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JPH0576960B2 - - Google Patents
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JPH0576960B2 - - Google Patents

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JPH0576960B2
JPH0576960B2 JP61500863A JP50086386A JPH0576960B2 JP H0576960 B2 JPH0576960 B2 JP H0576960B2 JP 61500863 A JP61500863 A JP 61500863A JP 50086386 A JP50086386 A JP 50086386A JP H0576960 B2 JPH0576960 B2 JP H0576960B2
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YUNIBASHITEI OBU NYUU MEKISHIKO
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Description

請求の範囲 １ カルボキシ化ポリエチレングリコールを、カ
ルボキシ活性化剤で反応させ、ポリエチレングリ
コール活性エステル中間体を形成し、該活性エス
テル中間体を、抗体と反応させ、PEG修飾抗体
を形成することにより得られ、前記PEG修飾抗
体は、生物学的に活性で、ポリエチレングリコー
ルと共有結合的にしており、修飾していない抗体
と比べて、低減した免疫原性と、低減した非特異
的反応性を有し、そして、修飾していない抗体と
比べて、高められた特異的反応性を有しているこ
とを特徴とするPEG修飾抗体。 ２ 該ポリエチレングリコールは、1000〜5000の
分子量を有する置換或いは非置換ポリマーである
請求の範囲第１項記載のPEG修飾抗体。 ３ 該ポリエチレングリコールは、モノメトキシ
ポリエチレングリコールである請求の範囲第１項
記載のPEG修飾抗体。 ４ 該カルボキシ化ポリエチレングリコール試薬
は、基本的に非免疫原性で、得られた修飾抗体
は、基本的に非毒性で、非免疫原性であることを
特徴とする請求の範囲第１項記載のPEG修飾抗
体。 ５ 該抗体分子の上のTNBS有効のアミノ基の
少なくとも10％は、ポリエチレングリコールと共
有結合的に修飾されていることを特徴とする請求
の範囲第１項記載のPEG修飾抗体。 ６ 該抗体は、モノクロナール抗体であることを
特徴とする請求の範囲第１項記載のPEG修飾抗
体。 ７ 該ポリエチレングリコールは、モノメトキシ
ポリエチレングリコールである請求の範囲第６項
記載のPEG修飾抗体。 ８ 該抗体分子の上のTNBS有効のアミノ基の
35％は、モノメトキシポリエチレングリコールと
共有結合的に修飾されていることを特徴とする請
求の範囲第１項記載のPEG修飾抗体。 ９ 該抗体分子の上のTNBS有効のアミノ基の
10％〜20％は、モノメトキシポリエチレングリコ
ールと共有結合的に修飾されていることを特徴と
する請求の範囲第８項記載のPEG修飾抗体。 １０ 該カルボキシ化ポリエチレングリコール
は、サクシニル化ポリエチレングリコールである
請求の範囲第１項記載のPEG修飾抗体。 １１ 該ポリエチレングリコールは、モノメトキ
シポリエチレングリコールである請求の範囲第１
０項記載のPEG修飾抗体。 １２ 該修飾抗体は、非修飾の抗体と比べて、増
加した生物学的な特異性により特徴づけられてい
る請求の範囲第１項記載のPEG修飾抗体。 １３ 活性部分と複合化された請求の範囲第１項
記載のPEG修飾抗体。 １４ 該活性部分が、放射活性ヌクレオチド、薬
剤、トキシン或いは螢光体である請求の範囲第１
３項記載のPEG修飾抗体。 １５ 該抗体は、抗腫瘍抗体である請求の範囲第
１４項記載のPEG修飾抗体。 １６ カルボキシ化ポリエチレングリコールを、
カルボキシ活性化剤で反応させ、ポリエチレング
リコール活性エステル中間体を形成し、該活性エ
ステル中間体を、抗体と反応させ、PEG修飾抗
体を形成することにより得られ、生物学的に活性
で、ポリエチレングリコールと共有結合的に結合
しているPEG修飾抗体を、活性免疫組織化学剤
として、含有することを特徴とする免疫組織化学
処理用の試薬。 １７ カルボキシ化ポリエチレングリコールを、
カルボキシ活性化剤で反応させ、ポリエチレング
リコール活性エステル中間体を形成し、該活性エ
ステル中間体を、抗体と反応させ、生物学的に活
性で、ポリエチレングリコールと共有結合的に結
合しているPEG修飾抗体を形成することを特徴
とするPEG修飾抗体の製造方法。 １８ ポリエチレングリコールは、モノメトキシ
ポリエチレングリコールである請求の範囲第１７
項記載のPEG修飾抗体の製造方法。 １９ カルボキシ化ポリエチレングリコールは、
サクシニル化ポリエチレングリコールであり、カ
ルボキシ化活性剤は、Ｎ−ヒドロキシサクシンイ
ミドであることを特徴とする請求の範囲第１７項
記載のPEG修飾抗体の製造方法。 (1) 発明の技術分野 目標組織との抗体の免疫反応に依存しているタ
イプの診断法及び治療法は、治療に適用中の試薬
