【発明の詳細な説明】[Detailed description of the invention]
［産業上の利用分野］
本発明は、関節症治療剤に関し、更に詳しく
は、関節症の病態そのものの本質的な治療に適用
し得る関節症治療剤に関する。
［従来技術及びその問題点］
関節疾患の中でも変形性関節症や慢性関節リウ
マチでは、患者の関節液中のヒアルロン酸（以下
「HA」という）が、その濃度、分子量ともに低
下しており、このことが関節液の有する潤滑機
能、関節軟骨表層の保護などの諸機能を低下させ
る一因であると考えられている。これらの関節疾
患に対する従来の薬物療法は、対症療法であり、
障害された関節組織の修復、改善という点からは
適切ではない。
これに対し、関節軟骨の変性を抑制し、あるい
は、すでに変性した関節軟骨を部分的に修復でき
れば病態そのものの本質的な治療となり得る。
かかる観点から、関節液の主成分であるHAを
関節腔内に注入することにより、競走馬の外傷性
関節炎［アクタ・ベト・スカンジナビア（Acta
Vet.Scand.），11，139（1970）］、ヒトの変形性関
節症［パソル・バイオル（Pathol.Biol.）22，
731（1974）］に対し、ある程度の有効性が認めら
れている。
しかしながら、生体内におけるHAは、ある特
殊な蛋白質と複合体を形成し、安定かつ強い曳糸
性、高粘弾性を有し、特殊な働きをしているのに
対して、単離精製されたHAは曳糸性をほとんど
示さず、かつ、従来技術では高粘性のHAの抽出
精製は非常に困難である。また、生体内、特に病
的部位に投与した後、酵素的分解や非酵素的酸化
還元的分解［アースライチス・リウマチズム
（Arthritis Rheumatism），４，240（1961）］を受
け、その粘性を維持することが困難であるため、
満足な結果は得られていない。
そこで、本発明者らは、前記した従来技術の欠
点を解消すべく鋭意研究を重ねた結果、架橋ヒア
ルロン酸（以下「架橋HA」という）を用いるこ
とにより本発明の目的を達成できることを見出
し、本発明を完成するに至つた。
［発明の構成］
本発明の関節症治療剤は、架橋HAからなるこ
とを特徴とするものである。
本発明に用いる架橋HAとしては、HA又はそ
の塩を適当な架橋剤で架橋させてなるものであつ
て、水溶性のものであれば如何なるものでもよい
が、このうち、高粘度のもの、例えば１％生理食
塩水溶液における粘度（20℃、ずり速度1sec-1）
が1000〜60000センチポアーズのものが好ましい。
好ましい架橋剤としては、例えば、多官能性エ
ポキシ化合物が挙げられる。
ここで、多官能性エポキシ化合物とは、エポキ
シ基を少なくとも１個有する化合物であつて、そ
の他に、エポキシ基を含めて、HAを架橋するに
適した官能基を１個以上有する化合物をいう。
かかる化合物としては、例えば、ハロメチルオ
キシラン化合物及びビスエポキシ化合物などが挙
げられる。ハロメチルオキシラン化合物として
は、エピクロルヒドリン、エピブロムヒドリン、
β−メチルエピクロルヒドリン及びβ−メチルエ
ピブロムヒドリンなどが挙げられる。ビスエポキ
シ化合物としては、１，２−ビス（２，３−エポ
キシプロポキシ）エタン、１，４−ビス（２，３
−エポキシプロポキシ）ブタン、１，６−ビス
（２，３−エポキシプロポキシ）ヘキサン及びビ
スフエノールＡ又はブスフエノールＦのジグリシ
ジルエーテルなどが挙げられる。
本発明に用いる架橋HAのうち、架橋剤として
多官能性エポキシ化合物を用いたもの及びその製
造法は、特願昭59−88440号明細書に詳述されて
いる。
通常、分子量数千から数百万のHA又はその塩
を、0.5％以上、好ましくは1.0％以上の濃度に、
アルカリ水溶液に溶解し、水溶性有機溶剤を全液
量の30％以上、好ましくは50％以上になるように
加える。アルカリ水溶液は、PH８〜14であること
が好ましく、PH12〜14であることが更に好まし
い。アルカリとしては、通常、水酸化ナトリウ
ム、水酸化カリウム、水酸化カルシウムなどの金
属水酸化物及び炭酸ナトリウム、炭酸カリウムな
どの金属炭酸塩等が挙げられる。水溶性有機溶剤
としては、メタノール、エタノール、イソプロパ
ノール、アセトン、ジオキサンなどが挙げられ、
これらは、単独で又は混合物として用いられる。
これらの水溶性有機溶剤を加えることにより反応
を有効に行なうことができ、また、アルカリによ
るHAの分解（低分子化）も抑制することができ
る。
次いで、得られた溶液に、前記多官能性エポキ
シ化合物の１種以上を加え、０〜100℃、好まし
くは10〜60℃、更に好ましくは15〜40℃で反応さ
せる。反応時間は、反応温度により異なるが、20
℃近辺では20〜48時間が好ましく、40℃近辺では
２〜３時間が好ましい。
また、本発明に用いる架橋HAは、次にように
しても調製することができる。
即ち、HA又はその塩の前記アルカル溶液に前
記水溶性有機溶剤を加えて、得られる水アメ状沈
殿物を分取し、該沈殿物に多官能性エポキシ化合
物を加えて、50℃以下で反応させると非常に効率
的に反応を行なうことができる。水アメ状沈殿物
を分取するには、例えば、デカンテーシヨンによ
り上清を除去すればよい。反応温度は、通常10〜
50℃で、最も好ましいのは20〜40℃である。温度
