JPH0573393B2 - - Google Patents
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- JPH0573393B2 JPH0573393B2 JP59227267A JP22726784A JPH0573393B2 JP H0573393 B2 JPH0573393 B2 JP H0573393B2 JP 59227267 A JP59227267 A JP 59227267A JP 22726784 A JP22726784 A JP 22726784A JP H0573393 B2 JPH0573393 B2 JP H0573393B2
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- JP
- Japan
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- dna
- bmnpv
- gene
- polyhedral
- fragment
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/14011—Baculoviridae
- C12N2710/14111—Nucleopolyhedrovirus, e.g. autographa californica nucleopolyhedrovirus
- C12N2710/14121—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/14011—Baculoviridae
- C12N2710/14111—Nucleopolyhedrovirus, e.g. autographa californica nucleopolyhedrovirus
- C12N2710/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2710/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
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Description
（発明の目的）
本発明の目的は、遺伝子工学的手法により、医
薬等に有用な物質を生産する方法を提供すること
にあり、特に従来に比して効率良く物質を生産す
る方法を提供することにあり、また、ウイルス
DNAを利用してin vitro的にまたは生物体内に
おいて物質を生産する方法を提供することにあ
り、更にはカイコ生体内において核多角体病ウイ
ルスを利用して種々の有用物質を効率よく生産す
る方法を提供することにある。また、本発明は、
これらの方法に有用なベクター、組換ウイルス
DNAおよびそれらの製造法を提供することにあ
る。また、本発明は、これらの方法に有用なベク
ター、組換ウイルスDNAおよびそれらの製造法
を提供することも目的とする。 （従来技術） 遺伝子組換技術によりプラスミド等を利用して
大腸菌、枯草菌、酵母等で有用物質を生産する方
法が多数報告されている。また、ウイルスDNA
の一種（Autographa californica nuclear
polyhedrosis virus DNA）を利用してその構造
遺伝子を置換して培養細胞中（Spodoptera
frugiperdaの樹立培養細胞中）においてβ−イン
ターフエロンおよびβ−ガラクトシデースを生産
させる試みも報告された（Molecular and
Cellular Biology３(12)2156〜2165（1983）、４(3)
399〜406（1984）。しかし、この方法は野外に生息
する害虫であるA.Californicaを利用する点で問
題があり、有用物質の製造法として満足できるも
のではない。本発明者は、さらに優れた有用物質
の生産方法を提供すべく研究の結果本発明を完成
した。 （発明の構成） 本発明は、カイコ核多角体病ウイルス
（Bombyx Nuclear Polyhedrosis Virus、以下
BmNPVと略す）のDNAを利用して蛋白または
糖蛋白等の有用物質を遺伝子工学的に生産する方
法に関し、BmNPV DNAのプロモーター領域の
機能を活用して有用物質を効率よく生産する方法
に関し、BmNPV DNAを有用物質生産用遺伝子
で組換（リコンビネーシヨン）した組換DNAに
関し、その組換に有用な組換ベクターに関する。
また本発明は、BmNPV DNAの多角体蛋白構造
遺伝子のプロモーター領域を含む5′上流DNA断
片、翻訳開始コドン及び有用物質生産用遺伝子を
有し、更にBmNPV DNAの多角体蛋白構造遺伝
子の3′下流DNA断片を含む他は含まない転移用
組換ベクターとBmNPV DNAを感染導入する方
法に関す。また本発明は転移用組換ベクターと
BmNPV DNAの混合物を培養細胞又はカイコ生
体に接種してそれらの中で組換BmNPVを作ら
せたり、BmNPV DNAと大腸菌プラスミド
pBR322との組換DNAを作成し、更にこの多角
体蛋白構造遺伝子部分を有用物質生産用遺伝子と
組換る等の方法により組換BmNPV DNAを作
り、これを同様に培養細胞またはカイコ生体に接
種して増殖させ、有用物質を生産する方法に関す
る。 次に本発明の態様を示しつつ更に詳細に説明す
る。 BmNPVはバキユロウイルス（baculovirus）
に属する昆虫ウイルスの一種であり宿主特異性は
高くカイコ（Bombyx mori）に感染してその細
胞中に多角体蛋白を多量に蓄積する。このウイル
スは約140kbpの環状二重鎖DNAのゲノムを持
ち、これはウイルス粒子からプロテアーゼ処理、
ラウリル硫酸ナトリウム（SDS）処理等及び抽出
等の常法により得ることができる。この環状二重
鎖DNA（以下ウイルスDNAまたはBmNPV
DNAと略す）は相当大きな環状DNAであるの
で、制限酵素処理により小さなDNA断片を製し、
多角体蛋白構造遺伝子及びその前後（5′上流及び
3′下流部分）を含有する断片を選択して使用する
のが適当である。制限酵素としては種々のものが
知られ、かつ市販されているので適当なものを選
んで用いればよく、使用条件も酵素に応じ適宜設
定する。なお、本発明の技術内容におけるDNA
断片の合成（化学的合成、制限酵素処理による切
断）、分離および検索、DNA配列の解析、大腸菌
等の処理（形質転換、培養、プラスミドの取得
等）などはよく知られた遺伝子操作技術を利用し
て行うことができる。 BmNPV DNAから得た多くのDNA断片より
構造遺伝子部分を含むDNA断片を選択するには、
常法によつて製したプローブを用いたサザンハイ
ブリダイゼーシヨン等により行えばよい。選ぶべ
き断片は、構造遺伝子部分を含んでいることが必
要であるが、その5′側（上流）及び場合によつて
は3′側（下流）にも相当の長さのDNA鎖を有し
ていることが重要である。この長さをどの程度に
するかは、目的の有用物質の生産の効率に関して
重要であり、かつ以下に述べる取扱いの容易さに
も関係してくるが、実験により確かめることが可
能であり、たとえ手数がかかるとしてもこの分野
での通常の知識を有する者にとつて、以下の説
明、特に実施例を参考にすれば、困難ではない。
この目的にかなつた一つは、EcoRで切断して
得た約10.6kbpの断片であるがその他の制限酵素
を用いて得る種々の断片が使用可能であろう。 多角体蛋白の構造遺伝子及びその前後のDNA
鎖を含む断片から構造遺伝子部分を除去し、その
上流側のプロモーター領域を含む適当な長さの
DNA鎖を取り出し、また構造遺伝子の下流の適
当な長さのDNA鎖を取り出して利用するには
種々の手法が活用される。 すなわち、種々の制限酵素で処理して得た断片
のDNA配列を検索して構造遺伝子部分を同定し、
その部分を制限酵素で切断（例えばBal31による
消化）して除去することができる。必要とされる
上流側および下流側のDNA鎖は、Bal31消化に
よつて残つた部分として調整するなど、あるいは
DNA配列を解明した後に制御酵素で切断して製
造するか、化学合成によつて製造することも可能
である。 カイコの多角体蛋白については、S.セレブリア
ニらがアミノ酸分析を行い、244個のアミノ酸配
列を発表している（J.Invertebrate Pathology30