の免疫原性、及び細胞表面Fc受容体への結合の
両者により、しばしば妨害されるものである。抗
体及び他の異種たんぱく質に対する免疫反応は、
アレルギー現象とたんぱく質の不活性化との両者
により特徴付けられ、ホスト免疫システムの刺激
作用を減ずるたんぱく質処置により迎撃されなけ
ればならない、一方、所望のたんぱく質生物学的
活性を保持している。更に、細胞表面受容体に対
するFc結合を減少或いは、除去することにより、
抗体特異性を増加せしめることが望ましい。 (2) 関連技術の記述 種々のたんぱく質修飾処理法が、外部たんぱく
質の免疫原性を低減するために使用されてきた。
特に、抗体活性を破壊しないで異種抗体に対する
ヒト免疫反応を抑制することは、以前より、分子
のFc断片を分割する抗体の酵素消化により行な
われてきた。生成Ｆ（ab）1断片は、抗原に対する
結合能力を保持し、そして、種々の化学剤と結合
し、低い免疫原性の複合体を与えることができ
る。然し乍ら、抗体のプロテアーゼ消化は、低い
収率で遅い処理過程のものであり、生成断片の分
離を必要とするものである。 より魅力的な研究方法は、高い抗原結合能力と
低い免疫原性を有し、そして、殆ど毒性のない生
成物を与える抗体の化学的な修飾法であつた。こ
のように提案された修飾法は、治療上有用な酵素
に対するポリエチレングリコール（PEG）のポ
リビニルアルコールのような親和性ポリマーの既
知免疫阻害性効果に広く基づいていたものであ
る。次のものを参照；J.Biol.Chem.252：3578−
3586（1977）；Biochim.Biophys.Acta.660：293−
298（1981）；Clin.Exn.Immunol.46：649−652
（1981）；Biochim.Biophys.Acta.578：47−53
（1979）；Int.Arch.Allergy.Appl.Immunol.56：
159−170（1978）；J.Immumol.126：406−413
（1981）；及びInt.Arch.Allergy.Allergy.Appl.
Immunol.63：１−13（1980）。然し乍ら、これら
の報告された修飾処理法は、抗体に一般的に適用
されなかつた。例示的研究では、
Radioimmunoimaging and
Redioimmunotherapy、Elsevier Science
Publishing Co.New York、1983、に報告され
るように、うさぎ抗ヒト血漿アルブミンの6000の
PEG誘導体を、PEGによるアルブミンの修飾で
用いた（J.Biol.Chem.252：3578−3581、1977）
と同様な塩化シアヌル結合法を用いて製造した。
その生成物は低減された免疫原性を示したが、抗
原に対する結合活性の損失は受け入れられない程
のものであつた（結合容量が70％近く減少した）。
同様の結果が関連した研究J.Immunol.
Methods-59：327（1983）でも得られた、これは、
塩化シアヌルにより媒介されたたIgのPEG修飾
処理が抗体活性を破壊したものと結論するもので
ある。 発明の概略 本発明は、PEG修飾抗体に関し、カルボキシ
化ポリエチレングリコールを、カルボキシ活性化
剤で反応させ、ポリエチレングリコール活性エス
テル中間体を形成し、該活性エステル中間体を、
抗体と反応させ、PEG修飾抗体を形成すること
により得られる。そのPEG修飾抗体は、生物学
的に活性で、ポリエチレングリコールと共有結合
的にしており、修飾していない抗体と比べて、低
減した免疫原性と、低減した非特異的反応性を有
し、そして、修飾していない抗体と比べて、高め
られた特異的反応性を有し、抗原結合活性を保持
しながら、細胞表面Fc受容体（receptor）の結
合容量が低く、免疫原性が低減されてい、貯蔵安
定性がすぐれ、毒性な少ないことで特徴ずけられ
ている。そして、通常の免疫学的技法、例えば、
腫瘍イメージング、化学療法、放射線療法及び免
疫組織化学処理法等に有用である。モノクロナー
ル抗体を含む診断用及び治療用抗体を、本発明に
より修飾でき、低減された免疫原性と低い非特異
性生物学的活性を有するPEG修飾抗体を与える
ことができる。
【図面の簡単な説明】
第１図は、mPEGコハク酸塩のＮ−ヒドロキシ
−コハク酸エステルにより修飾されたうさぎ抗−
コナルブミンのSDS−デイスクゲル電気泳動分析
を示す。このゲルは、コオマシイブルー
（coomassie blue）で着色されて、600nｍでのデ
ンシオメータでスキヤンされたものである。図中
の数字はmPEG修飾アミノ基のパーセントに相当
するものである。 第２図は、Ha／ICTマウスに対して与えられ
た50μｇのうさぎ抗−CALBの免疫原性を示し、
第２工程として、うさぎ抗−マウスIgG−燐酸ア
ルカリ塩試薬でEIA滴定を用いて、評価したもの
である。免疫化時期は、矢印で示す。非修飾のう
さぎ抗−CALBにより引き出された抗−うさぎ
IgG反応は、三角印で示される。PEG修飾で引き
出された反応（アミノ酸基の18％）は丸印で示さ
れる。 第３図は、免疫原性に対するうさぎ抗−コナル
ブミンのmPEG−修飾の効果を示すものである。
スイスマウスがPBS中の50μｇの抗原で免疫化さ
れ、そして、抗体反応は酵素免疫−アツセイを用
いて評価したものである。パネルＡは、第１次免