が高い程、短時間で反応を終了させる必要があ
る。一般的には、40℃近辺では２時間程度が、20
℃近辺では24〜48時間が好ましい。
架橋HAの調製において、HA又はその塩と多
官能性エポキシ化合物とのモル比、即ち架橋度を
変えることにより、得られる架橋HA又はその塩
の溶解性及び粘度を調節することができる。
分子量100万前後のHAにおいては、HAの繰り
返し二糖１モルに対する多官能性エポキシ化合物
の使用モル数を１〜10モルにすれば、水溶性で１
％生理食塩水溶液における粘度（20℃、ずり速度
1sec-1）が1000〜60000センチポアーズの架橋
HAを得ることができる。
本発明の関節症治療剤の各種関節症への適用に
際しては、架橋HAを、通常、生理食塩水に溶解
し、注射針を通過できる粘度、即ち50000センチ
ポアーズ（20℃、ずり速度1sec-1）以下、好まし
くは5000〜30000センチポアーズ（20℃、ずり速
度1sec-1）にして用いる。
［発明の効果］
本発明によれば、安全性が高く、かつ、ヒアル
ロニダーゼ等の組織酵素に対して抵抗性を示す関
節症治療剤を提供することができる。かかる本発
明の関節症治療剤は、生理食塩水等に溶解するこ
とにより、正常人の関節液と非常に類似した性質
を有する溶液となり、変形性関節症、慢性関節リ
ウマチなどの各種関節症の治療剤として有用であ
る。
［発明の実施例］
以下、調製例、試験例及び実施例により本発明
を更に詳細に説明するが、これらは、本発明の範
囲を何ら制限するものではない。
調製例 架橋HAの調製
(1) HAナトリウム塩（分子量730000）10ｇを
1N水酸化ナトリウム水溶液（PH 13.7）に２
％になるように溶解した後、0.22μｍの膜で除
菌し、エタノール500ml及びエピクロルヒドリ
ン6.0mlを加え、20℃で24時間反応させた。酢
酸を加えて反応液のPHを6.4とした後、エタノ
ール3000mlを加えて沈殿させ、架橋HA（以下
「架橋HA−１」という）を調製した。
収 量 8.5ｇ
１％生理食塩水溶液に
おける粘度（20℃、 11000センチポアーズ
ずり速度1sec-1）
元素分析値 Ｃ：42.0％，Ｈ：4.87％，
Ｎ：3.29％，Na：5.81％
(2) 架橋剤であるエピクロルヒドリンの量を変え
る以外は、(1)と同様に処理して、表１に示す３
種の架橋HAを調製した。
[Industrial Field of Application] The present invention relates to a therapeutic agent for arthropathy, and more particularly, to a therapeutic agent for arthropathy that can be applied to the essential treatment of the pathological condition of arthropathy itself. [Prior art and its problems] Among joint diseases, in osteoarthritis and rheumatoid arthritis, the concentration and molecular weight of hyaluronic acid (hereinafter referred to as "HA") in the patient's joint fluid decreases. This is thought to be one of the reasons for the deterioration of various functions of synovial fluid, such as the lubricating function and protection of the surface layer of articular cartilage. Conventional drug therapy for these joint diseases is symptomatic;
It is not appropriate from the point of view of repairing and improving damaged joint tissues. On the other hand, if degeneration of articular cartilage can be suppressed or articular cartilage that has already degenerated can be partially repaired, this could be an essential treatment for the disease state itself. From this point of view, by injecting hyaluronan, the main component of synovial fluid, into the joint cavity, it is possible to treat traumatic arthritis [Acta vet Scandinavia] in racehorses.