442〜443（1977））。従つて、BmNPV由来の
DNA断片について塩基配列を解明してそのコド
ンとアミノ酸を対応させてアミノ酸配列を作成
し、これをセレブリアニらの配列と照合すれば多
角体遺伝子のどの部分に相当するか、或いは別の
部分であるかを判断することができる。 本発明者は、構造遺伝子部分の除去およびその
上流並びに下流のDNA断片部分の利用のために
は、BmNPV DNAのEcoR切断断片（約
10.6kbp）が好適であり、かつそのものをHind
で切断するとき使用に便利な二個の断片が得られ
ることを確かめた。ただし、本発明の目的を達成
するためには必ずしもこの断片に限られることは
ないのであつて、種々の制御酵素を用いて検索を
行うことにより、他にも好適な断片を作成するこ
とが可能と考えられる。以下においては、必要に
応じて上記の好適な断片の例により説明する。な
お、DNA配列等の表示においては特に示す以外
は一般的方法により5′側を左に3′側を右にして行
い制御酵素名をハイフン（−）で継ぐことにより
その断片を表す。この場合にも左右は同じ意味を
有する。 上に述べた好適なEcoR−EcoR断片の概要
を次に示す。
薬等に有用な物質を生産する方法を提供すること
にあり、特に従来に比して効率良く物質を生産す
る方法を提供することにあり、また、ウイルス
DNAを利用してin vitro的にまたは生物体内に
おいて物質を生産する方法を提供することにあ
り、更にはカイコ生体内において核多角体病ウイ
ルスを利用して種々の有用物質を効率よく生産す
る方法を提供することにある。また、本発明は、
これらの方法に有用なベクター、組換ウイルス
DNAおよびそれらの製造法を提供することにあ
る。また、本発明は、これらの方法に有用なベク
ター、組換ウイルスDNAおよびそれらの製造法
を提供することも目的とする。 （従来技術） 遺伝子組換技術によりプラスミド等を利用して
大腸菌、枯草菌、酵母等で有用物質を生産する方
法が多数報告されている。また、ウイルスDNA
の一種（Autographa californica nuclear
polyhedrosis virus DNA）を利用してその構造
遺伝子を置換して培養細胞中（Spodoptera
frugiperdaの樹立培養細胞中）においてβ−イン
ターフエロンおよびβ−ガラクトシデースを生産
させる試みも報告された（Molecular and
Cellular Biology３(12)2156〜2165（1983）、４(3)
399〜406（1984）。しかし、この方法は野外に生息
する害虫であるA.Californicaを利用する点で問
題があり、有用物質の製造法として満足できるも
のではない。本発明者は、さらに優れた有用物質
の生産方法を提供すべく研究の結果本発明を完成
した。 （発明の構成） 本発明は、カイコ核多角体病ウイルス
（Bombyx Nuclear Polyhedrosis Virus、以下
BmNPVと略す）のDNAを利用して蛋白または
糖蛋白等の有用物質を遺伝子工学的に生産する方
法に関し、BmNPV DNAのプロモーター領域の
機能を活用して有用物質を効率よく生産する方法
に関し、BmNPV DNAを有用物質生産用遺伝子
で組換（リコンビネーシヨン）した組換DNAに
関し、その組換に有用な組換ベクターに関する。
また本発明は、BmNPV DNAの多角体蛋白構造
遺伝子のプロモーター領域を含む5′上流DNA断
片、翻訳開始コドン及び有用物質生産用遺伝子を
有し、更にBmNPV DNAの多角体蛋白構造遺伝
子の3′下流DNA断片を含む他は含まない転移用
組換ベクターとBmNPV DNAを感染導入する方
法に関す。また本発明は転移用組換ベクターと
BmNPV DNAの混合物を培養細胞又はカイコ生
体に接種してそれらの中で組換BmNPVを作ら
せたり、BmNPV DNAと大腸菌プラスミド
pBR322との組換DNAを作成し、更にこの多角
体蛋白構造遺伝子部分を有用物質生産用遺伝子と
組換る等の方法により組換BmNPV DNAを作
り、これを同様に培養細胞またはカイコ生体に接
種して増殖させ、有用物質を生産する方法に関す
る。 次に本発明の態様を示しつつ更に詳細に説明す
る。 BmNPVはバキユロウイルス（baculovirus）
に属する昆虫ウイルスの一種であり宿主特異性は
高くカイコ（Bombyx mori）に感染してその細
胞中に多角体蛋白を多量に蓄積する。このウイル
スは約140kbpの環状二重鎖DNAのゲノムを持
ち、これはウイルス粒子からプロテアーゼ処理、
ラウリル硫酸ナトリウム（SDS）処理等及び抽出
等の常法により得ることができる。この環状二重
鎖DNA（以下ウイルスDNAまたはBmNPV
DNAと略す）は相当大きな環状DNAであるの
で、制限酵素処理により小さなDNA断片を製し、
多角体蛋白構造遺伝子及びその前後（5′上流及び
3′下流部分）を含有する断片を選択して使用する
のが適当である。制限酵素としては種々のものが
知られ、かつ市販されているので適当なものを選
んで用いればよく、使用条件も酵素に応じ適宜設
定する。なお、本発明の技術内容におけるDNA
断片の合成（化学的合成、制限酵素処理による切
断）、分離および検索、DNA配列の解析、大腸菌
等の処理（形質転換、培養、プラスミドの取得
等）などはよく知られた遺伝子操作技術を利用し
て行うことができる。 BmNPV DNAから得た多くのDNA断片より
構造遺伝子部分を含むDNA断片を選択するには、
常法によつて製したプローブを用いたサザンハイ
ブリダイゼーシヨン等により行えばよい。選ぶべ
き断片は、構造遺伝子部分を含んでいることが必
要であるが、その5′側（上流）及び場合によつて
は3′側（下流）にも相当の長さのDNA鎖を有し
ていることが重要である。この長さをどの程度に
するかは、目的の有用物質の生産の効率に関して
重要であり、かつ以下に述べる取扱いの容易さに
も関係してくるが、実験により確かめることが可
能であり、たとえ手数がかかるとしてもこの分野
での通常の知識を有する者にとつて、以下の説
明、特に実施例を参考にすれば、困難ではない。
この目的にかなつた一つは、EcoRで切断して
得た約10.6kbpの断片であるがその他の制限酵素
を用いて得る種々の断片が使用可能であろう。 多角体蛋白の構造遺伝子及びその前後のDNA
鎖を含む断片から構造遺伝子部分を除去し、その
上流側のプロモーター領域を含む適当な長さの
DNA鎖を取り出し、また構造遺伝子の下流の適
当な長さのDNA鎖を取り出して利用するには
種々の手法が活用される。 すなわち、種々の制限酵素で処理して得た断片
のDNA配列を検索して構造遺伝子部分を同定し、
その部分を制限酵素で切断（例えばBal31による
消化）して除去することができる。必要とされる
上流側および下流側のDNA鎖は、Bal31消化に
よつて残つた部分として調整するなど、あるいは
DNA配列を解明した後に制御酵素で切断して製
造するか、化学合成によつて製造することも可能
である。 カイコの多角体蛋白については、S.セレブリア
ニらがアミノ酸分析を行い、244個のアミノ酸配
列を発表している（J.Invertebrate Pathology30
442〜443（1977））。従つて、BmNPV由来の
DNA断片について塩基配列を解明してそのコド
ンとアミノ酸を対応させてアミノ酸配列を作成
し、これをセレブリアニらの配列と照合すれば多
角体遺伝子のどの部分に相当するか、或いは別の
部分であるかを判断することができる。 本発明者は、構造遺伝子部分の除去およびその
上流並びに下流のDNA断片部分の利用のために
は、BmNPV DNAのEcoR切断断片（約
10.6kbp）が好適であり、かつそのものをHind
で切断するとき使用に便利な二個の断片が得られ
ることを確かめた。ただし、本発明の目的を達成
するためには必ずしもこの断片に限られることは
ないのであつて、種々の制御酵素を用いて検索を
行うことにより、他にも好適な断片を作成するこ
とが可能と考えられる。以下においては、必要に
応じて上記の好適な断片の例により説明する。な
お、DNA配列等の表示においては特に示す以外
は一般的方法により5′側を左に3′側を右にして行
い制御酵素名をハイフン（−）で継ぐことにより
その断片を表す。この場合にも左右は同じ意味を
有する。 上に述べた好適なEcoR−EcoR断片の概要
