となる。同じ容積の球は
8.3のＳ／Ｖ比であり、このキユベツトは最も悪
そうな形（球）よりもＳ／Ｖ比が僅かに良いだけ
である。さらに、発熱体は外部からキユベツトの
中に延びたアルミニウムのフオイルであり、従つ
て熱路長さは１mmをかなり超える。これらのこと
から、そのようなキユベツト内の水の熱時定数タ
ウは明らかに10秒よりかなり大であることが分か
る。キユベツトを接着剤を使つて取り付ける必要
はない。接着剤を使わない具体例を第８図に示
す。ここでは、前記具体例で使用されたものと類
似の部品には文字「ａ」を添えた参照番号を付け
ている。従つて、キユベツト３０ａは側壁（４０
ａのみを図示）と共に室３２ａを定める２つの向
かい合つた壁３４ａおよび３６ａよりなる。液体
出入口６０ａおよび空気抜き７０ａも前記具体例
と同様に設けられており、壁３４ａは前記と同じ
性質を持つ。しかしながら、この具体例では壁３
４ａと側壁４０ａとの間のどこにも接着剤を使用
していない。そのかわりに、室３２ａの周りの端
全部にエラストマーのガスケツトシール１００ま
たは他の適当なガスケツト材が壁３４ａと側壁と
の間にある。さらに、プラスチツク１１０のバン
プが側壁から側壁３４ａの適当な開口を通つて延
びている。そこでバンプ１１０を熱または圧力に
よつてアプセツトして壁３４ａを適所にびよう締
めする。任意に、ガスケツトシール１００をその
ようなバンプの周りに延ばしてもよい。出入口お
よび空気抜きを封じ、キユベツトを加熱すると、
室３２および３２ａ内で圧力が高まる。従つて、
反応容器室３４と培養器との間の緊密な接触を保
つために、熱伝導性壁以外のキユベツトの１部が
変形して圧力の増加に適応するのが好ましい。さ
らに、別の壁が変形すると熱伝導性壁を適所に保
持するシール上の歪みが減少する。そのような具
体例は、Helfer等の「非屈曲性熱伝導性壁を有
するキユベツト」を題する1987年11月23日付けの
共有所有の出願番号第123752号に記載のような第
９図のものである。前記のものと類似の部品には
文字「ｂ」を添えた参照番号が付いている。

従つて、キユベツト３０ｂは側壁４０ｂ（１つ
のみ図示）と共に、間隔t₁を有する室３２ｂを定
める向かい合つた壁３４ｂおよび３６ｂからな
る。これらおよび出入口６０ｂおよび空気抜き７
０ｂは前記具体例におけると同様に作られてい
る。しかしながら、壁３４ｂが加圧下で確実に変
形しないようにするために、壁３６ｂは壁３４ｂ
より小さい曲げ強さを有するように作られてい
る。詳しくは、以下のようにするのが好ましい：
壁３４ｂが厚さ約0.15mmのアルミニウムからなる
場合、曲げ中心でその曲げ強さＫは以下のように
して判定される：撓みＸはよく知られた以下の式で判定される： (2) Ｘ＝aPa²／Et³ 〔式中、Ｐ＝全加荷重、Ｅ＝プレートの弾性率、
ｔ＝プレートの厚さ、そしてａは実験係数（通常
約0.015である）〕整理し直すと、 (3) Ｐ／Ｘ＝Et³／αa² Ｐ／ＸはＫに等しいＦ／Ｘに類似しているの
で、 (4) ＫEt³／αa² このことからＫは約6.11×10⁶ダイン／mmと計
算できる。これよりも曲げ強さが小さいに壁３６
ｂの場合は、同様に計算して約8.3×10⁵ダイン／
mmの曲げ強さを持つ約0.3mmの厚さ（アルミニウ
ムの壁３４ｂの２倍の厚さt₃）のポリエチレンま
たはポリプロピレンの層よりもつぱらなる必要が
ある。そのような構造では、室３２ｂ内に圧が生
じるにつれて、壁３６ｂは上にドーム状にふくら
み、壁３４ｂを発熱体に対して平らな状態にして
おく（「Ｅ」として疑似模型で示す）。使用の際、
上記のキユベツトを４４（第３図）のところあた
りまで満たす。これは反応のための好ましい試料
を含む液体、例えば拡張を行なうDNA配列の溶
液、で約90％満たすことになる。次にこの装置を
適当な培養器に入れ、反応に必要な段階をサイク
ルさせる。

