JPH0574345B2 - - Google Patents
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- JPH0574345B2 JPH0574345B2 JP2326113A JP32611390A JPH0574345B2 JP H0574345 B2 JPH0574345 B2 JP H0574345B2 JP 2326113 A JP2326113 A JP 2326113A JP 32611390 A JP32611390 A JP 32611390A JP H0574345 B2 JPH0574345 B2 JP H0574345B2
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Description
〔産業上の利用分野〕
本発明は、テルムス・アクアチクス
（Thermus aquaticus）に由来する熱安定性の
DNAポリメラーゼ誘導体に関する。 本発明のDNAポリメラーゼは、温度循環DNA
ポリメラーゼ連鎖反応によつて既存の特定の核酸
配列から多量の核酸配列を複製するために特に有
用である。 〔従来の技術〕 E.コリ（E.Coli）のような中温微生物からの
DNAポリメラーゼの単離について、広範な研究
が行われてきた。例えば、ベスマン（Bessman）
ら、J.Biol.Chem.（1957年）、233巻、171〜177頁
およびブチン（Buttin）とコルンベルグ
（Kornberg）J.Biol.Chem.（1966年）、241巻、
5419〜5427頁を参照されたい。 これとは対照的に、テルムス・アクアチクス
（Thermus aquaticus）のような好熱菌からの
DNAポリメラーゼの単離と精製については、余
り研究が行なわれていない。カレジン
（Kaledin）ら、Biokhymiya、（1980年）45巻、
644〜651頁は、テルムス・アクアチクス（T.
aquaticus）VT1株の細胞からのDNAポリメラ
ーゼの６段階単離および精製法を開示している。
これらの工程は、粗製抽出物の単離、DEAE−セ
ルロース・クロマトグラフイー、ヒドロキシアパ
タイト上での分別、DEAE−セルロース上での分
別および単一鎖DNA−セルロース上でのクロマ
トグラフイーから成つている。それぞれの段階か
らのプールは、エンド−およびエクソヌクレアー
ゼの混入についてはスクリーニングされていな
い。精製された酵素の分子量は、モノマー単位当
たり62000ダルトンと報告されている。 テルムス・アクアチクス（T.aquaticus）から
のポリメラーゼについての第二の精製法は、エ
イ・チエン（A.Chien）ら、J.Bacteriol.（1976
年）、127巻、1550〜1557頁によつて記載されてい
る。この方法では、粗製の抽出物をDEAE−セフ
アデツクスカラムにかける。透析下プール分画を
次に、ホスホセルロースカラム上での処理に付
す。このプールした分画を透析して、ウシ血清ア
ルブミン（BAS）を加えてポリメラーゼの活性
の損失を防止する。生成する混合物をDNA−セ
ルロースカラムにかける。カラムからのプールし
た物質を透析し、ゲル濾過によつて分析すると分
子量は約63000ダルトンであり、スクロース遠心
分離によれば約68000ダルトンである。 しかしながら、これらの酵素は作用PH範囲、貯
蔵安定性等に問題があり、温度循環連鎖反応によ
る核酸の多量複製・増幅のために用いることはで
きなかつた。 〔発明が解決しようとする課題〕 従つて本発明は、温度循環連鎖反応による核酸
の多量複製のために使用することができる新規な
Ｎ−末端が短縮されたDNAポリメラーゼ誘導体
を提供するものである。 〔課題を解決するための手段〕 前記の課題は、核酸の鋳型鎖に相補的な核酸鎖
を形成するためヌクレオチドトリホスフエートの
結合を触媒するテルムス・アクアチクス
（Thermus aquaticus）由来の熱安定性DNAポ
リメラーゼを提供することにより解決される。 この酵素は、文献に記載されているテルムス・
アクアチクス（Thermus aquaticus）由来の熱
安定酵素のPHよりも広いPH範囲をは胃を有し、PH
７ではPH８における場合の50％より大きな活性を
示す。更に、これらの熱安定酵素は、非イオン性
洗剤を含有する緩衝液中に保存した場合長時間に
亙つて活性を失わずに安定である。 〔具体的な説明〕 本明細書におい用いる用語は次の意味を有す
る。 「細胞」、「細胞系（セルライン）」および「細
胞培養物」は相互交換可能に用いることができ、
これらの名称は総て子孫を包含する。したがつ
て、「形質転換体」または「形質転換された細胞」
とは、一次細胞およびトランスフアーの回数とは
関係なしにその細胞に由来する培養物を包含す
る。また、総ての子孫は、人為的または偶然的突
然変異によりDNA含量が正確には同一ではない
ことがあることも理解される。最初に形質転換さ
れた細胞においてスクリーニングしたのと同じ機
能を有する変異体子孫も包含される。 「制御配列」という用語は、特定の宿主生物に
おける作用可能に連結されたコード配列の発現に
必要なDNA配列を指す。原核生物に好適な制御
配列は、例えばプロモーター、任意にはオペレー
ター配列、リボゾーム結合部位であるが、さらに
その他の余り理解されていない配列も包含するこ
とが可能である。真核細胞は、プロモーター、ポ
リアデニル化シグナルおよびエンハンサーを利用
することが知られている。 「発現系」という用語は、作用可能に連結され
た所望のコード配列および制御配列を含むDNA
配列を指し、これらの配列で形質転換された宿主
はコードされた蛋白質を産生することができる。
形質転換を行うために、発現系をベクターに含有
させてもよいが、これに続き関連のDNAが宿主
染色体に組み込まれてもよい。 本発明書で用いられる「遺伝子」という用語
は、生物活性を有するポリペプチドまたはその前
駆体をコード化するDNA配列を指す。このポリ
ペプチドは、完全な長さの遺伝子配列によりまた
は酵素活性が保持されているかぎりコード配列の
いずれかの部分によつてコードされていてもよ
い。 「作用可能に連結した」という用語は、成分の
正常な機能を行うことができる併置を指す。例え
ば、制御配列に「作用可能に連結した」コード配
列は、このコード配列が制御配列の制御下で発現
スことができる配置を指す。 「非イオン性のポリマー性洗剤」とは、イオン
性電荷を持たず、本発明の目的には、約3.5〜約
9.5のPH範囲、好ましくは４〜8.5のPH範囲で酵素
を安定化することができることを特徴とする界面
活性剤を指す。 本明細書に用いられる「オリゴヌクレオチド」
という用語は、２個以上のデオキシリボヌクレオ
チドまたはリボヌクレオチド、好ましくは３個以
上のものからなる分子として定義される。その正
確な大きさは多くのフアクターによつて異り、こ
れらのフアクターはオリゴヌクレオチドの最終的
な機能または用途によつて異る。オリゴヌクレオ
チドは、合成的にまたはクローニングによつて調
製することができる。 本明細書に用いられる「制限エンドヌクレアー
ゼ」および「制限酵素」という用語は、細菌酵素
であつて、それぞれが特異的ヌクレオチド配列の
またはその付近の二重鎖DNAを切断するものを
指す。 本明細書に用いられる「ヌクレオチド配列の変
化」という用語は、ある種の単一または複数のヌ
クレオチド置換、欠失または挿入を指す。 本明細書に用いられる好ましい熱安定酵素は、
テルムス・アクアチス（Thermus aquaticus）
に由来するDNAポリメラーゼである。その各種
の株も、アメリカン・タイプ・カルチヤ・コレク
シヨン（American Type Citure Collection）
ロツクビル、メリーランド、から入手することが
でき、テイ・デイ・ブラツク（T.D.Brock）、J.
Bact.（1969年）、98巻、289〜297頁、およびテ
イ・オシマ（T.Oshima）、Arch.Microbiol.、
（1978年）、117巻、189〜196頁に記載されている。
これらの好ましい菌株の一つは、YT−１株であ
る。 本発明のDNAポリメラーゼ誘導体に対応する
天然酵素は次の性質を有する。 (1) 作用 本酵素は、鋳型DNAにアニールされたオリ
ゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドの3′−ヒ
ドロキシル基にデオキシボヌクレオシド5′−ト
リホスフエートのα−ホスフエートを共有結合
せしめることにより、デオキシリボ核酸にデオ
キシリボヌクレオシド5′−モノホスフエートを
鋳型依存的に導入する反応を触媒する。 (2) 基質特異性 本酵素はその十分な活性のために部分的に二
本鎖を形成したDNA鋳型及び種類のデオキシ
リボヌクレオシド5′−トリホスフエートを必要
とする。ここで部分的に二本鎖を形成した
DNA鋳型とは、例えば単鎖鋳型DNA分子に遊
離の3′−ヒドロキシル基を有するオリゴヌクレ
オチドプライマーがアニールしている状態を意
味する。単鎖DNAに対しても低い活性を示す
可能性がある。 (3) 最適PH及び安定PH範囲 最適PH範囲は、70℃〜75℃の温度においてPH
8.0〜8.5である。但し、PH7.0においても有意な
活性を有する。本酵素は少なくともPH5.0〜PH
9.4の範囲で比較的安定である。 (4) 作用温度範囲 室温〜85℃の範囲で活性であり、最適温度は
約75℃である。35℃における活性は75℃におけ
る活性の約１％である。 (5) 不活性化 本酵素は97.5℃において少なくとも５分間の
半減期を有する。 (6) 阻害、活性化及び安定化 ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミ
ド、EDTA、ホルムアミド、SDS、高濃度の
尿素、等により阻害される。 (7) 分子量 本発明の分子量を、SDS−ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動により、分子量標準としてホス
ホリダーゼＢ（分子量92000）、ウシ血清アルブ
ミン（分子量66200）、オバルブミン（分子量
45000）、カーボンニツクアンヒドラーゼ（分子
量31000）、大豆トリプシンインヒビター（分子
量21500）及びリゾチーム（分子量14000）を用
いて決定した場合、約86000〜90000ダルトンで
あつた。しかし最近の報告によればホスホリラ
ーゼＢの分子量は約97300ダルトンであるとさ
れており、この分子量に基けば本発明の酵素の
分子量は約94000ダルトンとされる。 なお、本酵素の活性測定法及び力価の定義は実
施例４に記載し、本酵素の精製方法の具体例を実
施例１及び４に記載する。 本発明のDNAポリメラーゼ誘導体は、該酵素
を生産する能力を有する組換宿主微生物を培養
し、この培養物から採取することができる。例え
ば、細胞を増殖させた後、遠心分離によつて回収
する。 細胞の増殖の後、酵素の単離および生成を６段
階で行い、それぞれの段階は室温より低い温度、
好ましくは約４℃で行う。 第一の段階または工程では、細胞が、凍結して
いる場合には、解凍し、超音波で破砕し、PHが約
7.5の緩衝液に懸濁する。 第二の段階では上澄液を集めて、次いで乾燥硫
酸アンモニウムのような塩を加えることによつて
分別する。適当な画分（典型的には、45〜75％飽
和）を集めて、0.2リン酸カリウム緩衝液、好ま
しくはPH6.5の緩衝液に溶解して、同じ緩衝液に
対して透析する。 第三の段階では、核酸及びある種の蛋白質を取
り除く。第二の段階からの画分を、上記と同じ緩
衝液で平衡化したDEAE−セルロースカラムにか
ける。次いで、このカラムを同じ緩衝液で洗浄
し、蛋白質含有画分を溶出し、280nｍで吸収に
よつて測定し、集めて、10mMリン酸カリウム緩
衝液に対して、好ましくは第一の緩衝液でPHを
7.5にしたものと同じ成分を有するもので透析す
る。 第四の段階では、上記のようにして集めた分画
を、第三の段階で透析に用いた緩衝液で平衡にし
たヒドロキシアパタイトカラムにかける。次い
で、このカラムを洗浄し、10mMの２−メチルカ
プトエタノールと５％のグリセリンを含むPH7.5
の0.01M〜0.5Mリン酸カリウム緩衝液の直線グ
ラジエントで酵素を溶出する。プールした熱安定
酵素DNAポリメラーゼ活性を含む画分を、第三
の段階で透析に使用したのと同じ緩衝液で透析す
る。 第五の段階では、透析した画分を、第三の段階
で透析に使用した緩衝液で平衡化したDEAE−セ
ルロースカラムにかける。このカラムを次に洗浄
し、第三の段階で透析に使用した緩衝液中で0.01
〜0.6MのKClのような緩衝液の直線グラジエン
トで、酵素を溶出する。熱安定酵素の活性を有す
る画分を、適当を方法を用いてデオキシリボヌク
レアーゼ（エンド−およびエキソヌクレアーゼ）
の混入について試験する。例えば、エンドヌクレ
アーゼ活性は、過剰のDNAポリメラーゼと共に
インキユベートした後フアージλDNAまたはス
ーパーコイルプラスミドDNAの分子量の変化か
ら、電気泳動によつて測定することができる。同
様に、エキソヌクレアーゼ活性は、数個の部位で
開裂する制限酵素を用いて処理した後、DNAの
分子量の変化から電気泳動によつて測定すること
ができる。 デオキシリボヌクレアーゼ活性を持たないと決
定された画分をプールして、第三の段階で用いた
のと同じ緩衝液で透析する。 第六の段階では、プールした画分を、一定のベ
ツドボリウムを有するホスホセルロースカラムに
入れる。このカラムを洗浄して、PH7.5でリン酸
カリウム緩衝液中0.01〜0.4MのKClのような緩衝
液の直線ゲラジエントで酵素を溶出する。熱安定
なポリメラーゼ活性を有し、デオキシリボヌクレ
アーゼ活性を有しないプールした画分を、PH8.0
の緩衝液で透析する。 透析した生成物の分子量は、蛋白質分子量マー
カーを用いてSDS PAGEによる方法等によつて
決定することができる。 本発明の熱安定酵素は、この酵素をコードする
遺伝子をテルムス・アクアチクス（Thermus
aquatics）ゲノムDNAからクローン化し、組換
えDNA技術によつて製造することもできる。テ
ルムス・アクアチクス（Taq）ポリメラーゼの完
全なコード配列は、約18kb（キロベース）のゲノ
ムDNAインサートフラグメント内に含まれる約
3.5kbのBgl−Asp718（部分）制限フラグメント
を含むバクテリオフアージCH35：Taq＃４−２
から誘導することができる。このバクテリオフア
ージは、1987年５月29日にアメリカン・タイプ・
カルチヤー・コレクシヨン（ATCC）に寄託さ
れ、寄託番号40336号を有する。また、この遺伝
子は、プラスミドpFC83（ATCC第67422号、1987
年５月29日寄託）から単離された約750塩基対
（bp）のBgl−Hind制限フラグメントを、プ
ラスミドpFC85（ATCC第67421号、1987年５月29
日寄託）から単離された約2.8kb Hind−
Asp718制限フラグメントに連結することによつ
て造成することができる。pFC85制限フラグメン
トはTaqポリメラーゼ遺伝子のアミノ末端をコー
ドする部分を有するが、pFC85からの制限フラグ
メントはカルポキシ−末端をコードする部分を有
する。したがつて、これらの２個のフラグメント
を、適当の制限配列を有する対応して消化された
ベクターと連結すると、全長Taqポリメラーゼの
翻訳が得られる。 所望の酵素活性を有する生物学的に活性な遺伝
子生成物を得るためにはTaqポリメラーゼ遺伝子
の全コード配列は必要でないことも見出された。
アミノ末端コード部分が欠失しており、コード配
列の約３分の１が不在であるDNAが、ポリメラ
ーゼ分析において完全に活性な遺伝子生成物を産
生した。 Ｎ−末端の欠失に加えて、Taqポリメラーゼを
構成するペプチド鎖中の個々のアミノ酸残基は、
酸化、還元、またはその他の誘導体化によつて改
変されていてもよく、また蛋白質を開裂して活性
を保持するフラグメントを得ることもできる。活
性を破壊しないかかる変更は、遺伝子の定義から
このような蛋白質をコードするDNA配列を除外
しない。 したがつて、翻訳の間に配列に組み込まれるア
ミノ酸の欠失、付加または変更による一次構造自
体の改変は、蛋白質の活性を破壊することなく行
うことができる。かかる置換またはその他の変更
は、本発明の範囲に属するDNAによつてコード
されたアミノ酸配列わ有する蛋白質をもたらす。 本発明の精製されたポリメラーゼで免疫したウ
サギからのポリクローナル抗血清を用いて、テル
ムス・アクアチクス（Thermus aquaticus）の
部分ゲノム発現ライプラリーをプローブして、下
記のようにして適当なコード配列を得た。クロー
ン化されたゲノム配列は融合ポリペプチドとして
発現させたり、それ自体の制御配列を用いて直接
に発現させたり、または酵素の発現に用いられる
特定の宿主に好適な制御配列を用いる構成によつ
て発現させることができる。 勿論、これらの配列をコードするDNAの入手
可能性は、コドン配列を改変してDNAポリメラ
ーゼ活性をも有するムテイン（mutein）形を得
る機会を提供する。 例えば、これらの手段は、Taq DNAポリメラ
ーゼのための完全なコード配列を提供して、この
コード配列から、各種の宿主系に適用できる発現
ベクターを構成し、そしてコード配列を発現せし
めることができる。さらに、以上のことから、
Taqポリメラーゼコード配列の部分はプローブと
して有用であり、色々な種のその他の熱安定ポリ
メラーゼコード配列を回収するためのプローブと
して有用であることも明らかである。したがつ
て、少なくとも６個のアミノ酸をコードするゲノ
ムDNAの部分をE.コリ（E.coli）において複製
しそしてこれを変性してプローブとして使用し、
あるいは少なくとも６個のアミノ酸をコードする
オリゴヌクレオチド合成し、これらを用いて熱安
定性ポリメラーゼをコードする他のDNAを検索
することができる。テルムス・アクアチクス
（Thermus aquatics）におけるヌクレアーゼ配
列とその他の種類の対応する部分の配列は正確に
は一致しないことがあるので、間違つた陽性を排
除するのに十分なストリジエンシー条件下でハイ
ブリダイゼーシヨンを行うために６個のアミノ酸
ストレツトをコードする約18個のヌクレオチドを
有するオリゴマーが必要であろう。６個のアミノ
をコードする配列は、かかるプローブのために十
分な情報を供給するであろう。 好適な宿主、制御系および方法 一般的に、組換え形のTaqポリメラーゼの製造
は、以下のような工程を含む。 第一に、成熟酵素（この場合、総てのムテイン
を含む意味に用いられる）、あるいはTaqポリメ
ラーゼとその活性を破壊しない追加の配列との融
合体、または制御された条件下で（例えば、ペプ
チダーゼによる処理による）開裂して活性蛋白質
をたらすことができる追加の配列との融合体、を
コード化するDNAを得る。配列がイントロンに
よつて中断されていないときには、それは如何な
る宿主における発現にも好適である。この配列
は、切り出し可能で且つ回収可能な形であるべき
である。 次に、好ましくは、切り出されたまたは回収さ
れたコード配列を、複製可能な発現ベクター中の
好適な制御配列と作用可能に連結する。このベク
ターを用いて、好適な宿主を形質転換し、形質転
換された宿主を好ましい条件下で培養して、組換
えTaqポリメラーゼを産生させる。場合によつて
は、Taqポリメラーゼを培養液または細胞から単
離するが、ある種の不純物が許容される場合に
は、蛋白質の回収および精製は必要でないことも
ある。 上記の段階のそれぞれは、各種の方法で行うこ
とができる。例えば、所望のコード配列をゲノム
フラグメントから得て、適当な宿主に直接用いる
こともできる。各種の宿主で作用可能な発現ベク
ターの造成は、以下のようなレプリコンを用いて
行なわれる。好適な制限部位が通常は利用可能で
ない場合には、これをコード配列の末端に加えて
切り出し可能な遺伝子を得、これらのベクターに
挿入することができる。 制御配列、発現べクターおよび形質転換法は、
遺伝子を発現するのに用いられる宿主細胞の型に
よつて異なる。一般的には、原核細胞、酵母、昆
虫または哺乳類細胞が宿主として現在有用であ
る。原核宿主は、一般的には組換え蛋白質の産生
にとつて最も有効で好都合であり、それ故Taqポ
リメラーゼの発原にとつて好ましい。 Taqポリメラーゼの特定の場合には、組換え条
件下および自然条件下のいずれにおいても、蛋白
質のＮ−末端でかなり欠失が起こり、そして蛋白
質の活性はなお保持されたままであることを示す
証拠が存在する。単離されな天然蛋白質は、蛋白
質分解による分解の結果であり、不完全な遺伝子
の翻訳の結果ではない。しかしながら、プラスミ
ドpFC85の不完全な遺伝子から産生されたムテイ
ンは、DNAポリメラーゼの分析で完全な長さを
有する配列をコードするDNAから産生されたム
テインと同様に、完全に活性である。ある種のＮ
末端が短縮された形は活性であることが有らかで
あるので、用いられる遺伝子構成物またはポリメ
ラーゼの発現も、対応する短縮された形状のコー
ド配列を含むことができる。 制御配列および対応する宿主 原核生物は、最も一般的には、E.コリ（E.