を次に示す。
【表】
この断片を更に小さな断片に分け、サザンハイ
ブリダイゼーシヨン等の方法で検索すれば多角体
蛋白遺伝子部分を見出すことができる。この例で
は、Hpa Ｉ−Hind断片（約1.4kb）中にこの
構造遺伝子の存在が認められた。従つて、構造遺
伝子の上流部分及び下流部分を利用するためには
Hind処理によりHind−Hind（約3.9kb）
およびHind−Hind（約3.1kb）の二種の断
片を調整して利用するのが便利である。この二種
はアガロース電気泳動等の常法で分離できる。 分離した二種の断片は人工リンカーを含有する
別々のプラミスドに組込んで操作するのが便利で
あり、例えば、市販のプラスミドpUC9および
pUC8（いずれもPharmacia Ｐ−Ｌ
Biochemicals社製）はこのために適している。 下流側のHind−Hind断片（約3.1kb）は
pUC8のHind部位に組込んで利用する。多角体
蛋白遺伝子を含む上流側のHind−Hind断片
はpUC9のHind部位に組込んだ後に、制限酵素
（例えばUcoRI）で一箇所切断し、得たDNA断片
にBal31を働らかすとDNA鎖を切断点から両側
に塩基を一個ずつ消化していくので、DNA鎖の
長さが調節に便利である。反応時間を換えて幾種
類かの長さの断片を作り、その塩基配列を解析す
れば多角体遺伝子の除去されたものを見出すこと
ができる。 このようにして多角体遺伝子を除去し、その上
流のウイルス由来のプロモーター領域を含む
DNA断片を得ることができる。このものは、も
う一方の多角体遺伝子の下流のDNA断片と組み
合わせて、プラスミドに組込んでベクター用プラ
スミドとし、両断片の間の多角体遺伝子が存在し
ていた部位に有用物質生産用遺伝子を組込んで組
換プラスミドを製造するために有用である。であ
る。ここで、本発明における有用物質とは、ペプ
チド、蛋白、又は糖蛋白を意味する。 例えば、上流部分はHind処理後pUC9に組込
んでプラスミドを作り、下流部分はHind−
Hind断片（約3.1kb）をpUC8のHind部位に
組込んでプラスミドとなし、両プラスミドの制限
酵素の共通部位を利用して上流部分と下流部分を
同一プラスミドに組込む。この場合両者の間に人
工リンカー部分が存在するように設計すると有用
物質生産用遺伝子の組込みに便利なことがある。 なお、多角体遺伝子の翻訳開始コード近辺およ
び終了コード近辺が欠損している場合は、合成
DNAで補充するなどの方法により修復してもよ
い。これらは一般的な組換DNA技術によつて行
う。 有用物質生産用遺伝子としては種々のものが報
告され、今後も多くのものの天然の遺伝子の単離
および合成の報告がされるであろうが、それらの
利用が可能なことは容易に理解できるであろう。
例えば、有用物質として、インターフエロン類
（α−インターフエロン、β−インターフエロン、
γ−インターフエロン）、インシユリン、ヒト成
長ホルモン、ソマトメジン類、インターロイキ
ン、各種リンホカインなどペプチド類、蛋白類、
糖蛋白類を挙げることができる。通常この有用物
質生産用遺伝子に予め翻訳開始コドン（ATG）
を結合して後の操作を行うのが適当である。 有用物質生産用遺伝子は、リンカーを両端に結
合させてベクターに組込むなど、常用される方法
を利用して組換プラスミドを製造する。その結
果、得られた組換プラスミドは有用物質生産遺伝
子の上流および下流にそれぞれウイルス由来の断
片、プロモーター領域を含むDNA断片と終了コ
ドンの下流のDNA断片が組込まれたものである。
以上の操作において、DNA断片の組込みあるい
は切断等さらに断片の選択等で、塩基配列が逆に
なる場合も考えられるが、各々の段階で正しい向
きのものであることを確認しながら先に進める必
要のあることは当然である。 上述の如くして得た組換プラスミドは、それ自
体大腸菌に形質転換して増殖させることは可能で
あるが、BmNPVの増殖力を利用することによ
り著しい効果が得られる。この効果を奏するため
に、組換プラスミド中に存在するウイルス由来の
プロモーター領域を含むDNA断片および終了コ
ドン以下のDNA断片が極めて有用である。上記
のプロモーター領域は、カイコ核多角体病ウイル
ス（BmNPV）DNAの多角体蛋白構造遺伝子の
翻訳開始コドンATGとその上流約4.5KbpのHid
サイト間に存在し、この領域が構造遺伝子部分
の蛋白への翻訳にとつて翻訳を促進するために重
要な役割を果たす。 プロモーター領域を含む5′上流断片は、必ずし
も元のBmNPV DNAに存在する塩基配列そのま
まである必要はなく、多少の修飾があつても同様
の機能が期待できる。例えば翻訳開始コドンの
5′上流−９〜−１の欠損または−19〜−１の欠損
した断片の利用によつても優れた効果が得られ、
−29〜−１の欠損した断片でも充分な効果が得ら
れることが認められた。但し−80程度迄が欠損し
たものは好ましいとは言えない。またこの塩基配
列を多少変更したものについては実験でその効果
を容易に確めることができ、そのような断片を合
成して利用することも本発明態様のうちである。 上述の組換プラスミドを利用して、有用物質生
産用遺伝子が組換された組換BmNPV DNAを得
るには種々の方法がある。例えば、一つはin
vitro的な方法であり、一つはカイコを使う方法
である。又この様な組換プラスミドを利用せず
に、BmNPV DNAとpBR322等との組換体を製
し、その多角体遺伝子を有用物質生産用遺伝子と
組換る事により組換ウイルスDNAを作る方法も
態様の一つである。 培養細胞、例えばカイコ樹立細胞（Bm細胞
（ATCC No.CRL−8851））を用いてin vitro的
に、BmNPV DNAと有用物質生産用遺伝子を有
する組換プラスミドを混合感染すると、目的の遺
伝子（有用物質生産用遺伝子）のウイルスDNA
への組換が起こり、組換ウイルスDNA（組換
BmNPV DNA）が生じる。この組換としては、
目的の遺伝子と多角体蛋白構造遺伝子領域の置換
の形態をとることもあり、ウイルスDNAのその
他の領域へ有用物質生産用遺伝子が一個乃至複数
個付加的に組込まれる形態をとることもある。こ
のように、in vitroでの混合感染を行えば組換ウ
イルスDNAが増殖して有用物質が蓄積される。
培地中には非組換体と組換体のウイルスが存在し
得るが、希釈法またはプラーク法などの一般的方
法によつて組換ウイルスを単離することが可能で
ある。 又、上記の混合感染をカイコを用いて行うこと
もできる。 Bm細胞で増殖されたウイルス（組換ウイルス
と非組換ウイルスの混合物、またはそれから組換
体を単離したもの）をin vitroでBm細胞に感染
させるか、またはカイコに経皮的、あるいは体腔
内に注射して効率よく目的の有用物質を生産する
ことができ、これらは公知の方法により単離精製
することができる。 （発明の効果） 本発明によれば、有用なペプチド類、蛋白類、
糖蛋白類を、安全、且つ、経済的に多量に製造す
る事が可能である。 本発明により生産されるペプチドおよび蛋白質
は、真核細胞中において産生されるため、真核生
物遺伝子を使用した場合、その生体内におけると
同様な修飾、すなわちシグナルペプチドの切断、
糖鎖の付加等を受けることができ、従来の細菌類
を用いる遺伝子操作生産物より遥かに有用性が高
いと期待される。またこれらの生産物は細胞外へ
分泌される為、その精製は極て容易である。 更に、カイコは、人類の多年にわたる飼育経
験、およびその研究蓄積により、大量飼育は容易
であり、又、現在では人工飼料による飼育も可能
である。従つて、ウイルスベクターを用いる有用
産物の生産を細胞レベルで行うよりは、生体レベ
ルで行う事が可能であれば、遥かに工業的、且
つ、経済的になると推定される。 以下に有用遺伝子としてα−インターフエロン
（α−IFN）遺伝子を用い医薬品として有用な蛋
白質α−IFNを生産する例を挙げて、その実施の
態様を示すが、本発明の範囲がこれに限定されな
い事は勿論である。 実施例 １ Ａ BmNPVのプラーク法によるクローニング
と増殖 BmNPVを３令期のカイコに経口感染させ、
数日後、体液を採取した。これを牛胎児血清を１
％含んだTC−10培地（J.Invertebrate
Pathology25 363〜370（1975））で希釈し、単層
に培養したBm細胞（カイコ樹立細胞：Appl.