本発明の別の態様では、可動バルブを配置して
キユベツト内の室への入り口を選択的に開閉す
る。前に記載したものと類似の部品には、識別文
字「ｃ」を添えた同じ参照番号を付けた。

従つて、第１１〜１４図において、室３２ｃの
端４２ｃは高くしたボス８０ｃ内に互いに隣接し
て取り付けたれた液体出入口６０ｃおよび空気抜
き通路７２ｃを有する（第１１図）。上部６２ｃ
は前の具体例と同様に円錐形であり、ピペツトＰ
と合わせられる（第１２図）。

しかしながら、この具体例では、円錐形のかみ
合い開口１２２内に取り付けた回転可能部１２０
よりなるバルブが設けられている（第１２図）。
回転可能部１２０は円錐形の外表面１２３を有す
る。バルブは、好ましくは開口６０ｃ内に同中心
的に配置された、回転軸を有する。ハンドル１２
６によつてバルプを手動または自動回転させる。
出入口６０ｃならびに空気抜き口７４ｃは可動バ
ルブ部１２０内に取り付ける（第１１および１３
図）。

開口６０ｃおよび開口７４ｃを室３２ｃに選択
的に接続するには、回転部１２０に２つの路を作
る。路１３０は開口６０ｃから外表面１２３に延
び（第１２図）、そこでその表面の角度シータに
開く（第１１図）。路１３２は開口７４ｃから面
１２３上の出口１３４に延びる（第１４図）。第
３２ｃおよび通路７２ｃにそれぞれ関連する路１
３０および１３２の高さは、回転部１２０が第１
３図に示す位置に回転すると、路が室または通路
に通じるようになつている。さらに必要ならば、
路１３０に生じた出入口の角度シータにより、部
分１２０を出入口６０ｃのみが室３２ｃに通じる
位置（図示せず）に回転させることもできる。

テール部分１４０は回転可能部１２０を適所に
垂直に保持し、溝１４４に掛かる（第１２図）。
出入口および空気抜きバルブは回転するようにす
る必要はない。移動可能なバルブも有用である。
前に記載したものと類似の部分には、識別のため
に「ｄ」を添えた同じ参照番号を付けた。従つ
て、第１５図では、出入口６０ｄおよび空気抜き
口７４ｄの両方を組み込むようにバルブ部１２０
ｄが端４２ｄ配置されている。しかしながら、前
の具体例とは異なり、部分１２０ｄは垂直に移動
可能なように取り付けられており、テール部分１
４０ｄは回転しない溝１４４ｄに垂直に掛かつて
いる。通常、スプリング１５０は、高くして路１
３０ｄおよび１３４ｄが室３２ｄおよび空気抜き
通路７２ｄに対してそれぞれ一直線にならないよ
うに、部分１２０ｄにかたよらせる。こうするこ
とによつて、室３２ｄは外の環境から遮断され
る。室に入れるには、使用者は、例えば出入口６
０ｄにピペツトＰを合わせ、スプリングを押すこ
とによつて、部分１２０ｄを下に押し下げるだけ
でよい。

この具体例では、空気抜き口７４ｄは外表面１
２３ｄに形成した溝であり、これによつて、部分
１２０ｄを、室３２ｄが出入口６０ｄとも通じる
のに十分な距離押し下げると、通路７２ｄのガス
抜きができるようになつている。

ある反応では、第１室での適当な滞留時間の後
液体を第２室に移動するのが好ましい。例えば、
DNAプローブ試験では、DNAプローブを拡張す
る目標配列に結合する単一の新しい熱サイクルを
加える必要がある。上記のDNA拡張温度サイク
ルに続いて、DNAを有する液体培地を拡張する
目標配列に特定なDNAプローブと接触させる。
そのようなプローブは反応容器の壁上に、さらに
詳しくは、第１６〜１７図に示すような第２の
DNAプローブの入つた室の壁に塗布してもよい。
前に記載したものと類似の部品には、識別のため
に「ｅ」を添えた同じ参照番号を付けた。