coli）の各種株によつて代表される。しかしなが
ら、バシルス層、例えばバシルス・ズブチリス
（Bacilus subtilis）、各種のシユドモナス
（Psuedomonas）またはその他の菌株のような他
の微生物株を用いることもできる。かかる原核系
では、宿主と適合性の種に由来する複製部位と制
御配列を有するプラスミドベクターが用いられ
る。例えば、E.コリ（E.coli）は、典型的には、
ボリバー（Bolivar）ら、Gene、1977年、２巻、
95頁によるE.コリ（E.coli）種に由来するプラス
ミドであるpBR322の誘導体を用いて形質転換さ
れる。pBR322はアンピシリンおよびテトラサイ
クリン耐性の遺伝子を有し、所望のベクターを造
成する際に保持されまたは破壊される付加的マー
カーを提供する。転写開始を促進し、任意にはオ
ペレーターを有し且つリボゾーム結合部位配列を
有する本明細書記載の一般的に用いられる原核制
御配列には、β−ラクタマーゼ（ペニシリナー
ゼ）およびラクトース（lac）プロモーター系
〔チヤン（Chang）ら、Nature（1977年）198巻、
1056頁〕、トリプトフアン（trp）プロモーター系
〔ゲーデル（Goeddel）ら、Nucleic Acid Res.
（1980年）８巻、4057頁〕、およびλ由来のPLプ
ロモーター〔シマタケ（Shimatake）ら、
Nature（1981年292巻、128頁〕、およびポータブ
ル制御カセツトとして有用なＮ−遺伝子リボゾー
ム結合部位があり、このポータブル制御カセツト
は、NRBE配列の6bp3′内での開裂を可能にする少
なくとも１個の制限部位を有する第三のDNA配
列のNRBS上流に対応する第二のDNA配列に操
作可能に連結したPLプロモーターである第一の
DNA配列を含んで成る。チヤン（Chang）らの
欧州特許出願公開第196864号明細書（1986年10月
８日発行）に記載され、同じ承継人に承継された
ホスフアターゼＡ（phoA）系も有用である。しか
しながら、原核生物に適合性の如何なる利用可能
なプロモーターも用いることができる。 細菌に加えて、酵母のような真核微生物も宿主
として用いることができる。サツカロミセス・セ
レビシアエ（Saccharomyces cerevisiae）の実
験室菌株であるパン酵母が最も多く用いられる
が、その他の多くの菌株も一般的に利用可能であ
る。２ミクロン複製開始点を用いるベクターが示
されているが〔ブローチ、ジエイ、アール
（Broach、Ｊ，R.）、Meth.Enz.（1983年）101巻、
307頁〕、酵母の発現に好適な他のプラスミドベク
ターも知られている〔例えば、スチンクコンブ
（Stinchcomb）ら、Nature（1979年）282巻、39
頁、チエンペ（Tschempe）ら、Gene（1980年）
10巻、157頁およびクラーク（Clarke）ら、
Meth.Enz.（1983年）101巻、300頁を参照された
い〕。酵母ベクターのための制御配列には解糖系
酵素の合成のプロモーターも含まれる〔ヘス
（Hess）ら、J.Adv.Enzyme Reg、（1968年）７
巻、149頁、ホランド（Holland）ら、
Biotechnology（1978年）17巻、4900頁〕。 その他の当業者に知られているプロモーターに
は、３−ホスフオグリセレート・キナーゼ（ヒツ
ツエマン（Hitzeman）ら、J.Biol.Chem.（1980
年）255巻、2073頁）およびその他の解糖系酵素、
例えばグリセルアルデヒド−３−ホスフエート・
デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルベー
ト・デカルボキシラーゼ、ホスホフラクトキナー
ゼ、グルコース−６−ホスフエート・イソメラー
ゼ、３−ホスホグリセレート・ムターゼ、ピルベ
ート・キナーゼ、トリオースホスフエート・イソ
メラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼおよび
グルコキナーゼの遺伝子のプロモーターがある。
増殖条件により制限される追加の利点を有するそ
の他のプロモーターは、アルコールデヒドロゲナ
ーゼ２、イソチトクロームＣ、酸性ホスフアター
ゼ、窒素代謝に関係する分解酵素およびマルトー
スおよびガラクトース利用に関する酵素のプロモ
ーターである〔ホランド（Holland）同上〕。 ターミネーター配列は、コード配列の3′末端に
おいて望ましいであろう。かかるターミネーター
は、酵母由来の遺伝子におけるコード配列に続く
3′非翻訳領域に見出される。例示されるベクター
の多くは、エノラーゼ遺伝子を含有するプラスミ
ドpeno46〔ホランド（Holland、M.J.）ら、J.
Biol.Chem.（1981年）256巻、1385頁〕から、ま
たはYEp13から得られるLEU2遺伝子〔ブローチ
（Broach、J.）ら、Gene（1978年）８巻、121頁〕
から誘導される制御配列を有するが、酵母適合性
プロモーター、複製開始点および他の制御配列を
有する如何なるベクターも好適である。 勿論、多細胞生物に由来する真核宿主細胞培養
物においてポリペプチドをコードする遺伝子を発
現させることも可能である。例えば、Tissue
Culture、アカデミツク・プレス（Academic
Press）、クルツ（Cruz）とパターソン
（Patterson）監修（1973年）を参照されたい。有
用な宿主細胞系には、ネズミミエローマN51、
VEROおよびHela細胞、並びにチヤイニーズハ
ムスター卵巣（CHO）細胞がある。これらの細
胞のための発現ベクターは、通常は、シミアンウ
イルス40（SV40）からの一般的に用いられる前期
および後期プロモーター（フイールス（Fiers）
ら、（1978年）273巻、113頁）、またはポリオー
マ、アデノウイルス２、ウシパピローマウイルス
もしくはトリザルコーマウイルスに由来するよう
なプロモーター、または免疫グロブリンプロモー
ターおよびヒートシヨツクプロモーターのような
哺乳類細胞に適合性のプロモーターおよび制御配
列を有する。BPVをベクターとして用いる哺乳
類系におけるDNA発現系は、米国特許第4419446
号明細書に開示されている。この系の変形は、米
国特許第4601978号明細書に記載されている。哺
乳類細胞系の形質転換の一般的態様は、米国特許
第4399216号明細書に記載されている。「エンハン
サー」領域が、最適な発現において重要であると
思われるが、これらの領域は一般的にはプロモー
ター領域の上流に見出される配列である。所望で
あるならば、複製開始点をウイルス源から得るこ
とができる。しかしながら、真核生物でのDNA
複製では染色体への組み込みが一般的な機構であ
る。 植物細胞も宿主として利用可能であり、植物細
胞に適合する制御配列、例えばノパリン・シンタ
ーゼ・プロモーターおよびポリアデニル化シグナ
ル配列〔デピツカー（Depicker、A.）ら、J.
Mol.Appl.Gen.（1982年）１巻、561頁〕が利用で
きる。 更に、最近では、バクロウイルス・ベクターに
よつて提供される制御系を利用する昆虫細胞を用
いた発現系も報告されている〔ミラー（Miller、
D.W.）ら、Genetic Engineering（1986年）、セト
ロウ（Setlow、J.K.）ら監修、プレナム・パブ
リツシング（Plenum Publishing）、８巻、277〜
297頁〕。これらの系はTaqポリメラーゼの産生に
も有用である。 形質転換 用いる宿主細胞に依存して、形質転換はその細
胞に適当な標準的な技術を用いて行なわれる。塩
化カルシウムを用いるカルシウム処理〔コーヘン
（Cohen、S.N.）、Rroc.Natl.Acad.Sci（USA）
（1972年）69巻、2110頁〕が、原核生物またはそ
の他の実質的な細胞障壁を有する細胞に用いられ
る。アグロバクテリウム・チユメフアシエンス
（Agrobacterium tumefaciens）での感染〔シア
ウ（Shaw、C.H.）ら、Gene（1983年）23巻、315
頁〕が、ある種の植物細胞で用いられる。前記の
ような細胞壁を持たない哺乳類細胞では、グラハ
ム（Graham）とヴアン・デル・エブ（van der
Eb）のリン酸カルシウム沈澱法が好ましい
〔Virology（1978年）52巻、546頁〕。酵母への形
質転換は、ヴアン・ゾリンゲン（Van Solingen、
P.）ら（J.Bact.、1977年、130巻、946頁）およ
びシアオ（Hsiao、C.L.）ら（Proc.Natl.Acad.
Sci（USA）、1979年、76巻、3829頁）の方法によ
つて行なわれる。 λgt11発現ライブラリーの造成 所望の蛋白質をコードするDNA、例えばTaq
ポリメラーゼをコードするDNAをバクテリオフ
アージλgt11を用いて単離する方法は、次の通り
である。ライブラリーは、テルムス・アクアチク
ス（Thermus aquaticus）DNAを完全消化しこ
れをλgt11フアージのEcoRI部位に挿入すること
によつて得られるEcoRI部位を両端に有するAlu
フラグメントから構成され得る〔ヤング
（Young）とデービス（Davis）、Proc.Natl.
Acad.Sci.USA、1983年、80巻、1194〜1198頁〕。
このバクテリオフアージ中のユニークEcoR部
位がβ−ガラクトシダーゼ遺伝子のカルボキシ末
端に位置しているので、適当なフレームおよび方
向で挿入されたDNAは、ラクトースオペロンプ
ロモーター／オペレーターの制御下でβ−ガラク
トシダーゼと融合した蛋白質として発現される。 次に、抗体プラークハイブリダイゼーシヨン法
を用いてゲノム発現ライブラリーをスクリーニン
グする。この方法は「エピトープ選択」と呼ば
れ、このフアージによつてコードされた融合蛋白
質配列に対する抗血清を用いてハイブリツド形成
するプラークを同定するものである。例えば、こ
の組換えフアージのライブラリーを、86000〜
90000ダルトンのTaqポリメラーゼを認識する抗
体を用いて、スクリーニングして、この蛋白質の
抗原決定基をコードするDNAセグメントを有す
るフアージを同定することができる。 約２×105個の組換えフアージを、全ウサギ
Taqポリメラーゼ抗血清を用いてスクリーニング
する。この一次スクリーニングでは、陽性シグナ
ルが検出され、これらのプラークの１種以上が、
免疫前血清と反応せず且つ免疫血清と反応する候
補プラークから精製され、幾分詳細に分析され
る。組換えフアージによつて産生される融合蛋白
質を検査するため、宿主Y1089におけるフアージ
の溶原株を得る。溶原株を誘発し、生成する蛋白
質をゲル電気泳動した後、それぞれの溶原株が他
の溶原株には見られない新たな蛋白質を産生する
のを観察することができ、または重複配列が生じ
ることもある。陽性シグナルを有するフアージを
取り出す。ここに記載する例においては１個の陽
性プラークを取り出して更に同定を行ない、低密
度で再プレートして組換体を純化し、純化したク
ローンをEcoR制限酵素での消化によるサイズ
クラスによつて分析する。次に、単離された
DNA挿入配列からプローブを作り、適当に標識
を行い、そしてこれらのプローブをマニアチス
（Maniatis）ら、Molecular Cloning：Ａ
Laboratory Manual、1982年に記載されている
通常のプラークハイブリダイゼーシヨン又はコロ
ニーハイブリダイゼーシヨン分析法に用いること
ができる。 標識したプローブを用いて、シヤロン
（Charon）35バクテリオフアージ中に構成された
第二のゲノムライブラリーをプローグした〔ウイ
ルヘルマイン（Wilhlmine、A.M.）ら、Gene、
1983年、26巻、171〜179頁〕。このライブラリー
は、テルムス・アクアチクス（Thermus
aquaticus）ゲノムDNAをSau3A部分消化しそし
てサイズ分別したフラグメント（15〜20kb）を
シヤロン35フアージのBamH Ｉ部位にクローン
化することにより作製された。このプローブを用
いて、TaqポリメラーゼをコードするDNAを含
むフアージを単離した。CH35：Taq＃４−２と
命名した生成するフアージの一つは、全遺伝子配
列を有することが判明した。この遺伝子の部分を
コードする部分配列も単離された。 ベクターの造成 所望のコード配列および制御配列を含有する好
適なベクターの造成は、当業界で周知の標準的な
連結および制限酵素技術を用いる。単離したプラ
スミド、DNA配列または合成されたオリゴヌク
レオチドを開裂し、ととのえ、そして再連結して
所望の形状にする。 部位特異的DNA開裂は、当業界で周知の条件
下で好適な（１種以上の）制限酵素を用いて処理
することによつて行ない、その詳細はこれらの市
販の制限酵素の製造業者によつて記載されてい
る。例えば、ニユー・イングランド・バイオラブ
ス（New England Biolabs）、製品カタログを
参照されたい。一般的には、約1μｇのプラスミ
ドまたはDNA配列を、約20μの緩衝溶液中で
１単位の酵素で開裂し、本明細書の実施例では、
典型的には、過剰量の制限酵素を用いてDNA基
質を完全に消化するようにしている。約37℃で約
１〜２時間のインキユベーシヨン時間が有効であ
るが、変更を行なうこともできる。それぞれのイ
ンキユベーシヨンの後に、蛋白質をフエノール／
クロロホルムで抽出して、次いでエーテル抽出を
行なうことによつて除去して、核酸を水性分画か
らエタノール沈澱によつて回収することができ
る。所望ならば、開裂フラグメントのサイズ分離
を、標準的技術を用いるポリアクリルアミドゲル
またはアガロースゲル電気泳動によつて行なうこ
とができる。サイズ分離の一般的説明について
は、Methods in Enzymology、1980年、65巻、
499〜560頁に記載されている。 制限開裂したフラグメントを、50ｍＭのトリ
ス、PH7.6、50ｍＭのNaCl、10ｍＭのMgCl2、10
ｍＭのDTTおよび50〜100μMのdNTPs中で、20
〜25℃で約15〜25分間のインキユベーシヨン時間
を用いて、４種類のデオキシヌクレオチドトリホ
スフエート（dNTP）の存在でE.コリ（E.coli）
DNAポリメラーゼ（クレノウ（Klenow））の
大フラグメントで処理することによつて平滑末端
にすることができる。クレノウフラグメントは
5′接着末端をフイルインするが、４種のdNTPs
が存在していても、突出する3′単一鎖をチユーバ
ツク（chews back）する。所望ならば、接着末
端の性状によつて指定される制限内で唯１種のま
たは選択された複数のdNTPsを供給することに
よつて選択的修復を行なうことができる。クレノ
ウで処理した後、混合物をフエノール／クロロホ
ルムで抽出し、エタノールで沈澱させた。適当な
条件下でS1ヌクレアーゼを用いて処理すると、
単一鎖部分の加水分解が起こる。 合成オリゴヌクレオチドは、マテウチ
（Matteucci）ら（J.Am.Chem.Soc.、1981年、
103巻、3185〜3191頁）のトリエステル法を用い
て、または自動合成法を用いて調製することがで
きる。アニーリングの前のまたは標識のための単
一鎖のキナージングは、50ｍＭのトリス、PH7.6、
10ｍＭのMgCl2、５ｍＭのジチオスレイトール、
１〜２ｍＭのATPの存在下で、1nMの基質に対
して過剰量の、例えば約10単位のポリヌクレオチ
ドキナーゼを用いて行なう。このキナーゼ処理が
プローブの標識するためのものであるときには、
ATPは高比活性のγ−32Pを有する。 連結は、下記の標準的条件及び温度で15〜30μ
の容積で行なう。20ｍＭ Tris−HCl、（PH
7.5）10ｍＭ MgClb2、10ｍＭ DTT、33μｇ／
mlBSA、10ｍＭ〜50ｍＭのNaCl、および（「接
着末端」の連結には）40μMのATP、0.01〜0.02
〔ワイス（Weiss）〕単位のT4 DNAリガーゼ、０
℃；または（「平滑末端」の連結には）１ｍＭの
ATP、0.3〜0.6〔ワイス（Weiss）〕単位のT4
DNAリガーゼ、14℃。分子内「粘着末端」連結
は、通常は33〜100μｇ／mlの総DNA濃度（５〜
100nMの総末端濃度）で行なう。分子間平滑末
端連結（通常は10〜30倍の過剰モルのリンカーを
用いる）は、1μMの総末端濃度で行なう。 「ベクターフラグメント」を用いるベクターの
造成では、ベクターフラグメントを通常は細菌性
アルカリホスフアターゼ（BAP）で処理して
5′ホスフエートを除去して、ベクターの再連結を
防止する。BAT消化は、PH８で、約150ｍＭのト
リス中で、Na+およびMg+2の存在で、ベクター
１mg当たり約１単位のBAPを用いて、60℃で約
１時間行なう。核酸フラグメントを回収するた
め、調製物をフエノール／クロロホルムで抽出
し、エタノール沈澱せしめる。また、好ましくな
いフラグメントを追加的制限酵素消化によつて二
重消化されたベクターでは、連結は防止すること
ができる。 DNA配列の改変 配列の改変を必要とするcDNAまたはゲノム
DNAに由来するベクターの部分については、部
位特異的なプライマー指令変異誘発を用いる。こ
の技術は現在では当業界で標準的であり、所望の
変異を表わす限定されたミスマツチを除いて変異
誘発されるべき単一鎖フアージDNAに相補的な
合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いて行な
われる。要約すれば、フアージに相補的な鎖の合
成を指令するプライマーとして合成オリゴヌクレ
オチドを用い、生成する二本鎖DNAをフアージ
支持性の宿主細菌に形質転換する。形質転換され
た細菌の培養液を上層寒天に塗布しフアージを有
する単一細胞からプラークを形成させる。 理論的には、新たなプラークの50％は変異形を
単一鎖として有するフアージを含み、50％はもと
の配列を有する。プラークをニトロセルロースフ
イルターに移して、正確にマツチするハイブリダ
イゼーシヨンを可能にし且つもとの鎖とのミスマ
ツチがハイブリダイゼーシヨンを防止するのに十
分であるような温度で、キナーゼ処理した合成プ
ライマーで「リフト（lifts）」ハイブリダイゼー
シヨンを行なう。次に、このプローブとハイブリ
ツドを形成するプラークを採取して、培養し、
DNAを回収する。 造成の証明 以下の造成では、プラスミド造成物の正確な連
結を、最初に連結混合物を用いてE.コリ（E.
coli）MM294株または他の適当な宿主を形質転
換することによつて確かめる。当業界で理解され
ているように、好結果の形質転換体を、プラスミ
ド造成の方式に依存してアンピシリン耐性、テト
ラサイクリン耐性またはその他の抗生物質耐性に
よつて選択する。次に、形質転換体からのプラス
ミドを、クレウエル（Clewell.D.B.）ら、（Proc.