Environ.Microbiol.44 227〜233（1982））に感染
させた後、0.75％アガロースおよび牛胎児血清を
５％含むTC−10培地に重層し、固化後、27℃で
数日間インキユベートした。このプレートに形成
したプラーク班をパスツールピペツトで採取し
た。このプラーク法による操作を２回繰返して遺
伝的に均一なウイルスを得た。このウイルスの代
表的な株であるBmNPV T3株を以下の実験に使
用した。 T3株をBm細胞で増殖させた後、更に５令期の
カイコに経皮接種感染させ、６日後、形成された
多角体を含む感染組織を蒸留水を加えて遠心しそ
の沈殿を蒸留水に懸濁し、磨細し、分画遠心
（3000rpm、30分）および45％と55％（ｗ／ｗ）
の蔗糖溶液の不連続の密度平衡遠心（20000rpm、
30分）により精製した。この多角体浮遊液より分
画遠心（3000rpm、10分）で蔗糖液を除去後、精
製多角体を0.1M炭酸ソーダ（PH11）−0.05M塩化
ナトリウム液に浮遊させ、25℃で30分反応させて
多角体を溶解し、ウイルス粒子を放出させる。 このウイルス浮遊液を10〜40％（Ｗ／Ｗ）蔗糖
液の密度勾配平衡遠心（18000rpm、30分）して、
ウイルスを精製した。蔗糖は透析又は分画遠心
（40000rpm、30分）により除去し、精製ウイルス
粒子を得た。 Ｂ ウイルスDNAの調整、多角体遺伝子の同定、
クローニング Ｂ−１ ウイルスDNAの抽出 精製したウイルス溶液に、SDS（ラウリル
硫酸ナトリウム、1W／Ｗ％）およびプロテ
アーゼＫ（メルク社製１mg／ml）を加え、37
℃で約２時間インキユベートした。この溶液
に等量のフエノール溶液（10ｍＭトリス−塩
酸緩衝液（PH7.6）−１ｍＭ EDTA飽和）を
加え静かに約５分間振とうし次に12000rpm
で５分間遠心した。水層を採り、同様のフエ
ノール処理を２回繰返した。このDNAを含
む水層に等量のクロロホルムを加え、静かに
約５分間振とうし、次いで12000rpmで２分
間遠心した。水層を採り、同様のクロロホル
ム処理を２回繰返した後、水層を10ｍＭ−ト
リス−塩酸緩衝液（PH7.6）−１ｍＭ EDTA
に対して約２日間透析した。得られたウイル
スDNA（ATCC No.40188）を以下の遺伝子
のクローニング及びBm細胞に対する形質転
換（transfection）に用いた。 Ｂ−２ 多角体遺伝子のクローニング プローブの作成：５令中期のカイコに
BmNPV T3株を経皮的に注入して感染さ
せ、数日後、脂肪体組織より塩酸グアニジン
法により全RNAを抽出した。これをオリゴ
dTセルロースカラムでポリＡを有する
mRNAを精製した。このmRNAについて、
ウサギ網状赤血球のin vitroの翻訳系により
調べたところ、全mRNAの90％以上が多角
体のmRNAであつた。このmRNAよりオリ
ゴdTプライマーおよび逆転写酵素を用いて
cDNAを合成した。この場合32Pを含む
dCTPを基質に用いてcDNAをラベルし、多
角体遺伝子の検索の為のプローブとした。 多角体遺伝子を含むEcoR断片のクロー
ニング：BmNPV T3株の精製DNAをEcoR
で消化し、その断片を0.7％アガロースゲ
ルにて電気泳動した後、ニトロセルロースフ
イルターに転写（transfer）し、前記のプロ
ーブとハイブリダイゼーシヨンを行つた。約
10.6kbのNAD断片が特異的にハイブリダイ
ズした。この断片をpBR322のEcoR切断
部位に挿入した。即ち、ウイルスDNAを
EcoRで消化し、Ｂ−１で記述したと同様
のフエノール処理およびクロロホルム処理を
行い、水層を分離した。これに1/20量の4M
塩化ナトリウム溶液および２倍量の冷エタノ
ールを加えて沈殿したDNAを少量のトリス
緩衝液（10ｍＭトリス−塩酸（PH7.6）−１ｍ
MEDTA）に溶解した。一方、pBR322は
EcoRで消化後、上記と同様に処理し、更
にBAP（bacterial alkaline phosphatase
（Besesda Research Laboratories製））で
処理し、再びフエノール処理、クロロホルム
処理を行い、エタノールを加えて沈殿させ、
これを少量のトリス緩衝液に溶解した。 これらのEcoR消化したウイルスDNAお
よびpBR322にT4−リガーゼを加え、５℃で
10時間反応、結合させた。これを大腸菌
K12JM83に挿入した。形質転換したテトラ
サイクリン耐性の大腸菌を前記のラベルした
cDNAをプローブとして用いたコロリーハイ
ブリダイゼイシヨンによりスクリーニング
し、多角体遺伝子を含む約10.6kbのEcoR
断片を含んだプラスミドを有する大腸菌を得
た。これを培養し、セシウムクロライド法で
プラスミドDNAを精製した。このプラスミ
ドをｐ BmE36とし、これを含有する大腸
菌K12JM83DGB−0036は微生物工業技術研
究所にFERM BP−813として寄託されてい
る。pBmE36のEcoR−EcoR挿入部分の
制限酵素地図は図面に示す。前記のcDNAを
プローブとしてサザン（Southern）ハイブ
リダイゼイシヨン法により更に挿入DNA部
分を検索したところ、Hpa−Hind断片
（約1.4kb）とのみハイブリダイズした。 Ｃ 多角体構造遺伝子部分の除去 Ｃ−１ 多角体遺伝子を含む部分及びその下流部
分のクローニング 前記のHpa−Hind断片を含む部分で
あるHind−Hind断片（約3.9kb）及び
多角体遺伝子の下流部分を含むHind−
Hind断片（約3.1kb）を、市販のクローニ
ング・ベクターpUC9及びpUC8のHind切
断部に組込み、夫々p9H18及びp8H225を作
成した。 Ｃ−２ 多角体遺伝子部分の除去 プラスミドp9H18をEcoRにて切断後、
Bal31にて処理し、切断点から両側を削り取
らせた。Bal31の処理時間を変えて、種々の
長さの断片を製した。これをHindで処理
し、0.7％アガロースゲル電気泳動で分離、
抽出し、種々の長さのウイルス由来のDNA
断片を得た。 pUC9をSmaおよびHindで処理し、先
に得たDNA断片（平滑末端およびHind末
端を有する）をライゲートしてプラスミドを
製し、大腸菌Ｋ−12 JM83を形質転換させ
た。これを増殖後、プラスミドを取り、挿入
したウイルス由来のDNA断片の3′側からの
塩基配列をプライマー（M13用15base
sequencing primer）を用い、ダイデオキシ
（dideoxy）法により決定し、ウイルスの多
角体遺伝子部分を同定した。即ち、セレブリ
アニらの文献記載の多角体蛋白のアミノ酸配
列に対応する塩基配列を、ウイルス由来の
DNA断片の塩基配列中に見出し、翻訳開始
コドンATGも決定した。Bal31の処理時間
に対応して得られた種々のプラスミドの内、
多角体遺伝子の翻訳開始コドンATGの上流
の29bpおよびATG以下の多角体蛋白構造遺
伝子が欠損しているものをp9B241とした。 同様にしてATGの上流82bp、19bp、18bp
または7bpおよびATG以下が欠損している
ものを夫々p9B587、p9B310、p9B276および
p9B585と命名した。 この領域の塩基配列を次に示す。
ブリダイゼーシヨン等の方法で検索すれば多角体
蛋白遺伝子部分を見出すことができる。この例で
は、Hpa Ｉ−Hind断片（約1.4kb）中にこの
構造遺伝子の存在が認められた。従つて、構造遺
伝子の上流部分及び下流部分を利用するためには
Hind処理によりHind−Hind（約3.9kb）
およびHind−Hind（約3.1kb）の二種の断
片を調整して利用するのが便利である。この二種
はアガロース電気泳動等の常法で分離できる。 分離した二種の断片は人工リンカーを含有する
別々のプラミスドに組込んで操作するのが便利で
あり、例えば、市販のプラスミドpUC9および
pUC8（いずれもPharmacia Ｐ−Ｌ
Biochemicals社製）はこのために適している。 下流側のHind−Hind断片（約3.1kb）は
pUC8のHind部位に組込んで利用する。多角体
蛋白遺伝子を含む上流側のHind−Hind断片
はpUC9のHind部位に組込んだ後に、制限酵素
（例えばUcoRI）で一箇所切断し、得たDNA断片
にBal31を働らかすとDNA鎖を切断点から両側
に塩基を一個ずつ消化していくので、DNA鎖の
長さが調節に便利である。反応時間を換えて幾種
類かの長さの断片を作り、その塩基配列を解析す
れば多角体遺伝子の除去されたものを見出すこと
ができる。 このようにして多角体遺伝子を除去し、その上
流のウイルス由来のプロモーター領域を含む
DNA断片を得ることができる。このものは、も
う一方の多角体遺伝子の下流のDNA断片と組み