従つて、キユベツト３０ｅは２つの向い合つた
壁３４ｅおよび３６ｅの間に配置された室３２ｅ
よりなり（第１７図）、主要面および側壁３８ｅ
および４０ｅを有し（第１６図）、これらは全て
前記具体例と大体類似しており、そして出入口６
０ｅ、空気抜き７０ｅおよび空気抜き口７４ｅが
ある。しかしながら、前記具体例と異なり、金属
壁３４ｅが室３２ｅの下ではなく上にあり（第１
７図）、そのため熱はキユベツト３０ｅの上から
下方へ供給される。（図示されていないフイルタ
ー膜を７０ｅに任意しておいてもよい。）壁３４
ｅおよび３６ｅのこの配置は、室３２ｅの下に配
置された第２室１６０が設けられているためであ
る。すなわち、各２室は、液体を収納する主要面
を有し、そして主要面表面部の背中合わせの壁が
一般に平らでありかつそれぞれに共通面であるた
め、好ましくは一般に平らな形状をしている。従
つて、室３２ｅの主要収納面は室１６０の主要収
納面の上に配置されている。

第１７図で明らかなように、室１６０は実際は
壁３６ｅである背中合わせの主要表面壁を有す
る。反対側の壁１６４は、壁３４ｅと実質的に同
じように作られており、熱エネルギー伝達する壁
である。側壁１６６および１６８（第１６図）
は、室１６０が室３２ｅに対して約45°回転して
いる他は、室３２ｅの場合と同様に室１６０を形
づくり、そのため下記のその空気抜きは出入口６
０ｅの下部６４ｅとぶつからない。

空気抜きおよび通路１７０を室１６０に取り付
ける（第１６図）。前記具体例の空気抜きの空気
抜き通路と同様に作る。あるいは、図示していな
いが、第１６図に示すように室３２ｅを通して回
収することなく、室１６０から液体を直接取り出
せるように空気抜き口７４ｅを作つてもよい。

使用の際、空気圧を出入口を通して室３２ｅに
注入するかまたは例えば任意にキユベツト内の後
続の反応用の試薬を含む溶液を注入することによ
つて、あるいは室１６０の真空にすることによつ
て、室３２ｅ内の液体を第１７図の矢印のように
室１６０へ流す。

あるいは、２つの室を、45°食い違わせないで、
正確にならべて側壁を互いに重ねてもよい。この
具体例は第１８図に示してある。前に記載のもの
と類似の部品は識別文字「ｆ」を添えた同じ参照
番号を付けた。

従つて、キユベツト３０ｆは、熱伝達壁ではな
い共通壁３６ｆを共有する上および下の室３２ｆ
および１６０ｆからなる。空気抜き７０ｆは液体
を室３２ｆから１６０ｆへ供給し、壁３４ｆおよ
び１６４ｆは必要とされる急速な熱エネルギー伝
達を行なう。しかしながら、前記具体例とは異な
り、側壁（室３２ｆの４０ｆ）は室１６０ｆの側
壁（壁１６６ｆ）と並列している。これは、液体
を室３２ｆに納める主要面内に出入口６０ｆがす
つかり入るように、ボス８０ｆを90°回転させる
ことによつて可能である。そのようなキユベツト
では、空気抜き１７０ｆおよびその開口７４ｆは
液体を室１６０ｆ内に納める主要面内に取り付け
る。

第１６〜１８図の２つの各具体例では、液体を
納める２つの主要面が共通面であるならば、キユ
ベツトの長さまたは幅は第２図のキユベツトのそ
れ以上にはならないという利点が得られる。２つ
の室を垂直に積み重ねて３次元の流れにすること
ができるため、垂直の厚さが少し増えるだけであ
る。

さらに別の有用な形は第２０図および２１図に
示すものであり、ここでは液体を納める第３の室
が前記第２の室に通じており、液体透過性膜が第
３室を第２室から隔離および分離している。前に
記載したものと類似の部品には、識別のために
「ｇ」を添えた同じ参照番号を付けた。