疫化後12日目の抗体滴定量を示し；パネルＢは第
１次免疫化後18日目、第２次免疫化後３日目の抗
体滴定量を示し；そして、パネルＣは第１次免疫
化後35日目で第３次免疫化後９日目の抗体滴定量
を示す。 第４図は、mPEG修飾されたうさぎ抗−コナル
ブミンで処理した効果を示し、非修飾うさぎ抗−
コナルブミンに対する抗体反応について示す。ス
イスマウスについての非処理のもの（●）或い
は、50μｇの非修飾うさぎ抗−コナルブミンで免
疫化したもの（▲）で、非修飾うさぎ抗−コナル
ブミン50μｇで免疫化前５日及び20日でのもので
ある。（日数20）。マウス抗−うさぎ免疫グロブリ
ンの滴定量は、酵素−結合のアツセイを用いて測
定した。 第５図は、P388.D1細胞に対する免疫複合体の
結合性を示す。免疫複合体はうさぎ抗−コナルブ
ミンと螢光体（フルオレセイン）標識ニワトリ卵
コナルブミン（３モルのコナルブミン／１モル抗
体）から製造した。各免疫複合体106個の細胞か
らのアリコートを30分間横軸に示した免疫複合体
の濃度で培養した。螢光細胞の数は流動サイトメ
トリ（血球計数）により測定した。 第６図は、３モルの螢光体標識ニワトリ卵コナ
ルブミンと１モルのmPEG−修飾のうさぎ抗−コ
ナルブミンとを用いて製造した免疫複合体の、
P388.D1細胞に対する結合性を示す。各免疫複合
体40μｇ（第５図のデータより決めた）のアリコ
ートを、106個のP388.D1細胞で30分間培養した。
螢光細胞の数は流動血球計数により測定した。％
mPEG修飾はTNBSアミノ基分析により確立し
た。自己螢光性は17％の細胞に見られた。異なる
符号は異なる日数で異なる試料PEG−修飾抗体
により行なわれた実験を示す。 第７図は、106個のマウス脾臓細胞に対する螢
光体標識のうさぎ抗−マウス免疫グロブリン
（▲）及びmPEG−修飾された螢光体標識アフイ
ニテイー精製うさぎ抗−マウス免疫グロブリン
（●）の結合性を示すものである。パネルＡは抗
体濃度の関数としての螢光細胞の数を示す。パネ
ルＢは螢光強度が流動血球計数上より消える細胞
の数を示す。 第８図は、マウス脾臓細胞に対する螢光体標識
のうさぎ抗−マウス免疫グロブリンの結合性を競
合的に抑制することを示す。横軸に示す量の精製
マウスIgGを8μｇの螢光体標識のうさぎ抗−マウ
ス免疫グロブリン（▲）の存在下、或いは、
mPEG−修飾された同じ試薬8μｇ（●）の存在
下で、そして、１×106ネズミの脾臓細胞存在で
培養したものである。細胞をPBSで洗浄した後、
螢光細胞の数を流動血球計数により測定した。こ
の実験中、自己−螢光が８％の細胞中に見られ
た。抑制剤の添加なしで、mPEG−修飾された抗
体が細胞の39％そして非修飾の抗体65％を検出し
た。 第９図は、mPEG−修飾で、螢光体−標識抗体
の螢光発光スペクトルに対する修飾処理の効果を
示す。アフイニテイー精製うさぎ抗−マウス免疫
グロブリン試薬を、FITCで、3.7（Ｍ）のＦ／Ｐ
比に修飾したものである。この試薬の分画を
mPEG（30％のアミノ基修飾）で修飾し、そして、
mPEG−修飾の螢光体−標識抗体の螢光発光スペ
クトル（▲）、及び非修飾の螢光体−標識抗体の
螢光発光スペクトル（●）は、0.80mg／mlで、
0.30cmのキユベツト中で、493nｍの励起波長の
AMICO螢光分析光度計を用いて測定した。 好適な具体的実施例の説明 本発明によると、異種たんぱく質の、特に抗体
の、免疫原性が、ポリエチレングリコール
（PEG）により、PEG活性エステル中間体を用い
て、たんぱく質の共有結合的修飾が行なわれるこ
とにより、低減され、或いは、除去されるもので
ある。既知の先行技術の修飾法とは逆に、本発明
方法による抗体のPEG修飾法により、抗原に対
する結合活性を保持する一方、低減された免疫原
性を有する誘導体が供される。本発明の特別の利
点は、特異性のない結合性が著しく低減され、そ
れは抗体分子のFc部分を不活性化するに貢献す
るものと信じられるものである。従つて、本方法
は抗体の細胞表面Fc受容体に対する結合性を基
本的に除去し、そして、腫瘍イメージング法及び
免疫組織化学技法の如き応用に於て目標組織での
抗体濃度を増大するものである。 本発明方法で有用な特定PEGポリマーには、
約1000〜5000の分子量を有する置換或いは、非置
換のPEGポリマーがあり、それ自体は低い免疫
原性であり、活性エステル中間体を用いてたんぱ
く質と結合させることもでき；得られる修飾たん
ぱく質は、生物学的に活性であり、基本的に非毒
性で非免疫原性でなければならない。モノメトキ
シポリエチレングリコール（mPEG）は、これら
の基準を満足し、そして、特に抗体に対して適す
るグリコール（mPEG）である。本発明の活性エ
ステル研究方法を用いて抗体の共有結合的mPEG
修飾が、結合活性を全部保持しながら達成され、
そして、非常に予想可能で再現可能な修飾処理が
得られる。 本発明によるたんぱく質修飾処理は、たんぱく
質分子上にTNBS利用性（入手性）（トリニトロ
ベンゼンスルホン酸−利用性）のアミノ基への
PEGの共有結合的付加を通して生じるものであ
る。PEG−修飾の誘導体の免疫原性は、修飾の
程度により変わり、それは、活性エステル対たん
ぱく質の比率を適当に選択することにより容易に
制御される。（利用できる修飾アミノ基の約10〜
20％を典型的に有する）誘導体の生成の最適範囲