合わせて、プラスミドに組込んでベクター用プラ
スミドとし、両断片の間の多角体遺伝子が存在し
ていた部位に有用物質生産用遺伝子を組込んで組
換プラスミドを製造するために有用である。であ
る。ここで、本発明における有用物質とは、ペプ
チド、蛋白、又は糖蛋白を意味する。 例えば、上流部分はHind処理後pUC9に組込
んでプラスミドを作り、下流部分はHind−
Hind断片（約3.1kb）をpUC8のHind部位に
組込んでプラスミドとなし、両プラスミドの制限
酵素の共通部位を利用して上流部分と下流部分を
同一プラスミドに組込む。この場合両者の間に人
工リンカー部分が存在するように設計すると有用
物質生産用遺伝子の組込みに便利なことがある。 なお、多角体遺伝子の翻訳開始コード近辺およ
び終了コード近辺が欠損している場合は、合成
DNAで補充するなどの方法により修復してもよ
い。これらは一般的な組換DNA技術によつて行
う。 有用物質生産用遺伝子としては種々のものが報
告され、今後も多くのものの天然の遺伝子の単離
および合成の報告がされるであろうが、それらの
利用が可能なことは容易に理解できるであろう。
例えば、有用物質として、インターフエロン類
（α−インターフエロン、β−インターフエロン、
γ−インターフエロン）、インシユリン、ヒト成
長ホルモン、ソマトメジン類、インターロイキ
ン、各種リンホカインなどペプチド類、蛋白類、
糖蛋白類を挙げることができる。通常この有用物
質生産用遺伝子に予め翻訳開始コドン（ATG）
を結合して後の操作を行うのが適当である。 有用物質生産用遺伝子は、リンカーを両端に結
合させてベクターに組込むなど、常用される方法
を利用して組換プラスミドを製造する。その結
果、得られた組換プラスミドは有用物質生産遺伝
子の上流および下流にそれぞれウイルス由来の断
片、プロモーター領域を含むDNA断片と終了コ
ドンの下流のDNA断片が組込まれたものである。
以上の操作において、DNA断片の組込みあるい
は切断等さらに断片の選択等で、塩基配列が逆に
なる場合も考えられるが、各々の段階で正しい向
きのものであることを確認しながら先に進める必
要のあることは当然である。 上述の如くして得た組換プラスミドは、それ自
体大腸菌に形質転換して増殖させることは可能で
あるが、BmNPVの増殖力を利用することによ
り著しい効果が得られる。この効果を奏するため
に、組換プラスミド中に存在するウイルス由来の
プロモーター領域を含むDNA断片および終了コ
ドン以下のDNA断片が極めて有用である。上記
のプロモーター領域は、カイコ核多角体病ウイル
ス（BmNPV）DNAの多角体蛋白構造遺伝子の
翻訳開始コドンATGとその上流約4.5KbpのHid
サイト間に存在し、この領域が構造遺伝子部分
の蛋白への翻訳にとつて翻訳を促進するために重
要な役割を果たす。 プロモーター領域を含む5′上流断片は、必ずし
も元のBmNPV DNAに存在する塩基配列そのま
まである必要はなく、多少の修飾があつても同様
の機能が期待できる。例えば翻訳開始コドンの
5′上流−９〜−１の欠損または−19〜−１の欠損
した断片の利用によつても優れた効果が得られ、
−29〜−１の欠損した断片でも充分な効果が得ら
れることが認められた。但し−80程度迄が欠損し
たものは好ましいとは言えない。またこの塩基配
列を多少変更したものについては実験でその効果
を容易に確めることができ、そのような断片を合
成して利用することも本発明態様のうちである。 上述の組換プラスミドを利用して、有用物質生
産用遺伝子が組換された組換BmNPV DNAを得
るには種々の方法がある。例えば、一つはin
vitro的な方法であり、一つはカイコを使う方法
である。又この様な組換プラスミドを利用せず
に、BmNPV DNAとpBR322等との組換体を製
し、その多角体遺伝子を有用物質生産用遺伝子と
組換る事により組換ウイルスDNAを作る方法も
態様の一つである。 培養細胞、例えばカイコ樹立細胞（Bm細胞
（ATCC No.CRL−8851））を用いてin vitro的
に、BmNPV DNAと有用物質生産用遺伝子を有
する組換プラスミドを混合感染すると、目的の遺
伝子（有用物質生産用遺伝子）のウイルスDNA
への組換が起こり、組換ウイルスDNA（組換
BmNPV DNA）が生じる。この組換としては、
目的の遺伝子と多角体蛋白構造遺伝子領域の置換
の形態をとることもあり、ウイルスDNAのその
他の領域へ有用物質生産用遺伝子が一個乃至複数
個付加的に組込まれる形態をとることもある。こ
のように、in vitroでの混合感染を行えば組換ウ
イルスDNAが増殖して有用物質が蓄積される。
培地中には非組換体と組換体のウイルスが存在し
得るが、希釈法またはプラーク法などの一般的方
法によつて組換ウイルスを単離することが可能で
ある。 又、上記の混合感染をカイコを用いて行うこと
もできる。 Bm細胞で増殖されたウイルス（組換ウイルス
と非組換ウイルスの混合物、またはそれから組換
体を単離したもの）をin vitroでBm細胞に感染
させるか、またはカイコに経皮的、あるいは体腔
内に注射して効率よく目的の有用物質を生産する
ことができ、これらは公知の方法により単離精製
することができる。 （発明の効果） 本発明によれば、有用なペプチド類、蛋白類、
糖蛋白類を、安全、且つ、経済的に多量に製造す
る事が可能である。 本発明により生産されるペプチドおよび蛋白質
は、真核細胞中において産生されるため、真核生
物遺伝子を使用した場合、その生体内におけると
同様な修飾、すなわちシグナルペプチドの切断、
糖鎖の付加等を受けることができ、従来の細菌類
を用いる遺伝子操作生産物より遥かに有用性が高
いと期待される。またこれらの生産物は細胞外へ
分泌される為、その精製は極て容易である。 更に、カイコは、人類の多年にわたる飼育経
験、およびその研究蓄積により、大量飼育は容易
であり、又、現在では人工飼料による飼育も可能
である。従つて、ウイルスベクターを用いる有用
産物の生産を細胞レベルで行うよりは、生体レベ
ルで行う事が可能であれば、遥かに工業的、且
つ、経済的になると推定される。 以下に有用遺伝子としてα−インターフエロン
（α−IFN）遺伝子を用い医薬品として有用な蛋
白質α−IFNを生産する例を挙げて、その実施の
態様を示すが、本発明の範囲がこれに限定されな
い事は勿論である。 実施例 １ Ａ BmNPVのプラーク法によるクローニング
と増殖 BmNPVを３令期のカイコに経口感染させ、
数日後、体液を採取した。これを牛胎児血清を１
％含んだTC−10培地（J.Invertebrate
Pathology25 363〜370（1975））で希釈し、単層
に培養したBm細胞（カイコ樹立細胞：Appl.
Environ.Microbiol.44 227〜233（1982））に感染
させた後、0.75％アガロースおよび牛胎児血清を
５％含むTC−10培地に重層し、固化後、27℃で
数日間インキユベートした。このプレートに形成
したプラーク班をパスツールピペツトで採取し
た。このプラーク法による操作を２回繰返して遺
伝的に均一なウイルスを得た。このウイルスの代
表的な株であるBmNPV T3株を以下の実験に使
用した。 T3株をBm細胞で増殖させた後、更に５令期の
カイコに経皮接種感染させ、６日後、形成された
多角体を含む感染組織を蒸留水を加えて遠心しそ
の沈殿を蒸留水に懸濁し、磨細し、分画遠心
（3000rpm、30分）および45％と55％（ｗ／ｗ）
の蔗糖溶液の不連続の密度平衡遠心（20000rpm、
30分）により精製した。この多角体浮遊液より分
画遠心（3000rpm、10分）で蔗糖液を除去後、精
製多角体を0.1M炭酸ソーダ（PH11）−0.05M塩化
ナトリウム液に浮遊させ、25℃で30分反応させて
多角体を溶解し、ウイルス粒子を放出させる。 このウイルス浮遊液を10〜40％（Ｗ／Ｗ）蔗糖
液の密度勾配平衡遠心（18000rpm、30分）して、
ウイルスを精製した。蔗糖は透析又は分画遠心
（40000rpm、30分）により除去し、精製ウイルス
粒子を得た。 Ｂ ウイルスDNAの調整、多角体遺伝子の同定、
クローニング Ｂ−１ ウイルスDNAの抽出 精製したウイルス溶液に、SDS（ラウリル
硫酸ナトリウム、1W／Ｗ％）およびプロテ
アーゼＫ（メルク社製１mg／ml）を加え、37
℃で約２時間インキユベートした。この溶液
に等量のフエノール溶液（10ｍＭトリス−塩
酸緩衝液（PH7.6）−１ｍＭ EDTA飽和）を
加え静かに約５分間振とうし次に12000rpm
で５分間遠心した。水層を採り、同様のフエ
ノール処理を２回繰返した。このDNAを含
む水層に等量のクロロホルムを加え、静かに
約５分間振とうし、次いで12000rpmで２分