従つて、キユベツト３０ｇは、向かい合つた壁
３４ｇおよび３６ｇ（この壁３４ｇは金属性であ
る）、側壁３８ｇおよび４０ｇ（第２１図）そして
出入口６０ｇを有する第１室３２ｇよりなる。室
３２ｇは、第１６図の具体例におけるように、通
路または空気抜き７０ｇを経て、室３２ｇが占め
る構造の主要面に平行な構造主要面に配置された
第２室１６０ｇにつながる。しかしながら、この
具体例では、室１６０ｇは室３２ｇの下ではなく
上にある。室１６０ｇは向かい合つた壁１６２ｇ
および１３６によつて一部定められており、壁１
３６は第９図の具体例の壁３６ｂの場合のように
好ましくはびよう締めされた、好ましくは透明な
壁である。壁１３６は引掻きから壁１３６の外面
を保護するために表面１３７の下の凹所にはめ込
むのが好ましい。室１６０ｇも、室１６０ｇに面
している上面３０２を有する液体透過性膜３００
によつて定められている。膜の下の面３０４は室
１６０ｇとは反対向きになつている。この膜に有
用な材料にはキヤストした、織つた、または電子
光学的に機械加工した微細濾過膜がある。側壁１
６６ｇおよび１６８ｇ（第２１図）により室が完
成する。

第３室３１０は膜３００を経て室１６０ｇにつ
ながつており、そのため室３１０は膜によつて他
の２つの室の隔離および分離されている。好まし
くは、室３１０は壁３６ｇと１６２ｇとの間に取
り付けられたブロツク内に形成されており（第２
０図）、そのため室１６０ｇ、３１０および３２
ｇの３室は垂直に下方へ準に積み重なつている。
空気抜き通路１７０ｇは、前記具体例のように、
室３１０からボス８０ｇ内に取り付けられた空気
抜き口７４ｇへつながる。さらに、一般に通路１
７０ｇの上の位置に、空気透過性ではあるが液体
不透過性の栓を持つ空気抜き（図示せず）が室１
６０ｇからボス８０ｇへ延びている。

最も好ましいのは、室を満たし、好ましくは膜
３００の下面３０４に接するように液体吸収性材
料３２０を室３１０内に配置のものである。

キユベツト３０ｇは、キユベツト内で拡張した
特定の核酸配列、例えばDNAのそれ、を捕捉し、
識別するのに使用するのが好ましい。このために
は、面３０２にDNAストランドに結合しうる蛋
白質物質を捕らえる手段があるのが好ましい。そ
のような捕捉蛋白質は一般的なものであり、選択
したDNA配列に結合するヌクレオチドの補足配
列よりなるものであり、配列は膜に結合する適当
な手段で付く。例えば、一般的に行なわれている
ように、そのような結合手段は一対のアビジンお
よびビオチンのうちの１つでよい。一対の他方は
面３０２に結合させる。

キユベツト３０ｇの使用法は以上のことから明
らかであろう。概して以下の通りである：室３２ｇは、予めつくされた、DNA拡張に必
要な試薬のほとんどまたは全部を含む。DNA含
有液体はピペツドＰによつて注入し室３２ｇを部
分的にのみ満たす。蓋Ｃは回して締めるかあるい
は他の方法で取り付ける。変性、培養および複製
化は他の具体例と同様に進める。その後、ピペツ
トを再び使つて室３２ｇへ上記の捕捉プローブお
よび検知プローブも注入する。そのような検知プ
ローブも従来のものであり、蛋白質および補足又
クレオチドからなり、これは捕捉プローブが付く
端とは反対の端の選択されたDNAストランドに
付く。検知プローブにはまた、ロイコ染料と反応
して検知信号（例えば色の変化）を生じることが
できる適当な信号発生部分、例えば西洋わさびペ
ルオキシダーゼ、が含まれる。２つの異なるプロ
ーブを反対の３′および５′末端に付ける方法は公
知である。例えば、「核酸研究」の第15巻、
p5305（1987）の「チオールの特定プローブを合
成オリゴデオキシリボヌクレオチドの３′末端に
付ける効果的な方法」では、３′末端に付ける有
用な方法が論じられている。５′末端へ付けるこ
とを論じている文献は多数あり、以下はその代表
にすぎない：「分析生化学」の第164巻、p336
（1987）の「５末端官能基の導入」。３′または
５′末端のいずれかが２つのプローブのうちの１
つを付けるのに使われ、他の末端が２つのプロー
ブのうちの他方をつけるのに使われることは明ら
かであろう。