Natl.Acad.Sci.USA、1969年、62巻、1159頁）
の方法により、場合によつてはクロラムフエニコ
ール増幅法〔クレウレル（Cleewll，D.B.）、J.
Bacteriol.、1972年、110巻、667頁〕によつて調
製する。単離したDNAを、制限処理により分析
し、そして／又はサンガー（Sanger、F.）ら
（Proc.Natl.Acad.Sci.USA、1977年、74巻、5463
頁）のジデオキシ法であつて更にメツシング
（Messing）ら（Nucleic Acids Res.、1981年、
９巻、309頁）によつて記載されている方法、ま
たはマクサム（Maxam）ら（Methods in
Enzymology、1980年、65巻、499頁）の方法に
よつて配列決定する。 宿主の例 この発明においてクローニング及び発現に用い
られる宿主菌株は、次の通りである。 クローニング及び配列決定、並びにほとんどの
細菌性プロモーターの制御下での造成物の発現に
は、E.コリ（E.coli）ゲネチツク・ストツク・セ
ンターGCSG＃6135から得たE.コリ（E.coli）株
MM294を宿主として用いた。PLNRBSプロモータ
ーの制御下での発現には、E.コリ（E.coli）K12
株MC1000λ溶原株、N7N53c1857SusP80、
ATCC39531を用いることができる。本明細書で
は、1987年４月７日にATCC（ATCC53606）とし
て寄託されているE.コリ（E.coli）DG116を用い
る。 M13フアージ組換体のためには、フアージ感染
を受けやすいE.コリ（E.coli）、例えばE.コリK12
株DG98を用いる。DG98株は1984年７月13日に
ATCC寄託され、寄託番号39768を有する。 哺乳類での発現はCOS−７、COS−A2、CV−
１およびネズミ細菌で行うことができ、そして昆
虫細胞ではスポドプテラ・フルジペイダ
（Spodoptera frugipeida）での発現を基礎とす
る。 酵素活性の安定化 酵素は、長期間安定にするためには、１種又は
複数種の非イオン性ポリマー性界面活性剤を含む
緩衝液中に貯蔵するのが好ましい。この様な界面
活性剤は一般的には分子量が約100〜250000の範
囲であり、好ましくは約4000〜200000ダルトンで
あり、PHが約3.5〜約9.5、好ましくは約４〜8.5で
酵素を安定化するものである。この様な界面活性
剤の例としては、マツク・クチエオン
（McCutcheon）のEmulsifiers＆Detergents、北
アメリカ版（1983年）エムシー・パブリツシン
グ・カンパニー（MC Publishing Co.）のマツ
チ・クチエオン部門発行、175、ロツクロード、
グレンロツク、ニユージヤージー（米国）、の295
〜298頁に記載されているものがあり、その詳細
については上記文献を参照されたい。好ましく
は、界面活性剤はエトキシル化した脂肪族アルコ
ールエーテルおよびラウリルエーテル、エトキシ
ル化したアルキルフエノール、オクチルフエノキ
シポリエトキシエタノール化合物、改質オキシエ
チル化したおよび／またはオキシプロピル化した
直鎖状アルコール、ポリエチレングリコールモノ
オレエート化合物、ポリソルベート化合物および
フエノール性脂肪族アルコールエーテルからなる
群から選択される。更に詳細には、好ましくは、
ポリオキシエチル化(20)ソルビタンモノラウレート
であるツイーン（Tween）20〔ICI・アメリカ
ス・インコーポレーテド（ICI Aemricas Inc.）、
ウイルミントン、DE〕およびエトキシル化アル
キルフエノール（ノニル）であるイコノール
（Iconol）（登録商標）NP−40（バスフ（BASF）
イアンドツド・コーポレーシヨン、パーシパニ
ー、ニユージヤージー）である。 以下の実施例は、単に例示のために提供するも
のであり、発明の範囲および特許請求の範囲を限
定することを意図するものではない。これらの実
施例において、総てのパーセンテージは、特に断
らないかぎり、固体の場合には重量％、液体の場
合には容積％であり、総ての温度は摂氏で表わし
ている。 実施例 １ テレムス・アクアチクス（Thermus
aquaticus）からのポリメラーゼの精製 アメリカン・タイプ・カルチユアー・コレクシ
ヨン、12301パークラウンドライブ、ロツクビル、
MDからATCCNo.25104としてなんら制御なく入
手できるテルムス・アクアチクス（Thermus
aquaticus）VT1株をフラスコ中で、下記の培地
中で増殖せしめた。 クエン酸ナトリウム １ｍＭ リン酸カリウムPH7.9 ５ｍＭ 塩化アンモニウム 10ｍＭ 硫酸マグネシウム 0.2ｍＭ 塩化カルシウム 0.1ｍＭ 塩化ナトリウム １ｇ／ 酵母エキス １ｇ／ トリプトン １ｇ／ グルコース ２ｇ／ 硫酸第一鉄 0.01ｍＭ （オートクレーブ前にPHを8.0に調整） 上記培地中で70℃にて一夜培養したフラスコ種
母を10発酵槽に接種した。種母フラスコからの
合計600mlの種母を10の同じ培地に接種した。
PHを水酸化アンモニウムにより8.0に調節し、溶
存酸素を40％に調節し、温度を70℃に調節し、そ
して撹拌速度を400rpmとした。 細胞の増殖の後、最初の５段階については
Kaledin等、前掲、の方法（わずかに変更を加え
て）を用い、そして第６段階では異なる方法を用
いて精製を行つた。６段階すべてを４℃にて行つ
た。カラムでの分画速度は0.5カラム／時とし、
溶出中のグラジエントの容量は10カラム容量とし
た。これに代る好ましい方法を例６に後記する。 要約すれば、上記培養のT.アクアチクス（T.
aquaticus）細胞を、９時間の培養の後、後期対
数期1.4ｇ乾燥重量／の細胞濃度において、遠
心分離により集菌した。20ｇの細胞を、50ｍ
MTris−HCl（PH7.5）及び0.1ｍＭ EDTAを含む
緩衝液80ml中に懸濁した。細胞を溶解し、そして
溶解物を４℃のローター中で35000rpmにて２時
間遠心した。上清を集め（画分Ａ）、そして硫酸
アンモニウムの45〜75％飽和の間で沈澱する蛋白
質画分を集め、0.2Mリン酸カリウム（PH6.5）、
10ｍＭ ２−メルカプトエタノール及び５％グリ
セリンを含有する緩衝液中に溶解し、そして最後
に同じ緩衝液に対して透析して画分Ｂを得た。 画分Ｂを、上記の緩衝液で平衡化されたDEAE
−セルロースの2.2×30cmカラムに適用した。次
に、このカラムを同じ緩衝液で洗浄し、そして蛋
白質を含有する画分（280ｍＭにおける吸収によ
り決定する）を集めた。一緒にした蛋白質画分
を、0.01Mリン酸カリウム（PH7.5）、10ｍＭ ２
−メルカプトエタノール及び５％ゲリセリンを含
有する第二緩衝液に対して透析して画分Ｃを得
た。 画分Ｃを、第二緩衝液で平衡化されたヒドロキ
シアパタイトの2.6×21cmカラムに適用した。次
に、このカラムを洗浄し、そして10ｍＭ ２−メ
ルカプトエタノール及び５％グリセリンを含有す
る0.01〜0.5Mリン酸カリウム（PH7.5）緩衝液の
直線グラジエントにより酵素を溶出した。DNA
ポリメラーゼ活性を含有する画分（90〜180ｍＭ
リン酸カリウム）を集め、アミコン撹拌セル及び
YM10膜を用いて４倍に濃縮し、そして第二緩衝
液に対して透析して画分Ｄを得た。 画分Ｄを、第二緩衝液で平衡化したDEAE−セ
ルロースの1.6×28cmカラムに適用した。このカ
ラムを洗浄し、そして第二緩衝液中0.01〜0.5M
リン酸カリウムの直線グラジエントによりDNA
ポリメラーゼを溶出した。画分をエンドヌクレア
ーゼ及びエキソヌクレアーゼの汚染について測定
した。これは、過剰のDNAポリメラーゼと共に
インキユベートした後のフアージλDNA又はス
ーパーコイルプラスミドDNAの分子量の変化を
電気泳動により検出することにより（エンドヌク
レアーゼについて）、そしてDNAを幾つかのフラ
グメントに開裂せしめる制限酵素による処理の後
に（エキソヌクレアーゼについて）行つた。最少
のヌクレアーゼ汚染を有するDNAポリメラーゼ
画分（65〜95ｍＭリン酸カリウム）のみをプール
した。このプールにオートクレーブしたゼラチン
を250μｇ／mlの量で添加し、そして第二緩衝液
に対して透析を行つて画分Ｅを得た。 画分Ｅをホスホグルコースカラムに適用し、そ
して20ｍＭリン酸カリウム（PH7.5）中0.01〜
0.4MKClのグラジエント100mlにより溶出した。
画分を上記のようにしてエンドヌクレアーゼ／エ
キソヌクレアーゼの汚染について、そしてさらに
ポリメラーゼ活性について（Kaledin等の方法に
より）測定した。プールした画分を第二緩衝液に
対して透析し、次に50％グリセリン及び第二緩衝
液に対する透析により濃縮した。 ポリメラーゼの分子量をSDS−PAGEにより決
定した。マーカー蛋白質はホスホリダーゼＢ
（92000）、ウシ血清アルブミン（66200）、オバル
ブミン（45000）、カーボンニツクアンヒドラーゼ
（31000）、大豆トリプシンインヒビター（21500）、
及びリゾチーム（14400）であつた。 予備的データは、文献（例えばKaledin等）に
報告されている62000〜63000ダルトンではなく、
約86000〜90000ダルトンであつた。 このポリメラーゼを、25ｍＭ Tris−HCl（PH
6.4及びPH8.0）、0.1M KCl、10ｍＭ MgCl2、１
ｍＭ ２−メルカプトエタノール、10nmoleずつ
のdGTP、dATP及びTTP、及び0.5μCi（ 3H）
dCTP、8μｇの“活性化されたウシ”胸腺DNA
並びに0.5−５ユニツトのポリメラーゼを含有す
る混合物50μ中でインキユベートした。“活性
化された”DNAは、DNAの５％が酸−溶解性画
分に移るまでDNase により消化して部分加
水分解した後のDNAの天然調製物である。この
反応は70℃にて30分間行い、そして0.125M
EDTA−Na2を含有するリン酸ナトリウムの飽和
水溶液約50μの添加により停止せしめた。サン
プルをKaledin等、前掲に記載されているように
して処理しそして活性を測定した。 この結果は、ポリメラーゼはPH6.4においてPH
8.0における活性の半分より活性であることを示
した。これに対して、Kaledin等は、酸素はPH約
7.0において、PH8.3における活性の８％を有する
ことを見出した。従つて、本発明の熱安定酵素の
PHプロフイールはKaledin等の酵素のそれよりも
広い。 最後に、DNAポリメラーゼ測定反応混合物か
ら１種類のみ又は複数種類のヌクレオチドトリホ
スフエートを除去した場合、本発明の酵素を用い
て活性がほとんど観察されず、活性は予測値と一
致しており、そして酵素は高い忠実性を示した。
これに対して、Kaledin等、前掲、を用いて観察
された活性は予測値と一致しておらず、そしてヌ
クレオチドトリホスフエートの間違つた導入が示
唆される。 実施例 ２ 遺伝子の検索 Ａ Taqポリメラーゼ遺伝子のためのDNA配列
プローブの同定 Taq pol遺伝子のための特異的DNA配列プ
ローブを、λgt11発現ライブラリーの免疫的ス
クリーニングにより得た。T.アクアチクスの
DNAをAluにより完全消化し、EcoR 12
−マーリンカー（CCGGAATTCCGG、ニユ
ーイングランドバイオラブス）と連結し、
EcoRで消化し、そしてEcoR−消化され脱
リン酸化されたλgt11 DNA（プロゲマ・バイ
オテク）と連結した。連結されたDNAをパツ
ケージし（ジガパツクプラス、ストラテジー
ン）、そしてE.コリＫ−12株Y1090（R.Youngよ
り入手）にトランスフエクトした。 ２×105プラークの最初のライブラリーを、
精製されたTaqポリメラーゼ（実施例１及び実
施例４を参照のこと）に対するラビツトポリク
ローナル抗血清の１：2000希釈物を用いてスク
リーニングした〔Young、R.A.及びR.W.
Davis（1983）Science、222：778−782〕。候補
プラークを限界希釈で再プレートし、そして均
一になるまで（約３サイクル）再スクリーニン
グした。免疫前血清と反応せずそして免疫血清
と反応する候補プラークからフアージを精製し
た。 候補フアージを用い2E.コリＹ−12株Y1089
（R.Young）溶原化した。溶原菌を、Taqポリ
メラーゼ抗血清と反応するIPTG誘導性融合蛋
白質（β−ガラクトシダーゼより大）の産生に
ついてスクリーニングした。固相のサイズ分画
された融合蛋白質を用いて、全ポリクローナル
抗体からエピトープ特異的抗体をアフイニテイ
ーを精製した〔Goldstein、L.S.B.等（1986）J.
Cell.Biol.102：2076−2087〕。 今度は、“つり上げられた”エピトープ−選
択された抗体をウエスタン分析において用い
て、Taqポリメラーゼに特異的なDNA配列を
コードしているλgt11フアージ候補を同定し
た。λgt：１と称する１つのλgt11フアージ候
補が、全ラビツトポリクローナルTaqポリメラ
ーゼ抗血清からの精製されたTaqポリメラーゼ
及びTaqポリメラーゼを含有する粗抽出画分の
両者と特異的に反応する抗体を、特異的に選択
した。このフアージλgt：１を使用してさらに
検討した。 テルムス・アクアチクスDNAの約115bpの
EcoR−適合Alu断片をラベルし
（Maniatis等、前掲）て、Taqポリメラーゼ特
異的プローブを形成した。このプローブをサザ
ン分析において、及びT.アクアチクスDNAラ
ンダムゲノムライブラリーをスクリーニングす
るために用いた。 Ｂ テルムス・アクアチクス−ランダムゲノムラ
イブラリーの造成及びスクリーニング λフアージシヤロン35（Wilhelmine、A.M.
等、前掲）をその接着末端を介してアニールし
そして連結し、BamHにより完全消化し、
そしてアニールされたアームをスタフアー
（stuffer）フラグメントから、酢酸カルシウム
密度勾配超遠心（Maniatis等、前掲）により
精製した。T.アクアチクスのDNAをSau3Aで
部分分解し、そして15〜20kbサイズの画分を
シユークロース密度勾配超遠心により精製し
た。標的DNAフラグメント及びベクターDNA
フラグメントを１：１のモル比で連結すること
によりランダムゲノムライブラリーを造成し
た。DNAをパツケージし、そしてE.コリＫ−
12株LE392又はK802にトランスフエクトした。
99％以上の組換体を含有する20000以上の最初
のフアージのライブラリーをE.コリＫ−12株
LE392上で増幅した。 λgt11：１の放射性ラベルされたEcoR挿
入部によりCH35Taqゲノムフアージライブラ
リーをスクリーニングした（マニアチス等、前
掲）。特異的にハイブリダイズする候補フアー
ジプラークを精製し、そしてさらに分析した。
CH35：：４−２と称する１つのフアージが、
Hindにより消化の後に４個以上のT.アクア
チクスDNAフラグメントを放出した（約8.0、
4.5、0.8、0.58kb）。 ４種類のHindT.アクアチクスDNAフラグ
メントを、Hindで消化したプラスミド
BSM13+（3.2kb、ベクタークローニングシステ
ム、サンジエゴ）に連結し、そしてそれぞれE.