間遠心した。水層を採り、同様のクロロホル
ム処理を２回繰返した後、水層を10ｍＭ−ト
リス−塩酸緩衝液（PH7.6）−１ｍＭ EDTA
に対して約２日間透析した。得られたウイル
スDNA（ATCC No.40188）を以下の遺伝子
のクローニング及びBm細胞に対する形質転
換（transfection）に用いた。 Ｂ−２ 多角体遺伝子のクローニング プローブの作成：５令中期のカイコに
BmNPV T3株を経皮的に注入して感染さ
せ、数日後、脂肪体組織より塩酸グアニジン
法により全RNAを抽出した。これをオリゴ
dTセルロースカラムでポリＡを有する
mRNAを精製した。このmRNAについて、
ウサギ網状赤血球のin vitroの翻訳系により
調べたところ、全mRNAの90％以上が多角
体のmRNAであつた。このmRNAよりオリ
ゴdTプライマーおよび逆転写酵素を用いて
cDNAを合成した。この場合32Pを含む
dCTPを基質に用いてcDNAをラベルし、多
角体遺伝子の検索の為のプローブとした。 多角体遺伝子を含むEcoR断片のクロー
ニング：BmNPV T3株の精製DNAをEcoR
で消化し、その断片を0.7％アガロースゲ
ルにて電気泳動した後、ニトロセルロースフ
イルターに転写（transfer）し、前記のプロ
ーブとハイブリダイゼーシヨンを行つた。約
10.6kbのNAD断片が特異的にハイブリダイ
ズした。この断片をpBR322のEcoR切断
部位に挿入した。即ち、ウイルスDNAを
EcoRで消化し、Ｂ−１で記述したと同様
のフエノール処理およびクロロホルム処理を
行い、水層を分離した。これに1/20量の4M
塩化ナトリウム溶液および２倍量の冷エタノ
ールを加えて沈殿したDNAを少量のトリス
緩衝液（10ｍＭトリス−塩酸（PH7.6）−１ｍ
MEDTA）に溶解した。一方、pBR322は
EcoRで消化後、上記と同様に処理し、更
にBAP（bacterial alkaline phosphatase
（Besesda Research Laboratories製））で
処理し、再びフエノール処理、クロロホルム
処理を行い、エタノールを加えて沈殿させ、
これを少量のトリス緩衝液に溶解した。 これらのEcoR消化したウイルスDNAお
よびpBR322にT4−リガーゼを加え、５℃で
10時間反応、結合させた。これを大腸菌
K12JM83に挿入した。形質転換したテトラ
サイクリン耐性の大腸菌を前記のラベルした
cDNAをプローブとして用いたコロリーハイ
ブリダイゼイシヨンによりスクリーニング
し、多角体遺伝子を含む約10.6kbのEcoR
断片を含んだプラスミドを有する大腸菌を得
た。これを培養し、セシウムクロライド法で
プラスミドDNAを精製した。このプラスミ
ドをｐ BmE36とし、これを含有する大腸
菌K12JM83DGB−0036は微生物工業技術研
究所にFERM BP−813として寄託されてい
る。pBmE36のEcoR−EcoR挿入部分の
制限酵素地図は図面に示す。前記のcDNAを
プローブとしてサザン（Southern）ハイブ
リダイゼイシヨン法により更に挿入DNA部
分を検索したところ、Hpa−Hind断片
（約1.4kb）とのみハイブリダイズした。 Ｃ 多角体構造遺伝子部分の除去 Ｃ−１ 多角体遺伝子を含む部分及びその下流部
分のクローニング 前記のHpa−Hind断片を含む部分で
あるHind−Hind断片（約3.9kb）及び
多角体遺伝子の下流部分を含むHind−
Hind断片（約3.1kb）を、市販のクローニ
ング・ベクターpUC9及びpUC8のHind切
断部に組込み、夫々p9H18及びp8H225を作
成した。 Ｃ−２ 多角体遺伝子部分の除去 プラスミドp9H18をEcoRにて切断後、
Bal31にて処理し、切断点から両側を削り取
らせた。Bal31の処理時間を変えて、種々の
長さの断片を製した。これをHindで処理
し、0.7％アガロースゲル電気泳動で分離、
抽出し、種々の長さのウイルス由来のDNA
断片を得た。 pUC9をSmaおよびHindで処理し、先
に得たDNA断片（平滑末端およびHind末
端を有する）をライゲートしてプラスミドを
製し、大腸菌Ｋ−12 JM83を形質転換させ
た。これを増殖後、プラスミドを取り、挿入
したウイルス由来のDNA断片の3′側からの
塩基配列をプライマー（M13用15base
sequencing primer）を用い、ダイデオキシ
（dideoxy）法により決定し、ウイルスの多
角体遺伝子部分を同定した。即ち、セレブリ
アニらの文献記載の多角体蛋白のアミノ酸配
列に対応する塩基配列を、ウイルス由来の
DNA断片の塩基配列中に見出し、翻訳開始
コドンATGも決定した。Bal31の処理時間
に対応して得られた種々のプラスミドの内、
多角体遺伝子の翻訳開始コドンATGの上流
の29bpおよびATG以下の多角体蛋白構造遺
伝子が欠損しているものをp9B241とした。 同様にしてATGの上流82bp、19bp、18bp
または7bpおよびATG以下が欠損している
ものを夫々p9B587、p9B310、p9B276および
p9B585と命名した。 この領域の塩基配列を次に示す。
【表】
Ｄ 多角体構造遺伝子部分欠損プラスミドの構築
プラスミドp9B241をEcoRおよびAatで
処理し、別にp8H225〔Ｃ−１にて作成〕を
EcoR、AatおよびScaで処理した（不要
なpUC8由来の断片をScaで小片とした）。両
反応液を夫々、フエノール処理、クロロホルム
処理し、エタノール沈殿させて得た２種の
DNAをライゲートし、生成したプラスミドで
大腸菌K12 JM83を形質転換した。形質転換体
からプラスミドを抽出し、ウイルス由来DNA
断片の上流部分と下流部分が正しい方向に結合
しているプラスミドを選択した。この組換えプ
ラスミドは各種制限酵素による切断像から、ア
ンピシリン耐性マーカーを有し、多角体遺伝子
の開始コードATGから上流30bp目からさらに
上流に約3kb迄の部分（プロモーターを含む非
翻訳部分）及び同遺伝子の終止コードから下流
約3.1kbの部分（但し、終止コードから下流約
300bpは欠損している）を、元のウイルスと同
じ向きに含有しており、大腸菌系で増殖可能で
ある。これをp89B241とした。同様に、
p9B587、p9B310、p9B276およびp9B585を素
材としてp89B587、p89B310、p89B276および
p86B585を構築した。 Ｅ α−IFN遺伝子の挿入 (i) ヒト・ゲノムのλフアージCharon4A組換
体ライブラリー（Lawn等、Cell15 1157
（1978））より白血球IFN遺伝子を検索し、得
られたα−IFN−Ｊ遺伝子を含むDNAを
HindおよびEcoRで処理し、アガロース
ゲル電気泳動でα−IFN−Ｊ遺伝子を含む断
片を分離し、これをHindおよびEcoRで
処理したpUC9とライゲートした。得られた
プラスミドで大腸菌K12JM83を形質転換さ
せた。このプラスミドを取り出し、Mstお
よびPvuで処理し、α−IFN−Ｊ遺伝子を
含むDNA断片を分離し、その両端にSma
リンカー（宝酒造製）を結合させた。これを
Sma処理し、Ｄ項で得たプラスミド
p89B241のSma切断片とライゲートして組
換えプラスミドを製した。α−IFN−Ｊ遺伝
子が正しい方向に入つている事を確かめ、こ
のプラスミドで大腸菌Ｋ−12 JM83を形質転
換し、増殖させ、多量のプラスミドを製し
た。このプラスミドをpIFN−１−B241とし
た。これは多角体遺伝子の上流部分（約−
3kb目から−30番目まで）に続き、プラスミ
ドp89B241構築の際に使用したリンカー残基
13bpおよび染色体より得られたα−IFN−
Ｊ遺伝子の5′非翻訳領域32bpの次にATGで
始まるα−IFN−Ｊ遺伝子が正しい方向に結
合し、更に多角体遺伝子の下流部分（終止コ
ドンから下流約300番目のbpから約3.1kbpま
で）が結合している。 (ii) α−IFN−Ｊ遺伝子を含む前記のHind、
EcoR切断片をpUC9にライゲートして得
られたプラスミドで大腸菌K12JM83を形質
転換させ、そのプラスミドを取り出し、Hpa
で処理し、α−IFN−Ｊ遺伝子を含む
DNA断片を分離し、別途化学合成したオリ
ゴマー（CGGGCCATC）を32P−ATPおよ
びT4−ポリヌクレオチドキナーゼ（宝酒造
社製）を用いてリン酸化し、別の合成オリゴ
マー（CCGGGATGGCC）とアニーリング
させたものとライゲートさせた。これをアガ
ロースゲル電気泳動により分離抽出し、ふた
たび32P−ATPおよびT4ポリヌクレオチドキ
ナーゼを用いてリン酸化したのちＤ項で得た
プラスミドp89B241のXma切断片とライ