あるいは、検知プローブおよび固定化プローブ
が前記「分析生化学」の教示する方法を使つて正
に５′末端に付け得るものである。

両方のプローブ並びに拡張DNAを入れたキユ
ベツトを攪拌して混合を促す。

その後、２つのプローブをDNAの別のストラ
ンドに付けるために第１図に示すサイクル部分
「Ｘ」を繰り返す。

この工程の後、まだ室３２ｇにある液体を通路
７９ｇを経て室１６０ｇに押し上げるこの押し出
しはピペツトによりさらに液体または空気を注入
することによつてあるいはガス抜き口７４ｇで真
空にすることによつて達成される。液体を使う場
合、中性溶液（活性成分を含まない）を使用す
る。液体は、好ましくはガス抜き口７４ｇを蓋Ｃ
で閉じることにより、室１６０ｇ内で培養する。

その後、液体全部を膜３００を通つて吸収材３
２０中に引く。これは、さらに注入される空気の
パネルにより、あるいは７４ｇから部分真空にす
ることによつて膜３００を通る液体の自然な流れ
を促すことにより、あるいは吸収剤材料３２０の
毛管吸引力により行なわれる。この時点で、捕捉
および検知プローブは、サイクルのＸ部の反復部
の結果としてDNAストランドに結合し、捕捉プ
ローブは膜の面３０２によつて捕らえられる。捕
捉プローブのないDNAストランドは膜３００を
通り材料３２０によつて吸収される。

最終段階は室３２ｇおよび１６０ｇに注入する
ことであり、液体は、面３０２上に捕捉された
DNAストランドから突き出ている検知プローブ
と反応しうるロイコ染料または他の物質を含有し
ている。有用なロイコ染料には米国特許第
4089747号に示されているものがあり、好ましく
はポリ（ビニルピロリドン）のような安定化ポリ
マーと組合せる。この染料の好ましい例は２−
（４−ヒドロキシ−３，５−ジメトキシフエニル）
−４，５−ビス（４−メトキシフエニル）イミダ
ゾールである。というのは、この化合物は西洋わ
さびペルオキシダーゼ１モル当たり約1000の染料
分子を提供するからである。

これとは別に、やはり従来から使われている、
ビーズに結合した捕捉プローブを使用してもよ
い。ビーズは膜３００の細孔を通過しない程の大
きさの直径を持つビーズを選ぶ。

本発明のキユベツトを望ましい加熱および冷却
段階にサイクルさせるどのような適当な培養器も
有用である。培養器が第１図に示す温度をサイク
ルする段階を提供することが最も好ましい。これ
を行なう従来の培養器２００は第１９図に示すス
テーシヨンを有するものである。予備培養ステー
シヨン２０２は温度を約95℃に定める加熱手段を
有する。ここから、キユベツトを従来の押し出し
手段で一定温度のステーシヨンのリング２１０上
に押し出す。その最初のステーシヨン２１２は55
℃で保たれている。このステーシヨンからキユベ
ツトをステーシヨン２１４に動かし、ここで70℃
に加熱する。この温度にある時間保つ。従つて、
ステーシヨン２１６もその温度である。次に、95
℃に保たれている短時間変性ステーシヨン２１８
で新しく複製化したDNAを変性する。ステーシ
ヨン２２０〜２３４はステーシヨン２１２〜２１
８ですでに行なわれたサイクルをさらに２回繰り
返すだけである。

ステーシヨン２３４の後、拡張がすべて終了し
たら、従来の移動装置（図示せず）でキユベツト
をリング２１０から次の工程に移す。（液体のキ
ユベツトへの注入および液体のそこからの取り出
しはラインから離れて、すなわち、培養器２００
の外側、で行なわれる。）さらに拡張が必要なら、
特定のキユベツトを培養器内でさらにサイクルさ
せる。

（発明の効果）本発明の有益な技術的効果は、キユベツトおよ
びその液体内容物へのまたはそれからの熱エネル
ギーの伝達を急速に行なつて、希望する反応に必
要な多数の温度変化を液体に加えることができる
ことである。その結果、サイクルを必要な回数繰
り返すことがこれまでよりも短時間で可能であ
る。

本発明に関する有益な技術的結果は、加熱と冷
却を何回も繰り返す必要のある多段階サイクルに
よるDNAストランドの急速熱処理を行なうこと
のできるキユベツトを提供することである。

本発明に関する別の有益な技術的効果は、その
ようなキユベツトおよびその液体の熱時定数が小
さく、液体を加熱または冷却する遅れが全くない
ことである。

本発明の別の有益な技術的効果は、そのような
キユベツトではまた、反応が終われば、全部の液
体内容物を比較的容易にとりだすことができるこ
とである。

本発明のさらに別の有益な技術的効果は、その
ようなキユベツトが最小の長さと幅を持つ２つの
室を有するとである。

【図面の簡単な説明】

第１図はDNAの複製化を行なうキユベツトの
一般的な温度変化をプロツトしたグラフである。
第２図は、本発明により製造したキユベツトの等
角投影図である。第３図は、第２図のキユベツト
の平面図である。第４図は、第３図のライン−
に添つた断面図である。第５図は、第４図の
「Ｖ」とあるキユベツトの囲んだ部分の拡大断面
図である。第６図は、そのようなキユベツトの熱
時定数を得るためのキユベツトの実際の時間−温
度応答のプロツトである。第７図は、第６図に照
らして、そのようなキユベツトが有するであろう
加熱応答曲線のプロツトである。第８および９図
は、第４図と同様な断面図であるが、２つの異な
る具体例を示すものである。第１０図は、第４図
と同様な断片的な断面図であり、ピペツトおよび
シールのキユベツトとの相互関係を示すものであ
る。第１１図は、特にバルブ機構の、別の具体例
の断片的な平面図である。第１２図は、第１１図
のラインXII−XIIに添つた断面図である。第１３図
は、第１１図と同様な断片的な平面図であるが、
バルブが約45℃回転しているものである。第１４
図は、第１２図と同様な断面図であるが、バルブ
が第１３図のように回転したものであり、第１３
のラインXI−XIに添つて得たものである。第
１５図は、第１２図と同様な断面図であるが、ま
た別の具体例である。第１６図は、本発明の部分
的に取り壊した別の具体例の平面図である。第１
７図は、第１６図のライン−に添つた断
面図である。第１８図は、第１７図と同様な断面
図であるが、また別の具体例を説明するものであ
る。第１９図は、キユベツトをDNA処理温度に
サイクルさせるのに有用な培養装置の略図であ
る。第２０図は、また別の具体例の第１７図と同
様な断面図である。第２１図は、第２０図のライ
ンXI−XIに添つた断面図である。図中、数字は次の意味を持つ：３０，３０ａ，
３０ｂ，３０ｅ，３０ｆ，３０ｇ……キユベツ
ト、３２，３２ａ，３２ｂ，３２ｃ，３２ｄ，３
２ｅ，３２ｆ，３２ｇ……室、３４，３４ａ，３
４ｂ，３４ｅまたは１６４，３４ｆまたは１６４
ｆ，３４ｇ……間隔をおいて離れた２つの向かい
合つた壁のうち１つ、および熱伝導性の壁、３
６，３６ａ，３６ｂ，３６ｅ，３６ｆ，３６ｇ…
…間隔をおいて離れた向かい合つたもう一方の
壁、１６０，１６０ｆ，１６０ｇ……３２ｅ，３
２ｆ、および３２ｇと共に一対の室を形成する第
２の室、２００……本発明のキユベツトと共に使
う培養器、３００…核酸配列を拡張する方向に使
用するフイルター。

Claims

【特許請求の範囲】１少なくとも約35℃の温度範囲をサイクルさせ
る液体成分の制御反応用の熱サイクルキユベツト
３０；３０ａ；３０ｂ；３０ｅ；３０ｆ；３０ｇ
であつて、前記キユベツト３０；３０ａ；３０ｂ；３０
ｅ；３０ｆ；３０ｇは、少なくとも１つの液体を
入れる室３２；３２ａ；３２ｂ；３２ｃ；３２
ｄ；３２ｅ；３２ｆ；３２ｇを有し、その室は、２つの間隔をおいて離れた向かい合
つた壁３４，３６；３４ａ，３６ａ；３４ｂ，３
６ｂ；３４ｅ，３６ｅ；３４ｆ，３６ｆ；３４
ｇ，３６ｇ（各々が主要な面で接している）、前記
２つの向かい合つた壁３４，３６；３４ａ，３６
ａ；３４ｂ，３６ｂ；３４ｅ，３６ｅ；３４ｆ，
３６ｆ；３４ｇ，３６ｇをその間に0.5mm以上の
間隔t₁をもつて結合する側壁３８，４０；４０
ａ；４０ｂ：３８ｅ，４０ｅ；４０ｆ；３８ｇ，
４０ｇ、並びに前記室３２；３２ａ；３２ｂ；３
２ｃ；３２ｄ；３２ｅ；３２ｆ；３２ｇへの液体
の導入及びそれからの液体の排出を行う手段６
０，６２，６４；６０ａ；６０ｂ；６０ｃ，６２
ｃ；６０ｄ；６０ｅ，６４ｅ；６０ｆ；６０ｇに
よつて画成されているキユベツトにおいて、前記向かい合つた壁３４，３６；３４ａ，３６
ａ；３４ｂ，３６ｂ；３４ｅ，３６ｅ；３４ｆ，
３６ｆ；３４ｇ，３６ｇ及び前記側壁３８，４
０；４０ａ；４０ｂ：３８ｅ，４０ｅ；４０ｆ；
３８ｇ，４０ｇは、前記室３２；３２ａ；３２
ｂ；３２ｃ；３２ｄ；３２ｅ；３２ｆ；３２ｇの
予め定められた面−対−容積比を備えるように寸
法が決定され、前記向かい合つた壁あ３４；３４ａ；３４ｂ；
３４ｅ；３４ｆ；３４ｇの少なくとも１つは、予
め決めれた熱路長さt₂及び熱抵抗を有しており、
それにより前記比、路長さ及び熱抵抗が、前記向
かい合つた壁３４，３６；３４ａ，３６ａ；３４
ｂ，３６ｂ；３４ｅ，３６ｅ；３４ｆ，３６ｆ；
３４ｇ，３６ｇと接した前記室３２；３２ａ；３
２ｂ；３２ｃ；３２ｄ；３２ｅ；３２ｆ；３２ｇ
内に含有された純水に対して、200μ以下の液
体容積に対して10秒以下であるような水に対する
熱時間定数を有するのに効果的であることを特徴
とするキユベツト。２液体成分の制御反応用のキユベツトであつ
て、前記キユベツトは、反応を行うための第１及
び第２の液体を入れる室を有し、それぞれの室は
２つの間隔をおいて離れた向かい合つた壁と前記
２つの向かい合つた壁を結合する側壁とによつて
画成され、前記各室は液体を入れておく主要面を
提供するものにおいて、前記２つの室は、前記室の一方の主要面が他方
の室の主要面上に配置され、そのために前記キユ
ベツト長さ及び／又は幅は、前記主要面が同一平
面上にある同等のキユベツトと比べて小さくされ
ることを特徴とする前記キユベツト。３１ストランドの核酸とモル過剰のオリゴヌク
レオチドプライマーとの混合物を前記プライマー
を前記ストランドに結合させるのに有効な温度で
処理し、この結合したプライマー及びストランド
を伸長酵素の存在下で加熱してプライマーを伸長
して補足ストランドを形成し、この結合補足スト
ランド及び前記核酸のストライドを、これらを２
つの原型ストランドに分離する温度で加熱し、そ
の後前記各工程をこれらの原型ストランドに繰り
返して多数の伸張ストランドを生成することより
なる核酸配列を伸長する方法であつて、更に以下の各工程：選択したオリゴヌクレオチド配列に結合したヌ
クレオチドの補足配列よりなる検知及び捕捉プロ
ーブを前記混合物に加える（これらのプローブ
は、更に、反応して検知信号を出すことのできる
信号部分、又はプロープに結合したストランドを
固定化する捕捉部分のいずれか、又はそれら両方
を含んでいる）工程、前記プローブを前記伸長ストランドと反応させ
てプロープを伸長ストランドに結合させる工程、結合したプロープ及びストランドを含む混合物
を分離手段に移す工程、そしてこの混合物を、そのような捕捉部分とは結合す
るがそのような捕捉部分のないストランドは通過
させる物質を含有するフイルターに通すことによ
つて、捕捉プロープを有するストランドをそのよ
うなプロープのないストランドから分離する工
程、よりなる前記方法。よりなる上記の方法。