コリＫ−12株DG98を形質転換してクローン化
した。 CH35：：４−２からの約8.0kbのHind
DNAフラグメントをプラスミドpFC82
（11.2kb）中に単離し、他方CH35：：４−２か
らの4.5kb Hind DNAフラグメントをプラ
スミドpFC83（7.7kb）中に単離した。 pFC82を含有するE.コリDG98株は熱安定性
高温DNAポリメラーゼ活性を含有することが
示された（第１表）。さらに、この細胞は、免
疫的にTaq DNAポリメラーゼと関連する新た
な約60kdの分子量のポリペプチドを合成した。 8.0kb Hind DNAフラゲメントのTaqポ
リメラーゼコード領域をさらに処理し、8.0kb
Hindフラゲメントの2.8kbのHind−
Asp718部分をlas−プロモーターの近位に位置
付けた。この領域をサブクローニングしてプラ
スミドpFC85（6.0kb）を得た。IPTGと共にイ
ンキユベートした後、プラスミドpFC85を含有
するE.コリDG98細胞は、もとの親クローン
（pFC82／DG98）に比べて100倍までの熱安定
性Taqポリメラーゼ関連活性を合成する（第１
表）。pFC85を含有する細胞は有意量の熱安定
DNAポリメラーゼ活性を合成するが、Taq
pol DNA配列の一部分のみが翻訳され、約
60kbのTaqポリメラーゼ関連ポリペプチドの
蓄積が起こる。
（Thermus aquaticus）に由来する熱安定性の
DNAポリメラーゼ誘導体に関する。 本発明のDNAポリメラーゼは、温度循環DNA
ポリメラーゼ連鎖反応によつて既存の特定の核酸
配列から多量の核酸配列を複製するために特に有
用である。 〔従来の技術〕 E.コリ（E.Coli）のような中温微生物からの
DNAポリメラーゼの単離について、広範な研究
が行われてきた。例えば、ベスマン（Bessman）
ら、J.Biol.Chem.（1957年）、233巻、171〜177頁
およびブチン（Buttin）とコルンベルグ
（Kornberg）J.Biol.Chem.（1966年）、241巻、
5419〜5427頁を参照されたい。 これとは対照的に、テルムス・アクアチクス
（Thermus aquaticus）のような好熱菌からの
DNAポリメラーゼの単離と精製については、余
り研究が行なわれていない。カレジン
（Kaledin）ら、Biokhymiya、（1980年）45巻、
644〜651頁は、テルムス・アクアチクス（T.
aquaticus）VT1株の細胞からのDNAポリメラ
ーゼの６段階単離および精製法を開示している。
これらの工程は、粗製抽出物の単離、DEAE−セ
ルロース・クロマトグラフイー、ヒドロキシアパ
タイト上での分別、DEAE−セルロース上での分
別および単一鎖DNA−セルロース上でのクロマ
トグラフイーから成つている。それぞれの段階か
らのプールは、エンド−およびエクソヌクレアー
ゼの混入についてはスクリーニングされていな
い。精製された酵素の分子量は、モノマー単位当
たり62000ダルトンと報告されている。 テルムス・アクアチクス（T.aquaticus）から
のポリメラーゼについての第二の精製法は、エ
イ・チエン（A.Chien）ら、J.Bacteriol.（1976
年）、127巻、1550〜1557頁によつて記載されてい
る。この方法では、粗製の抽出物をDEAE−セフ
アデツクスカラムにかける。透析下プール分画を
次に、ホスホセルロースカラム上での処理に付
す。このプールした分画を透析して、ウシ血清ア
ルブミン（BAS）を加えてポリメラーゼの活性
の損失を防止する。生成する混合物をDNA−セ
ルロースカラムにかける。カラムからのプールし
た物質を透析し、ゲル濾過によつて分析すると分
子量は約63000ダルトンであり、スクロース遠心
分離によれば約68000ダルトンである。 しかしながら、これらの酵素は作用PH範囲、貯
蔵安定性等に問題があり、温度循環連鎖反応によ
る核酸の多量複製・増幅のために用いることはで
きなかつた。 〔発明が解決しようとする課題〕 従つて本発明は、温度循環連鎖反応による核酸
の多量複製のために使用することができる新規な
Ｎ−末端が短縮されたDNAポリメラーゼ誘導体
を提供するものである。 〔課題を解決するための手段〕 前記の課題は、核酸の鋳型鎖に相補的な核酸鎖
を形成するためヌクレオチドトリホスフエートの
結合を触媒するテルムス・アクアチクス
（Thermus aquaticus）由来の熱安定性DNAポ
リメラーゼを提供することにより解決される。 この酵素は、文献に記載されているテルムス・
アクアチクス（Thermus aquaticus）由来の熱
安定酵素のPHよりも広いPH範囲をは胃を有し、PH
７ではPH８における場合の50％より大きな活性を
示す。更に、これらの熱安定酵素は、非イオン性
洗剤を含有する緩衝液中に保存した場合長時間に
亙つて活性を失わずに安定である。 〔具体的な説明〕 本明細書におい用いる用語は次の意味を有す
る。 「細胞」、「細胞系（セルライン）」および「細
胞培養物」は相互交換可能に用いることができ、
これらの名称は総て子孫を包含する。したがつ
て、「形質転換体」または「形質転換された細胞」
とは、一次細胞およびトランスフアーの回数とは
関係なしにその細胞に由来する培養物を包含す
る。また、総ての子孫は、人為的または偶然的突
然変異によりDNA含量が正確には同一ではない
ことがあることも理解される。最初に形質転換さ
れた細胞においてスクリーニングしたのと同じ機
能を有する変異体子孫も包含される。 「制御配列」という用語は、特定の宿主生物に
おける作用可能に連結されたコード配列の発現に
必要なDNA配列を指す。原核生物に好適な制御
配列は、例えばプロモーター、任意にはオペレー
ター配列、リボゾーム結合部位であるが、さらに
その他の余り理解されていない配列も包含するこ
とが可能である。真核細胞は、プロモーター、ポ
リアデニル化シグナルおよびエンハンサーを利用
することが知られている。 「発現系」という用語は、作用可能に連結され
た所望のコード配列および制御配列を含むDNA
配列を指し、これらの配列で形質転換された宿主
はコードされた蛋白質を産生することができる。
形質転換を行うために、発現系をベクターに含有
させてもよいが、これに続き関連のDNAが宿主
染色体に組み込まれてもよい。 本発明書で用いられる「遺伝子」という用語
は、生物活性を有するポリペプチドまたはその前
駆体をコード化するDNA配列を指す。このポリ
ペプチドは、完全な長さの遺伝子配列によりまた
は酵素活性が保持されているかぎりコード配列の
いずれかの部分によつてコードされていてもよ
い。 「作用可能に連結した」という用語は、成分の
正常な機能を行うことができる併置を指す。例え
ば、制御配列に「作用可能に連結した」コード配
列は、このコード配列が制御配列の制御下で発現
スことができる配置を指す。 「非イオン性のポリマー性洗剤」とは、イオン
性電荷を持たず、本発明の目的には、約3.5〜約
9.5のPH範囲、好ましくは４〜8.5のPH範囲で酵素
を安定化することができることを特徴とする界面
活性剤を指す。 本明細書に用いられる「オリゴヌクレオチド」
という用語は、２個以上のデオキシリボヌクレオ
チドまたはリボヌクレオチド、好ましくは３個以
上のものからなる分子として定義される。その正
確な大きさは多くのフアクターによつて異り、こ
れらのフアクターはオリゴヌクレオチドの最終的
な機能または用途によつて異る。オリゴヌクレオ
チドは、合成的にまたはクローニングによつて調
製することができる。 本明細書に用いられる「制限エンドヌクレアー
ゼ」および「制限酵素」という用語は、細菌酵素
であつて、それぞれが特異的ヌクレオチド配列の
またはその付近の二重鎖DNAを切断するものを
指す。 本明細書に用いられる「ヌクレオチド配列の変
化」という用語は、ある種の単一または複数のヌ
クレオチド置換、欠失または挿入を指す。 本明細書に用いられる好ましい熱安定酵素は、
テルムス・アクアチス（Thermus aquaticus）
に由来するDNAポリメラーゼである。その各種
の株も、アメリカン・タイプ・カルチヤ・コレク
シヨン（American Type Citure Collection）
ロツクビル、メリーランド、から入手することが
でき、テイ・デイ・ブラツク（T.D.Brock）、J.
Bact.（1969年）、98巻、289〜297頁、およびテ
イ・オシマ（T.Oshima）、Arch.Microbiol.、
（1978年）、117巻、189〜196頁に記載されている。
これらの好ましい菌株の一つは、YT−１株であ
る。 本発明のDNAポリメラーゼ誘導体に対応する
天然酵素は次の性質を有する。 (1) 作用 本酵素は、鋳型DNAにアニールされたオリ
ゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドの3′−ヒ
ドロキシル基にデオキシボヌクレオシド5′−ト
リホスフエートのα−ホスフエートを共有結合
せしめることにより、デオキシリボ核酸にデオ
キシリボヌクレオシド5′−モノホスフエートを
鋳型依存的に導入する反応を触媒する。 (2) 基質特異性 本酵素はその十分な活性のために部分的に二
本鎖を形成したDNA鋳型及び種類のデオキシ
リボヌクレオシド5′−トリホスフエートを必要
とする。ここで部分的に二本鎖を形成した
DNA鋳型とは、例えば単鎖鋳型DNA分子に遊
離の3′−ヒドロキシル基を有するオリゴヌクレ
オチドプライマーがアニールしている状態を意
味する。単鎖DNAに対しても低い活性を示す
可能性がある。 (3) 最適PH及び安定PH範囲 最適PH範囲は、70℃〜75℃の温度においてPH
8.0〜8.5である。但し、PH7.0においても有意な
活性を有する。本酵素は少なくともPH5.0〜PH
9.4の範囲で比較的安定である。 (4) 作用温度範囲 室温〜85℃の範囲で活性であり、最適温度は
約75℃である。35℃における活性は75℃におけ
る活性の約１％である。 (5) 不活性化 本酵素は97.5℃において少なくとも５分間の
半減期を有する。 (6) 阻害、活性化及び安定化 ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミ
ド、EDTA、ホルムアミド、SDS、高濃度の
尿素、等により阻害される。 (7) 分子量 本発明の分子量を、SDS−ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動により、分子量標準としてホス
ホリダーゼＢ（分子量92000）、ウシ血清アルブ
ミン（分子量66200）、オバルブミン（分子量
45000）、カーボンニツクアンヒドラーゼ（分子
量31000）、大豆トリプシンインヒビター（分子
量21500）及びリゾチーム（分子量14000）を用
いて決定した場合、約86000〜90000ダルトンで
あつた。しかし最近の報告によればホスホリラ
ーゼＢの分子量は約97300ダルトンであるとさ
れており、この分子量に基けば本発明の酵素の
分子量は約94000ダルトンとされる。 なお、本酵素の活性測定法及び力価の定義は実
施例４に記載し、本酵素の精製方法の具体例を実
施例１及び４に記載する。 本発明のDNAポリメラーゼ誘導体は、該酵素
を生産する能力を有する組換宿主微生物を培養
し、この培養物から採取することができる。例え
ば、細胞を増殖させた後、遠心分離によつて回収
する。 細胞の増殖の後、酵素の単離および生成を６段
階で行い、それぞれの段階は室温より低い温度、
好ましくは約４℃で行う。 第一の段階または工程では、細胞が、凍結して
いる場合には、解凍し、超音波で破砕し、PHが約
7.5の緩衝液に懸濁する。 第二の段階では上澄液を集めて、次いで乾燥硫
酸アンモニウムのような塩を加えることによつて
分別する。適当な画分（典型的には、45〜75％飽
和）を集めて、0.2リン酸カリウム緩衝液、好ま
しくはPH6.5の緩衝液に溶解して、同じ緩衝液に
対して透析する。 第三の段階では、核酸及びある種の蛋白質を取
り除く。第二の段階からの画分を、上記と同じ緩
衝液で平衡化したDEAE−セルロースカラムにか
ける。次いで、このカラムを同じ緩衝液で洗浄
し、蛋白質含有画分を溶出し、280nｍで吸収に
よつて測定し、集めて、10mMリン酸カリウム緩
衝液に対して、好ましくは第一の緩衝液でPHを
7.5にしたものと同じ成分を有するもので透析す
る。 第四の段階では、上記のようにして集めた分画
を、第三の段階で透析に用いた緩衝液で平衡にし
たヒドロキシアパタイトカラムにかける。次い
で、このカラムを洗浄し、10mMの２−メチルカ
プトエタノールと５％のグリセリンを含むPH7.5
の0.01M〜0.5Mリン酸カリウム緩衝液の直線グ
ラジエントで酵素を溶出する。プールした熱安定
酵素DNAポリメラーゼ活性を含む画分を、第三
の段階で透析に使用したのと同じ緩衝液で透析す
る。 第五の段階では、透析した画分を、第三の段階
で透析に使用した緩衝液で平衡化したDEAE−セ
ルロースカラムにかける。このカラムを次に洗浄
し、第三の段階で透析に使用した緩衝液中で0.01
〜0.6MのKClのような緩衝液の直線グラジエン
トで、酵素を溶出する。熱安定酵素の活性を有す
る画分を、適当を方法を用いてデオキシリボヌク
レアーゼ（エンド−およびエキソヌクレアーゼ）
の混入について試験する。例えば、エンドヌクレ
アーゼ活性は、過剰のDNAポリメラーゼと共に
インキユベートした後フアージλDNAまたはス
ーパーコイルプラスミドDNAの分子量の変化か
ら、電気泳動によつて測定することができる。同
様に、エキソヌクレアーゼ活性は、数個の部位で
開裂する制限酵素を用いて処理した後、DNAの
分子量の変化から電気泳動によつて測定すること
ができる。 デオキシリボヌクレアーゼ活性を持たないと決
定された画分をプールして、第三の段階で用いた
のと同じ緩衝液で透析する。 第六の段階では、プールした画分を、一定のベ
ツドボリウムを有するホスホセルロースカラムに
入れる。このカラムを洗浄して、PH7.5でリン酸
カリウム緩衝液中0.01〜0.4MのKClのような緩衝
液の直線ゲラジエントで酵素を溶出する。熱安定
なポリメラーゼ活性を有し、デオキシリボヌクレ
アーゼ活性を有しないプールした画分を、PH8.0
の緩衝液で透析する。 透析した生成物の分子量は、蛋白質分子量マー
カーを用いてSDS PAGEによる方法等によつて
決定することができる。 本発明の熱安定酵素は、この酵素をコードする
遺伝子をテルムス・アクアチクス（Thermus
aquatics）ゲノムDNAからクローン化し、組換
えDNA技術によつて製造することもできる。テ
ルムス・アクアチクス（Taq）ポリメラーゼの完
全なコード配列は、約18kb（キロベース）のゲノ
ムDNAインサートフラグメント内に含まれる約
3.5kbのBgl−Asp718（部分）制限フラグメント
を含むバクテリオフアージCH35：Taq＃４−２
から誘導することができる。このバクテリオフア
ージは、1987年５月29日にアメリカン・タイプ・
カルチヤー・コレクシヨン（ATCC）に寄託さ
れ、寄託番号40336号を有する。また、この遺伝
子は、プラスミドpFC83（ATCC第67422号、1987
年５月29日寄託）から単離された約750塩基対
（bp）のBgl−Hind制限フラグメントを、プ
ラスミドpFC85（ATCC第67421号、1987年５月29
日寄託）から単離された約2.8kb Hind−
Asp718制限フラグメントに連結することによつ
て造成することができる。pFC85制限フラグメン
トはTaqポリメラーゼ遺伝子のアミノ末端をコー
ドする部分を有するが、pFC85からの制限フラグ
メントはカルポキシ−末端をコードする部分を有
する。したがつて、これらの２個のフラグメント
を、適当の制限配列を有する対応して消化された
ベクターと連結すると、全長Taqポリメラーゼの
翻訳が得られる。 所望の酵素活性を有する生物学的に活性な遺伝
子生成物を得るためにはTaqポリメラーゼ遺伝子
の全コード配列は必要でないことも見出された。
アミノ末端コード部分が欠失しており、コード配
列の約３分の１が不在であるDNAが、ポリメラ
ーゼ分析において完全に活性な遺伝子生成物を産
生した。 Ｎ−末端の欠失に加えて、Taqポリメラーゼを
構成するペプチド鎖中の個々のアミノ酸残基は、
酸化、還元、またはその他の誘導体化によつて改
変されていてもよく、また蛋白質を開裂して活性
を保持するフラグメントを得ることもできる。活
性を破壊しないかかる変更は、遺伝子の定義から
このような蛋白質をコードするDNA配列を除外
しない。 したがつて、翻訳の間に配列に組み込まれるア
ミノ酸の欠失、付加または変更による一次構造自
体の改変は、蛋白質の活性を破壊することなく行
うことができる。かかる置換またはその他の変更
は、本発明の範囲に属するDNAによつてコード
されたアミノ酸配列わ有する蛋白質をもたらす。 本発明の精製されたポリメラーゼで免疫したウ
サギからのポリクローナル抗血清を用いて、テル
ムス・アクアチクス（Thermus aquaticus）の
部分ゲノム発現ライプラリーをプローブして、下
記のようにして適当なコード配列を得た。クロー
ン化されたゲノム配列は融合ポリペプチドとして
発現させたり、それ自体の制御配列を用いて直接
に発現させたり、または酵素の発現に用いられる
特定の宿主に好適な制御配列を用いる構成によつ
て発現させることができる。 勿論、これらの配列をコードするDNAの入手
可能性は、コドン配列を改変してDNAポリメラ
ーゼ活性をも有するムテイン（mutein）形を得
る機会を提供する。 例えば、これらの手段は、Taq DNAポリメラ
ーゼのための完全なコード配列を提供して、この
コード配列から、各種の宿主系に適用できる発現
ベクターを構成し、そしてコード配列を発現せし
めることができる。さらに、以上のことから、
Taqポリメラーゼコード配列の部分はプローブと
して有用であり、色々な種のその他の熱安定ポリ
メラーゼコード配列を回収するためのプローブと
して有用であることも明らかである。したがつ
て、少なくとも６個のアミノ酸をコードするゲノ
ムDNAの部分をE.コリ（E.coli）において複製
しそしてこれを変性してプローブとして使用し、
あるいは少なくとも６個のアミノ酸をコードする
オリゴヌクレオチド合成し、これらを用いて熱安
定性ポリメラーゼをコードする他のDNAを検索
することができる。テルムス・アクアチクス
（Thermus aquatics）におけるヌクレアーゼ配
列とその他の種類の対応する部分の配列は正確に
は一致しないことがあるので、間違つた陽性を排
除するのに十分なストリジエンシー条件下でハイ
ブリダイゼーシヨンを行うために６個のアミノ酸
ストレツトをコードする約18個のヌクレオチドを
有するオリゴマーが必要であろう。６個のアミノ
をコードする配列は、かかるプローブのために十
分な情報を供給するであろう。 好適な宿主、制御系および方法 一般的に、組換え形のTaqポリメラーゼの製造
は、以下のような工程を含む。 第一に、成熟酵素（この場合、総てのムテイン
を含む意味に用いられる）、あるいはTaqポリメ
ラーゼとその活性を破壊しない追加の配列との融
合体、または制御された条件下で（例えば、ペプ
チダーゼによる処理による）開裂して活性蛋白質
をたらすことができる追加の配列との融合体、を
コード化するDNAを得る。配列がイントロンに
よつて中断されていないときには、それは如何な
る宿主における発現にも好適である。この配列
は、切り出し可能で且つ回収可能な形であるべき
である。 次に、好ましくは、切り出されたまたは回収さ
れたコード配列を、複製可能な発現ベクター中の
好適な制御配列と作用可能に連結する。このベク
ターを用いて、好適な宿主を形質転換し、形質転
換された宿主を好ましい条件下で培養して、組換
えTaqポリメラーゼを産生させる。場合によつて
は、Taqポリメラーゼを培養液または細胞から単
離するが、ある種の不純物が許容される場合に
は、蛋白質の回収および精製は必要でないことも
ある。 上記の段階のそれぞれは、各種の方法で行うこ
とができる。例えば、所望のコード配列をゲノム
フラグメントから得て、適当な宿主に直接用いる
こともできる。各種の宿主で作用可能な発現ベク
ターの造成は、以下のようなレプリコンを用いて
行なわれる。好適な制限部位が通常は利用可能で
ない場合には、これをコード配列の末端に加えて
切り出し可能な遺伝子を得、これらのベクターに
挿入することができる。 制御配列、発現べクターおよび形質転換法は、
遺伝子を発現するのに用いられる宿主細胞の型に
よつて異なる。一般的には、原核細胞、酵母、昆
虫または哺乳類細胞が宿主として現在有用であ
る。原核宿主は、一般的には組換え蛋白質の産生
にとつて最も有効で好都合であり、それ故Taqポ
リメラーゼの発原にとつて好ましい。 Taqポリメラーゼの特定の場合には、組換え条
件下および自然条件下のいずれにおいても、蛋白
質のＮ−末端でかなり欠失が起こり、そして蛋白
質の活性はなお保持されたままであることを示す
証拠が存在する。単離されな天然蛋白質は、蛋白
質分解による分解の結果であり、不完全な遺伝子
の翻訳の結果ではない。しかしながら、プラスミ
ドpFC85の不完全な遺伝子から産生されたムテイ
ンは、DNAポリメラーゼの分析で完全な長さを
有する配列をコードするDNAから産生されたム
テインと同様に、完全に活性である。ある種のＮ
末端が短縮された形は活性であることが有らかで
あるので、用いられる遺伝子構成物またはポリメ
ラーゼの発現も、対応する短縮された形状のコー
ド配列を含むことができる。 制御配列および対応する宿主 原核生物は、最も一般的には、E.コリ（E.
coli）の各種株によつて代表される。しかしなが
ら、バシルス層、例えばバシルス・ズブチリス
（Bacilus subtilis）、各種のシユドモナス
（Psuedomonas）またはその他の菌株のような他
の微生物株を用いることもできる。かかる原核系
では、宿主と適合性の種に由来する複製部位と制
御配列を有するプラスミドベクターが用いられ
る。例えば、E.コリ（E.coli）は、典型的には、
ボリバー（Bolivar）ら、Gene、1977年、２巻、
95頁によるE.コリ（E.coli）種に由来するプラス
ミドであるpBR322の誘導体を用いて形質転換さ
れる。pBR322はアンピシリンおよびテトラサイ
クリン耐性の遺伝子を有し、所望のベクターを造
成する際に保持されまたは破壊される付加的マー
カーを提供する。転写開始を促進し、任意にはオ
ペレーターを有し且つリボゾーム結合部位配列を
有する本明細書記載の一般的に用いられる原核制
御配列には、β−ラクタマーゼ（ペニシリナー
ゼ）およびラクトース（lac）プロモーター系
〔チヤン（Chang）ら、Nature（1977年）198巻、
1056頁〕、トリプトフアン（trp）プロモーター系
〔ゲーデル（Goeddel）ら、Nucleic Acid Res.