ゲートして組換えプラスミドを製した。α−
IFN−Ｊ遺伝子が正しい方向に入つている事
を確かめ、このプラスミドで大腸菌
K12JM83を形質転換し、増殖させ多量のプ
ラスミドを製し、これをpIFN−２−Ｂ−241
とした。 これは多角体遺伝子の上流部分（約3kb上
流から−30番目のbp）に続き、プラスミド
p89B241構築の際に使用したリンカー残基
13bpおよびATGで始まるα−IFN−Ｊ遺伝
子が正しい方向に結合し、更に多角体遺伝子
の下流部分（終止コドンから下流約300番目
のbpから約3.1kb下流まで）が結合してい
る。 同様にしてp89B587、p89B310、p89B276
およびp89B585を素材としてpIFN−２−
B587、pIFN−２−B310、pIFN−２−B276
およびpIFN−２−B585を構築した。 (iii) リンカーの合成 オリゴデオキシリボヌクレオチド類の化学
合成： H.Itoらの報告〔Nucleic Acids
Research、10 1755（1982）〕に準じて、ポ
リスチレン樹脂を用いた固相法により、オリ
ゴマーを合成した。完全に保護された二官能
性ダイマー（）（約100mg）をｔ−ブチルア
ミン−ピリジン（１：9v／ｖ）溶液により、
対応する3′−燐酸ジエステル（）に変換
し、5′−遊離−ヌクレオシド樹脂（）と縮
合剤メシチレンスルホニル−ニトロトリアゾ
リド（MSNT、100mg）を用いて縮合させ、
未反応の5′−水酸基は無水酢酸−ピリジン
（１：9v／ｖ）溶液によつてアセチル化し、
縮合生成物は２％トリクロル酢酸（TCA）−
塩化メチレンにより脱トリチル化処理し脱ト
リチル体（）を得た（反応式参照：
COCH2CH2CONHCH2C6H4−R5部分は樹脂
部分）。これらの一連の反応を目的とするシ
ークエンスまで繰り返した。得られたオリゴ
マー結合樹脂（約20mg）に0.5Mテトラメチ
ルグアニジン−ピリジン−２−アルドキシム
（ピリジン−水（15：４）中）0.5mlを加えて
37℃、８時間反応させ、次いで濃アンモニア
水で55℃、８時間処理した。溶液を
Sephadex Ｇ−50 fine（2.5×60cm）のカラム
でゲルろ化し、DMTrオリゴマーを得た。
これを高速液体クロマトグラフイー
（HPLC）を用いて、更に精製した。カラム
は逆相カラム（SSC−ODS−272、0.6×20
cm）を用い、溶液Ａ（0.02M−TEAA、PH
7.0）と溶液Ｂ（0.02M TEAA、PH7.0中50％
アセトニトリル）による直線濃度勾配法を用
いてDMTrオリゴマーを精製した。これに
80％酢酸を加え、室温で20分処理し、脱トリ
チル化を行い、更に上述のHPLCによつてオ
リゴマーを得た。目的とするオリゴマー10ｍ
Ｍ Tris−HCl（PH7.5）−１ｍＭ EDTA（PH
8.0）で透析することにより得られた。この
様にして得た完全脱保護したオリゴデオキシ
リボヌクレオチドの均一性（homogeneity）
は、逆相カラムクロマトグラフイーで単一ピ
ークで得られること、T4−ポリヌクレオチ
ドキナーゼを用い〔γ−32P〕ATPで5′−末
端を標識した後、15％ポリアクリルアミドゲ
ル−7M尿素の電気泳動で単一バンドである
ことにより確認した。
処理し、別にp8H225〔Ｃ−１にて作成〕を
EcoR、AatおよびScaで処理した（不要
なpUC8由来の断片をScaで小片とした）。両
反応液を夫々、フエノール処理、クロロホルム
処理し、エタノール沈殿させて得た２種の
DNAをライゲートし、生成したプラスミドで
大腸菌K12 JM83を形質転換した。形質転換体
からプラスミドを抽出し、ウイルス由来DNA
断片の上流部分と下流部分が正しい方向に結合
しているプラスミドを選択した。この組換えプ
ラスミドは各種制限酵素による切断像から、ア
ンピシリン耐性マーカーを有し、多角体遺伝子
の開始コードATGから上流30bp目からさらに
上流に約3kb迄の部分（プロモーターを含む非
翻訳部分）及び同遺伝子の終止コードから下流
約3.1kbの部分（但し、終止コードから下流約
300bpは欠損している）を、元のウイルスと同
じ向きに含有しており、大腸菌系で増殖可能で
ある。これをp89B241とした。同様に、
p9B587、p9B310、p9B276およびp9B585を素
材としてp89B587、p89B310、p89B276および
p86B585を構築した。 Ｅ α−IFN遺伝子の挿入 (i) ヒト・ゲノムのλフアージCharon4A組換
体ライブラリー（Lawn等、Cell15 1157
（1978））より白血球IFN遺伝子を検索し、得
られたα−IFN−Ｊ遺伝子を含むDNAを
HindおよびEcoRで処理し、アガロース
ゲル電気泳動でα−IFN−Ｊ遺伝子を含む断
片を分離し、これをHindおよびEcoRで
処理したpUC9とライゲートした。得られた
プラスミドで大腸菌K12JM83を形質転換さ
せた。このプラスミドを取り出し、Mstお
よびPvuで処理し、α−IFN−Ｊ遺伝子を
含むDNA断片を分離し、その両端にSma
リンカー（宝酒造製）を結合させた。これを
Sma処理し、Ｄ項で得たプラスミド
p89B241のSma切断片とライゲートして組
換えプラスミドを製した。α−IFN−Ｊ遺伝
子が正しい方向に入つている事を確かめ、こ
のプラスミドで大腸菌Ｋ−12 JM83を形質転
換し、増殖させ、多量のプラスミドを製し
た。このプラスミドをpIFN−１−B241とし
た。これは多角体遺伝子の上流部分（約−
3kb目から−30番目まで）に続き、プラスミ
ドp89B241構築の際に使用したリンカー残基
13bpおよび染色体より得られたα−IFN−
Ｊ遺伝子の5′非翻訳領域32bpの次にATGで
始まるα−IFN−Ｊ遺伝子が正しい方向に結
合し、更に多角体遺伝子の下流部分（終止コ
ドンから下流約300番目のbpから約3.1kbpま
で）が結合している。 (ii) α−IFN−Ｊ遺伝子を含む前記のHind、
EcoR切断片をpUC9にライゲートして得
られたプラスミドで大腸菌K12JM83を形質
転換させ、そのプラスミドを取り出し、Hpa
で処理し、α−IFN−Ｊ遺伝子を含む
DNA断片を分離し、別途化学合成したオリ
ゴマー（CGGGCCATC）を32P−ATPおよ
びT4−ポリヌクレオチドキナーゼ（宝酒造
社製）を用いてリン酸化し、別の合成オリゴ
マー（CCGGGATGGCC）とアニーリング
させたものとライゲートさせた。これをアガ
ロースゲル電気泳動により分離抽出し、ふた
たび32P−ATPおよびT4ポリヌクレオチドキ
ナーゼを用いてリン酸化したのちＤ項で得た
プラスミドp89B241のXma切断片とライ
ゲートして組換えプラスミドを製した。α−
IFN−Ｊ遺伝子が正しい方向に入つている事
を確かめ、このプラスミドで大腸菌
K12JM83を形質転換し、増殖させ多量のプ
ラスミドを製し、これをpIFN−２−Ｂ−241
とした。 これは多角体遺伝子の上流部分（約3kb上
流から−30番目のbp）に続き、プラスミド
p89B241構築の際に使用したリンカー残基
13bpおよびATGで始まるα−IFN−Ｊ遺伝
子が正しい方向に結合し、更に多角体遺伝子
の下流部分（終止コドンから下流約300番目
のbpから約3.1kb下流まで）が結合してい
る。 同様にしてp89B587、p89B310、p89B276
およびp89B585を素材としてpIFN−２−
B587、pIFN−２−B310、pIFN−２−B276
およびpIFN−２−B585を構築した。 (iii) リンカーの合成 オリゴデオキシリボヌクレオチド類の化学
合成： H.Itoらの報告〔Nucleic Acids
Research、10 1755（1982）〕に準じて、ポ
リスチレン樹脂を用いた固相法により、オリ
ゴマーを合成した。完全に保護された二官能
性ダイマー（）（約100mg）をｔ−ブチルア
ミン−ピリジン（１：9v／ｖ）溶液により、
対応する3′−燐酸ジエステル（）に変換
し、5′−遊離−ヌクレオシド樹脂（）と縮
合剤メシチレンスルホニル−ニトロトリアゾ
リド（MSNT、100mg）を用いて縮合させ、
未反応の5′−水酸基は無水酢酸−ピリジン
（１：9v／ｖ）溶液によつてアセチル化し、
縮合生成物は２％トリクロル酢酸（TCA）−
塩化メチレンにより脱トリチル化処理し脱ト
リチル体（）を得た（反応式参照：
COCH2CH2CONHCH2C6H4−R5部分は樹脂
部分）。これらの一連の反応を目的とするシ
ークエンスまで繰り返した。得られたオリゴ
マー結合樹脂（約20mg）に0.5Mテトラメチ
ルグアニジン−ピリジン−２−アルドキシム
（ピリジン−水（15：４）中）0.5mlを加えて
37℃、８時間反応させ、次いで濃アンモニア
