JPH0573387B2 - - Google Patents

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【発明の詳細な説明】

〔産業上の利用分野〕 本発明は、バチルス・メガテリウム由来のグル
コースデヒドロゲナーゼ（以下「GDH」とい
う。）をコードするDNAのアミノ酸配列で示され
る特定の位置のアミノ酸を他のアミノ酸で置換す
ることによつて得られる改良型DNAを大腸菌用
DNA導入ベクターに組み込んだ大腸菌内で複製
可能な改良型組換えDNA、それを含む形質転換
体及びそれを用いる耐熱性GDHの製造法に関す
る。 〔従来技術〕 GDH（EC1.1.1.47〕は、グルコース定量用酵素
として臨床検査及び食品工業の分野において重要
な酵素として使用されている。 従来、GDHを生産する微生物としては、バチ
ルス・メガテリウム（Bacillus megaterium）、
バチルス・セレウス（Bacillus cereus）等のバ
チルス属菌が知られている（特開昭53−137199
号）。 〔解決すべき問題点〕 しかしながらグルコース測定用酵素として
GDHを使用するためには、より安定生に優れた
GDHを安価に製造することが望まれていた。 最近になつてバチルス・メガテリウム
（Bacillus megaterium）由来のGDH遺伝子を大
腸菌に組み入れた組換え体を用いたGDHの生産
方法が開示された（ヨーロピアン・ジヤーナル・
オブ・バイオケミストリー（Eur.J.Biochem.）
174巻、485〜490、（1988）〕。 しかし、バチルス・メガテリウム（Bacillus
megaterium）由来のGDH遺伝子は複数個存在す
ることが示され、それらを用いて形質転換体を
得、GDHを生産しているが、使用しているベク
ターはGDHの大量生産には向かないものであり、
かつGDHをより安定化するための改良は何らな
されていないのであつた。 〔問題点を解決すべき手段・作用〕 本発明者らは、まずGDHをより安価に製造す
るため、バチルス・メガテリウム（Bacillus
megaterium）油愛のGDH遺伝子を高発現ベクタ
ーpKK223−２に組み入れて形質転換体を得、該
形質転換体を栄養培地で培養することによつて
GDHを高生産することに成功した。 その後、さらに検討を続けた結果、バチルス・
メガテリウム（Bacillus megaterium）由来の
GDHをコードするDNAのアミノ酸配列で示され
る特定の位置のアミノ酸を他のアミノ酸で置換し
て得られる改良型DNAを大腸菌に組み入れた形
質転換体を栄養培地で培養したところ、培養物中
に従来のGDHより熱安定生に優れたGDHを大量
に製造せしめることに成功し、本発明を完成した
ものである。 本発明のバチルス・メガテリウム（Bacillus
megaterium）由来のGDH改良型組換えDNAを
調製するためには、まずGDHをコードする組換
えDNAを調製する必要がある。 そのために使用する菌株としては、GDH生産
能を有するバチルス・メガテリウム（Bacillus
megaterium）であればいずれのものも使用でき
るが、好ましくはバチルス・メガテリウム
（Bacillus megaterium）IAM1030及び土壌から
分譲されたバチルス・メガテリウム（Bacillus
megaterium）IWG3を用いるのがよい。 このうち土壌から得られた菌株のバチルス・メ
ガテリウム（Bacillus megaterium）IWG3は以
下のようにして同定されたものである。 同定の結果 菌学的諸性質の試験は、ルース・イー・ゴード
ン著、ザ・ジーナス・バチルス（Ruth E.
Gordon：The Genus Bacillus（1973）〕に準拠
し、分類方法はバージエイス・マニユアル・オ
ブ・デイタミネイテイブ・バクテリオロジー
（Bergey′s Manual of Determinative
Bacteriology）（第８版）及び前記The Genus
Bacillusによつた。 Ａ 形態 細胞の大きさは1.1〜1.6μ×3.0〜5.0μで桿
菌である。またグルコース栄養培地
（glucose nutrient agar）で生育した細胞を
フクシンで染めると細胞内は粒状である。 運動性はない。 胞子を形成し、大きさは1.0〜1.3μ×2.0〜
2.5μで、卵形ないしは円柱形である。胞子の
うは膨らまない。中立ないしは準端立であ
る。 グラム染色性は陽性である。 Ｂ 生理学的性質 硝酸塩の還元：陰性 脱窒反応：陰性 VPテスト：陰性。グロスのPHは７日間の
培養で4.6〜5.0である。 インドールの生成：陰性 デンプンの加水分解：陰性 クエン酸塩の利用：陽性 無機窒素源の利用：アンモニウム塩と硝酸
塩を共に利用する。 色素の生成：チロシン培地で茶褐色の水溶
性色素を生成する。 ウレアーゼ：弱陽性 カタラーゼ：陽性 酸素に対する態度：好気性 糖類からの酸及びガスの生成： アラビノース、キシロース、グルコース、
フラクトース、ガラクトース、マルトース、
シユクロース、ラクトース、トレハロース、
マンニツト、イノシツト、グリセリン、デン
プンから酸を生成するが、ガスは生成しな
い。マンノース、ソルビツトからは酸もガス
も生成しない。 ７％NaCl培地での生育：生育しない 45℃における生育：生育する 65℃における生育：生育しない サブロー、デキストローズ（Sabouraud
dextrose）培地における生育：生育する フエニルアラニンのデアミネーシヨン：陽
性 ゼラチンの液化性：陽性 カゼインの分解性：陽性 チロシンの分解性：陽性 卵黄反応：陰性 以上の諸性質をバージエイス・マニユアル・オ
ブ・デイタミネイテイブ・バクテリオロジー
（Bergey′s Manual of Determinative
Bacteriology）（第８版）の分類方法にしたがつ
て検索すると、本菌株はグラム陽性の好気性桿菌
で胞子を形成するのでBacillus属に分類される。
種については栄養細胞の大きさが1.0〜1.6μ×
3.0〜5.0μであり、グルコース培地で細胞内が粒
状であること、胞子のうが膨らまないこと、胞
子形成部位は中央部ないしはやや末端よりである
こと、グルコースから酸を生成すること、VP
テストが陰性であること、嫌気条件下では生育
しないこと、サブロー、デキストローズ
（Sabouraud dextrose）培地で生育すること、
アラビノース、キシロース、マンニツトから酸を
生成すること、卵黄反応が陰性であること等の
性質からバチルス・メガテリウム（Bacillus
megaterium）と同定された。 本発明者らは、本菌株をバチルス・メガテリウ
ム（Bacillus megaterium）IWG3と命名した。 形質転換体(1)調製 (1) GDHの精製 バチルス・メガテリウム（Bacillus
megeterium）IWG3を2XTYブロスに植菌し、
培養後集菌し、菌体粉砕後、遠心分離して得ら
れる上清液を脱塩濃縮後、凍結乾燥して得られ
たGDH粗酵素粉末105μｇをグリセロール10％
含有イミダゾール緩衝液（20ｍＭ、PH6.5）15
mlに溶解し、DEAE−セフアデツクスＡ−50に
吸着させた後、食塩濃度勾配（0.1M−0.5M）
により溶出させ、活性画分を集め脱塩濃縮す
る。次にTSK−gel DEAE 3SWを担体とする
高速液体クロマトグラフイーにより分子量分画
を行い、さらにTSK−gel G3000SWを担体と
する高速液体クロマトグラフイーにより吸着溶
離して電気泳動的に均一な活性画分（蛋白質量
として約５mg）を得た。 (2) GDHのアミノ基末端アミノ酸配列の決定前
記１により得た精製酵素蛋白質のアミノ基末端
アミノ酸配列をABI〔アプライド バイオシス
テム（Applied Biosystem）〕社製ペプチドシ
ーケンサーGas Phase 470Aにより分析し、Ｎ
末端より29アミノ酸残基の配列を決定した。得
られたアミノ基末端アミノ酸配列を以下に示
す。 Met−Tyr−Lys−Asp−Leu−Glu−Gly−
Lys−Val−Val−Val−Ile−Thr−Gly−Ser−
Ser−Thr−Gly−Leu−Gly−Lys−Ser−Met
−Ala−Ile−Arg−Phe−Ala−Thr 注：下線部はプローブ合成に用いられた配列
を示す。 (3) DNAプローブの合成 前記アミノ酸配列から下線で示した１個所の
配列を選択し、これらのアミノ酸配列から推定
される遺伝子上の可能なDNA塩基配列のうち、
枯草菌のコドン利用頻度を参考にしてDNA塩
基配列を推定し、38merの１種のDNAプロー
ブの塩基配列を下記の如く決定した。 TAC ATA TTT CTA CAC CTT CCT
TTT CAA CAA CAA TAA TG DNAの場合はABI社製でシンセサイザー
（Synthesizer）モデル381Aを用いて行つた。 (4) バチルス・メガテリウム（Bacillus
megaterium）からの全DNAの抽出と切断 斉藤、三浦らの方法〔バイオキミカ・バイオ
フイジカ・アクタ（Biochim.Biophys.Acta）、
72巻、619（1963）〕に従つてバチルス・メガテ
リウム（Bacillus megaterium）IWG3から全
DNAを抽出精製した。このDNA240μｇをと
り、制限酵素EcoR 、Belをそれぞれ150
単位と37℃、３時間反応させた。反応液の全量
を１％アガロースゲル電気泳動に供し、３〜
4Kbの大きさに相当するDNAを含む部分を切
出して、電気抽出法によりゲルからDNA断片
を溶出させた。次いで溶出液を当量のフエノー
ル及びフエノール・クロロホルムで順次抽出
し、得られた水層にエタノールを添加して
DNAを沈澱させた後、TE緩衝液100μに溶
かした。 (5) ベクターへのDNA断片の挿入 ベクターとしてはpBR322を用いたが、
DNA断片挿入のためには、pBR322 20μｇを
EcoI−BamHIで完全分解して得られた直鎖状
ベクターDNAをTE緩衝液200μに溶解して
使用した。上記工程４で得られたDNA断片と
の結合は、工程４で得られた溶液と直鎖状ベク
ターDNA溶液を10：１の割合に混合し、T4
DNAリガーゼを14℃で一夜反応させることに
より行つた。 (6) バチルス・メガテリウム（Bacillus
megaterium）のDNAライブラリーの作成 上記工程５で得られた組換えDNAを形質転
換により宿主大腸菌エシエリヒア・コリ
（Escherichia coli）C600に導入し、アンピシ
リン50μｇ／mlを含むＬ−ブロス寒天培地上で
生育してきたコロニーを集めてバチルス・メガ
テリウム（Bacillus megaterium）IWG3の
DNAライブラリーと称した。 (7) DNAライブラリーからGDHクローンの選
択・分離 上記工程３で得られたDNAプローブを各々
イングリア（Inglia）らの方法〔ヌクレイツ
ク・アシツド・リサーチ（Nucleic Acids
Res.）、９巻、1627〜1642（1982）〕に従つてT4
ポリヌクレオチドキナーゼとγ−³²P−ATPを
用いてラベルした。次に前記工程６で得られた
大腸菌をアンピシリン50μｇ／mlを含むＬ−ブ
ロス寒天培地上でコロニーとして生育させ、こ
れをレプリカ法によつて、アマーシヤム
（Amersham）ナイロンメンブランへ移し、リ
ゾチームを溶菌し、アルカリでDNA変性させ、
塩酸による中和処理を行つた後、前記プローブ
と、ハイブリダイゼーシヨンさせた。ハイブリ
ダイゼーシヨンは６倍濃度のSSC
（0.15MNaCl、0.015Mクエン酸ナトリウム、PH
7.0）、５倍濃度のデンハルト（Denhardt）液
（0.02％フイコール、0.02％ポリビニルピロリ
ドン、0.02％牛血清アルブミン）、0.5％SDS、
牛胸腺DNA20μｇ／ml（終濃度）及びラベル
したDNAプローブ約５×10⁵cpm／mlを用いて
プレハイブリダイゼーシヨンを45℃、３時間行
つた後、45℃、一夜のハイブリダイゼーシヨン
を行つた。この後、５倍濃度のSSCを用いて45
℃で２回、つづいて５倍濃度のSSC（0.1％SDS
を含む）を用いて45℃で２回、４倍濃度のSSC
で２回ナイロンメンブランを洗浄した。この後
ナイロンメンブランを乾燥させ、オートラジオ
グラフイー（条件：−80℃、一夜）に供した。
その結果、ハイブリダイゼーシヨン陽性のコロ
ニーが３つ見出された。そこで陽性のコロニー
について液体培養をした後、バーンボイム
（Birnboim）らの方法〔ヌクレイツク・アシツ
ド・リサーチ（Nucleic Acids Res.）、７巻、
1513〜1523（1979）〕によりプラミスドDNAを
調製した。得られたプラスミドDNAを制限酵
素EcoRI、SaIIで切断し、アガロースゲル電気
泳動を行つた後、ラベルしたDNAプローブと
サザン（Southern）ハイブリダイゼーシヨン
〔ジヤーナル・オブ・モレキユラー・バイオロ
ジー（J.Mol.Biol.）、98巻、503〜517（1975）〕
を行つた。その結果、EcoRI、SalI切断で生成
する約3.6KbのDNA断片にDNAプローブが強
くハイブリダイズすることが見出された。なお
分離された３株は同一のプロスミドを有するこ
とが示され、GDHクローンの候補としてこの
プラスミドをpGDA1と命名した。 (8) GDHクローンの同定とDNA塩基配列の決定 プラスミドpGDA1よりEcoRI、Sau3AI切断
により生成する930bpのDNA断片についてサ
ンガー（Sanger）らの方法〔プロシーデイン
グス・オブ・ナシヨナル・アカデミー・サイエ
ンス・エーエスエー（Proc.Natl.Acad.Sci.U.
S.A.）、74巻、5463〜5467、（1977）〕に従つて
DNA塩基配列を決定した。その結果、上記工
程２で得られたGDHのアミノ基末端アミノ酸
配列に完全に一致するアミノ酸配列をコードす
る塩基配列が見出され、この断片がGDH遺伝
子の一部を含むことが明らかになつた。プラス
ミドpGDA1については、制限酵素切断の結果
にもとづいて第１図に表される制限酵素地図を
作成した。すでに決定された塩基配列から遺伝
子読取り方向の下流部位のDNA塩基配列を決
定したところ、第２図に示される261個のアミ
ノ酸よりなる蛋白質をコードする塩基配列が存
在することが示された。以上の結果によりプラ
スミドpGDA1中のバチルス・メガテリウム
（Bacillus megaterium）IWG3由来のDNA断
片中にはGDHの構造遺伝子が完全に含まれて
いるものと推定される。 (9) GDH遺伝子の発現 クローニングされたGDH遺伝子を大腸菌で
発現させるためにプラスミドpGDA1中のバチ
ルス・メガテリウム（Bacillus megaterium）
IWG3由来のDNA断片から、以下に示す工程
に従い遺伝子の発現を試みた。 プラスミドpGDA1 10μｇをEcoR及びPvu
で切断し、１％アガロース電気泳動に供し、
約1.5Kbの大きさの断片を回収した。得られた
断片1μｇにdATP、dGTP、dCTP、dTTPを
終濃度各１ｍＭ、DNAポリメラーゼクレノウ
フラグメント（Klenow fragment）４単位を
加え、10ｍＭトリス−塩酸緩衝液（PH7.5）、７
ｍＭ MgCl₂、１ｍＭジチオスレイトールの反
応液20μ中で、30℃、20分間反応させた。こ
れにより両端が平滑末端にされたDNA断片を
精製し、その約0.5μｇにPstリンカーと
T4DNAリガーゼ10単位を加え、66ｍＭトリス
−塩酸緩衝液（PH7.5）、５ｍＭ MgCl₂、５ｍ
Ｍジチオスレイトール、１ｍMATPの反応液
20μ中で、14℃、一夜反応させた。反応後
DNA断片を精製し、Banで切断後、この断
片にマングビーヌクレアーゼ（Mung bean
nuclease）1Uを加え、40ｍＭ酢酸ナトリウム
（PH4.5）、100ｍＭ NaCl、２ｍＭ ZnCl₂、10
％グリセロースの反応液50μ中で、30℃、30
分間反応させた。この操作によりBan の突
出末端を平滑末端にし、さらに上述したのと同
様の方法でEcoRリンカーを連結した。反応
後DNA断片を精製し、EcoRとPstで両端
を切断し、EcoR−Pst断片として回収し
た。 本実施例に用いられる発現用ベクター
pKK223−３は、ブロシウス（Brosius.J.）ら
〔プローシデイングス・オブ・ナシヨナル・ア
カデミー・サイエンス・ユーエスエー（Porc.
Natl.Acad.Sci.U.S.A.）、81巻、6929〜6933、
（1984）〕により報告されたものであり、プロモ
ーターとしてtacプロモーターを有している。 この発現ベクターpKK223−３を制限酵素
EcoR とPst で切断した後、回収した
EcoR −Pst 断片と混合し、T4DNAリ
ガーゼで結合反応を行わせた。その反応液を用
いてエシエリヒア・コリ（Escherichia coil）
JM105を形質転換し、アンピシリン50μｇ／
ml、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラ
ノシド（IPTG）を含むＬ−ブロス寒天培地上
で生育してくるコロニーを選択した。 得られたコロニーについてGDHの発現を確
認するために、色素共役法を用いたコロニーア
ツセイを行つた。コロニーをろ紙上にレプリカ
し、50ｍＭトリス−塩酸（PH7.5）、10ｍＭ
EDTA緩衝液にリゾチームを１mg／mlの濃度
に調整したリゾチーム溶液をろ紙上のコロニー
に加え、30℃、20分間保温後、１％トリトン溶
液を加え室温で５分間放置した。さらに熱処理
用の緩衝液（50ｍＭリン酸緩衝液（PH6.5）、
2M NaCl、50ｍＭ EDTA）を加え、60℃、
20分間熱処理を行つた。 次に基質混合液（20ｍＭトリス−塩酸（PH
8.0）、1M NaCl、100ｍＭグルコース、0.5ｍＭ
フエナジンエトサルフエート（PES）、0.5ｍＭ
３−（4′、5′−ジメチルチアゾール−２−イ
ール−２、５−ジフエニルテトラゾリウム、ブ
ロマイド（MTT）、50μM NAD）を加え、37
℃、５分間暗所にて放置する。対照実験として
上記基質混合液中のグルコースを除いたものを
用いた。反応の停止は、10％酢酸溶液を加える
ことにより行つた。コロニーの選択は、コロニ
ーが青紫色に変化したものを選んだ。コロニー
アツセイの結果、多数の陽性コロニーを得、こ
の中の１株からプラスミドDNAを抽出し、こ
れをpGDA2と命名し、制限酵素による切断で
予想される構造（第３図）を確認した。 なお、本プラスミドをエシエリヒア・コリ
（Escherichia coli）JM105へ形質転換により
導入してGDH高発現株エシエリヒア・コリ
（Escherichia coil）JM105／pGDA2を得た。 本菌株は工業技術院微生物工業技術研究所に
微工研菌寄第10247号として寄託されている。 形質転換体(2)の調製 バチルス・メガテリウム（Bacillus
megaterium）IWG3にかえてバチルス・メガテ
リウム（Bacillus megaterium）IAM1030を用
い、形質転換体(1)の調製の(1)〜(9)と同様に操作
し、高GDH発現プラスミドDNAを抽出し、
pGDA3の命名した。次いで本プラスミドを形質
転換してGDH高発現株エシエリヒア・コリ
（Escherichia coil）JM105／pGDA3を得た。 なお、バチルス・メガテリウム（Bacillus
megaterium）IAM1030より得られたGDHのア
ミノ酸配列は、第２図に示されたバチルス・メガ
テリウム（Bacillus megaterium）IWG3由来
GDHのDNAアミノ酸配列と比較してそのＮ未端
より22位のセリンがアラニンに、43位のアスパラ
ギン酸がグルタミン酸に、79位のアラニンがセリ
ンにそして95位のロイシンがメチオニンにそれぞ
れ置き換わつたことにすぎないことがわかつた。 即ちバチルス・メガテリウム（Bacillus
megaterium）由来のGDHをコードするDNAの
アミノ酸配列は以下に要約される。

【表】

【表】 改良型組換えDNA(1)の調製 (1) 一本鎖DNAの調製 前記プラスミドpGDA2又はpGDA3を制限酵
素EcoR −Pst によつて切断し、GDH
遺伝子断片約0.9Kbを得、M13フアージmp18
又はmp19を用いてクローニングを行い得られ
た組換え体より常法に従つて一本鎖DNAを調
製した。 (2) 一本鎖DNAの化学試薬による変異処理 上記により得られた一本鎖DNA40μｇを
0.5M酢酸緩衝液（PH4.3）50μに溶解し、2M
亜硝酸ナトリウム溶液50μを加えて20℃、１
〜３時間の処理を行つた。 また同様に亜硝酸ナトリウムの代わりに12M
のギ酸を100μ添加して20℃、５〜20分間処
理したり、他にも60％ヒドラジン100μ加え
て同様に20℃、５〜20分間処理した。反応の停
止は上記処理液にそれぞれ20μｇのtRNAを含
む2.5M酢酸緩衝液（PH7.0）100μを添加する
ことにより行い、続いて各反応液に蒸留水
200μを加えた後、氷冷エタノール１mlを加
えて変異処理DNAを沈澱させ、さらに氷冷70
％エタノールで３回洗浄した。 (3) 変異二本鎖遺伝子断片の調製 前工程により得られた変異処理DNA10μｇ
に10倍濃度の逆転写酵素用緩衝液〔70ｍＭトリ
ス塩酸緩衝液（PH7.5）、70ｍＭ塩化マグネシウ
ム、0.5M塩化ナトリウム、20ｍＭジチオスレ
イトール〕10μと20pmolのプライマーを含む
溶液2μと蒸留水74μを加えて85℃、５分
間、40℃、15分間保温した後、10ｍＭの
dNTP13μと逆転写酵素1μ（20μ）を加え
て37℃で反応を行つた。１時間後フエノール抽
出を行つた後エタノール沈澱を行い、沈澱物を
溶解後、制限酵素EcoR、Pstで分解し、ア
ガロースゲル電気泳動を行い、ゲルより変異二
本鎖遺伝子断片を常法に従い回収した。 (4) 耐熱化GDH遺伝子保持株の選択 前工程により得られた変異二本鎖遺伝子断片
を発現ベクターpKK223のEcoR、Pst切断
部位へ組み込み、大腸菌エシエリヒア・コリ
（Escherichia coil）JM103を形質転換した。
シヤーレを培地上に生育したコロニーについ
て、ろ紙を用いるレプリカプリント法により酵
素活性を調べた。尚、ろ紙はあらかじめ60℃、
20分間の加熱処理を行つた。ろ紙上に強い発色
が認められたクローンについては、変異により
GDHの遺伝子が変化して耐熱化したことが考
えられるため、菌株をマスタープレートから鈎
菌する。 次に上記方法により選択された菌株を各々
2XTY培地５mlに接種し37℃、18時間振盪培養
を行い、集菌洗浄後、菌体懸濁液を超音波処理
し、遠心分離を行つて上清液を得た。この上清
液について60℃、20分間の加熱処理を行い、残
存活性を測定して耐熱化変異酵素遺伝子保持株
を選択した。 (5) 耐熱化変異酵素遺伝子の塩基配列決定と変異
の同定 耐熱化変異酵素遺伝子保持株よりプラスミド
DNAを調製し、常法に従つて遺伝子断片の塩
基配列の決定を行い、変異点を明らかにし、酵
素蛋白質のアミノ酸配列上の変化を確認した。 即ち、バチルス・メガテリウム（Bacillus
megaterium）IWG3由来GDH天然型DNAのア
ミノ酸配列のＮ末端より96位のグルタミン酸がア
ラニンに変化した改良型組換えDNAである
pGDA2F−18、同じくＮ末端より96位のグルタ
ミン酸がグリシンに変化したpGDA2H−35、Ｎ
末端より252位のグルタミンがロイシンに変化し
たpGDA2F720、Ｎ末端より253位のチロシンが
システインに変化したpGDA2N−71、Ｎ末端よ
り96位のグルタミン酸及びＮ末端より183位のバ
リンがそれぞれリジン及びイソロイシンに変化し
たpGDA2N−１、Ｎ末端より96位、112位、133
位及び217位のグルタミン酸、バリン、グルタミ
ン酸及びチロシンがそれぞれリジン、アラニン、
リジン及びヒスチジンに変化したpGDA2N−13、
さらにはＮ末端より96位、108位、194位及び210
位のグルタミン酸、アスパラギン酸、プロリン及
びグルタミン酸がそれぞれリジン、アスパラギ
ン、グルタミン及びリジンに変化したpGDA2N
−28の各改良型組換えDNAが得られた。次いで
各プラスミドでエシエリヒア・コリ
（Escherichia coil）JM103を形質転換して得ら
れた各形質転換体について2XTYブロス培地で37
℃、18時間培養し、集菌後、菌体懸濁液を超音波
処理し、遠心分離後、得られた上澄液について50
℃、20分及び60℃、20分処理後の残存GDH活性
を測定した。 尚、対照菌としてエシエリヒア・コリ
（Escherichia coli）JM103／pGDA2菌を使用し
て比較した。その結果は表−１に示される。

【表】 表−１より明らかのように、GDHをコードす
るアミノ酸配列で示される特定のアミノ酸即ちＮ
末端より96位のグルタミン酸がアラニン、グリシ
ン又はリジンのいずれかに置換することによつて
或いはＮ末端より252位のグルタミンがロイシン
及びＮ末端より253位のチロシンがシステインに
置換されることによつてもGDHの耐熱性が著し
く向上することがわかる。 改良型組換えDNA(2)の調製 プラスミドpDCA2にかえてプラスミドpGDA3
を用いる以外は改良型組換えDNA(1)の調製の項
の(1)〜(5)と同様に操作してバチルス・メガテリウ
ム（Bacillus megaterium）IAM1030由来天然
型DNAのアミノ酸配列のＮ末端より96位のグル
タミン酸がアラニンに変化した改良型組換え
DNAであるpGDA3F−18及びＮ末端より252位
のグルタミンがロイシンに変化したpGDA3F−
20、Ｎ末端より253位のチロシンがグリシンに変
化したpGDA3N−71がそれぞれ得られた。 次いで各プラスミドでエシエリヒア・コリ
（Escherichia coli）JM103を形質転換して得ら
れた各形質転換体について2XYTブロス培地で37
℃、18時間培養し、集菌洗浄後、菌体懸濁液を超
音波処理し、遠心分離後、得られた上澄液につい
て50℃、20分及び60℃、20分処理後の残存GDH
活性を測定した。 尚、対照菌としてエシエリヒア・コリ
（Escherichia coli）JM103／pGDA3菌を使用し
て比較した。その結果は表−２に示される。

〔発明の効果〕

本発明は、バチルス・メガテリウム（Bacillus
megaterium）由来のGDHをコードするDNAの
アミノ酸配列で示される特定位置のアミノ酸を他
のアミノ酸で置き換えて得られる改良型DNAを
GDH高発現用ベクターに組み込んだ大腸菌内で
複製可能な改良型組換えDNAを含む形質転換体
を培養することによつて耐熱性GDHを安価に大
量に供給することを可能としたものである。

【図面の簡単な説明】

第１図はプラスミドpGDA1の制限酵素地図を
示すものであり、第２図はバチルス・メガテリウ
ム（Bacillus megaterium）IWG3由来GDHの
DNAアミノ酸配列を示すものであり、第３図は
プラスミドpGDA2の制限酵素地図を示すもので
ある。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 次のアミノ酸配列で示されるバチルス・メガ
   テリウム由来のグルコースデヒドロゲナーゼをコ
   ードするDNAのＮ末端から96位のグルタミン酸
   がリジン、グリシン又はアラニンのいずれかによ
   つて置換されるか、該DNAのＮ末端から252位の
   グルタミンがロイシンによつて置換されるか、又
   は該DNAのＮ末端から253位のチロシンがシステ
   インによつて置換されるかのいずれか１つ以上か
   らなる改良型DNAを大腸菌導入ベクターに組み
   込んだ大腸菌内で複製可能な改良型組換えDNA。 【表】 【表】 【表】 ２ 特許請求の範囲第１項の改良型組換えDNA
   を導入したエシエリヒア・コリ。 ３ 特許請求の範囲第２項記載の形質転換体を栄
   養培地で培養し、耐熱性グルコースデヒドロゲナ
   ーゼを培養物中に産生せしめ、該培養物中より耐
   熱性グルコースデヒドロゲナーゼを採取すること
   を特徴とする耐熱性グルコースデヒドロゲナーゼ
   の製造法。