（1980年）８巻、4057頁〕、およびλ由来のPLプ
ロモーター〔シマタケ（Shimatake）ら、
Nature（1981年292巻、128頁〕、およびポータブ
ル制御カセツトとして有用なＮ−遺伝子リボゾー
ム結合部位があり、このポータブル制御カセツト
は、NRBE配列の6bp3′内での開裂を可能にする少
なくとも１個の制限部位を有する第三のDNA配
列のNRBS上流に対応する第二のDNA配列に操
作可能に連結したPLプロモーターである第一の
DNA配列を含んで成る。チヤン（Chang）らの
欧州特許出願公開第196864号明細書（1986年10月
８日発行）に記載され、同じ承継人に承継された
ホスフアターゼＡ（phoA）系も有用である。しか
しながら、原核生物に適合性の如何なる利用可能
なプロモーターも用いることができる。 細菌に加えて、酵母のような真核微生物も宿主
として用いることができる。サツカロミセス・セ
レビシアエ（Saccharomyces cerevisiae）の実
験室菌株であるパン酵母が最も多く用いられる
が、その他の多くの菌株も一般的に利用可能であ
る。２ミクロン複製開始点を用いるベクターが示
されているが〔ブローチ、ジエイ、アール
（Broach、Ｊ，R.）、Meth.Enz.（1983年）101巻、
307頁〕、酵母の発現に好適な他のプラスミドベク
ターも知られている〔例えば、スチンクコンブ
（Stinchcomb）ら、Nature（1979年）282巻、39
頁、チエンペ（Tschempe）ら、Gene（1980年）
10巻、157頁およびクラーク（Clarke）ら、
Meth.Enz.（1983年）101巻、300頁を参照された
い〕。酵母ベクターのための制御配列には解糖系
酵素の合成のプロモーターも含まれる〔ヘス
（Hess）ら、J.Adv.Enzyme Reg、（1968年）７
巻、149頁、ホランド（Holland）ら、
Biotechnology（1978年）17巻、4900頁〕。 その他の当業者に知られているプロモーターに
は、３−ホスフオグリセレート・キナーゼ（ヒツ
ツエマン（Hitzeman）ら、J.Biol.Chem.（1980
年）255巻、2073頁）およびその他の解糖系酵素、
例えばグリセルアルデヒド−３−ホスフエート・
デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルベー
ト・デカルボキシラーゼ、ホスホフラクトキナー
ゼ、グルコース−６−ホスフエート・イソメラー
ゼ、３−ホスホグリセレート・ムターゼ、ピルベ
ート・キナーゼ、トリオースホスフエート・イソ
メラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼおよび
グルコキナーゼの遺伝子のプロモーターがある。
増殖条件により制限される追加の利点を有するそ
の他のプロモーターは、アルコールデヒドロゲナ
ーゼ２、イソチトクロームＣ、酸性ホスフアター
ゼ、窒素代謝に関係する分解酵素およびマルトー
スおよびガラクトース利用に関する酵素のプロモ
ーターである〔ホランド（Holland）同上〕。 ターミネーター配列は、コード配列の3′末端に
おいて望ましいであろう。かかるターミネーター
は、酵母由来の遺伝子におけるコード配列に続く
3′非翻訳領域に見出される。例示されるベクター
の多くは、エノラーゼ遺伝子を含有するプラスミ
ドpeno46〔ホランド（Holland、M.J.）ら、J.
Biol.Chem.（1981年）256巻、1385頁〕から、ま
たはYEp13から得られるLEU2遺伝子〔ブローチ
（Broach、J.）ら、Gene（1978年）８巻、121頁〕
から誘導される制御配列を有するが、酵母適合性
プロモーター、複製開始点および他の制御配列を
有する如何なるベクターも好適である。 勿論、多細胞生物に由来する真核宿主細胞培養
物においてポリペプチドをコードする遺伝子を発
現させることも可能である。例えば、Tissue
Culture、アカデミツク・プレス（Academic
Press）、クルツ（Cruz）とパターソン
（Patterson）監修（1973年）を参照されたい。有
用な宿主細胞系には、ネズミミエローマN51、
VEROおよびHela細胞、並びにチヤイニーズハ
ムスター卵巣（CHO）細胞がある。これらの細
胞のための発現ベクターは、通常は、シミアンウ
イルス40（SV40）からの一般的に用いられる前期
および後期プロモーター（フイールス（Fiers）
ら、（1978年）273巻、113頁）、またはポリオー
マ、アデノウイルス２、ウシパピローマウイルス
もしくはトリザルコーマウイルスに由来するよう
なプロモーター、または免疫グロブリンプロモー
ターおよびヒートシヨツクプロモーターのような
哺乳類細胞に適合性のプロモーターおよび制御配
列を有する。BPVをベクターとして用いる哺乳
類系におけるDNA発現系は、米国特許第4419446
号明細書に開示されている。この系の変形は、米
国特許第4601978号明細書に記載されている。哺
乳類細胞系の形質転換の一般的態様は、米国特許
第4399216号明細書に記載されている。「エンハン
サー」領域が、最適な発現において重要であると
思われるが、これらの領域は一般的にはプロモー
ター領域の上流に見出される配列である。所望で
あるならば、複製開始点をウイルス源から得るこ
とができる。しかしながら、真核生物でのDNA
複製では染色体への組み込みが一般的な機構であ
る。 植物細胞も宿主として利用可能であり、植物細
胞に適合する制御配列、例えばノパリン・シンタ
ーゼ・プロモーターおよびポリアデニル化シグナ
ル配列〔デピツカー（Depicker、A.）ら、J.
Mol.Appl.Gen.（1982年）１巻、561頁〕が利用で
きる。 更に、最近では、バクロウイルス・ベクターに
よつて提供される制御系を利用する昆虫細胞を用
いた発現系も報告されている〔ミラー（Miller、
D.W.）ら、Genetic Engineering（1986年）、セト
ロウ（Setlow、J.K.）ら監修、プレナム・パブ
リツシング（Plenum Publishing）、８巻、277〜
297頁〕。これらの系はTaqポリメラーゼの産生に
も有用である。 形質転換 用いる宿主細胞に依存して、形質転換はその細
胞に適当な標準的な技術を用いて行なわれる。塩
化カルシウムを用いるカルシウム処理〔コーヘン
（Cohen、S.N.）、Rroc.Natl.Acad.Sci（USA）
（1972年）69巻、2110頁〕が、原核生物またはそ
の他の実質的な細胞障壁を有する細胞に用いられ
る。アグロバクテリウム・チユメフアシエンス
（Agrobacterium tumefaciens）での感染〔シア
ウ（Shaw、C.H.）ら、Gene（1983年）23巻、315
頁〕が、ある種の植物細胞で用いられる。前記の
ような細胞壁を持たない哺乳類細胞では、グラハ
ム（Graham）とヴアン・デル・エブ（van der
Eb）のリン酸カルシウム沈澱法が好ましい
〔Virology（1978年）52巻、546頁〕。酵母への形
質転換は、ヴアン・ゾリンゲン（Van Solingen、
P.）ら（J.Bact.、1977年、130巻、946頁）およ
びシアオ（Hsiao、C.L.）ら（Proc.Natl.Acad.
Sci（USA）、1979年、76巻、3829頁）の方法によ
つて行なわれる。 λgt11発現ライブラリーの造成 所望の蛋白質をコードするDNA、例えばTaq
ポリメラーゼをコードするDNAをバクテリオフ
アージλgt11を用いて単離する方法は、次の通り
である。ライブラリーは、テルムス・アクアチク
ス（Thermus aquaticus）DNAを完全消化しこ
れをλgt11フアージのEcoRI部位に挿入すること
によつて得られるEcoRI部位を両端に有するAlu
フラグメントから構成され得る〔ヤング
（Young）とデービス（Davis）、Proc.Natl.
Acad.Sci.USA、1983年、80巻、1194〜1198頁〕。
このバクテリオフアージ中のユニークEcoR部
位がβ−ガラクトシダーゼ遺伝子のカルボキシ末
端に位置しているので、適当なフレームおよび方
向で挿入されたDNAは、ラクトースオペロンプ
ロモーター／オペレーターの制御下でβ−ガラク
トシダーゼと融合した蛋白質として発現される。 次に、抗体プラークハイブリダイゼーシヨン法
を用いてゲノム発現ライブラリーをスクリーニン
グする。この方法は「エピトープ選択」と呼ば
れ、このフアージによつてコードされた融合蛋白
質配列に対する抗血清を用いてハイブリツド形成
するプラークを同定するものである。例えば、こ
の組換えフアージのライブラリーを、86000〜
90000ダルトンのTaqポリメラーゼを認識する抗
体を用いて、スクリーニングして、この蛋白質の
抗原決定基をコードするDNAセグメントを有す
るフアージを同定することができる。 約２×105個の組換えフアージを、全ウサギ
Taqポリメラーゼ抗血清を用いてスクリーニング
する。この一次スクリーニングでは、陽性シグナ
ルが検出され、これらのプラークの１種以上が、
免疫前血清と反応せず且つ免疫血清と反応する候
補プラークから精製され、幾分詳細に分析され
る。組換えフアージによつて産生される融合蛋白
質を検査するため、宿主Y1089におけるフアージ
の溶原株を得る。溶原株を誘発し、生成する蛋白
質をゲル電気泳動した後、それぞれの溶原株が他
の溶原株には見られない新たな蛋白質を産生する
のを観察することができ、または重複配列が生じ
ることもある。陽性シグナルを有するフアージを
取り出す。ここに記載する例においては１個の陽
性プラークを取り出して更に同定を行ない、低密
度で再プレートして組換体を純化し、純化したク
ローンをEcoR制限酵素での消化によるサイズ
クラスによつて分析する。次に、単離された
DNA挿入配列からプローブを作り、適当に標識
を行い、そしてこれらのプローブをマニアチス
（Maniatis）ら、Molecular Cloning：Ａ
Laboratory Manual、1982年に記載されている
通常のプラークハイブリダイゼーシヨン又はコロ
ニーハイブリダイゼーシヨン分析法に用いること
ができる。 標識したプローブを用いて、シヤロン
（Charon）35バクテリオフアージ中に構成された
第二のゲノムライブラリーをプローグした〔ウイ
ルヘルマイン（Wilhlmine、A.M.）ら、Gene、
1983年、26巻、171〜179頁〕。このライブラリー
は、テルムス・アクアチクス（Thermus
aquaticus）ゲノムDNAをSau3A部分消化しそし
てサイズ分別したフラグメント（15〜20kb）を
シヤロン35フアージのBamH Ｉ部位にクローン
化することにより作製された。このプローブを用
いて、TaqポリメラーゼをコードするDNAを含
むフアージを単離した。CH35：Taq＃４−２と
命名した生成するフアージの一つは、全遺伝子配
列を有することが判明した。この遺伝子の部分を
コードする部分配列も単離された。 ベクターの造成 所望のコード配列および制御配列を含有する好
適なベクターの造成は、当業界で周知の標準的な
連結および制限酵素技術を用いる。単離したプラ
スミド、DNA配列または合成されたオリゴヌク
レオチドを開裂し、ととのえ、そして再連結して
所望の形状にする。 部位特異的DNA開裂は、当業界で周知の条件
下で好適な（１種以上の）制限酵素を用いて処理
することによつて行ない、その詳細はこれらの市
販の制限酵素の製造業者によつて記載されてい
る。例えば、ニユー・イングランド・バイオラブ
ス（New England Biolabs）、製品カタログを
参照されたい。一般的には、約1μｇのプラスミ
ドまたはDNA配列を、約20μの緩衝溶液中で
１単位の酵素で開裂し、本明細書の実施例では、
典型的には、過剰量の制限酵素を用いてDNA基
質を完全に消化するようにしている。約37℃で約
１〜２時間のインキユベーシヨン時間が有効であ
るが、変更を行なうこともできる。それぞれのイ
ンキユベーシヨンの後に、蛋白質をフエノール／
クロロホルムで抽出して、次いでエーテル抽出を
行なうことによつて除去して、核酸を水性分画か
らエタノール沈澱によつて回収することができ
る。所望ならば、開裂フラグメントのサイズ分離
を、標準的技術を用いるポリアクリルアミドゲル
またはアガロースゲル電気泳動によつて行なうこ
とができる。サイズ分離の一般的説明について
は、Methods in Enzymology、1980年、65巻、
499〜560頁に記載されている。 制限開裂したフラグメントを、50ｍＭのトリ
ス、PH7.6、50ｍＭのNaCl、10ｍＭのMgCl2、10
ｍＭのDTTおよび50〜100μMのdNTPs中で、20
〜25℃で約15〜25分間のインキユベーシヨン時間
を用いて、４種類のデオキシヌクレオチドトリホ
スフエート（dNTP）の存在でE.コリ（E.coli）
DNAポリメラーゼ（クレノウ（Klenow））の
大フラグメントで処理することによつて平滑末端
にすることができる。クレノウフラグメントは
5′接着末端をフイルインするが、４種のdNTPs
が存在していても、突出する3′単一鎖をチユーバ
ツク（chews back）する。所望ならば、接着末
端の性状によつて指定される制限内で唯１種のま
たは選択された複数のdNTPsを供給することに
よつて選択的修復を行なうことができる。クレノ
ウで処理した後、混合物をフエノール／クロロホ
ルムで抽出し、エタノールで沈澱させた。適当な
条件下でS1ヌクレアーゼを用いて処理すると、
単一鎖部分の加水分解が起こる。 合成オリゴヌクレオチドは、マテウチ
（Matteucci）ら（J.Am.Chem.Soc.、1981年、
103巻、3185〜3191頁）のトリエステル法を用い
て、または自動合成法を用いて調製することがで
きる。アニーリングの前のまたは標識のための単
一鎖のキナージングは、50ｍＭのトリス、PH7.6、
10ｍＭのMgCl2、５ｍＭのジチオスレイトール、
１〜２ｍＭのATPの存在下で、1nMの基質に対
して過剰量の、例えば約10単位のポリヌクレオチ
ドキナーゼを用いて行なう。このキナーゼ処理が
プローブの標識するためのものであるときには、
ATPは高比活性のγ−32Pを有する。 連結は、下記の標準的条件及び温度で15〜30μ
の容積で行なう。20ｍＭ Tris−HCl、（PH
7.5）10ｍＭ MgClb2、10ｍＭ DTT、33μｇ／
mlBSA、10ｍＭ〜50ｍＭのNaCl、および（「接
着末端」の連結には）40μMのATP、0.01〜0.02
〔ワイス（Weiss）〕単位のT4 DNAリガーゼ、０
℃；または（「平滑末端」の連結には）１ｍＭの
ATP、0.3〜0.6〔ワイス（Weiss）〕単位のT4
DNAリガーゼ、14℃。分子内「粘着末端」連結
は、通常は33〜100μｇ／mlの総DNA濃度（５〜
100nMの総末端濃度）で行なう。分子間平滑末
端連結（通常は10〜30倍の過剰モルのリンカーを
用いる）は、1μMの総末端濃度で行なう。 「ベクターフラグメント」を用いるベクターの
造成では、ベクターフラグメントを通常は細菌性
アルカリホスフアターゼ（BAP）で処理して
5′ホスフエートを除去して、ベクターの再連結を
防止する。BAT消化は、PH８で、約150ｍＭのト
リス中で、Na+およびMg+2の存在で、ベクター
１mg当たり約１単位のBAPを用いて、60℃で約
１時間行なう。核酸フラグメントを回収するた
め、調製物をフエノール／クロロホルムで抽出
し、エタノール沈澱せしめる。また、好ましくな
いフラグメントを追加的制限酵素消化によつて二
重消化されたベクターでは、連結は防止すること
ができる。 DNA配列の改変 配列の改変を必要とするcDNAまたはゲノム
DNAに由来するベクターの部分については、部
位特異的なプライマー指令変異誘発を用いる。こ
の技術は現在では当業界で標準的であり、所望の
変異を表わす限定されたミスマツチを除いて変異
誘発されるべき単一鎖フアージDNAに相補的な
合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いて行な
われる。要約すれば、フアージに相補的な鎖の合
成を指令するプライマーとして合成オリゴヌクレ
オチドを用い、生成する二本鎖DNAをフアージ
支持性の宿主細菌に形質転換する。形質転換され
た細菌の培養液を上層寒天に塗布しフアージを有
する単一細胞からプラークを形成させる。 理論的には、新たなプラークの50％は変異形を
単一鎖として有するフアージを含み、50％はもと
の配列を有する。プラークをニトロセルロースフ
イルターに移して、正確にマツチするハイブリダ
イゼーシヨンを可能にし且つもとの鎖とのミスマ
ツチがハイブリダイゼーシヨンを防止するのに十
分であるような温度で、キナーゼ処理した合成プ
ライマーで「リフト（lifts）」ハイブリダイゼー
シヨンを行なう。次に、このプローブとハイブリ
ツドを形成するプラークを採取して、培養し、
DNAを回収する。 造成の証明 以下の造成では、プラスミド造成物の正確な連
結を、最初に連結混合物を用いてE.コリ（E.
coli）MM294株または他の適当な宿主を形質転
換することによつて確かめる。当業界で理解され
ているように、好結果の形質転換体を、プラスミ
ド造成の方式に依存してアンピシリン耐性、テト
ラサイクリン耐性またはその他の抗生物質耐性に
よつて選択する。次に、形質転換体からのプラス
ミドを、クレウエル（Clewell.D.B.）ら、（Proc.
Natl.Acad.Sci.USA、1969年、62巻、1159頁）
の方法により、場合によつてはクロラムフエニコ
ール増幅法〔クレウレル（Cleewll，D.B.）、J.
Bacteriol.、1972年、110巻、667頁〕によつて調
製する。単離したDNAを、制限処理により分析
し、そして／又はサンガー（Sanger、F.）ら
（Proc.Natl.Acad.Sci.USA、1977年、74巻、5463
頁）のジデオキシ法であつて更にメツシング
（Messing）ら（Nucleic Acids Res.、1981年、
９巻、309頁）によつて記載されている方法、ま
たはマクサム（Maxam）ら（Methods in
Enzymology、1980年、65巻、499頁）の方法に
よつて配列決定する。 宿主の例 この発明においてクローニング及び発現に用い
られる宿主菌株は、次の通りである。 クローニング及び配列決定、並びにほとんどの
細菌性プロモーターの制御下での造成物の発現に
は、E.コリ（E.coli）ゲネチツク・ストツク・セ
ンターGCSG＃6135から得たE.コリ（E.coli）株
MM294を宿主として用いた。PLNRBSプロモータ
ーの制御下での発現には、E.コリ（E.coli）K12
株MC1000λ溶原株、N7N53c1857SusP80、
ATCC39531を用いることができる。本明細書で
は、1987年４月７日にATCC（ATCC53606）とし
て寄託されているE.コリ（E.coli）DG116を用い
る。 M13フアージ組換体のためには、フアージ感染
を受けやすいE.コリ（E.coli）、例えばE.コリK12
株DG98を用いる。DG98株は1984年７月13日に
ATCC寄託され、寄託番号39768を有する。 哺乳類での発現はCOS−７、COS−A2、CV−
１およびネズミ細菌で行うことができ、そして昆
虫細胞ではスポドプテラ・フルジペイダ
（Spodoptera frugipeida）での発現を基礎とす
る。 酵素活性の安定化 酵素は、長期間安定にするためには、１種又は
複数種の非イオン性ポリマー性界面活性剤を含む
緩衝液中に貯蔵するのが好ましい。この様な界面
活性剤は一般的には分子量が約100〜250000の範
囲であり、好ましくは約4000〜200000ダルトンで
あり、PHが約3.5〜約9.5、好ましくは約４〜8.5で
酵素を安定化するものである。この様な界面活性
剤の例としては、マツク・クチエオン
（McCutcheon）のEmulsifiers＆Detergents、北
アメリカ版（1983年）エムシー・パブリツシン
グ・カンパニー（MC Publishing Co.）のマツ
チ・クチエオン部門発行、175、ロツクロード、
グレンロツク、ニユージヤージー（米国）、の295
〜298頁に記載されているものがあり、その詳細
については上記文献を参照されたい。好ましく
は、界面活性剤はエトキシル化した脂肪族アルコ
ールエーテルおよびラウリルエーテル、エトキシ
ル化したアルキルフエノール、オクチルフエノキ
シポリエトキシエタノール化合物、改質オキシエ
チル化したおよび／またはオキシプロピル化した
直鎖状アルコール、ポリエチレングリコールモノ
オレエート化合物、ポリソルベート化合物および
フエノール性脂肪族アルコールエーテルからなる
群から選択される。更に詳細には、好ましくは、
ポリオキシエチル化(20)ソルビタンモノラウレート
であるツイーン（Tween）20〔ICI・アメリカ
ス・インコーポレーテド（ICI Aemricas Inc.）、
ウイルミントン、DE〕およびエトキシル化アル
キルフエノール（ノニル）であるイコノール
（Iconol）（登録商標）NP−40（バスフ（BASF）
イアンドツド・コーポレーシヨン、パーシパニ
ー、ニユージヤージー）である。 以下の実施例は、単に例示のために提供するも
のであり、発明の範囲および特許請求の範囲を限
定することを意図するものではない。これらの実
施例において、総てのパーセンテージは、特に断
らないかぎり、固体の場合には重量％、液体の場
合には容積％であり、総ての温度は摂氏で表わし
ている。 実施例 １ テレムス・アクアチクス（Thermus
aquaticus）からのポリメラーゼの精製 アメリカン・タイプ・カルチユアー・コレクシ
ヨン、12301パークラウンドライブ、ロツクビル、
MDからATCCNo.25104としてなんら制御なく入
手できるテルムス・アクアチクス（Thermus
aquaticus）VT1株をフラスコ中で、下記の培地
中で増殖せしめた。 クエン酸ナトリウム １ｍＭ リン酸カリウムPH7.9 ５ｍＭ 塩化アンモニウム 10ｍＭ 硫酸マグネシウム 0.2ｍＭ 塩化カルシウム 0.1ｍＭ 塩化ナトリウム １ｇ／ 酵母エキス １ｇ／ トリプトン １ｇ／ グルコース ２ｇ／ 硫酸第一鉄 0.01ｍＭ （オートクレーブ前にPHを8.0に調整） 上記培地中で70℃にて一夜培養したフラスコ種
母を10発酵槽に接種した。種母フラスコからの
合計600mlの種母を10の同じ培地に接種した。
PHを水酸化アンモニウムにより8.0に調節し、溶
存酸素を40％に調節し、温度を70℃に調節し、そ
して撹拌速度を400rpmとした。 細胞の増殖の後、最初の５段階については
Kaledin等、前掲、の方法（わずかに変更を加え
て）を用い、そして第６段階では異なる方法を用
いて精製を行つた。６段階すべてを４℃にて行つ
た。カラムでの分画速度は0.5カラム／時とし、
溶出中のグラジエントの容量は10カラム容量とし
た。これに代る好ましい方法を例６に後記する。 要約すれば、上記培養のT.アクアチクス（T.
aquaticus）細胞を、９時間の培養の後、後期対
数期1.4ｇ乾燥重量／の細胞濃度において、遠
心分離により集菌した。20ｇの細胞を、50ｍ
MTris−HCl（PH7.5）及び0.1ｍＭ EDTAを含む
緩衝液80ml中に懸濁した。細胞を溶解し、そして
溶解物を４℃のローター中で35000rpmにて２時
間遠心した。上清を集め（画分Ａ）、そして硫酸
アンモニウムの45〜75％飽和の間で沈澱する蛋白
質画分を集め、0.2Mリン酸カリウム（PH6.5）、
10ｍＭ ２−メルカプトエタノール及び５％グリ
セリンを含有する緩衝液中に溶解し、そして最後
に同じ緩衝液に対して透析して画分Ｂを得た。 画分Ｂを、上記の緩衝液で平衡化されたDEAE
−セルロースの2.2×30cmカラムに適用した。次
に、このカラムを同じ緩衝液で洗浄し、そして蛋
白質を含有する画分（280ｍＭにおける吸収によ
り決定する）を集めた。一緒にした蛋白質画分
を、0.01Mリン酸カリウム（PH7.5）、10ｍＭ ２
−メルカプトエタノール及び５％ゲリセリンを含
有する第二緩衝液に対して透析して画分Ｃを得
た。 画分Ｃを、第二緩衝液で平衡化されたヒドロキ
シアパタイトの2.6×21cmカラムに適用した。次
に、このカラムを洗浄し、そして10ｍＭ ２−メ
ルカプトエタノール及び５％グリセリンを含有す
る0.01〜0.5Mリン酸カリウム（PH7.5）緩衝液の
直線グラジエントにより酵素を溶出した。DNA
ポリメラーゼ活性を含有する画分（90〜180ｍＭ
リン酸カリウム）を集め、アミコン撹拌セル及び
YM10膜を用いて４倍に濃縮し、そして第二緩衝
液に対して透析して画分Ｄを得た。 画分Ｄを、第二緩衝液で平衡化したDEAE−セ
ルロースの1.6×28cmカラムに適用した。このカ
ラムを洗浄し、そして第二緩衝液中0.01〜0.5M
リン酸カリウムの直線グラジエントによりDNA
ポリメラーゼを溶出した。画分をエンドヌクレア
ーゼ及びエキソヌクレアーゼの汚染について測定
した。これは、過剰のDNAポリメラーゼと共に
インキユベートした後のフアージλDNA又はス
ーパーコイルプラスミドDNAの分子量の変化を
電気泳動により検出することにより（エンドヌク
レアーゼについて）、そしてDNAを幾つかのフラ
グメントに開裂せしめる制限酵素による処理の後
に（エキソヌクレアーゼについて）行つた。最少
のヌクレアーゼ汚染を有するDNAポリメラーゼ
画分（65〜95ｍＭリン酸カリウム）のみをプール
した。このプールにオートクレーブしたゼラチン
を250μｇ／mlの量で添加し、そして第二緩衝液
に対して透析を行つて画分Ｅを得た。 画分Ｅをホスホグルコースカラムに適用し、そ
して20ｍＭリン酸カリウム（PH7.5）中0.01〜
0.4MKClのグラジエント100mlにより溶出した。
画分を上記のようにしてエンドヌクレアーゼ／エ
キソヌクレアーゼの汚染について、そしてさらに
ポリメラーゼ活性について（Kaledin等の方法に
より）測定した。プールした画分を第二緩衝液に
対して透析し、次に50％グリセリン及び第二緩衝
液に対する透析により濃縮した。 ポリメラーゼの分子量をSDS−PAGEにより決
定した。マーカー蛋白質はホスホリダーゼＢ
（92000）、ウシ血清アルブミン（66200）、オバル
ブミン（45000）、カーボンニツクアンヒドラーゼ
（31000）、大豆トリプシンインヒビター（21500）、
及びリゾチーム（14400）であつた。 予備的データは、文献（例えばKaledin等）に
報告されている62000〜63000ダルトンではなく、
約86000〜90000ダルトンであつた。 このポリメラーゼを、25ｍＭ Tris−HCl（PH
6.4及びPH8.0）、0.1M KCl、10ｍＭ MgCl2、１
ｍＭ ２−メルカプトエタノール、10nmoleずつ
のdGTP、dATP及びTTP、及び0.5μCi（ 3H）
dCTP、8μｇの“活性化されたウシ”胸腺DNA
並びに0.5−５ユニツトのポリメラーゼを含有す
る混合物50μ中でインキユベートした。“活性
化された”DNAは、DNAの５％が酸−溶解性画
分に移るまでDNase により消化して部分加
水分解した後のDNAの天然調製物である。この
反応は70℃にて30分間行い、そして0.125M
EDTA−Na2を含有するリン酸ナトリウムの飽和
水溶液約50μの添加により停止せしめた。サン
プルをKaledin等、前掲に記載されているように
して処理しそして活性を測定した。 この結果は、ポリメラーゼはPH6.4においてPH
8.0における活性の半分より活性であることを示
した。これに対して、Kaledin等は、酸素はPH約
7.0において、PH8.3における活性の８％を有する
ことを見出した。従つて、本発明の熱安定酵素の
PHプロフイールはKaledin等の酵素のそれよりも
広い。 最後に、DNAポリメラーゼ測定反応混合物か
ら１種類のみ又は複数種類のヌクレオチドトリホ
スフエートを除去した場合、本発明の酵素を用い
て活性がほとんど観察されず、活性は予測値と一
致しており、そして酵素は高い忠実性を示した。
これに対して、Kaledin等、前掲、を用いて観察
された活性は予測値と一致しておらず、そしてヌ
クレオチドトリホスフエートの間違つた導入が示
唆される。 実施例 ２ 遺伝子の検索 Ａ Taqポリメラーゼ遺伝子のためのDNA配列
プローブの同定 Taq pol遺伝子のための特異的DNA配列プ
ローブを、λgt11発現ライブラリーの免疫的ス
クリーニングにより得た。T.アクアチクスの
DNAをAluにより完全消化し、EcoR 12
−マーリンカー（CCGGAATTCCGG、ニユ
ーイングランドバイオラブス）と連結し、
EcoRで消化し、そしてEcoR−消化され脱
リン酸化されたλgt11 DNA（プロゲマ・バイ
オテク）と連結した。連結されたDNAをパツ
ケージし（ジガパツクプラス、ストラテジー
ン）、そしてE.コリＫ−12株Y1090（R.Youngよ
り入手）にトランスフエクトした。 ２×105プラークの最初のライブラリーを、
精製されたTaqポリメラーゼ（実施例１及び実
施例４を参照のこと）に対するラビツトポリク
ローナル抗血清の１：2000希釈物を用いてスク
リーニングした〔Young、R.A.及びR.W.
Davis（1983）Science、222：778−782〕。候補
プラークを限界希釈で再プレートし、そして均
一になるまで（約３サイクル）再スクリーニン
グした。免疫前血清と反応せずそして免疫血清
と反応する候補プラークからフアージを精製し
た。 候補フアージを用い2E.コリＹ−12株Y1089
（R.Young）溶原化した。溶原菌を、Taqポリ
メラーゼ抗血清と反応するIPTG誘導性融合蛋
白質（β−ガラクトシダーゼより大）の産生に
ついてスクリーニングした。固相のサイズ分画
された融合蛋白質を用いて、全ポリクローナル
抗体からエピトープ特異的抗体をアフイニテイ
ーを精製した〔Goldstein、L.S.B.等（1986）J.
Cell.Biol.102：2076−2087〕。 今度は、“つり上げられた”エピトープ−選
択された抗体をウエスタン分析において用い
て、Taqポリメラーゼに特異的なDNA配列を
コードしているλgt11フアージ候補を同定し
た。λgt：１と称する１つのλgt11フアージ候
補が、全ラビツトポリクローナルTaqポリメラ
ーゼ抗血清からの精製されたTaqポリメラーゼ
及びTaqポリメラーゼを含有する粗抽出画分の
両者と特異的に反応する抗体を、特異的に選択
した。このフアージλgt：１を使用してさらに
検討した。 テルムス・アクアチクスDNAの約115bpの
EcoR−適合Alu断片をラベルし
（Maniatis等、前掲）て、Taqポリメラーゼ特
異的プローブを形成した。このプローブをサザ
ン分析において、及びT.アクアチクスDNAラ
ンダムゲノムライブラリーをスクリーニングす
るために用いた。 Ｂ テルムス・アクアチクス−ランダムゲノムラ
イブラリーの造成及びスクリーニング λフアージシヤロン35（Wilhelmine、A.M.
等、前掲）をその接着末端を介してアニールし
そして連結し、BamHにより完全消化し、
そしてアニールされたアームをスタフアー
（stuffer）フラグメントから、酢酸カルシウム
密度勾配超遠心（Maniatis等、前掲）により
精製した。T.アクアチクスのDNAをSau3Aで
部分分解し、そして15〜20kbサイズの画分を
シユークロース密度勾配超遠心により精製し
た。標的DNAフラグメント及びベクターDNA
フラグメントを１：１のモル比で連結すること
によりランダムゲノムライブラリーを造成し
た。DNAをパツケージし、そしてE.コリＫ−
12株LE392又はK802にトランスフエクトした。
99％以上の組換体を含有する20000以上の最初
のフアージのライブラリーをE.コリＫ−12株
LE392上で増幅した。 λgt11：１の放射性ラベルされたEcoR挿
入部によりCH35Taqゲノムフアージライブラ
リーをスクリーニングした（マニアチス等、前
掲）。特異的にハイブリダイズする候補フアー
ジプラークを精製し、そしてさらに分析した。
CH35：：４−２と称する１つのフアージが、
Hindにより消化の後に４個以上のT.アクア
チクスDNAフラグメントを放出した（約8.0、
4.5、0.8、0.58kb）。 ４種類のHindT.アクアチクスDNAフラグ
メントを、Hindで消化したプラスミド
BSM13+（3.2kb、ベクタークローニングシステ
ム、サンジエゴ）に連結し、そしてそれぞれE.
コリＫ−12株DG98を形質転換してクローン化
した。 CH35：：４−２からの約8.0kbのHind
DNAフラグメントをプラスミドpFC82
（11.2kb）中に単離し、他方CH35：：４−２か
らの4.5kb Hind DNAフラグメントをプラ
スミドpFC83（7.7kb）中に単離した。 pFC82を含有するE.コリDG98株は熱安定性
高温DNAポリメラーゼ活性を含有することが
示された（第１表）。さらに、この細胞は、免
疫的にTaq DNAポリメラーゼと関連する新た
な約60kdの分子量のポリペプチドを合成した。 8.0kb Hind DNAフラゲメントのTaqポ
リメラーゼコード領域をさらに処理し、8.0kb
Hindフラゲメントの2.8kbのHind−
Asp718部分をlas−プロモーターの近位に位置
付けた。この領域をサブクローニングしてプラ
スミドpFC85（6.0kb）を得た。IPTGと共にイ
ンキユベートした後、プラスミドpFC85を含有
するE.コリDG98細胞は、もとの親クローン
（pFC82／DG98）に比べて100倍までの熱安定
性Taqポリメラーゼ関連活性を合成する（第１
表）。pFC85を含有する細胞は有意量の熱安定
DNAポリメラーゼ活性を合成するが、Taq
pol DNA配列の一部分のみが翻訳され、約
60kbのTaqポリメラーゼ関連ポリペプチドの
蓄積が起こる。
【表】
実施例 ３
この発明の熱安定酵素の遺伝子は種々の細菌発
現ベクター、例えばDG6141（ATCC39588）及び
pPLNRBSATG中で発現せしめることができる。こ
れらの宿主ベクターの両者はpBR322の誘導体で
あつて、トリプトフアン・プロモーターオペレー
ター及びATG開始コドンと作用可能に連結され
たリボゾーム結合部位（DG141）、又はλPLプロ
モーターを含む配列及びATG開始コドンに作用
可能に連結された遺伝子Ｎ結合部位pPLNRBS
ATG）を有する。これらの宿主ベクターのいず
れか一方をSacにより制限酵素処理し、そして
Klenow又はS1ヌクレアーゼにより平滑末端化し
て、Taqポリメラーゼ遺伝子を後で挿入するため
の便利な部位を作ることができる。 次の様にして、プラスミドpFC83及びpFC85に
サブクローニングされたDNA挿入フラグメント
から完全な長さのTaqポリメラーゼ遺伝子を造成
した。ベクターBSM13+（ベクタークローニング
システムス、サンジエゴ、CAから市販されてい
る）をユニークHind部位において消化し、
Klenow及びdNTPにより修復し、そして
T4DNAリガーゼを用いてBalオクタヌクレオ
チドリンカ−5′−CAGATCTG−3′に連結し、そ
してE.コリDG98株に形質転換した。AmpRlacZ〓+
形質転換体からプラスミドを単離した。クローン
の１つをBgl及びAsp718により消化し、そして
大ベクターフラグメントをゲル電気泳動により精
製した。 次に、プラスミドpFC83をBgl及びHindで
消化し、そして約750bpのフラグメントを単離し
た。プラスミドpFC85をHind及びAsp718で消
化し、そして約2.8kbのフラグメントを単離し、
そして３片連結によりpFC83からの約750bpの
Bgl−Hindフラグメント及びBSM13+のBgl
−Asp718ベクターフラグメントと連結した。
この連結混合物を用いてE.コリDG98株（1984年
７月13日に寄託のATCCNo.39768）を形質転換し、
これからAmpRコロニーを選択し、そして約
6.75kbのプラスミド（pLSG1）を単離した。
pLSG1を含有するイソプロピル−β−Ｄ−チオ
ガラクトシド（IPTG）により誘導されたDG98
細胞は、T.アクアチクスから単離された天然酵
素と区別できないサイズのTaq DNAポリメラー
ゼを合成した。次に、プラスミドpLSG1を用い
て、ベクタークローニングシステムにより推奨さ
れる方法に従つて単離DNA鋳型を形成すること
ができる。 次に、オリゴヌクレオチド−指令変異誘発
〔Zoller及びSmith、Nuc.Acids Res.（1982）10：
6487−6500〕を用いてATG開始コドンの部分と
してSph制限部位を導入することができる
（Taqポリメラーゼ遺伝子のコード配列中の内部
Hind部位の上流に）。同様にして、遺伝子のカ
ルボキシ末端の後（Asp718部位から約0.7kb上
流）にBgl部位を導入して発現ベクターへの
Taqポリメラーゼ遺伝子のサブクローニングを容
易にすることができる。部位特定変異誘導を終つ
た後、遺伝子をBSM13+ベクターから約3.2kbの
Sph−BstE制限セグメント上に単離し、
Klenowフラグメント及び４種類すべてのdNTP
により処理し、そしてT4 DNAリガーゼ用いて
（平滑末端条件）、あらかじめSacで消化し、
Klenow及びdNTPにより修復しそしてウシ腸ホ
スフアターゼで処理して脱リン酸化平滑末端を形
成しておいた前記の発現ベクターに挿入すること
ができる。この連結混合物を用いてE.コリDG116
を形質転換し、そして得られる形質転換体をTaq
ポリメラーゼの産生についてスクリーニングす
る。酵素の発現は、ウエスタンイムノブロツト分
析及び活性分析により確認することができる。 プラスミドpFC85の約2.8kbのHind−Asp718
フラゲメント中に含有されるTaqポリメラーゼ遺
伝子のさらに大きな部分を、例えばプラスミド
pPLNRBSATGを用いて、Taq pol遺伝子をコード
するアミノ−末端Hind制限部位をATG開始コ
ドンに連結することにより、発現せしめることが
できる。この融合体の発現生成物は約66000〜
68000ダルトンの端が切り取られたポリメラーゼ
をもたらす。 この特定の造成は、プラスミドpFC85をHind
で消化し、そしてdATP、dGTP及びdCTPの
存在下でKlenowフラグメントで処理することに
より行うことができる。生じたフラグメントを
S1ヌクレアーゼでさらに処理することにより単
鎖延長部を除去し、そして生じたDNAをAsp718
で消化し、そして４種類すべてのdNTPの存在下
でKlenowフラグメントにより処理する。回収さ
れた断片を、T4 DNAリガーゼを用いて、あら
かじめSacにより消化しそしてdGTPの存在下
でKlenowフラグメントで処理してATG平滑末端
を形成しておいた脱リン酸化プラスミドpPLNRBS
ATGに連結することができる。次に、この連結
混合物を用いてE.コリDG116を形質転換し、そし
て形質転換体をTaqポリメラーゼの産生について
スクリーニングする。やはり、ウエスタンイムノ
ブロツト分析及び活性分析により発現を確認する
ことができる。 実施例 ４ 精製 熱安定性ポリメラーゼは、前に記載した例に従
つて、テルムス・アクアチクス（Thermus
aquaticus）の培養物から直接精製する方法に粗
抽出物の調製において必要なわずかな変更を加え
て、組換生産された酵素を含有する細菌培養物か
ら精製することができる。 遠心分離により集菌した後、60ｇの細胞を50ｍ
Ｍ Tris−HCl（PH8.1）及び１ｍＭ EDTAを含
有する緩衝液75ml中に懸濁した。細胞をヘレンチ
プレス中で14000〜16000PSIにて溶菌し、この後
４容積（300ml）の追加のTris−EDTAを加え
た。緩衝液Ａ（β−メルカプトエタノールを５ｍ
Ｍに、そしてNP−40及びトウイーン20をそれぞ
れ0.5v／ｖ％に）を添加し、そしてこの溶液を冷
却しながら十分に音波処理した。得られる均質懸
濁液を緩衝液Ａによりさらに希釈して最終容量が
出発細胞重量の7.5〜８倍となるようにした。こ
れを画分と称する。 画分及び上清画分中のポリメラーゼ活性を、
0.025M TAPS−HCl（PH9.2、20℃）、0.002M
MgCl2、0.05M KCl、１ｍM2−メルカプトエタ
ノール、0.2ｍＭずつのdGTP、dATP、TTP、
0.1ｍＭ dCTP〔α−32P、0.05Ci／ｍＭ〕、12.5μ
ｇ“活性化された”サケ精子DNA及び0.01〜0.2
ユニツトのポリメラーゼ（10ｍＭ Tris−HCl、
PH８、50ｍＭ KCl、１mg／mlのオートクレーブ
されたゼラチン、0.5％NP−40、0.5％トウイー
ン20及び１ｍＭ ２−メルカプトエタノール中に
希釈）を含んで成る50μの混合物中で測定し
た。１ユニツトは30分間中10nMの生成物に相当
する。“活性化された”DNAは、DNAの５％が
酸可溶性画分に変るまでDNaseにより部分加
水分解された後のDNAの天然調製物である。反
応を74℃にて10分間行い、そして次に40μを２
ｍＭ EDTA中50μｇ／mlのキヤリヤーDNA溶
液1.0ml（０℃）中に移した。同容量（1.0ml）の
20％TCA及び２％ピロリン酸ナトリウムを加え
た。０℃にて15〜20分間の後、サンプルをワツト
マンGF／Ｃデイスクを通して濾過し、そして冷
５％TCA−１％ピロリン酸塩により十分に洗浄
し、次に冷95％エタノール洗浄し、そして乾燥
し、計数した。 画分を、ベツクマンTI45ローター中で
35000rpmにて２時間、２℃にて遠心し、そして
集めた上清を画分とした。 活性の90〜95％を沈澱せしめるのに必要なポリ
ミン（Polymin）Ｐの最少量（この量は一般に最
終容量の0.25〜0.3％であることが見出された）
を決定した後、ポリミンＰ（BPL、ガイセルブル
グ、MD）（10v／ｖ％、PH7.5に調整しそしてオ
ートクレーブしたもの）によりTaqポリメラーゼ
活性を沈澱せしめた。 ０℃にて15分間にわたり撹拌しながら、適当な
レベルのポリミンＰを画分に徐々に添加した。
この溶液を０℃にてベツクマンJA14ローター中
で20分間にわたり13000rpmにて遠心した。上清
の活性を測定し、そしてペレツトを1/5容量の0.5
×緩衝液Ａ（水で１：２に希釈したもの）に再懸
濁した。この懸濁液を再遠心分離し、そしてペレ
ツトを1/4容量の緩衝液Ａ（0.4M KClを含有）に
再懸濁した。この懸濁液を十分にホモジナイズ
し、そして４℃に一夜置いた。このホモジネート
を前記のように遠心し、そして集めた上清を画分
と命名した。 蛋白質画分を硫酸アンモニウムの75％飽和での
“沈澱”により集め、遠心分離し（27000rpm、
SW27ローター、30分間）そして浮上した薄膜を
50ｍＭ Tris−HCl（PH８）、１ｍＭ EDTA中に
再懸濁した。これらの段階を反復し、そして蛋白
質懸濁液を80ｍＭ KClに含有するＰ−cell緩衝
液〔20ｍＭ KPO4、PH7.5、0.5ｍＭ EDTA、
５ｍＭ β−メルカプトエタノール、5w／ｖ％
グリセルロース、0.5v／ｖ％NP−40及びトウイ
ーン20〕により十分に透析した。 透析物を遠心ビンに移し、これに、80ｍＭ
KClを含有するＰ−cell緩衝液ですすがれたサツ
クから回収されたすべての蛋白質を加えた。遠心
を20000×ｇにて行い、そして時間は15分間に短
縮した。上清を貯蔵し、そして残つたペレツトを
Ｐ−cell緩衝液及び80ｍＭ KClにより洗浄・抽
出し、そして再遠心した。次に上清を一緒にして
画分と命名した。 画分を、80ｍＭ KClを含有するＰ−cell緩
衝液で平衡化したホスホセルロースの2.2×22cm
のカラムに適用した。このカラムを同じ緩衝液で
洗浄し（カラムの2.5〜３倍容量）、そしてＰ−
cell緩衝液中80〜400ｍＭ KClの直線グラジエン
トを用いて蛋白質を溶出した。DNAポリメラー
ゼ活性を含有する画分（約0.18〜0.20M KCl）を
プールし、そしてアミコン撹拌セル及びYM30膜
上で３〜４倍濃縮した。このセルを、KClを含有
しないＰ−cell緩衝液ですすぎ、そして画分濃縮
物（0.15M KCl最終容量調整）に加えて画分Ｖ
とした。 画分を、Ｐ−cell緩衝液及び0.15M KClで平
衡化したヘパリン・セフアロースCL−6Bカラム
（フアルマシア）５mlに適用した。カラムを
0.15M KCl緩衝液（３〜４カラム容量）により
洗浄し、そしてＰ−cell緩衝液中0.15〜0.65M
KClの直線グラジエントにより蛋白質を溶出し
た。SDS−PAGE分析のためにゼラチンを含まな
い希釈剤への１：10希釈を行い、そして酵素の測
定に使用するため１mg／mlのゼラチンを含有する
希釈剤への引続いての１：20希釈を行つた。活性
画分（約0.3M KClで溶出）を、スーパーコイル
DNA鋳型上で特異的及び非特異的エンドヌクレ
アーゼ／トポイソメラーゼについて、過剰の
DNAポリメラーゼと共にインキユベートした後
のスーパーコイルブラスミドDNAの分子量の変
化を電気泳動により検出することによつて測定し
た。少量の線状DNAフラグメントとのインキユ
ベーシヨンの後エキソヌクレアーゼの汚染が検出
された。ピーク画分中、約88kd蛋白質が主たる
バンドであることが見出された。画分と称する
主要画分は、このプールを約３〜５ポリメラーゼ
ユニツト／600ng DNAで55℃にて30分間測定し
た場合、最少の検出可能なエンドヌクレアーゼ活
性を伴つて最高のポリメラーゼ活性を有してい
た。 画分を、10ｍＭ KPO4（PH7.5）、５ｍＭ β
−メルカプトエタノール、５％グリセロール、
0.2％NP−40及び0.2％トウイーン20（HA緩衝液）
に対して透析した。この透析されたサンプルを、
ヒドロキシアパタイトの３mlのカラムに適用し、
そしてHA緩衝液中10〜250ｍＭ KPO4（PH7.5）
の直線グラジエントにより酵素を溶出した。ポリ
メラーゼ活性は75ｍＭ KPO4において溶出し始
め、100ｍＭ KPO4においてピークを示した。
活性ピーク画分を１：100〜１：300希釈で測定し
た。前のクロマトグラフイー段階におけるよう
に、SDS−PAGE分析のため、ゼラチンを含まな
い希釈剤中１：10の希釈物を調製した。５ポリメ
ラーゼユニツトで55℃において有意なエンドヌク
レアーゼ又は二本鎖エキソヌクレアーゼ活性を有
しない画分をプールし、そして画分と命名し
た。 画分を、25ｍＭ酢酸ナトリウム（PH5.2）、５
％グリセルロース、５ｍＭ β−メルカプトエタ
ノール、0.1ｍＭ BDTA、0.1％NP−40及び0.1
％トウイーン20の溶液に対して透析し、室温にお
いてPH５に調整した。透析されたサンプルを、あ
らかじめ平衡化した２mlのDEAE−Tris−Acryl
−Ｍ（LKB）カラムに適用し、そして次に同じ緩
衝液で洗浄した。カラムに付着しなかつたポリメ
ラーゼ活性を含有する画分をプールし、そして同
じ緩衝液中50ｍＭ NaClに調整し、画分を得
た。 画分を、同じ緩衝液（25ｍＭ酢酸ナトリウ
ム、50ｍＭ NaCl、５％グリセルロース、0.1ｍ
MEDTA、0.1％NP−40及び0.1％トウイーン20）
で平衡化された２mlのCM−Tris−Acryl−Ｍ
（LKB）カラムに適用した。このカラムを、４〜
５カラム容量の同じ緩衝液で洗浄し、そして酵素
を酢酸ナトリウム緩衝液中50〜400ｍＭ NaClの
直線グラジエントにより溶出した。ポリメラーゼ
活性のピークは約0.15〜0.20M NaClにおいて溶
出された。ポリメラーゼ活性を、SDS−PAGE分
析のためにゼラチンを含有しない希釈剤中にまず
１：10で希釈し、１：300〜１：500希釈において
測定した。74℃にてDNAポリメラーゼアツセイ
塩（25ｍＭ TAPS−HCl、PH9.4、2.0ｍＭ
MgCl2及び50ｍＭ KCl）を用いて特異的及び非
特異的エンドヌクレアーゼ／トポイソメラーゼに
ついてスーパーコイルDNA鋳型に対する活性ピ
ークにわたる測定を行い、さらにM13ssDNA及
びPHBR322フラグメントに対するヌクレアーゼ
の測定も行つた。検出可能なヌクレアーゼを含有
しない活性画分をプールし、そして銀染色SDS−
PAGEミニゲル上を泳動せしめた。 実施例 ５ 実施例４に記載したようにして精製されたTaq
ポリメラーゼは、Taqエドヌクレアーゼ活性及び
Taqエキソヌクレアーゼ活性により汚染されてい
ないことが見出された。さらに、Taqポリメラー
ゼは好ましくは、使用される各非イオン性洗剤約
0.1〜約0.5v／ｖ％を含有する貯蔵緩衝液中に貯
蔵される。さらに好ましくは、貯蔵緩衝液は
50v／ｖ％グリセロース、100ｍＭ KCl、20ｍＭ
Tris−HCl（PH8.0）、0.1ｍＭエチレンジアミン
四酢酸（EDTA）、１ｍＭジチオスレイトール、
0.5v／ｖ％NP−40、0.5v／ｖ％トウイーン20及
び20μｇ／mlゼラチンからなり、そして好ましく
は−20℃で貯蔵される。 実施例 ６ 実施例に記載したようにして精製したTaqポリ
メラーゼを先行する例において記載したようにし
て貯蔵のために製剤化した。但し、非イオン性ポ
リマー洗剤を使用しなかつた。その例において記
載したようにして活性を測定した場合、この酵素
貯蔵混合物は不活性であることが見出された。貯
蔵緩衝液にNP−20及びトウイーン20を添加した
場合、十分な酵素活性が保存されており、酵素製
剤の安定のために非イオン性洗剤が必要であるこ
とが示された。 下記のバクテリオフアージ及び細菌株がシタ
ス・マスター・カルチユア・コレクシヨン
（Cetus Master Culture Collection）（CMCC）、
米国カリホルニア、エメリービル、1400、53スト
リート、及びアメリカン・タイプ・カルチユア・
コレクシヨン（ATCC）、米国マリーランド、ロ
ツクビル、12301パークラウンドドライブ、に寄
託された。これらの寄託は、特許手続のための微
生物の寄託の国際的承認についてのブタペスト条
約及びそれに基く規則（プタペスト条約）の規定
のもとに行われた。
現ベクター、例えばDG6141（ATCC39588）及び
pPLNRBSATG中で発現せしめることができる。こ
れらの宿主ベクターの両者はpBR322の誘導体で
あつて、トリプトフアン・プロモーターオペレー
ター及びATG開始コドンと作用可能に連結され
たリボゾーム結合部位（DG141）、又はλPLプロ
モーターを含む配列及びATG開始コドンに作用
可能に連結された遺伝子Ｎ結合部位pPLNRBS
ATG）を有する。これらの宿主ベクターのいず
れか一方をSacにより制限酵素処理し、そして
Klenow又はS1ヌクレアーゼにより平滑末端化し
て、Taqポリメラーゼ遺伝子を後で挿入するため
の便利な部位を作ることができる。 次の様にして、プラスミドpFC83及びpFC85に
サブクローニングされたDNA挿入フラグメント
から完全な長さのTaqポリメラーゼ遺伝子を造成
した。ベクターBSM13+（ベクタークローニング
システムス、サンジエゴ、CAから市販されてい
る）をユニークHind部位において消化し、
Klenow及びdNTPにより修復し、そして
T4DNAリガーゼを用いてBalオクタヌクレオ
チドリンカ−5′−CAGATCTG−3′に連結し、そ
してE.コリDG98株に形質転換した。AmpRlacZ〓+
形質転換体からプラスミドを単離した。クローン
の１つをBgl及びAsp718により消化し、そして
大ベクターフラグメントをゲル電気泳動により精
製した。 次に、プラスミドpFC83をBgl及びHindで
消化し、そして約750bpのフラグメントを単離し
た。プラスミドpFC85をHind及びAsp718で消
化し、そして約2.8kbのフラグメントを単離し、
そして３片連結によりpFC83からの約750bpの
Bgl−Hindフラグメント及びBSM13+のBgl
−Asp718ベクターフラグメントと連結した。
この連結混合物を用いてE.コリDG98株（1984年
７月13日に寄託のATCCNo.39768）を形質転換し、
これからAmpRコロニーを選択し、そして約
6.75kbのプラスミド（pLSG1）を単離した。
pLSG1を含有するイソプロピル−β−Ｄ−チオ
ガラクトシド（IPTG）により誘導されたDG98
細胞は、T.アクアチクスから単離された天然酵
素と区別できないサイズのTaq DNAポリメラー
ゼを合成した。次に、プラスミドpLSG1を用い
て、ベクタークローニングシステムにより推奨さ
れる方法に従つて単離DNA鋳型を形成すること
ができる。 次に、オリゴヌクレオチド−指令変異誘発
〔Zoller及びSmith、Nuc.Acids Res.（1982）10：
6487−6500〕を用いてATG開始コドンの部分と
してSph制限部位を導入することができる
（Taqポリメラーゼ遺伝子のコード配列中の内部
Hind部位の上流に）。同様にして、遺伝子のカ
ルボキシ末端の後（Asp718部位から約0.7kb上
流）にBgl部位を導入して発現ベクターへの
Taqポリメラーゼ遺伝子のサブクローニングを容
易にすることができる。部位特定変異誘導を終つ
た後、遺伝子をBSM13+ベクターから約3.2kbの
Sph−BstE制限セグメント上に単離し、
Klenowフラグメント及び４種類すべてのdNTP
により処理し、そしてT4 DNAリガーゼ用いて
（平滑末端条件）、あらかじめSacで消化し、
Klenow及びdNTPにより修復しそしてウシ腸ホ
スフアターゼで処理して脱リン酸化平滑末端を形
成しておいた前記の発現ベクターに挿入すること
ができる。この連結混合物を用いてE.コリDG116
を形質転換し、そして得られる形質転換体をTaq
ポリメラーゼの産生についてスクリーニングす
る。酵素の発現は、ウエスタンイムノブロツト分
析及び活性分析により確認することができる。 プラスミドpFC85の約2.8kbのHind−Asp718
フラゲメント中に含有されるTaqポリメラーゼ遺
伝子のさらに大きな部分を、例えばプラスミド
pPLNRBSATGを用いて、Taq pol遺伝子をコード
するアミノ−末端Hind制限部位をATG開始コ
ドンに連結することにより、発現せしめることが
できる。この融合体の発現生成物は約66000〜
68000ダルトンの端が切り取られたポリメラーゼ
をもたらす。 この特定の造成は、プラスミドpFC85をHind
で消化し、そしてdATP、dGTP及びdCTPの
存在下でKlenowフラグメントで処理することに
より行うことができる。生じたフラグメントを
S1ヌクレアーゼでさらに処理することにより単
鎖延長部を除去し、そして生じたDNAをAsp718
で消化し、そして４種類すべてのdNTPの存在下
でKlenowフラグメントにより処理する。回収さ
れた断片を、T4 DNAリガーゼを用いて、あら
かじめSacにより消化しそしてdGTPの存在下
でKlenowフラグメントで処理してATG平滑末端
を形成しておいた脱リン酸化プラスミドpPLNRBS
ATGに連結することができる。次に、この連結
混合物を用いてE.コリDG116を形質転換し、そし
て形質転換体をTaqポリメラーゼの産生について
スクリーニングする。やはり、ウエスタンイムノ
ブロツト分析及び活性分析により発現を確認する
ことができる。 実施例 ４ 精製 熱安定性ポリメラーゼは、前に記載した例に従
つて、テルムス・アクアチクス（Thermus
aquaticus）の培養物から直接精製する方法に粗
抽出物の調製において必要なわずかな変更を加え
て、組換生産された酵素を含有する細菌培養物か
ら精製することができる。 遠心分離により集菌した後、60ｇの細胞を50ｍ
Ｍ Tris−HCl（PH8.1）及び１ｍＭ EDTAを含
有する緩衝液75ml中に懸濁した。細胞をヘレンチ
プレス中で14000〜16000PSIにて溶菌し、この後
４容積（300ml）の追加のTris−EDTAを加え
た。緩衝液Ａ（β−メルカプトエタノールを５ｍ
Ｍに、そしてNP−40及びトウイーン20をそれぞ
れ0.5v／ｖ％に）を添加し、そしてこの溶液を冷
却しながら十分に音波処理した。得られる均質懸
濁液を緩衝液Ａによりさらに希釈して最終容量が
出発細胞重量の7.5〜８倍となるようにした。こ
れを画分と称する。 画分及び上清画分中のポリメラーゼ活性を、
0.025M TAPS−HCl（PH9.2、20℃）、0.002M
MgCl2、0.05M KCl、１ｍM2−メルカプトエタ
ノール、0.2ｍＭずつのdGTP、dATP、TTP、
0.1ｍＭ dCTP〔α−32P、0.05Ci／ｍＭ〕、12.5μ
ｇ“活性化された”サケ精子DNA及び0.01〜0.2
ユニツトのポリメラーゼ（10ｍＭ Tris−HCl、
PH８、50ｍＭ KCl、１mg／mlのオートクレーブ
されたゼラチン、0.5％NP−40、0.5％トウイー
ン20及び１ｍＭ ２−メルカプトエタノール中に
希釈）を含んで成る50μの混合物中で測定し
た。１ユニツトは30分間中10nMの生成物に相当
する。“活性化された”DNAは、DNAの５％が
酸可溶性画分に変るまでDNaseにより部分加
水分解された後のDNAの天然調製物である。反
応を74℃にて10分間行い、そして次に40μを２
ｍＭ EDTA中50μｇ／mlのキヤリヤーDNA溶
液1.0ml（０℃）中に移した。同容量（1.0ml）の
20％TCA及び２％ピロリン酸ナトリウムを加え
た。０℃にて15〜20分間の後、サンプルをワツト
マンGF／Ｃデイスクを通して濾過し、そして冷
５％TCA−１％ピロリン酸塩により十分に洗浄
し、次に冷95％エタノール洗浄し、そして乾燥
し、計数した。 画分を、ベツクマンTI45ローター中で
35000rpmにて２時間、２℃にて遠心し、そして
集めた上清を画分とした。 活性の90〜95％を沈澱せしめるのに必要なポリ
ミン（Polymin）Ｐの最少量（この量は一般に最
終容量の0.25〜0.3％であることが見出された）
を決定した後、ポリミンＰ（BPL、ガイセルブル
グ、MD）（10v／ｖ％、PH7.5に調整しそしてオ
ートクレーブしたもの）によりTaqポリメラーゼ
活性を沈澱せしめた。 ０℃にて15分間にわたり撹拌しながら、適当な
レベルのポリミンＰを画分に徐々に添加した。
この溶液を０℃にてベツクマンJA14ローター中
で20分間にわたり13000rpmにて遠心した。上清
の活性を測定し、そしてペレツトを1/5容量の0.5
×緩衝液Ａ（水で１：２に希釈したもの）に再懸
濁した。この懸濁液を再遠心分離し、そしてペレ
ツトを1/4容量の緩衝液Ａ（0.4M KClを含有）に
再懸濁した。この懸濁液を十分にホモジナイズ
し、そして４℃に一夜置いた。このホモジネート
を前記のように遠心し、そして集めた上清を画分
と命名した。 蛋白質画分を硫酸アンモニウムの75％飽和での
“沈澱”により集め、遠心分離し（27000rpm、
SW27ローター、30分間）そして浮上した薄膜を
50ｍＭ Tris−HCl（PH８）、１ｍＭ EDTA中に
再懸濁した。これらの段階を反復し、そして蛋白
質懸濁液を80ｍＭ KClに含有するＰ−cell緩衝
液〔20ｍＭ KPO4、PH7.5、0.5ｍＭ EDTA、
５ｍＭ β−メルカプトエタノール、5w／ｖ％
グリセルロース、0.5v／ｖ％NP−40及びトウイ
ーン20〕により十分に透析した。 透析物を遠心ビンに移し、これに、80ｍＭ
KClを含有するＰ−cell緩衝液ですすがれたサツ
クから回収されたすべての蛋白質を加えた。遠心
を20000×ｇにて行い、そして時間は15分間に短
縮した。上清を貯蔵し、そして残つたペレツトを
Ｐ−cell緩衝液及び80ｍＭ KClにより洗浄・抽
出し、そして再遠心した。次に上清を一緒にして
画分と命名した。 画分を、80ｍＭ KClを含有するＰ−cell緩
衝液で平衡化したホスホセルロースの2.2×22cm
のカラムに適用した。このカラムを同じ緩衝液で
洗浄し（カラムの2.5〜３倍容量）、そしてＰ−
cell緩衝液中80〜400ｍＭ KClの直線グラジエン
トを用いて蛋白質を溶出した。DNAポリメラー
ゼ活性を含有する画分（約0.18〜0.20M KCl）を
プールし、そしてアミコン撹拌セル及びYM30膜
上で３〜４倍濃縮した。このセルを、KClを含有
しないＰ−cell緩衝液ですすぎ、そして画分濃縮
物（0.15M KCl最終容量調整）に加えて画分Ｖ
とした。 画分を、Ｐ−cell緩衝液及び0.15M KClで平
衡化したヘパリン・セフアロースCL−6Bカラム
（フアルマシア）５mlに適用した。カラムを
0.15M KCl緩衝液（３〜４カラム容量）により
洗浄し、そしてＰ−cell緩衝液中0.15〜0.65M
KClの直線グラジエントにより蛋白質を溶出し
た。SDS−PAGE分析のためにゼラチンを含まな
い希釈剤への１：10希釈を行い、そして酵素の測
定に使用するため１mg／mlのゼラチンを含有する
希釈剤への引続いての１：20希釈を行つた。活性
画分（約0.3M KClで溶出）を、スーパーコイル
DNA鋳型上で特異的及び非特異的エンドヌクレ
アーゼ／トポイソメラーゼについて、過剰の
DNAポリメラーゼと共にインキユベートした後
のスーパーコイルブラスミドDNAの分子量の変
化を電気泳動により検出することによつて測定し
た。少量の線状DNAフラグメントとのインキユ
ベーシヨンの後エキソヌクレアーゼの汚染が検出
された。ピーク画分中、約88kd蛋白質が主たる
バンドであることが見出された。画分と称する
主要画分は、このプールを約３〜５ポリメラーゼ
ユニツト／600ng DNAで55℃にて30分間測定し
た場合、最少の検出可能なエンドヌクレアーゼ活
性を伴つて最高のポリメラーゼ活性を有してい
た。 画分を、10ｍＭ KPO4（PH7.5）、５ｍＭ β
−メルカプトエタノール、５％グリセロール、
0.2％NP−40及び0.2％トウイーン20（HA緩衝液）
に対して透析した。この透析されたサンプルを、
ヒドロキシアパタイトの３mlのカラムに適用し、
そしてHA緩衝液中10〜250ｍＭ KPO4（PH7.5）
の直線グラジエントにより酵素を溶出した。ポリ
メラーゼ活性は75ｍＭ KPO4において溶出し始
め、100ｍＭ KPO4においてピークを示した。
活性ピーク画分を１：100〜１：300希釈で測定し
た。前のクロマトグラフイー段階におけるよう
に、SDS−PAGE分析のため、ゼラチンを含まな
い希釈剤中１：10の希釈物を調製した。５ポリメ
ラーゼユニツトで55℃において有意なエンドヌク
レアーゼ又は二本鎖エキソヌクレアーゼ活性を有
しない画分をプールし、そして画分と命名し
た。 画分を、25ｍＭ酢酸ナトリウム（PH5.2）、５
％グリセルロース、５ｍＭ β−メルカプトエタ
ノール、0.1ｍＭ BDTA、0.1％NP−40及び0.1
％トウイーン20の溶液に対して透析し、室温にお
いてPH５に調整した。透析されたサンプルを、あ
らかじめ平衡化した２mlのDEAE−Tris−Acryl
−Ｍ（LKB）カラムに適用し、そして次に同じ緩
衝液で洗浄した。カラムに付着しなかつたポリメ
ラーゼ活性を含有する画分をプールし、そして同
じ緩衝液中50ｍＭ NaClに調整し、画分を得
た。 画分を、同じ緩衝液（25ｍＭ酢酸ナトリウ
ム、50ｍＭ NaCl、５％グリセルロース、0.1ｍ
MEDTA、0.1％NP−40及び0.1％トウイーン20）
で平衡化された２mlのCM−Tris−Acryl−Ｍ
（LKB）カラムに適用した。このカラムを、４〜
５カラム容量の同じ緩衝液で洗浄し、そして酵素
を酢酸ナトリウム緩衝液中50〜400ｍＭ NaClの
直線グラジエントにより溶出した。ポリメラーゼ
活性のピークは約0.15〜0.20M NaClにおいて溶
出された。ポリメラーゼ活性を、SDS−PAGE分
析のためにゼラチンを含有しない希釈剤中にまず
１：10で希釈し、１：300〜１：500希釈において
測定した。74℃にてDNAポリメラーゼアツセイ
塩（25ｍＭ TAPS−HCl、PH9.4、2.0ｍＭ
MgCl2及び50ｍＭ KCl）を用いて特異的及び非
特異的エンドヌクレアーゼ／トポイソメラーゼに
ついてスーパーコイルDNA鋳型に対する活性ピ
ークにわたる測定を行い、さらにM13ssDNA及
びPHBR322フラグメントに対するヌクレアーゼ
の測定も行つた。検出可能なヌクレアーゼを含有
しない活性画分をプールし、そして銀染色SDS−
PAGEミニゲル上を泳動せしめた。 実施例 ５ 実施例４に記載したようにして精製されたTaq
ポリメラーゼは、Taqエドヌクレアーゼ活性及び
Taqエキソヌクレアーゼ活性により汚染されてい
ないことが見出された。さらに、Taqポリメラー
ゼは好ましくは、使用される各非イオン性洗剤約
0.1〜約0.5v／ｖ％を含有する貯蔵緩衝液中に貯
蔵される。さらに好ましくは、貯蔵緩衝液は
50v／ｖ％グリセロース、100ｍＭ KCl、20ｍＭ
Tris−HCl（PH8.0）、0.1ｍＭエチレンジアミン
四酢酸（EDTA）、１ｍＭジチオスレイトール、
0.5v／ｖ％NP−40、0.5v／ｖ％トウイーン20及
び20μｇ／mlゼラチンからなり、そして好ましく
は−20℃で貯蔵される。 実施例 ６ 実施例に記載したようにして精製したTaqポリ
メラーゼを先行する例において記載したようにし
て貯蔵のために製剤化した。但し、非イオン性ポ
リマー洗剤を使用しなかつた。その例において記
載したようにして活性を測定した場合、この酵素
貯蔵混合物は不活性であることが見出された。貯
蔵緩衝液にNP−20及びトウイーン20を添加した
場合、十分な酵素活性が保存されており、酵素製
剤の安定のために非イオン性洗剤が必要であるこ
とが示された。 下記のバクテリオフアージ及び細菌株がシタ
ス・マスター・カルチユア・コレクシヨン
（Cetus Master Culture Collection）（CMCC）、
米国カリホルニア、エメリービル、1400、53スト
リート、及びアメリカン・タイプ・カルチユア・
コレクシヨン（ATCC）、米国マリーランド、ロ
ツクビル、12301パークラウンドドライブ、に寄
託された。これらの寄託は、特許手続のための微
生物の寄託の国際的承認についてのブタペスト条
約及びそれに基く規則（プタペスト条約）の規定
のもとに行われた。
第１図は、プラスミドBSM13+中にサブクロー
ニングされた約4.5kbのHindT.アクアチクス
DNA挿入部を含有するプラスミドpFC83の制限
地図である。第２図は、プラスミドBSM13+中に
サブクローニングされた約2.8kbのHind−
Asp718T.アクアチクスDNA挿入部を含有するプ
ラスミドpFC85の制限地図である。第３図は本発
明の酵素誘導体に対応する天然酵素のアミノ酸配
列及びそれをコードする塩基配列を示す。この図
中、本発明の酵素は第620位の塩基を含むHind
部位から第2500位の塩基の近傍の翻訳終止コドン
（End）の前までのアミノ酸配列を含んで成る。
ニングされた約4.5kbのHindT.アクアチクス
DNA挿入部を含有するプラスミドpFC83の制限
地図である。第２図は、プラスミドBSM13+中に
サブクローニングされた約2.8kbのHind−
Asp718T.アクアチクスDNA挿入部を含有するプ
ラスミドpFC85の制限地図である。第３図は本発
明の酵素誘導体に対応する天然酵素のアミノ酸配
列及びそれをコードする塩基配列を示す。この図
中、本発明の酵素は第620位の塩基を含むHind
部位から第2500位の塩基の近傍の翻訳終止コドン
（End）の前までのアミノ酸配列を含んで成る。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 次の性質： (1)鋳型DNAにアニールされたオリゴヌクレオチ
ド又はポリヌクレオチドの3′−ヒドロキシル基
にデオキシリボヌクレオシド5′−トリホスフエ
ートのα−ホスフエートを共有結合せしめるこ
とにより、デオキシリボ核酸にデオキシリボヌ
クレオシド5′−モノホスフエートを鋳型依存的
に導入する反応を触媒し； (2) 対応する天然酵素に比して短縮されており；
そして (3) 第２図に示すプラスミドpFC85（ATCCNo.67，
421）中の挿入領域のHind部位から下流方向
に連続する１個のコード領域によりコードされ
ており且つ約60Kダルトンの分子量をもたらす
アミノ酸配列、を含んで成る； を有することを特徴とする熱安定性DNAポリメ
ラーゼ。
Applications Claiming Priority (8)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US89951386A | 1986-08-22 | 1986-08-22 | |
| US89924186A | 1986-08-22 | 1986-08-22 | |
| US899241 | 1986-08-22 | ||
| US899513 | 1986-08-22 | ||
| US63509 | 1987-06-17 | ||
| US07/063,647 US4965188A (en) | 1986-08-22 | 1987-06-17 | Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences using a thermostable enzyme |
| US07/063,509 US4889818A (en) | 1986-08-22 | 1987-06-17 | Purified thermostable enzyme |
| US63647 | 1987-06-17 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1003887A Division JPH0824570B2 (ja) | 1986-08-22 | 1989-01-12 | 熱安定性ｄｎａポリメラーゼをコードする遺伝子 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH03180178A JPH03180178A (ja) | 1991-08-06 |
| JPH0574345B2 true JPH0574345B2 (ja) | 1993-10-18 |
Family
ID=27490366
Family Applications (5)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1003887A Expired - Lifetime JPH0824570B2 (ja) | 1986-08-22 | 1989-01-12 | 熱安定性ｄｎａポリメラーゼをコードする遺伝子 |
| JP2326113A Granted JPH03180178A (ja) | 1986-08-22 | 1990-11-29 | 熱安定性ｄｎａポリメラーゼ誘導体 |
| JP2326114A Expired - Lifetime JP2719529B2 (ja) | 1986-08-22 | 1990-11-29 | 熱安定性核酸ポリメラーゼ組成物 |
| JP6002160A Expired - Lifetime JP2502042B2 (ja) | 1986-08-22 | 1994-01-13 | 熱安定性ｄｎａポリメラ―ゼの製造方法 |
| JP6002142A Expired - Lifetime JP2502041B2 (ja) | 1986-08-22 | 1994-01-13 | 熱安定性ｄｎａポリメラ―ゼを用いる核酸の増幅方法 |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1003887A Expired - Lifetime JPH0824570B2 (ja) | 1986-08-22 | 1989-01-12 | 熱安定性ｄｎａポリメラーゼをコードする遺伝子 |
Family Applications After (3)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2326114A Expired - Lifetime JP2719529B2 (ja) | 1986-08-22 | 1990-11-29 | 熱安定性核酸ポリメラーゼ組成物 |
| JP6002160A Expired - Lifetime JP2502042B2 (ja) | 1986-08-22 | 1994-01-13 | 熱安定性ｄｎａポリメラ―ゼの製造方法 |
| JP6002142A Expired - Lifetime JP2502041B2 (ja) | 1986-08-22 | 1994-01-13 | 熱安定性ｄｎａポリメラ―ゼを用いる核酸の増幅方法 |
Country Status (17)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (2) | EP0776970B2 (ja) |
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