水で55℃、８時間処理した。溶液を
Sephadex Ｇ−50 fine（2.5×60cm）のカラム
でゲルろ化し、DMTrオリゴマーを得た。
これを高速液体クロマトグラフイー
（HPLC）を用いて、更に精製した。カラム
は逆相カラム（SSC−ODS−272、0.6×20
cm）を用い、溶液Ａ（0.02M−TEAA、PH
7.0）と溶液Ｂ（0.02M TEAA、PH7.0中50％
アセトニトリル）による直線濃度勾配法を用
いてDMTrオリゴマーを精製した。これに
80％酢酸を加え、室温で20分処理し、脱トリ
チル化を行い、更に上述のHPLCによつてオ
リゴマーを得た。目的とするオリゴマー10ｍ
Ｍ Tris−HCl（PH7.5）−１ｍＭ EDTA（PH
8.0）で透析することにより得られた。この
様にして得た完全脱保護したオリゴデオキシ
リボヌクレオチドの均一性（homogeneity）
は、逆相カラムクロマトグラフイーで単一ピ
ークで得られること、T4−ポリヌクレオチ
ドキナーゼを用い〔γ−32P〕ATPで5′−末
端を標識した後、15％ポリアクリルアミドゲ
ル−7M尿素の電気泳動で単一バンドである
ことにより確認した。
【化】
【化】
【化】
【化】
Ｆ Bm細胞へのトランスフエクシヨン
BmNPV T3株のウイルスDNAとpIFN−１
−B241をモル比で１：100になる様にし、下記
組成液とを混合した。 蒸留水 2.1ml キヤリアDNA（鮭精巣、１mg／ml） 50μ BmNPV DNA 10μ pIFN−１−B241 DNA 50μｇ 2M塩化カルシウム液 300μｇ 0.28M塩化ナトリウム含有の50ｍＭ
HEPES緩衝液（PH7.1） 2.5ml リン酸緩衝液（35ｍＭ Na2HPO4−35ｍＭ
NaH2PO4） 50μ 生じた懸濁液の１mlを４mlのBm細胞培養基
に加え、カイコ細胞に上記DNAを導入した。
20時間後、新鮮な培地と交換し、更に５日間培
養後、培地を回収した。遠心して清澄化した上
清をとり、α−IFNの活性検定に用いた。 Ｇ カイコでのα−IFNの発現 ５令１日目のカイコに、Ｆ項記載の５日間培
養後の培地0.5ml／匹（107pfu）を経皮的に注
入し、25℃で５日間、クワ葉を与えて飼育後、
腹脚に採取針をさし、体液を氷冷したエツペン
ドルフ・チユーブに採取し、等量のTC−10培
地を加えて遠心し（10000rpm、５分）、上清を
とりα−IFNの活性検定に用いた。 Ｈ α−IFNのバイオアツセイ (i) 活性測定 C.Philip等の報告（Method in
Enzymology、Vol.78 387〜394（1981））に
準じ、FL細胞（ヒト羊膜由来）、VSV
（vesicular stomatitis virus）を用い、96穴
のマイクロタイター・トレーの中で、NIH
のα−IFN標準品との比較で、50％CPE阻止
法（cytopathic effect inhibition assay）
により測定した。結果を表１に示す。
−B241をモル比で１：100になる様にし、下記
組成液とを混合した。 蒸留水 2.1ml キヤリアDNA（鮭精巣、１mg／ml） 50μ BmNPV DNA 10μ pIFN−１−B241 DNA 50μｇ 2M塩化カルシウム液 300μｇ 0.28M塩化ナトリウム含有の50ｍＭ
HEPES緩衝液（PH7.1） 2.5ml リン酸緩衝液（35ｍＭ Na2HPO4−35ｍＭ
NaH2PO4） 50μ 生じた懸濁液の１mlを４mlのBm細胞培養基
に加え、カイコ細胞に上記DNAを導入した。
20時間後、新鮮な培地と交換し、更に５日間培
養後、培地を回収した。遠心して清澄化した上
清をとり、α−IFNの活性検定に用いた。 Ｇ カイコでのα−IFNの発現 ５令１日目のカイコに、Ｆ項記載の５日間培
養後の培地0.5ml／匹（107pfu）を経皮的に注
入し、25℃で５日間、クワ葉を与えて飼育後、
腹脚に採取針をさし、体液を氷冷したエツペン
ドルフ・チユーブに採取し、等量のTC−10培
地を加えて遠心し（10000rpm、５分）、上清を
とりα−IFNの活性検定に用いた。 Ｈ α−IFNのバイオアツセイ (i) 活性測定 C.Philip等の報告（Method in
Enzymology、Vol.78 387〜394（1981））に
準じ、FL細胞（ヒト羊膜由来）、VSV
（vesicular stomatitis virus）を用い、96穴
のマイクロタイター・トレーの中で、NIH
のα−IFN標準品との比較で、50％CPE阻止
法（cytopathic effect inhibition assay）
により測定した。結果を表１に示す。
【表】
【表】
なお、本発明で用いたBmNPVおよびBm細
胞は微生物工業技術研究所へ寄託申請したが受
託を拒否された。 本発明の実験は、組換えDNA実験指針及び科
学技術庁へ提出した組換えDNA実験計画書に基
づいて実施したものである。
胞は微生物工業技術研究所へ寄託申請したが受
託を拒否された。 本発明の実験は、組換えDNA実験指針及び科
学技術庁へ提出した組換えDNA実験計画書に基
づいて実施したものである。
第１図は組換BmNPV DNA製造に有用はプラ
スミド作用例の概略図である。
スミド作用例の概略図である。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ カイコ核多角体病ウイルス（BmNPV）
DNAの多角体蛋白構造遺伝子の翻訳開始コドン
ATGとその上流約4.5KbpのHindサイト間に存
在するプロモーターを含む5′上流DNA断片
（）、翻訳開始コドン（）、ペプチド、蛋白又
は糖蛋白の生産用構造遺伝子（）および翻訳終
止コドン（）を含み、更にBmNPV DNAの多
角体蛋白構造遺伝子の3′下流DNA断片（）を
含む、二重鎖DNAで組換（recombination）さ
れているBmNPV又はBmNPV DNAを、カイコ
培養細胞中又はカイコ生体中で増殖させることを
特徴とするペプチド、蛋白、又は糖蛋白質の生産
方法。 ２ BmNPV又はBmNPV DNAをカイコ生体中
で増殖させる請求項１記載のペプチド、蛋白、又
は糖蛋白の生産方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59227267A JPS619297A (ja) | 1984-10-29 | 1984-10-29 | ペプチド類の製法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59227267A JPS619297A (ja) | 1984-10-29 | 1984-10-29 | ペプチド類の製法 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59128215A Division JPS619288A (ja) | 1984-06-21 | 1984-06-21 | ペプチド類の製法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS619297A JPS619297A (ja) | 1986-01-16 |
| JPH0573393B2 true JPH0573393B2 (ja) | 1993-10-14 |
Family
ID=16858140
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59227267A Granted JPS619297A (ja) | 1984-10-29 | 1984-10-29 | ペプチド類の製法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS619297A (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2941859B2 (ja) * | 1989-09-20 | 1999-08-30 | 国立予防衛生研究所 | Ｈａ蛋白の製造法 |
| JP5071740B2 (ja) * | 2006-05-19 | 2012-11-14 | 国立大学法人山口大学 | チョウ目昆虫用人工飼料及びその製造方法、チョウ目昆虫及びその製造方法、並びに生体物質 |
-
1984
- 1984-10-29 JP JP59227267A patent/JPS619297A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS619297A (ja) | 1986-01-16 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |