【発明の詳細な説明】[Detailed description of the invention]
［１］ 発明の目的
本発明は、牛の正常分娩（出産）後の胎盤から
抽出された、新規な水溶性蛋白質に関する。
更に詳しくは、牛胎盤から抽出された水溶性蛋
白質より、更にこれを分画して得られる、分子量
が25000付近である細胞代謝活性化物質に関する。
（産業上の利用分野）
胎盤エキスには、組織代謝活性作用、組織再生
修復能といつた効果が知られており、強肝、抗潰
瘍剤、損傷修復剤などとして利用されてきた。
本発明による新規な水溶性蛋白質は、牛胎盤か
ら得られた推定分子量が25000付近の分画であり、
細胞代謝活性化作用が極めて顕著である。
すなわち、本発明による牛胎盤由来の水溶性蛋
白質は、繊維芽細胞の増殖と伸展を促進し、又、
マクロフアージの伸展を促進して貧食作用を増大
させるといつた効果がある。したがつて、例え
ば、医薬品として、強肝剤、胃、十二指腸潰瘍
剤、損傷修復剤、免疫賦活剤等に直接、或は、配
合剤として用いることが有用である。
また、近年における癌治療などにおいて使用さ
れている抗癌剤では、正常細胞に対する毒性が強
すぎるものや、あるいは、長期投与によつて生体
の免疫機能を次第に低下させてしまうといつたこ
とが心配され、このため免疫系を強化するような
物質が注目されているが、本発明による新規な水
溶性蛋白質は、こうした癌治療薬に併用すること
も有用であると考えられる。
（従来の技術）
各種基原（動物種属）の胎盤を出発原料とな
し、これにより各種の抽出法を採用して得られ
た、そのエキス、又はその有効成分を分離して、
医薬品や化粧品に用いることは、古くから知られ
ている。
その中から、水溶性抽出成分（エキス）につい
て、その応用や抽出法について調査すれば、例え
ば、「第１表」に示すごとくの公知刊行物がある。
[1] Object of the Invention The present invention relates to a novel water-soluble protein extracted from the placenta of cows after normal delivery (birth). More specifically, the present invention relates to a cell metabolism activating substance with a molecular weight of around 25,000, which is obtained by further fractionating a water-soluble protein extracted from bovine placenta. (Industrial Application Fields) Placenta extract is known to have effects such as tissue metabolic activation and tissue regeneration and repair ability, and has been used as a liver strengthener, an anti-ulcer agent, and a damage repair agent. The novel water-soluble protein according to the present invention is a fraction with an estimated molecular weight of around 25,000 obtained from bovine placenta,
Cell metabolism activation effect is extremely significant. That is, the water-soluble protein derived from bovine placenta according to the present invention promotes the proliferation and expansion of fibroblasts, and
It has the effect of promoting macrophage expansion and increasing oligophagy. Therefore, for example, it is useful to use it directly or as a combination agent in medicines such as liver tonics, gastric and duodenal ulcer agents, damage repair agents, and immunostimulants. In addition, there are concerns that some of the anticancer drugs used in cancer treatment in recent years are too toxic to normal cells, or that long-term administration may gradually reduce the body's immune function. For this reason, substances that strengthen the immune system are attracting attention, and the novel water-soluble protein according to the present invention is also considered to be useful when used in combination with such cancer therapeutics. (Prior art) The placenta of various species (animal species and genera) is used as a starting material, and its extract or its active ingredients are separated using various extraction methods.
It has been known for a long time to be used in pharmaceuticals and cosmetics. Among them, if we investigate the applications and extraction methods of water-soluble extracts, we will find, for example, publicly known publications as shown in Table 1.
【表】【table】
【表】
又、第１表に示されるような胎盤からの水溶性
成分の抽出物について、これをそれぞれの抽出操
作法から調べてみると、その共通点としては、有
機溶媒、強酸又は強アルカリが用いられているこ
とである。
更に、この他、蛋白分解酵素等を用いるなどの
方法も知られている。
そして、これらの抽出物の薬理学的作用として
は、抗潰瘍作用、組織代謝賦活作用が知られてお
り、医薬品では、注射剤や内服剤の形態で、強肝
剤、胃又は十二指腸潰瘍治療剤として用いられて
いる。
又、化粧品では、肌の老化防止（シワ防止）、
シミの防止（メラニン色素生成抑制）の目的で、
外用塗布剤の形態で用いられている。
つまり、従来から、胎盤中には組織再生修復能
を有する物質の存在が知られている。ところが、
その作用又は効果についての裏付けなどの判定法
は、充分でなく、従来では、例えば、モルモツト
の皮膚などの組織片を用い、これに胎盤から抽出
したエキス、又は、成分を添加して、ワールブル
クの検圧計などを用いて、消費される酸素の量を
求める方法により、評価されていたに過ぎなかつ
た。
（発明が解決しようとする問題点）
本発明者らは、胎盤抽出物に関する、前記の組
織代謝活性作用、又は、組織再生修復作用に注目
すると共に、これらの従来の抽出方法による抽出
物の再評価のための、より的確な試験法の確立を
もとに、胎盤からその本体を求める研究をするこ
とにした。
すなわち、胎盤由来の抽出成分の治療効果は、
臨床学的報告によつて確立されているが、しかし
基礎的な角度から、これを細胞レベルにおいての
真の細胞増殖能について立証されたものは見あた
らないでいた。
本発明者らは、受精卵を10カ月の体内にあつ
て、１億数千万倍に成長促進させる、胎盤の重要
な機能に着目し、直接、細胞に対する増殖作用の
定量的な検索法を開発し、これをもとに、真の胎
盤由来の細胞代謝活性化物質の検索を開始したわ
けである。
本発明による検索法は、次項に示すごとくであ
るが、これによつて、前記の第１表で示すごとく
の抽出物には、そのいずれもが、細胞に対して直
接的に高い活性能を有するものではないことを見
い出したのである。
そして、この原因について検討を加えてみる
と、１つに、従来法による抽出方法及びエキス抽
出のための処理法に起因していることがわかつた
のである。つまり、本物質が、熱と有機溶媒に対
して不安定であることと関係している。
すなわち、従来の胎盤エキス、又は、抽出成分
の有する、これまでに知られている臨床治験にお
ける抗腫瘍作用、組織代謝活性作用等は、本試験
法による検討からすれば、少なくとも、直接、細
胞を増殖促進させることによつて、治療的効果が
得られたというより、むしろ、別の作用機序から
組織の代謝を活性化することによつて得られたも
のであると考えられたのである。
そこで、本発明者らは、細胞に対して、直接に
増殖促進作用を有する物質について、胎盤中から
見出すための抽出手段について、いかなる操作を
用いたら良いか、又、従来の公知な方法による抽
出エキス、又は単離成分が、なぜ細胞増殖促進作
用が小さいのか又は無いのか、この２点から研究
を続け、鋭意追求した結果、高い細胞増殖促進作
用を有する抽出物を得ることが出来たのである。
（細胞増殖促進作用の測定等に関する注解）
細胞増殖促進作用について、今日一般に知られ
ている成長因子でも、的確にその効力を表現する
方法は少なかつた。
しかし、細胞毒性を表現する方法としては、こ
れまでに様々な方法が示され、例えば、増殖率の
抑制として、細胞数、蛋白量等で定量的に示すこ
とが確立されている。
そこで、本発明者らはこの細胞毒性試験をもと
に、これらを応用することによつて、逆に、増殖
率の促進能を定量的に表現する方法を鋭意検討し
てきた。その結果、細胞を培養する際の環境を制
御し、対照の細胞増殖率を死滅しないまでも、ゼ
ロ近くに抑制・制御することにより、目的物質の
細胞増殖作用を表現する方法を確立するに至つた
のである。
この方法をより具体的に示せば、細胞を培養す
る環境において、添加する牛胎児血清（FBS）
の量を調節することにより行う方法である。
尚、本発明者らは、本試験法の確立のための研
究の初期段階において、目的物質の評価にあたつ
て、様々の株細胞で検討してきた。しかし、それ
らは正常細胞とは異なり、生体での細胞の機能モ
デルとは言い難いことがわかり、最終的には、正
常皮膚から取り出した初代細胞で検索することに
した。
すなわち、モルモツトの皮膚から無菌的に細胞
を分離し、一定期間継代して変異していない細胞
を対象となし、目的物質の細胞増殖度を表現する
ことにした。
以下に、その方法について詳しく述べる。
皮膚の細胞には、表皮細胞、繊維芽細胞がある
が、例えば、モルモツト（ハートレー系、雌）か
ら採取した繊維芽細胞は、５％牛胎児血清
（FBS）を添加したイーグルMEM培地中では、
盛んに分裂増殖し、その倍数増殖時間は、「第１
図」に示すごとく、約48時間であることが確認さ
れた。
そして、この細胞は、採取後、約１年間で株化
することである。
そこで、本発明の目的物質の細胞増殖能の評価
のためには、出来るだけ正常に近い細胞という条
件から、採取後、６カ月までに増殖継代した細胞
を、冷凍保存することより、目的物質の分離、及
び熱処理に対する安定化方法等の検討のために、
順次使用することにした。
一方、培養環境については、使用する牛胎児血
清（FBS）による細胞増殖促進作用への影響を、
その濃度変化から調査し、培養中、細胞を死滅化
させることなく、又、細胞増殖を認めない最善の
条件を満たす最少量を基準とした。
具体的に、系中に添加するFBSの添加量と、
それによる繊維芽細胞増殖との関係を示せば、第
２図のごとくである。
ここで示されるように、添加するFBSが系中
の１％量の時では、９日間の培養で、繊維芽細胞
の増殖を認めなかつた。
したがつて、コントロールとして、この条件を
基準とした。
繊維芽細胞の増殖能の評価方法は、まず、直径
3.5cmのペトリデイツシユ（コーニング社製）に、
1mL当り４〜５×104個の細胞浮遊液を分注し、
低濃度のFBS（細胞が死滅することがなく、増殖
率がゼロ付近となる量：１％）を添加した、イー
グルMEM培地を２〜３日毎に交換する。そし
て、細胞数を、２〜３日目毎にビユルケルチユル
クの血球計算盤を用いて測定する。
尚、この際、同時に蛋白量、核酸量を測定して
も良い。
測定に使用する目的物質は、その蛋白量にて調
整（溶液）し、培地当り10分の１量を、培地交換
の都度添加し、対照（コントロール）には、同量
の生理食塩水のみを添加する。
［２］ 発明の構成
本発明は、牛胎盤から抽出した水溶性蛋白質で
その推定分子量が25000付近である細胞代謝活性
化物質をもつてなる。
（問題点を解決するための手段）
本発明の要旨は、前述した如くであるが、より
具体的に示すために、以下に実施例及び作用につ
いて述べる。尚、実施例を示すに当たり、本発明
による基本的な要点を示すと次の如くである。
(イ)
抽出法における、その出発原料は、牛の正常分
娩（出産）後の新鮮な胎盤を用いる。又、必要に
よつては、豚等の他の家畜動物の胎盤などを用い
ることもできるが、それは、用いる対象となる動
物種の、治療又は医薬的な用途、化粧料等々の用
途に応じて選択すればよい。
(ロ)
実施例では、特定した抽出条件下で、最も簡易
な方法を示すも、その抽出行程における操作のポ
イントは、熱を加えないこと。有機溶媒による抽
出操作は避けること。強酸、強アルカリ、各種の
蛋白質分解酵素を用いないことが必要である。
すなわち、これらの処理操作は、目的物質の活
性を失活させてしまうので、用いてはならないの
である。よつて、本発明による胎盤からの抽出法
の特徴は、従来の公知な胎盤エキス、又は、単離
成分の抽出法に用いた、有機溶媒、強酸、強アル
カリや酵素等を、行程中に一切用いないことにあ
り、これに従つて、遠心分離法、塩析分画法、ゲ
ル濾過法、透析法、低温又は真空濃縮法、凍結乾
燥法などの、従来の生体成分を抽出する様々な方
法の組合せによつて、本願物質を得ることができ
る。
（実施例 １）
牛の正常分娩後の胎盤を洗浄の前処理なしに細
切し、低温下にてホモジナイザー等でホモジネー
トする。これに対して水又は緩衝液、例えば塩化
ナトリウム含有の低イオン濃度リン酸緩衝液を添
加して攪拌し、６時間から１昼夜放置した後、遠
心分離して上澄液を得る。
次にこの上澄液に対して、20％飽和の濃度にな
るように硫酸アンモニウムを添加後、遠心分離し
て、その上澄液を回収し、更にこの上澄液に対し
て、60％飽和の濃度になるように硫酸アンモニウ
ムを再添加し、これによつて発生する沈殿物を回
収する。
尚、沈澱物は、少量の水又は生理食塩水などの
溶解した後、脱塩操作を行う。
脱塩操作には、ゲル濾過、限外濾過、透析など
の方法があるが、ここでは、例えば透析チユーブ
に入れて、充分量の生理食塩水などに、１昼夜以
上透析する方法により行つた。
（実施例 ２）
実施例１で得られた細胞増殖促進作用の高い抽
出物は、その用いる用途を考慮するとき、ウイル
スの不活化について充分な配慮が必要である。例
えば、肝炎ウイルスを不活化するには、60℃、10
時間の加熱処理が有効とされている。
実施例１で得られた液体を凍結乾燥したものに
ついて、水又は食塩水に溶解させた後、60℃、10
時間の加熱処理を行つたところ、ウイルス不活化
には有効であつても、本来の目的である細胞増殖
促進作用も100％失活してしまうことがわかつた。
すなわち、いろいろと条件を変え、加熱処理を
行つた結果、本願発明物質である新規な水溶性蛋
白質は、60℃、30分間で細胞増殖促進作用が完全
に失活してしまうことがわかつたのである。
そこで、本発明者らは、本物質の有する細胞増
殖作用が持続し、肝炎ウイルスのみ不活化するた
めの手段として、長時間高温下での処理に耐えら
れる安定化法について、種々の研究に入つた。
そして、その手段として、例えばグルコース、
マンノース等の単糖類、シヨ糖、マルトース等の
２糖類等を添加し加熱処理を行い、検討を加えた
が、この操作でも同様に失活してしまうことがわ
かつた。
本発明者らは、溶解した状態で60℃の加熱処理
を行うと、この処理によつて目的物質蛋白の高次
構造に不可逆的な変性をきたし、これによつて失
活したものと推定すると共に、これに対応する手
段として、次に高濃度塩類溶液中等で、予め蛋白
の構造を変化させ、沈澱させた状態で加熱するこ
とによつて、蛋白の不可逆的な変性を最小限に抑
制することが可能ではないか、との発想のもと
に、実施例３で示すごとくの新規な加熱処理方法
を完成した。
この方法は、当然さまざまの従来の公知な血液
及び臓器由来の成分の、熱安定化法としても利用
可能な、便利な方法である。
（実施例 ３）
実施例１で得られた液体を凍結乾燥し、これを
60％硫酸アンモニウム飽和溶液に懸濁したもの、
又はその沈澱物を分取し、60℃、10時間加熱処理
を施した。
この方法によれば、肝炎ウイルスの不活化がな
されると共に、細胞に対する増殖促進作用が80〜
90％残存することがわかつた。
第３図は、実施例３による処理後の目的物質の
細胞増殖作用について、実施例１で得られたもの
と対比して測定した結果を示す。
つまり、加熱処理に対して、細胞増殖作用を失
活させないための手段が、実施例３で示した方法
である。
尚、実施例２〜３は、血清及び各種臓器由来の
蛋白質製剤における、公知な肝炎ウイルスの不活
化法をもとに、60℃、10時間を前提に行つたとき
のものであるが、特に、実施例３において、その
行程中で採用した、高濃度塩類溶液による沈澱又
は懸濁化法によれば、温度はさらに高くすること
により、処理時間も短縮することがもちろん可能
である。
（実施例 ４）
実施例１又は３で得られた蛋白質は、細胞に対
して、直接、代謝活性化作用を有する抽出物であ
り、そのまま、従来の胎盤エキスの公知な使用分
野（医薬、化粧品等）に利用することが出来る
が、本発明者らは、有効成分を更に追求するた
め、次のような分画を試みた。
まず、実施例１又は３で得られた沈澱物につい
て、ゲル濾過を試み、経時的に流出する各フラク
シヨンの成分について検討してみた。ゲル濾過に
用いられる担体としては、セフアデツクス、アガ
ロース、セフアクリル等があげられるが、ここで
は、セフアデツクスを用い行うことにした。
（分画条件）
樹脂：セフアデツクスＧ−200
カラムサイズ：31×370mm
溶媒：0.01M リン酸バツフアー
（0.14M NaCl含 PH7.4）
流速：２cm／hr
これについての流出曲線は、第４図及び第５図
に示す通りである。
尚、第４図は、実施例１で得られた成分で、
又、第５図は、実施例３による加熱処理された成
分の流出曲線である。
そして、各フラクシヨンについて繊維芽細胞増
殖能の測定を試みた結果、第６図に示すごとく、
Fr−Ｃ、及び、Fr−Ｄ（Kav値0.18〜0.80付近に
流出する画分）に、有効成分が存在していること
を見いだした。
そこで、更に詳しく追求するため、Fr−Ｃ、
及び、Fr−Ｄについて、イオン交換による分画
を試みた。イオン交換に用いられる担体として
は、セフアデツクス、セフアロース、セフアクリ
ル等の、陽及び陰イオン交換体があげられるが、
ここでは、DEAE−セフアデツクスを用いて分画
した。
（分画条件）
樹脂：DEAE−セフアデツクスＡ−50
カラムサイズ：20×200mm
溶媒：0.10M−0.05Nトリス塩酸バツフアー
（PH8.0）
溶出条件：NaCl濃度 ０→0.5M
（0.05M段階に分け分画）
第７図は、これについての流出曲線を示したも
のである。
そして、この分画操作によつて得られた各フラ
クシヨンについて、同様にして繊維芽細胞増殖能
を測定した結果、NaCl濃度0.05〜0.10M、及び、
0.20〜0.25Mの間に流出する画分に、強い活性が
見られた。そこで、再度、この画分について、セ
フアデツクスＧ−200を用い、ゲル濾過を行つた
ところ、第８図に示す流出曲線が得られた。
図中Ａは、NaCl濃度0.05〜0.10Mで流出する成
分、又、Ｂは、0.20〜0.25Mで流出する成分を示
す。
（実施例 ５）
実施例４によつて分画した、有効成分の分子量
を測定するため、分子量既知物質である下記の３
物質について、セフアデツクスＧ−200によるゲ
ル濾過を行い、Kav値と分子量の検量線を作成
し、目的物質の分子量を算定した。
（分子量既知物質（標準物質））
Ａ アルドラーゼ（分子量158000）
Ｂ 牛血清アルブミン（分子量67000）
Ｃ α−キモトリプシノーゲンＡ（分子量25000）
第９図は、その標準線である。
尚、本願発明物質の収量は、牛の胎盤１Kgか
ら、約150〜300mg程度得られる。
［３］ 発明の効果
本発明は、牛の胎盤から得られた新規な水溶性
の蛋白質にある。そして、この蛋白質は、直接に
細胞の代謝活性化作用が極めて高いことにある。
従来の公知な胎盤抽出エキス又は抽出物質と、
その抽出条件から対比すると、従来の公知な抽出
エキス又は抽出物質は、その行程中で、有機溶
媒、強酸、強アルカリ、蛋白分解酵素などの薬剤
が用いられてきたが、その結果は、これらの薬剤
によつて、胎盤中の細胞増殖促進作用物質が失活
されてきたことである。又、従来法における特徴
は、抽出操作の前処理として、胎盤又はホモジナ
イズした胎盤を洗浄していたが、その結果、本目
的物質を洗い流していたこと。又、単なる、加熱
処理によつても、失活されていたものと考えられ
る。
本発明は、牛の胎盤中に存在する細胞増殖促進
作用物質を、細胞に添加して、その増殖能を直接
に細胞の数で定量的に立証した。そして、更に、
従来の抽出法による胎盤エキス、又は、その単離
物質が、なぜ細胞増殖作用を示さないのか、その
原因を追求した。その結果、抽出のために用いら
れる薬剤や、加熱処理の行程で失活させていたこ
とを見いだすと共に、本願発明を完成することが
出来た。[Table] Furthermore, when examining the extracts of water-soluble components from placenta as shown in Table 1, the common points are that organic solvents, strong acids, or strong alkalis are used. is used. Furthermore, other methods such as using proteolytic enzymes are also known. The pharmacological effects of these extracts are known to be anti-ulcer effects and tissue metabolism activation effects, and as pharmaceuticals, they are used as liver tonics and gastric or duodenal ulcer therapeutics in the form of injections and oral preparations. It is used as. In addition, cosmetics are used to prevent skin aging (wrinkle prevention),
For the purpose of preventing age spots (suppressing melanin pigment production),
It is used in the form of an external application. In other words, it has been known that there are substances in the placenta that have the ability to regenerate and repair tissues. However,
There is not enough evidence to support its action or effect, and in the past, for example, a piece of tissue such as guinea pig skin was used, and an extract extracted from the placenta or other ingredients were added to it. The only way to evaluate it was to measure the amount of oxygen consumed using a pressure gauge. (Problems to be Solved by the Invention) The present inventors have focused on the above-mentioned tissue metabolic activation effect or tissue regeneration and repair effect regarding placental extracts, and have also focused on the regeneration of extracts using these conventional extraction methods. Based on the establishment of a more accurate test method for evaluation, we decided to conduct research to determine the body of the placenta. In other words, the therapeutic effect of placenta-derived extracted ingredients is
Although it has been established through clinical reports, nothing has been found to prove its true cell proliferation ability at the cellular level from a basic perspective. The present inventors focused on the important function of the placenta, which accelerates the growth of a fertilized egg by 100 million times during its 10 months in the body. Based on this, we began the search for a true placenta-derived cell metabolism activator. The search method according to the present invention is as shown in the next section, and it has been found that all of the extracts shown in Table 1 above have high activity directly against cells. He discovered that it is not something that one has. When we investigated the cause of this problem, we found that one of the causes was the conventional extraction method and processing method for extract extraction. In other words, this is related to the fact that this substance is unstable to heat and organic solvents. In other words, the anti-tumor effects, tissue metabolic activation effects, etc. of conventional placenta extracts or extract components in clinical trials that have been known so far have at least been shown to directly affect cells. It was thought that therapeutic effects were not obtained by promoting proliferation, but rather by activating tissue metabolism through a different mechanism of action. Therefore, the present inventors have investigated what kind of extraction method should be used to find substances that have a direct proliferation-promoting effect on cells from the placenta, and how to extract them using conventional known methods. As a result of continued research and earnest pursuit of why extracts or isolated components have little or no cell growth promoting effect, we were able to obtain an extract that has a high cell growth promoting effect. . (Comments regarding measurement of cell proliferation-promoting effect, etc.) Regarding cell proliferation-promoting effect, there have been few methods to accurately express the efficacy of growth factors that are generally known today. However, various methods have been shown to date to express cytotoxicity, and, for example, it has been established that suppression of proliferation rate can be quantitatively expressed by cell number, protein amount, etc. Therefore, based on this cytotoxicity test, the present inventors have intensively studied a method of quantitatively expressing the ability to promote proliferation rate by applying these tests. As a result, we have established a method to express the cell proliferation effect of the target substance by controlling the environment in which cells are cultured and suppressing and controlling the control cell proliferation rate to near zero, if not to kill it. It's ivy. To demonstrate this method more specifically, fetal bovine serum (FBS) is added in the environment where cells are cultured.
This method is carried out by adjusting the amount of In addition, in the initial stage of research for establishing this test method, the present inventors have investigated various cell lines in evaluating the target substance. However, it was found that these were different from normal cells and could not be considered a functional model of living cells, so in the end, they decided to search using primary cells taken from normal skin. That is, we decided to aseptically separate cells from the skin of guinea pigs and use cells that had not mutated after being subcultured for a certain period of time to express the degree of cell proliferation of the target substance. The method will be described in detail below. Skin cells include epidermal cells and fibroblasts, and for example, fibroblasts collected from guinea pigs (Hartley strain, female) in Eagle's MEM medium supplemented with 5% fetal bovine serum (FBS).
It divides and proliferates actively, and its multiple multiplication time is ``the first
As shown in the figure, it was confirmed that the time was approximately 48 hours. After collection, these cells are established into a cell line within about one year. Therefore, in order to evaluate the cell proliferation ability of the target substance of the present invention, in order to obtain cells that are as close to normal as possible, cells that have been expanded and subcultured within 6 months after collection are frozen and preserved. In order to study the separation of the
I decided to use them sequentially. On the other hand, regarding the culture environment, we investigated the effect of the fetal bovine serum (FBS) used on the cell proliferation promoting effect.
The changes in concentration were investigated, and the minimum amount that satisfies the best conditions without killing cells and not allowing cell proliferation during culture was set as the standard. Specifically, the amount of FBS added to the system,
The relationship between this and fibroblast proliferation is shown in Figure 2. As shown here, when the amount of FBS added to the system was 1%, no proliferation of fibroblasts was observed after 9 days of culture. Therefore, this condition was used as a control. To evaluate the proliferation ability of fibroblasts, first, the diameter
A 3.5cm petri dish (manufactured by Corning),
Dispense 4-5 × 104 cell suspension per mL,
Eagle's MEM medium supplemented with a low concentration of FBS (an amount that does not kill cells and keeps the proliferation rate close to zero: 1%) is replaced every 2 to 3 days. The cell number is then measured every 2-3 days using a Bjürkercijürk hemocytometer. Incidentally, at this time, the amount of protein and the amount of nucleic acid may be measured at the same time. The target substance used for measurement is adjusted (solution) according to its protein content, and 1/10th of the amount per medium is added each time the medium is replaced.As a control, the same amount of physiological saline alone is added. Added. [2] Structure of the Invention The present invention comprises a cell metabolism activating substance that is a water-soluble protein extracted from bovine placenta and has an estimated molecular weight of around 25,000. (Means for Solving the Problems) The gist of the present invention is as described above, but in order to show it more specifically, examples and effects will be described below. Incidentally, in presenting the embodiments, the basic points according to the present invention are as follows. (b) The starting material for the extraction method is fresh placenta from cows after normal parturition (birth). If necessary, the placenta of other domestic animals such as pigs may also be used, but this will depend on the therapeutic or medicinal use, cosmetics, etc. of the animal species to be used. Just choose. (b) Although the examples show the simplest method under the specified extraction conditions, the key point in the extraction process is not to apply heat. Avoid extraction operations with organic solvents. It is necessary to avoid using strong acids, strong alkalis, and various proteolytic enzymes. In other words, these treatment operations should not be used because they deactivate the activity of the target substance. Therefore, the feature of the extraction method from placenta according to the present invention is that organic solvents, strong acids, strong alkalis, enzymes, etc. used in conventional well-known placenta extracts or isolated component extraction methods are not used during the process. Accordingly, various conventional methods for extracting biological components, such as centrifugation, salting-out fractionation, gel filtration, dialysis, low-temperature or vacuum concentration, and freeze-drying. The substance of the present application can be obtained by a combination of the following. (Example 1) A placenta of a cow after normal delivery is cut into small pieces without pretreatment of washing, and homogenized using a homogenizer or the like at low temperature. Water or a buffer solution, such as a low ionic concentration phosphate buffer containing sodium chloride, is added to the solution, stirred, and left for 6 hours to 1 day and night, followed by centrifugation to obtain a supernatant. Next, ammonium sulfate was added to this supernatant to a concentration of 20% saturation, centrifugation was performed to collect the supernatant, and the supernatant was further added to a concentration of 60% saturation. Ammonium sulfate is added again to the desired concentration and the resulting precipitate is collected. Note that the precipitate is dissolved in a small amount of water or physiological saline, and then desalted. Desalination operations include methods such as gel filtration, ultrafiltration, and dialysis, but here, for example, the sample was placed in a dialysis tube and dialyzed against a sufficient amount of physiological saline for at least one day and night. (Example 2) When considering the use of the extract obtained in Example 1, which has a high cell growth-promoting effect, sufficient consideration must be given to inactivating viruses. For example, to inactivate hepatitis virus, 60℃, 10
Heat treatment for several hours is considered effective. The lyophilized liquid obtained in Example 1 was dissolved in water or saline, and then heated at 60°C for 10
When heat treatment was performed for several hours, it was found that although it was effective in inactivating the virus, the original purpose of promoting cell proliferation was also completely lost. In other words, as a result of heat treatment under various conditions, it was found that the cell growth promoting effect of the novel water-soluble protein, which is the substance of the present invention, was completely inactivated at 60°C for 30 minutes. be. Therefore, the present inventors have conducted various studies on stabilization methods that can withstand treatment at high temperatures for long periods of time as a means of sustaining the cell proliferation effect of this substance and inactivating only the hepatitis virus. Ivy. For example, glucose,
Studies were conducted by adding monosaccharides such as mannose, disaccharides such as sucrose, and maltose, etc., and performing heat treatment, but it was found that this operation also resulted in similar inactivation. The present inventors presume that when heat treatment is performed at 60°C in a dissolved state, this treatment causes irreversible denaturation of the higher-order structure of the protein of interest, resulting in its inactivation. In addition, as a means to deal with this, irreversible denaturation of the protein is minimized by changing the structure of the protein in advance with a high concentration salt solution, etc., and heating the precipitated state. Based on the idea that this might be possible, a novel heat treatment method as shown in Example 3 was completed. This method is of course a convenient method that can also be used as a heat stabilization method for various conventionally known components derived from blood and organs. (Example 3) The liquid obtained in Example 1 was freeze-dried and
suspended in 60% ammonium sulfate saturated solution,
Alternatively, the precipitate was collected and heat-treated at 60°C for 10 hours. According to this method, the hepatitis virus is inactivated and the proliferation promoting effect on cells is 80~
It was found that 90% remained. FIG. 3 shows the results of measuring the cell proliferation effect of the target substance after treatment in Example 3 in comparison with that obtained in Example 1. In other words, the method shown in Example 3 is a means to prevent the cell proliferation effect from being inactivated by heat treatment. In addition, Examples 2 and 3 are based on a known method of inactivating hepatitis viruses in serum and protein preparations derived from various organs, and were carried out at 60°C for 10 hours. According to the precipitation or suspension method using a highly concentrated salt solution, which was adopted in the process in Example 3, it is of course possible to shorten the treatment time by increasing the temperature even higher. (Example 4) The protein obtained in Example 1 or 3 is an extract that has a direct metabolic activation effect on cells, and can be used as it is in the conventional fields of use of placenta extracts (medicine, cosmetics). However, in order to further discover the active ingredients, the present inventors attempted the following fractionation. First, gel filtration was attempted on the precipitate obtained in Example 1 or 3, and the components of each fraction flowing out over time were examined. Examples of carriers used in gel filtration include Cephadex, agarose, Cephacryl, etc., but here, Cephadex was used. (Fraction conditions) Resin: Cephadex G-200 Column size: 31 x 370 mm Solvent: 0.01M phosphoric acid buffer (contains 0.14M NaCl, PH7.4) Flow rate: 2cm/hr The outflow curve for this is shown in Figure 4 and As shown in Figure 5. In addition, FIG. 4 shows the components obtained in Example 1,
Moreover, FIG. 5 is an outflow curve of the heat-treated components according to Example 3. As a result of trying to measure the fibroblast proliferation ability of each fraction, as shown in Figure 6,
It was found that active ingredients were present in Fr-C and Fr-D (fraction that flows out around Kav values of 0.18 to 0.80). Therefore, in order to pursue it in more detail, Fr-C,
For Fr-D, fractionation by ion exchange was attempted. Examples of carriers used for ion exchange include cationic and anionic ion exchangers such as Cephadex, Cepharose, Cephacryl, etc.
Here, fractionation was performed using DEAE-Sephadex. (Fraction conditions) Resin: DEAE-Sephadex A-50 Column size: 20 x 200 mm Solvent: 0.10M-0.05N Tris-HCl buffer (PH8.0) Elution conditions: NaCl concentration 0 → 0.5M (divided into 0.05M steps) Figure 7 shows the outflow curve for this. The fibroblast proliferation ability of each fraction obtained by this fractionation procedure was measured in the same manner.
Strong activity was observed in the fraction flowing between 0.20 and 0.25M. Therefore, this fraction was again subjected to gel filtration using Sephadex G-200, and the outflow curve shown in FIG. 8 was obtained. In the figure, A indicates a component that flows out at a NaCl concentration of 0.05 to 0.10M, and B indicates a component that flows out at a NaCl concentration of 0.20 to 0.25M. (Example 5) In order to measure the molecular weight of the active ingredient fractionated in Example 4, the following 3 substances with known molecular weights were used.
The substance was subjected to gel filtration using Cephadex G-200, a calibration curve of Kav value and molecular weight was created, and the molecular weight of the target substance was calculated. (Substances with known molecular weights (standard substances)) A. Aldolase (molecular weight: 158,000) B. Bovine serum albumin (molecular weight: 67,000) C.alpha.-Chymotrypsinogen A (molecular weight: 25,000) FIG. 9 is the standard line. The yield of the substance of the present invention is about 150 to 300 mg from 1 kg of cow placenta. [3] Effects of the Invention The present invention resides in a novel water-soluble protein obtained from bovine placenta. This protein has an extremely high direct metabolic activation effect on cells. Conventional known placenta extract or extract substance,
Comparing the extraction conditions, conventionally known extracted extracts or extracted substances have used chemicals such as organic solvents, strong acids, strong alkalis, and proteolytic enzymes during the process; Drugs have been used to deactivate substances that promote cell proliferation in the placenta. Another feature of the conventional method is that the placenta or homogenized placenta was washed as a pretreatment for the extraction operation, and as a result, the target substance was washed away. Moreover, it is thought that it was deactivated by mere heat treatment. In the present invention, a cell proliferation-promoting substance present in bovine placenta was added to cells, and its proliferation ability was directly and quantitatively verified by the number of cells. And furthermore,
We investigated the reason why placenta extract obtained by conventional extraction methods or its isolated substances do not exhibit cell proliferation effects. As a result, they discovered that the chemicals used for extraction and that they were deactivated during the heat treatment process, and were able to complete the present invention.
【図面の簡単な説明】[Brief explanation of the drawing]
第１図は、モルモツト（ハートレー系、雌）か
ら採取した繊維芽細胞を、培養液中５％量の牛胎
児血清（FBS）を添加したイーグルMEM培地中
で培養した時の、細胞数の変化を示したものであ
る。第２図は、繊維芽細胞増殖に及ぼす、培養液
中の、牛胎児血清（FBS）濃度の影響について
示したものである。第３図は、牛の胎盤から抽出
された水溶性蛋白質の、熱処理する前と熱処理し
た後の、細胞増殖促進作用を示したものである。
図中イは、熱処理する前の抽出物の添加による細
胞増殖作用、ロは、熱処理した後の抽出物の添加
による細胞増殖作用、又、ハは、対照群（生理食
塩水添加群）の細胞増殖作用である。第４図は、
60％硫酸アンモニウムで沈澱した成分の、セフア
デツクスＧ−200を用いたゲル濾過による流出曲
線である。第５図は、60％硫酸アンモニウムで沈
澱した成分を加熱処理した物の、セフアデツクス
Ｇ−200を用いたゲル濾過による流出曲線である。
第６図は、60％硫酸アンモニウムで沈澱した成分
を、セフアデツクスＧ−200を用いて分画した各
フラクシヨンの、繊維芽細胞増殖作用を示したも
のである。第７図は、牛の胎盤から抽出された水
溶性蛋白質を、セフアデツクスＧ−200を用いて
分画し得られた、フラクシヨンＣ及びＤについ
て、更に、DEAE−セフアデツクスＡ−50を用い
て、イオン交換分画した流出曲線を示す。第８図
は、DEAE−セフアデツクスＡ−50を用いて分画
した、活性フラクシヨンの、セフアデツクスＧ−
200を用いたゲル濾過による、流出曲線である。
図中Ａは、イオン交換分画でNaCl濃度0.05〜
0.10Mの間で流出する画分、図中Ｂは、NaCl濃
度0.20〜0.25Mの間に流出する画分についての、
セフアデツクスＧ−200でのゲル濾過による流出
曲線である。第９図は、アルドラーゼ（分子量
158000）：図中Ａ、牛血清アルブミン（分子量
67000）：図中Ｂ、α−キモトリプシノーゲンＡ
（分子量25000）：図中Ｃをマーカー蛋白質として
作成した、Kav値と分子量の標準線である。
Figure 1 shows the change in cell number when fibroblasts collected from guinea pigs (Hartley strain, female) were cultured in Eagle's MEM medium supplemented with 5% fetal bovine serum (FBS) in the culture medium. This is what is shown. FIG. 2 shows the influence of fetal bovine serum (FBS) concentration in the culture solution on fibroblast proliferation. FIG. 3 shows the cell proliferation promoting effect of water-soluble protein extracted from bovine placenta before and after heat treatment.
In the figure, A indicates the cell proliferation effect due to the addition of the extract before heat treatment, B indicates the cell proliferation effect due to the addition of the extract after heat treatment, and C indicates the cell proliferation effect of the control group (physiological saline addition group). It is a proliferative effect. Figure 4 shows
This is an efflux curve of a component precipitated with 60% ammonium sulfate, obtained by gel filtration using Sephadex G-200. FIG. 5 is an outflow curve obtained by gel filtration using Sephadex G-200 of a heat-treated component precipitated with 60% ammonium sulfate.
FIG. 6 shows the fibroblast proliferation effect of each fraction obtained by fractionating the components precipitated with 60% ammonium sulfate using Sephadex G-200. Figure 7 shows fractions C and D obtained by fractionating water-soluble proteins extracted from bovine placenta using Cephadex G-200. The exchange fractionated efflux curve is shown. Figure 8 shows the active fraction fractionated using DEAE-Sephadex G-50.
200 gel filtration.
A in the figure is an ion exchange fraction with a NaCl concentration of 0.05~
The fraction flowing out between 0.10M and B in the figure is the fraction flowing out between 0.20 and 0.25M NaCl concentration.
This is an outflow curve obtained by gel filtration using Sephadex G-200. Figure 9 shows aldolase (molecular weight
158000): A in the figure, bovine serum albumin (molecular weight
67000): B in the figure, α-chymotrypsinogen A
(Molecular weight 25000): C in the figure is a standard line of Kav value and molecular weight created with marker protein.