Vet. Scand.), 11 , 139 (1970)], human osteoarthritis [Pahol. Biol. 22 ,
731 (1974)], a certain degree of effectiveness has been recognized. However, in vivo, hyaluronan forms a complex with a specific protein, has stable and strong stringiness, and has high viscoelasticity, and has a special function. HA exhibits almost no stringiness, and it is extremely difficult to extract and purify highly viscous HA using conventional techniques. In addition, after administration in vivo, especially to a diseased site, it undergoes enzymatic and non-enzymatic redox decomposition [Arthritis Rheumatism, 4 , 240 (1961)] and maintains its viscosity. Because it is difficult to
Satisfactory results have not been obtained. Therefore, the present inventors have conducted intensive research to eliminate the drawbacks of the prior art described above, and have discovered that the object of the present invention can be achieved by using crosslinked hyaluronic acid (hereinafter referred to as "crosslinked HA"). The present invention has now been completed. [Structure of the Invention] The therapeutic agent for arthropathy of the present invention is characterized by comprising crosslinked HA. The cross-linked HA used in the present invention may be any water-soluble material obtained by cross-linking HA or its salt with an appropriate cross-linking agent, but among these, those with high viscosity, such as Viscosity in 1% physiological saline solution (20℃, shear rate 1sec -1 )
It is preferable that the value is 1000 to 60000 centipoise. Preferred crosslinking agents include, for example, polyfunctional epoxy compounds. Here, the polyfunctional epoxy compound refers to a compound having at least one epoxy group and, in addition, one or more functional groups suitable for crosslinking HA, including the epoxy group. Examples of such compounds include halomethyloxirane compounds and bisepoxy compounds. Examples of halomethyloxirane compounds include epichlorohydrin, epibromohydrin,
Examples include β-methylepichlorohydrin and β-methylepibromohydrin. As bisepoxy compounds, 1,2-bis(2,3-epoxypropoxy)ethane, 1,4-bis(2,3
-epoxypropoxy)butane, 1,6-bis(2,3-epoxypropoxy)hexane, and diglycidyl ether of bisphenol A or busphenol F. Among the crosslinked HAs used in the present invention, those using a polyfunctional epoxy compound as a crosslinking agent and the method for producing the same are detailed in Japanese Patent Application No. 88440/1982. Usually, HA or its salt with a molecular weight of several thousand to several million is added to a concentration of 0.5% or more, preferably 1.0% or more,
It is dissolved in an alkaline aqueous solution, and a water-soluble organic solvent is added in an amount of 30% or more, preferably 50% or more of the total solution. The alkaline aqueous solution preferably has a pH of 8 to 14, more preferably a pH of 12 to 14. Examples of the alkali include metal hydroxides such as sodium hydroxide, potassium hydroxide, and calcium hydroxide, and metal carbonates such as sodium carbonate and potassium carbonate. Examples of water-soluble organic solvents include methanol, ethanol, isopropanol, acetone, dioxane, etc.
These may be used alone or as a mixture.
By adding these water-soluble organic solvents, the reaction can be carried out effectively, and the decomposition (low molecularization) of HA due to alkali can also be suppressed. Next, one or more of the above-mentioned polyfunctional epoxy compounds is added to the obtained solution and reacted at 0 to 100°C, preferably 10 to 60°C, more preferably 15 to 40°C. The reaction time varies depending on the reaction temperature, but the reaction time is 20
It is preferably 20 to 48 hours at around 40°C, and 2 to 3 hours at around 40°C. Further, the crosslinked HA used in the present invention can also be prepared as follows. That is, the water-soluble organic solvent is added to the alkaline solution of HA or its salt, the resulting starch syrup-like precipitate is separated, a polyfunctional epoxy compound is added to the precipitate, and the reaction is carried out at 50°C or lower. This allows the reaction to be carried out very efficiently. In order to separate the starch syrup-like precipitate, the supernatant may be removed, for example, by decantation. The reaction temperature is usually 10~
50°C, most preferably 20-40°C. The higher the temperature, the faster it is necessary to complete the reaction. Generally, around 40℃, it takes about 2 hours, but 20℃
24 to 48 hours is preferable around ℃. In the preparation of crosslinked HA, the solubility and viscosity of the resulting crosslinked HA or salt thereof can be adjusted by changing the molar ratio of HA or its salt and the polyfunctional epoxy compound, that is, the degree of crosslinking. For HA with a molecular weight of around 1 million, if the number of moles of the polyfunctional epoxy compound used per mole of repeating disaccharide of HA is 1 to 10 moles, the water solubility is 1 to 10 moles.
% viscosity in saline solution (20℃, shear rate
1sec -1 ) is 1000 to 60000 centipoise crosslinking
You can get HA. When applying the therapeutic agent for arthropathy of the present invention to various arthropathy, cross-linked HA is usually dissolved in physiological saline and has a viscosity that can pass through an injection needle, that is, 50,000 centipoise (20°C, shear rate 1 sec -1 ). Hereinafter, it is preferably used at 5000 to 30000 centipoise (20° C., shear rate 1 sec −1 ). [Effects of the Invention] According to the present invention, it is possible to provide a therapeutic agent for arthropathy that is highly safe and exhibits resistance to tissue enzymes such as hyaluronidase. When the therapeutic agent for arthrosis of the present invention is dissolved in physiological saline etc., it becomes a solution having properties very similar to the synovial fluid of a normal person, and is effective against various arthropathy such as osteoarthritis and rheumatoid arthritis. Useful as a therapeutic agent. [Examples of the Invention] Hereinafter, the present invention will be explained in more detail with reference to Preparation Examples, Test Examples, and Examples, but these are not intended to limit the scope of the present invention in any way. Preparation example Preparation of cross-linked HA (1) 10 g of HA sodium salt (molecular weight 730000)
2 in 1N sodium hydroxide aqueous solution (PH 13.7)
%, sterilization was performed using a 0.22 μm membrane, 500 ml of ethanol and 6.0 ml of epichlorohydrin were added, and the mixture was reacted at 20° C. for 24 hours. After adding acetic acid to adjust the pH of the reaction solution to 6.4, 3000 ml of ethanol was added to precipitate it to prepare crosslinked HA (hereinafter referred to as "crosslinked HA-1"). Yield 8.5g Viscosity in 1% physiological saline solution (20℃, 11000 centipoise, shear rate 1sec -1 ) Elemental analysis values C: 42.0%, H: 4.87%, N: 3.29%, Na: 5.81% (2) Crosslinking The same procedure as in (1) was carried out except for changing the amount of epichlorohydrin, which is the agent, to produce 3 as shown in Table 1.
Seeds of cross-linked HA were prepared.
【表】
これらの３種の架橋HA及び合成に使用した
HAナトリウム塩を、それぞれ、0.1M酢酸（PH
5.0）に１％の濃度に溶解し、測定（20℃、ずり
速度1sec-1）したところ、次のとおりであつた。
架橋HA−２ 45000センチポアーズ
架橋HA−３ 27000センチポアーズ
架橋HA−４ 8000センチポアーズ
HAナトリウム塩 1500センチポアーズ
これらの溶液に0.09重量％になるように牛睾丸
ヒアルロニダーゼを加え50℃で反応させ、15，
35，55，70分後に粘度を測定し、反応前の粘度に
対する割合を算出した。
結果を図１に示す。図１において、□印、△
印、○印及び●印は、それぞれ、架橋HA−２，
３，４及びHAナトリウム塩の酢酸溶液の各反応
時間における反応前の粘度に対する割合を表わ
す。
図１から、本発明に用いる架橋HAは、HAに
比し、ヒアルロニダーゼに対する抵抗性が高く、
その程度は、架橋剤が高いほど顕著であることが
わかる。
試験例１ 架橋HAの架橋度と粘度との関係
分子量370000及び730000のHAナトリウム塩
100mgを、それぞれ、1N水酸化ナトリウム5.0ml
に溶解した溶液に、エタノール５mlとエピクロル
ヒドリン、それぞれ、25，50，100，200μとを
加え、40℃で２時間反応した。反応後は調製例(1)
に準じて後処理を行なつた。
また、分子量1700000のHAナトリウム塩75mg
を1N水酸化ナトリウム7.5mlに溶解した溶液にエ
タノール7.5mlとエピクロルヒドリン40μ又は
80μとを加え、40℃で２時間反応した。更に、
上記反応と同時に同じ条件で［２−14Ｃ］エピク
ロルヒドリン（アマシヤム・ジヤパン社から入
手）を用いて反応を行ない、この標識化合物の放
射活性から架橋度を算出した。架橋度と粘度との
関係を表２に示す。
表２から、架橋HAにおいては、架橋度と粘度
とが比例関係にあることがわかる。[Table] These three types of cross-linked HA and those used in the synthesis
HA sodium salt, respectively, in 0.1M acetic acid (PH
5.0) to a concentration of 1% and measured (20°C, shear rate 1sec -1 ), the results were as follows. Cross-linked HA-2 45000 centipoise Cross-linked HA-3 27000 centipoise Cross-linked HA-4 8000 centipoise HA sodium salt 1500 centipoise Bovine testicle hyaluronidase was added to these solutions at a concentration of 0.09% by weight and reacted at 50°C.
The viscosity was measured after 35, 55, and 70 minutes, and the ratio to the viscosity before the reaction was calculated. The results are shown in Figure 1. In Figure 1, □ mark, △ mark
The marks, ○ and ● are cross-linked HA-2, respectively.
It represents the ratio of the viscosity of the acetic acid solution of 3, 4 and HA sodium salt to the viscosity before the reaction at each reaction time. From Figure 1, the cross-linked HA used in the present invention has higher resistance to hyaluronidase than HA;
It can be seen that the higher the crosslinking agent, the more remarkable the degree. Test Example 1 Relationship between crosslinking degree and viscosity of crosslinked HA HA sodium salt with molecular weights of 370,000 and 730,000
100mg each, 5.0ml of 1N sodium hydroxide
5 ml of ethanol and 25, 50, 100, and 200 microns of epichlorohydrin were added to the solution, and the mixture was reacted at 40°C for 2 hours. Preparation example (1) after reaction
Post-processing was carried out according to. Also, 75mg of HA sodium salt with a molecular weight of 1700000
in 7.5 ml of 1N sodium hydroxide, add 7.5 ml of ethanol and 40μ of epichlorohydrin or
80μ was added and reacted at 40°C for 2 hours. Furthermore,
Simultaneously with the above reaction, a reaction was carried out under the same conditions using [ 2-14C ]epichlorohydrin (obtained from Amasyam Japan), and the degree of crosslinking was calculated from the radioactivity of this labeled compound. Table 2 shows the relationship between the degree of crosslinking and viscosity. Table 2 shows that in crosslinked HA, there is a proportional relationship between the degree of crosslinking and the viscosity.
【表】【table】
【表】
試験例２ 架橋HAの非ニユートン指数
架橋HA−１と合成に使用したHAとの１％生
理食塩水溶液について回転粘度計（(株)東京計器製
Ｅ形粘度計）を用い、ずり速度を変え、37℃で粘
度を測定し、非ニユートン指数（ｍ＝ａ／ｂ）を算
出した。また、正常人の関節液及び変形性関節症
患者の関節液についても、同時に粘度を測定し、
非ニユートン指数を算出した。結果を図２に示
す。図２において、○印、●印、□印及び■印
は、それぞれ、架橋HA−１及びHAの１％生理
食塩水溶液並びに正常人の関節液及び軽度の変形
性関節症患者の関節液の各ずり速度における粘度
を表わす。
図２から、本発明に用いる架橋HA−１の１％
生理食塩水溶液は、正常人の関節液と非常に類似
した物理パターンを示すことがわかる。
試験例３ 架橋HAの曳糸性
架橋HA−１と合成に使用したHAの曳糸性を、
渡辺式曳糸性測定装置（池内宏、日本整形外科学
会雑誌，34，175（1960））を模して作製した装置
を用いて測定した。結果を図３に示す。図３にお
いて、○印、△印、●印及び○・それぞれ、架橋
HA−１の0.5％生理食塩水溶液、同１％生理食塩
水溶液、HAの１％生理食塩水溶液及びイヌの正
常関節液の各引き上げ速度における曳糸性を表わ
す。
図３から、本発明に用いる架橋HA−１は、関
節液と同様に曳糸性を有することがわかる。
試験例４ 急性毒性試験
４週令のddY系雄性マウスを１週間予備飼育し
た。試験開始時における実験に用いたマウスの体
重は21〜27ｇであつた。
前記マウスを各群15匹ずつに分け、それぞれに
ついて架橋HA−１の0.5％生理食塩水溶液１ml／
10ｇ体重（架橋HA−１ 500mg／Ｋｇ）、同１％
生理食塩水溶液１ml／10ｇ体重（架橋HA−１
1000mg／Ｋｇ）又は生理食塩水１ml／10ｇ体重を
腹腔内投与した。
アーウイン（Irwin）法に準じて毎日同時刻に
一般症状を観察した。投与後７日目に各群５匹ず
つを屠殺し、14日目に残りの生存マウスを屠殺
し、投与部位及び主要臓器の肉眼的観察を行なつ
た。その結果を以下に示す。
(i) 各群とも死亡例はなかつた。
(ii) 500mg／Ｋｇ投与群、1000mg／Ｋｇ投与群、
対照群とも一般症状、体重変化、摂取量、摂水
量に差はなかつた。
(iii) ７日目、14日目の剖検では対照群と500mg／
Ｋｇ投与群に差はなかつたが、1000mg／Ｋｇ投
与群についてのみ７日目、14日目とも腹腔内残
留液のウロン酸が対照群よりも多く、14日目で
3.6〜3.8mg／mlの架橋HA−１が残留している
と推定された。
(iv) 各群とも臓器への影響は殆どなかつた。
実施例１ 架橋HAの鎮痛効果
架橋HA−１について、次のようにして、その
鎮痛効果を検討した。
ビーグル犬を雌雄の別なく用い、一方の後肢の
膝関節腔内に疼痛物質として、ブラジキニン又は
アセチルコリンのそれぞれ20μｇ又は２mgを架橋
HA−12.5mg／0.5ml生理食塩水と同時に投与し、
投与側の後肢荷重の変動を経時的に測定した。ま
た、対照として架橋HA−１の代りに調製剤で原
料として用いたHAナトリウム塩５mg／0.5ml生理
食塩水を用いた。鎮痛効果は、正常時の50％荷重
回復時間をもつて比較した。結果を表３に示す。[Table] Test Example 2 Non-Newtonian index of cross-linked HA The shear rate was measured using a rotational viscometer (E-type viscometer manufactured by Tokyo Keiki Co., Ltd.) for a 1% physiological saline solution of cross-linked HA-1 and HA used in the synthesis. The viscosity was measured at 37° C. and the non-Newtonian index (m=a/b) was calculated. In addition, the viscosity of joint fluid of normal people and joint fluid of osteoarthritis patients was measured at the same time.
A non-Newtonian index was calculated. The results are shown in Figure 2. In FIG. 2, ○, ●, □, and ■ are cross-linked HA-1 and HA in 1% physiological saline solution, joint fluid of normal people, and synovial fluid of mild osteoarthritis patients, respectively. Represents viscosity at shear rate. From Figure 2, 1% of crosslinked HA-1 used in the present invention
It can be seen that the saline solution exhibits a physical pattern very similar to the synovial fluid of a normal person. Test Example 3 Threadability of crosslinked HA Threadability of crosslinked HA-1 and HA used for synthesis were
Measurements were made using a device modeled after the Watanabe style stringability measuring device (Hiroshi Ikeuchi, Journal of the Japanese Orthopedic Society, 34 , 175 (1960)). The results are shown in Figure 3. In Figure 3, crosslinking is indicated by ○, △, ●, and ○, respectively.
The stringiness is shown at each pulling speed of a 0.5% physiological saline solution of HA-1, a 1% physiological saline solution of HA-1, a 1% physiological saline solution of HA, and normal joint fluid of a dog. From FIG. 3, it can be seen that the crosslinked HA-1 used in the present invention has stringiness similar to synovial fluid. Test Example 4 Acute Toxicity Test Four-week-old ddY male mice were preliminarily bred for one week. The weight of the mice used in the experiment at the start of the study was 21-27 g. The mice were divided into groups of 15 mice, and each group was treated with 1 ml of a 0.5% physiological saline solution of cross-linked HA-1.
10g body weight (crosslinked HA-1 500mg/Kg), 1%
Physiological saline solution 1ml/10g body weight (crosslinked HA-1
1000 mg/Kg) or physiological saline (1 ml/10 g body weight) was administered intraperitoneally. General symptoms were observed at the same time every day according to the Irwin method. On the 7th day after administration, 5 mice in each group were sacrificed, and on the 14th day, the remaining surviving mice were sacrificed, and the administration site and major organs were macroscopically observed. The results are shown below. (i) There were no deaths in either group. (ii) 500mg/Kg administration group, 1000mg/Kg administration group,
There were no differences in general symptoms, weight changes, intake, or water intake between the control group and the control group. (iii) At necropsy on the 7th and 14th day, the control group and 500mg/
There was no difference between the Kg-administered groups, but only in the 1000 mg/Kg-administered group, uronic acid in the intraperitoneal fluid remained higher on both days 7 and 14 than in the control group;
It was estimated that 3.6-3.8 mg/ml of crosslinked HA-1 remained. (iv) There was almost no effect on organs in each group. Example 1 Analgesic effect of cross-linked HA The analgesic effect of cross-linked HA-1 was investigated in the following manner. Using beagle dogs of both sexes, 20 μg or 2 mg of bradykinin or acetylcholine, respectively, was cross-linked as a pain substance into the knee joint cavity of one hind leg.
Administer simultaneously with HA-12.5mg/0.5ml physiological saline,
Changes in hindlimb load on the administered side were measured over time. Further, as a control, HA sodium salt 5 mg/0.5 ml physiological saline, which was used as a raw material in the preparation, was used instead of crosslinked HA-1. The analgesic effect was compared using the normal 50% load recovery time. The results are shown in Table 3.
【表】
表３から、本発明の関節症治療剤は、２倍量の
HAナトリウム塩と同等の鎮痛効果を有すること
がわかる。
実施例 ２
卵白アルブミン生理食塩水溶液（10mg／ml）
0.5ml及びフロインド完全アジユバント生理食塩
水溶液（10mg／ml）0.5mlの混合溶液ウサギ12羽
（平均体重３Kg）の皮下内に10日間隔で３回感作
し、最終感作後９日目に卵白アルブミン生理食塩
水溶液（５mg／ml）0.2mlを抗原として膝関節腔
内に投与してアレルギー性関節炎を生じさせた。
架橋HA−１生理食塩水溶液（20mg／ml）0.1mlを
卵白アルブミン生理食塩水溶液（10mg／ml）0.1
mlとともに膝関節腔内に投与して、投与後３，７
及び14日目の関節腔内の滲出細胞数を測定した。
結果を表４に示す。[Table] From Table 3, the arthropathy therapeutic agent of the present invention has a double dose of
It can be seen that it has an analgesic effect equivalent to that of HA sodium salt. Example 2 Ovalbumin physiological saline solution (10mg/ml)
A mixed solution of 0.5 ml and 0.5 ml of Freund's complete adjuvant physiological saline solution (10 mg/ml) was subcutaneously sensitized to 12 rabbits (average weight 3 kg) three times at 10-day intervals, and on the 9th day after the final sensitization, egg white was applied. 0.2 ml of albumin saline solution (5 mg/ml) was administered as an antigen into the knee joint cavity to induce allergic arthritis.
Cross-linked HA-1 saline solution (20mg/ml) 0.1ml was added to ovalbumin saline solution (10mg/ml) 0.1ml.
ml into the knee joint cavity, 3,7 days after administration.
And on the 14th day, the number of exudate cells in the joint cavity was measured.
The results are shown in Table 4.
【表】
表４から、架橋HA−１の投与により、明らか
に滲出細胞数が減少したことがわかる。[Table] Table 4 shows that administration of cross-linked HA-1 clearly reduced the number of exudate cells.
【図面の簡単な説明】[Brief explanation of the drawing]
図１は、各種架橋HA及びHAをヒアルロニダ
ーゼ処理したときの粘度低下と時間との関係を示
す図である。図２は、架橋HA−１、HA並びに
正常人及び変形性関節症患者の関節液の粘度測定
結果を示す図である。図３は、架橋HA−１、
HA及びイヌの正常関節液の曳糸性測定結果を示
す図である。
FIG. 1 is a diagram showing the relationship between viscosity reduction and time when various crosslinked hyaluronan and hyaluronan are treated with hyaluronidase. FIG. 2 is a diagram showing the viscosity measurement results of crosslinked HA-1, HA, and synovial fluid of normal people and osteoarthritis patients. Figure 3 shows cross-linked HA-1,
It is a figure which shows the stringiness measurement result of HA and the normal joint fluid of a dog.