において、多くの抗体が通常の診断用或いは、治
療用の量で修飾された抗体にさらされることによ
る免疫反応を生じないものである。修飾の高いと
きも低いときも、免疫原性は、たんぱく質及び使
用したPEG修飾に依存して保持され或いは、高
められもする。一般的に、mPEGで修飾されたア
ミノ基13〜18％を有する免疫グロブリン分子は検
出可能な免疫原性に欠け、然し乍ら、修飾が低く
ても高くても、mPEG−抗体複合体は、非修飾分
子に対する免疫反応を誘導し、多くの場合、抗体
反応の高まりが見られる。本発明方法の抗体−
mPEG誘導体は、35％未満の修飾されたアミノ基
を持つ完全な抗原結合活性を保持している；非常
に過剰量の活性エステルを用いても、mPEGによ
る、約35％以上の利用できるアミノ基を修飾する
ことは、困難であると証されているので、この点
についてmPEGによる修飾処理は自己規制的であ
り、有利なものである。利用できるように低減さ
れた免疫原性をもつ多くのたんぱく質−mPEG誘
導体は、所望の処理条件下で効果的な抗原結合活
性をも保持するものであることを目指すものであ
る。本明細書に述べた修飾生成物は、分子の分布
を含めてのものであるので、述べた修飾の程度は
この分布の平均値であることに注意すべきであ
る。その範囲は精製の程度に依存することがで
き、特に、利用できるように低減された免疫原性
は、出発原料の精製を高めると、より広い修飾範
囲にわたり得ることができるものである。 PEGは、本発明に従いたんぱく質分子に次の
如く共有結合的に付着される： (1) PEG＋カルボキシ化剤→PEG−COOH (2) PEG−COOH＋カルボキシ基活性化剤→
PEG−COOH（PEG*）の活性エステル (3) たんぱく質＋PEG*→たんぱく質−PEG これらの式に要約されるように、PEGはカル
ボキシル化され、そして、精製された生成物
（PEG−COOH）は適当なカルボキシル活性化剤
でエステル化され、活性なエステルPEG*が形成
される。次に、この活性エステル中間体をたんぱ
く質分子と結合せしめるが、活性化部分の損失を
伴うものである。上記のように、修飾処理は、た
んぱく質分子の分布、PEGで種々に修飾された
たんぱく質分子の分布を与えるものである；その
生成物は、より正確には、たんぱく質−（PEG）x
（ｘは、たんぱく質分子上のPEG基の数である。）
として示される。PEG基の数ｘは、たんぱく質
分子上にある反応性アミノ基の数により変化する
ものである。精製されていない反応生成物を用い
るときは、置換されていないたんぱく質（ｘ＝
０）の量を小さくし、裸のたんぱく質分子に免疫
反応が導入される可能性を回避することが重要で
ある。 PEGをカルボキシル化しPEG−COOHにする
こと、PEGを活性化し、活性エステル中間体
PEG*にすることは、当業者に既知の数種の方法
により達成できるものである。コハク酸無水塩の
如きカルボキシル化剤を用いるもの、酸化処理と
ウイリアムソンのエステル合成法の如き古典的教
科書的方法を含む方法により達成できるものであ
る。特に有用な具体例では、選択されたたんぱく
質種を先ず無水コハク酸でスクシニル化し、
PEG−COOHを反応工程(1)により形成する；
PEG−COOH（スクシニル化された）を次にＮ−
スクシンイミドでエステル化し、活性エステル
PEG*を反応工程(2)により形成する。Ｎ−ヒドロ
キシスクシンイミド活性エステルを次に所望のた
んぱく質と反応せしめ、PEG−たんぱく質接合
体を反応工程(3)により形成し、エステル化部分の
損失を伴う。PEG−COOHを活性化する有用な
タイプのカルボキシル−活性化剤は、当業者によ
く知られており：Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド
の他に、トリニトロフエノールはその１例であ
る。PEGをたんぱく質と結合させるための上記
のような既知の先行技術とは逆に、本発明の方法
は、生物学的特異性を保持しながら、しかし、基
本的に非特異性の反応性をなくした活性の非毒性
生成物を供するものである。 本発明方法は、哺乳動物に、特に、ヒトに投与
されたときに、その免疫原性を低減できるたんぱ
く質の広い範囲に適用可能なものである。本方法
は特に異型（heterologous）の種のたんぱく質の
免疫原性を低減するには有用であり、一方、本方
法また相同性の（homologous；同類の）種のた
んぱく質にも適用できる。抗体は本発明方法によ
るものと同じように特別の関心のたんぱく質であ
り、そして、抗体分子の特異性及び結合活性は保
持しているものである。一方、抗体分子の細胞
Fc受容体に対する非特異性結合及び抗体の循環
からの急速な浄化は、なくなる。薬剤、毒素、螢
光物質、放射性核種或いは、他の活性部分は、選
択組織に、特に、腫瘍組織に、診断用或いは、治
療用に分配するための当業者に理解できる原理に
従いPEG置換基を通して修飾抗体分子に容易に
付着され得る。PEG−修飾された抗体或いは他
のたんぱく質により接合された活性部分を有する
複合体は、非特異性の活性が低減されていること
に依存して、複合体の時期尚早の解離が回避さ
れ、そして、高い選択的分配が達成される。 本発明により修飾されたモノクロナール抗体
は、ねずみ起源の非修飾のMAbsを治療用にする
と、増加し、ホストの異種たんぱく質に対する免
疫反応であり、その両者は、MAbを不活性化し、
アレルギー反応或いは血清病を起こす能力を有す
る。ヒト抗体を治療に使用すると、このような免
疫反応を部分的になくするができる；然し乍ら、
ヒトMAbは、免疫反応を刺激できるアロタイプ
及びイデオタイプの抗原位置を有するものであ
る。更に、活性部分を付着した無傷のヒトMAb
で処理すると、ハプテン−接合のたんぱく質で免
疫化すると同等であり、それは、抗ハプテン反応
を刺激できたものである。従つて、ヒト及び動物
のMAbの本発明に従う修飾処理は、これらの全
ての免疫反応を消去することを、特に意図するも
のである。 本発明の修飾抗体は、また、既知の組織及び細
胞染色処理で、無傷の抗体の置換物として、有用
であり、細胞のFc受容体と抗体のFc部分との間
に干渉があることにより、非−特異性の染色を回
避できるものである。本発明により修飾できる他
のたんぱく質は、酵素、特に、置換治療に治療的
に有用である酵素を含む。一般的に、本発明は、
試験管内及び生体内の両方で用いられるたんぱく
質に適用できるものであり、そのとき、免疫学的
処理法は、たんぱく質の、及び／或いは、非−特
異性の組織の結合の免疫原性により妨害される。 次の実施例は、本発明の実施を例示するのもの
である。 実施例 物質と方法 抗−コナルブミン抗体の製造 うさぎ抗−コナルブミン抗血清は、にわとり卵
コナルブミン（シグマ、St.Lous、MO）をフロ
インド（Freund′s）接合体（アジユバント）
（Gibco Laboratories、Grand Island、NY）に
より、乳化し、PEG中に溶解せしめ、1.0mg／ml．
の最終濃度のコナルブミンを得ることにより製造
された。うさぎは、そのフツドパツド中で乳化液
1.0mlのアリコートにより免疫化され、12−14日
後に皮下注射により１mgの乳化抗原で促進され
た。免疫化うさぎから取つた血液試料を、通常の
ように、オクテロニー分析により抗体含有率につ
いて監視した。高い滴定量での、後の過程での
み、抗血清を残りの実験で用いた。 抗−コナルブミン抗体が、CM−バイオゲル
（バイオ−ラツド ラボラトリ；Bio−Rad
Laboratories、Richmond、CA）上のアフイニ
テイクロマトグラフイにより、うさぎ抗血清から
単離された、それを、水溶性カルボジイミド処理
（Bio Rad Lab.Chem.Div.、Tech.Bul.1075、
Richmond CA.1980）を用いてコナルブミンに結
合せしめた。簡略すれば、抗血清をアフイニテイ
カラムにかけ、カラムを0.5Ｍチオシアン酸ナト
リウムで洗浄し、得られた抗体を同時に脱塩し、
Micro Pro di Con装置（Bio Moleculare
Dynamics、Beaverton、OR）を用いて濃縮し
た。精製された抗体を４度で滅菌保存した。 抗−コナルブミン活性の測定 アフイニテイ精製され、そして、化学的に修飾
された抗体の抗原結合活性は、うさぎ抗−コナル
ブミン−アルカリフオスフアーゼ接合体のコナル
ブミン−被覆のミクロエリーサプレート
（Vangard、Neptune、NJ）に対する結合性を競
合的に抑制する能力を評価することにより測定さ
れた。このアツセイで酵素結合した抗体は、アバ
ルメース（Avermeas；Immuno.Chem.６：43、
1969）により説明された方法の修飾処理により製
造された、そして、最大感度を確認するために、
アツセイで使用される前に抗原被覆のプレートの
上で滴定された。コナルブミン被覆のミクロエリ
ーサプレートは、コナルブミンを0.05Ｍ
NaHCO3中にPH9.6で10μｇ／mlに希釈し、室温で
18時間培養することにより製造した。次に、適当
な希釈度の、抗体と酵素接合体との等量を、抗原
被覆プレート中に、室温で２〜５時間定常的に混
合しながら、培養した。H2Oでそのプレートを
洗浄し、0.1Nのトリス−Cl（Tris−Cl）、PH10中
のｐ−ニトロフエニルフオスフエート0.25mg／ml
の300mlのアリコートを各試料に添加し、そして、
適当に培養した後に、ダイナテツクミクロリーサ
（dynatech microelisa）読取計（Dynatech、
Alexandria、VA）を用い、410nｍと650ｍの吸
収を測定した。全てのテストで、修飾された抗体
は、非修飾のアフイニテイ精製抗体の標準曲線で
同時にアツセイされた、そして、データは、比較
１mg抗体／mgたんぱく質として示される。この結
合アツセイにおいて、非修飾のアフイニテイ精製
抗体は、１mg抗体／mgたんぱく質の値を持つもの
として定義される。抗原結合をブロツクするか或
いは、抗体を変性する化学的修飾処理は、この数
の減少により特性指摘がされる。 修飾抗体の特性（Characterization） ３つの異なる測定法が、修飾抗体を特性指摘す
るために使用された。たんぱく質濃度は、Ｅ％
280nｍ＝14と仮定し、280nｍでの光学的濃度測
定（Methods Immunol.Immunochem.2：343、
1968）により、及び、染料結合アツセイ
（Analyt.Biochem.72：248、1976）をうさぎガン
マーグロブリンと共に使用することの両方法によ
り、測定された。標準の濃度は、ケルダール
（Kjeldahl）消化のネスラー化（Stanford.Med.
Bull.6：97、1948）により評価された。たんぱく
質アミノ基は、Habeed（Analyt.Biochem.14：
328、1966）により説明されたTNBS滴定により
測定された。PEG修飾の程度は、たんぱく質の
大きさの増加を測定することにより評価された。
この測定のために、たんぱく質の大きさは、６％
不連続SDS電気泳動ゲルシステムを用いて評価さ
れた。然し乍ら、球状たんぱく質の標準曲線に基
づくポリマー修飾の免疫グロブリンのSDSゲルの
大きさの計算は、大きな誤差を含むものである。
従つて、結果は、付加たんぱく質標準なしで、移
動距離を示すものとして報告される。 免疫原性の測定 うさぎ抗体とそのPEG−修飾の誘導体の免疫
原性は、PEG中の50μｇ抗原（うさぎ抗体）を腹
腔内注射に対するスイスマウスの抗体反応を測定
することにより決定した。マウス抗体反応は、２
段階酵素結合アツセイを用いて測定された。簡単
に云えば、マウス血清の２倍希釈したもの数個
を、２〜５時間うさぎ免疫グロブリン被覆ミクロ
エリーサプレート上で培養した。よく洗浄した
後、プレートを、うさぎ抗−マウスアルカリフオ
スフアターゼ接合体で、更に２〜５時間培養し
た。この第２の培養の後に、非結合の接合体を、
H2Oでよく洗浄することにより除去した、そし
て、各試料プレートを300mlのｐ−ニトロフエニ
ルフオスフエート、0.25mg／mlの0.1Nトリス−Cl
溶液（PH10）で再充填した。２時間の培養時期の
後に、410nｍと630nｍの吸収率を前記の如く測
定した。このシステムで、抗体滴定量は、最大希
釈のものとして規定され、プレブリードレベル以
上に顕著な吸収が読み取れる。 化学的修飾法 ２つの異なる研究法を、抗体のmPEGによる修
飾に用いられた。モノメトキシポリエチレングリ
コール（av MW＝5000）Aldrich.Milwaukee、
WI）を、アブチエウスキー（Abuchewski：J.
Biol.Chem.252：3578、1977）により説明される
塩化シアヌル酸（Eastman Chemical Co.、
Rochester、NY）処理法を用いて抗体に結合せ
しめた。更に、mPEGも、活性エステル中間体を
用いて抗体に結合せしめる。この誘導体を製造す
るために、mPEGを、乾燥ピリヂン中の無水コハ
ク酸（Aldrich）過剰量を用いて、スクシニル化
せしめた。ピリヂンは、フラツシユ蒸留と凍結乾
燥の組合わせにより除去した、そして、汚染コハ
ク酸は、透析により除去した。精製されたmPEG
コハク酸塩は、凍結乾燥され、モレキユラーシー
ブ4A（Matheson Coleman ＆ Bell、
Nodwood、OH）上の塩化メチレン中で乾燥さ
れた。mPEGコハク酸塩を、次に、DCC
（Aldrich）とＮ−ヒドロキシスクシンイミド
（Aldrich）との等モル混合物中でエステル化し
た。そして、得られたＮ−ヒドロキシスクシンイ
ミドエステルを、石油エーテル沈殿法により除去
した。mPEGコハク酸のＮ−ヒドロキシ−スクシ
ンイミドエステルは、石油エーテルでベンゼンの
繰り返し再結晶化精製により精製された、そし
て、次に、乾燥DMFに溶解せしめ、抗体溶液と
急速に混合せしめ、0.7Ｍ、NaHCO3PH9.6中で修
飾せしめた。修飾の程度は、活性エステルと抗体
との比率を変化せしめることにより、制御され
た。得られたmPEG修飾抗体は、PBSに対して
の完全透析により精製された。 FITCによるたんぱく質の修飾 コナルブミン（Sigma Chemical Co.、St.
Lous.MO）の試料及びアフイニテイ精製うさぎ
抗−マウス免疫グロブリンを、ゴデイング；
Goding（J.Immunol.Meth.13：215、1976）の方
法を用いて、FITCにより螢光体標識化を行なつ
た。１モルのたんぱく質当り２〜４モルの螢光体
を含有するたんぱく質試料のみを、次の研究に用
いた。 ポリエチレングリコール修飾法 アフイニテイ精製うさぎ抗体を、モノメトキシ
ポリエチレングリコールコハク酸塩のＮ−ヒドロ
キシスクシンイミドエステルを用いて、ポリエチ
レングリコールで修飾した（平均分子量＝5000）。
各修飾された製造物に対して、修飾の程度は、
TNBSアミノ基分析（Anlyt.Biochem.14：328、
1966）及び６％ポリアクリルアミドゲル上の非還
元性のSDS−ゲル電気泳動分析（Nature227：
680、1970）の両方により確立した。 細胞表面結合性の評価 細胞表面に対する、抗体製造物の免疫複合体の
結合性を評価するために、１×106細胞のアリコ
ートを、PBS中のテスト試薬で０度で30分間培
養せしめた。この初期培養に続いて、非結合物質
が、細胞を３回０度PBSで洗浄することにより
除去された。最終細胞ペレツトは、１mlのPBS
中に再懸濁され、螢光活性化細胞ソーター
（Becton Dickinson、Sunnyvale、CA）を用い
て細胞数が、分析された。各分析において、1000
以上の細胞が計数された。また、細胞は、螢光顕
微鏡で検査され、細胞表面螢光が調査確認でき
た。２つの細胞集団がこれらの実験に用いられ
た。脾臓細胞をスイスマウス（Sprague−
Dawley、Madison、WI）から得た、そして、汚
染脾臓細胞は、塩化アンモニウム技法（Mishell
et al、Preparation of Mouse Cell
Suspensions in Selected Methods of Cellular
Immunology［B.Mishell and S.Shiigi、eds.］
W.H.Freeman and Col.、San Francisco、
p.23、1980）を用いて分析された。 細胞ライン ネズミマクロフアージラインP388.D1を、実験
室中で、アメリカンタイプテイツシユーコレクシ
ヨン（American Type Tissue Colleotion.
Bethesda Maryland.）から当初得た株から成長
せしめた。 例 １ 抗体活性に対するmPEG修飾の効果 塩化シアヌル酸及び活性エステル結合法を用い
て、抗体活性に対するmPEG修飾処理の効果を、
第１及び２表に報告する。これらの結果から、低
い修飾の程度でも、塩化シアヌル酸との抗体結合
活性が顕著に減少することがあることが明らかで
ある。活性化PEGの速度と形状を変化させる実
験が、反応時間と温度を変化させる実験と並行さ
せて行なうが、活性抗体の回収率に顕著な向上は
なかつた。これに対して、PEGによる抗体の修
飾のために活性エステルを用いると、抗体滴定量
或いは、抗体活性に検知できる損失はなかつた。
【表】
【表】 例 本発明に従いmPEGによる例の抗体の修飾の
効果 抗体がこの処理法により著しく修飾されること
を実証するために、全てのmPEG−修飾抗体製造
物を、SDSゲル電気泳動分析により分析した。誘
導体の１シリーズの例を第１図に示す。この実験
から得た結果により、その分布の殆ど或いは、全
ての分子が、修飾され、そして、見掛け分子量
は、修飾処理につれて増大することが示される。
然し乍ら、修飾されたテスト抗体は、抗体当り
PEG分子の異なる数を含む各分子の分布である
ことを注意すべきである。従つて、報告された修
飾％は、この分布の平均値である。 例 本発明により修飾されたうさぎ抗−コナルブミ
ンの免疫性 非修飾のうさぎ抗体の免疫原性に比較して、
mPEG修飾うさぎ抗−コナルブミン（修飾された
アミノ基18％）（活性エステル結合剤）の、スイ
スマウスの免疫原性が、第２図に示される。この
図は、適切な修飾条件下で、うさぎ抗体の免疫原
性が基本的に消去され得ることを明示している。
この実験中で試験された修飾抗体は、完全な抗原
結合活性を保持していた。修飾うさぎ抗体の、マ
ウス中の免疫原性に対するmPEG含有量の変化の
効果が第３図に示される。同様な結果が、第１
次、第２次或いは、第３次の免疫化の後に見ら
れ、これらの結果は、塩化シアヌル酸処理法で製
造したうさぎ抗体（例）で見られるものと本質
的に同等なものである。塩化シアヌル酸で製造し
た誘導体と逆に、この実験でテストした全てのう
さぎ抗体が、完全な抗体活性を保持していたこと
を強調すべきである。同様の結果が、抗−ヒト血
清アルブミン抗体でも得られた。 例 うさぎ抗体に対するマウス免疫反応の評価 Ａ mPEG−修飾抗体に対する反応がないこと
は、免疫的な許容量導入によることの可能性を
なくするために、スイスマウスを、非免疫原性
のmPEG−修飾の抗体50μｇで２回免疫化し
た。免疫化動物が、本発明に従い、mPEGで修
飾されたうさぎ抗体に対する反応がないことを
測定した後に、免疫動物及び、もとの参照動物
に、修飾されていないうさぎ抗体50μｇアリコ
ートを注入した。この注入後12日目、マウス抗
−うさぎ免疫グロブリンを測定した。この実験
の結果は、第４図に示され、うさぎ抗体に対す
る２つの群の動物の反応に差がなかつたことが
示され、それは、mPEG−修飾の抗体は、実験
動物を、寛容化（耐性化）も、プライミング化
もしないことを示唆している。 Ｂ 上記Ａで、mPEG−修飾のうさぎ抗体のいく
つかにより導入された過応答性は、PEGの接
合体特性を評価することにより研究された。ス
イスマウスを、存在PEG濃度を１mg／mlにま
で変化させて、うさぎ免疫グロブリン50μｇで
免疫化し、15日後に抗体反応性を測定した。こ
の実験において、PEGは、うさぎたんぱく質
に共有結合的に付着しなかつた。その結果は
（データは示せず）、いかなる試料でも免疫原性
に差異がないことを示し、PEG自体が接合体
（アジユバント）でないことを示唆している。 例 本発明によるmPEG抗体修飾によるFc受容体
結合の消去 Ａ うさぎ抗−コナルブミン抗体及び螢光体−標
識のコナルブミンから製造した免疫複合体の、
ネズミマクロフアージP388.D1細胞ラインに対
する結合性は、第５図に示される。これらのデ
ータは、免疫複合体が、その集団中のほとんど
の細胞に結合するのは、濃度依存のものである
ことを示している。この結合曲線は、免疫複合
体が数種の抗原対抗体比率を用いて製造される
ときに、著しく変化しなかつた。 mPEG−修飾処理のFc結合に対する効果を
検査するために、免疫複合体の濃度を、第５図
の曲線から選択して、約75％結合のものとし、
この濃度を、次の実験に用いた。第５図に説明
したように、結合性実験を、本発明に従い
mPEG−修飾抗体を用いて製造した免疫複合体
で繰り返した。典型的な実験の結果を第６図に
示し、それは、20％以下のアミノ基がmPEG−
修飾されたとき、Fc結合を完全に抑制したこ
とを示している。これらの実験で用いたmPEG
−修飾の抗体は全て、競合する酵素−結合の免
疫アツセイ中で測定して、その最初の抗体活性
を100％維持していたことが強調されるべきで
ある。異なるロツトのmPEG−修飾の抗体から
製造した免疫複合体を用いて、この実験を繰り
返すと、同様にFc結合の抑制性が得られた。
従つて、免疫複合体にある抗体が活性エステル
−媒介の反応物中で15〜20％のmPEG−修飾の
アミノ基を含むものである場合、Fc結合性は、
完全に抑制することができる。 Ｂ 更に、Fc結合のmPEG−修飾処理の効果を
調査するために、螢光体−修飾のうさぎ抗−マ
ウス免疫グロブリン試料を、本発明に従い
mPEGで修飾せしめた、そして、この二重に修
飾された試薬をマウス脾臓細胞でテストした。
第７図は、マウス脾臓細胞に対する螢光化され
たうさぎ抗体の滴定曲線を、mPEG−修飾処理
の前及び後について、比較するものである。こ
の図から、両方の試薬とも、マウスＢ−細胞の
検出には等しい感度を有すること、（第７Ａ図）
が分かる。然し乍ら、過剰の螢光化試薬を用い
ると、mPEG−修飾された抗体により検出され
た細胞は、細胞螢光強度に上限を有するようで
あり、それに対して、mPEG−修飾でない試薬
により検出された細胞は、増大される螢光強度
を示す（第７Ｂ図）。 Ｃ mPEG−修飾の試薬は、細胞表面免疫グロブ
リンに結合し、一方、非mPEG−修飾の試薬
は、細胞表面Fc受容体に対する非特異性結合
を有することが、示されていた。この発見を評
価するために、精製マウス免疫グロブリンを使
用し、マウス脾臓細胞に対する両方の試薬の結
合性を競合させて抑制せしめた。この実験の結
果は、第８図に示した、古典的な螢光化試薬
（mPEG−修飾のものでない）の結合性は、抗
原により完全に抑制できなかつたこと、一方、
mPEG−試薬の結合性は、完全に抑制されたこ
とを明白に示している。更に、マウス脾臓細胞
に対するmPEG−修飾の試薬の結合性を競合的
に抑制するに必要なマウス免疫グロブリンの量
は、抑制できるようになるための理論的に結合
用に計算されるものに基づいて予想される濃度
に相当する。 Ｄ 試薬濃度を飽和する条件下で、古典的な試薬
を用いて検出した細胞は、mPEG−修飾の試薬
を用いて検出した細胞より輝いているので、
mPEG−修飾処理は、螢光体螢光を消光する可
能性があつた。この可能性を試験するために、
螢光発光スペクトルを、うさぎ抗−マウス免疫
グロブリン試薬について、mPEG−修飾処理の
前及び後に測定した。これらの発光スペクトル
は、第９図に示される。mPEG−修飾処理の効
果は、発光強度及びスペクトルのいずれにも見
られない。これらのデータは、抗体を修飾する
ために実施例で使用したmPEGの濃度におい
て、感度の損失がないことを示唆している。 結 果 本発明によるPEG−修飾抗体は、著しく低減
された免疫原性、細胞表面Fc受容体に対する低
い特異性結合能力、及び、抗原−結合活性の保持
を示すものである。抗体のmPEG修飾処理も、ま
た、Fc受容体結合を本質的に除去する。うさぎ
抗−コナルブミン抗体の15％以上のアミノ基が
mPEGで共有結合的に修飾されると、この抗体で
製造された免疫複合体が、ネズミマクロフアージ
細胞ライン、P388.D1上のFc受容体に結合するこ
とを防止した。同様の感受性が、mPEG−修飾さ
れた螢光体標識の抗体に観測される、何故なら
ば、mPEG修飾処理は、螢光体螢光を消失しない
ものであるからである。螢光体標識のうさぎ抗−
マウスの免疫グロブリンは、mPEGで修飾される
と、ネズミ脾臓細胞Fc受容体に対する結合性が
流動血球計数による検出で検知されないものであ
つた。従つて、mPEG−修飾処理は、細胞及び組
織染色、例えば、免疫組織化学処理に使用する
Fc結合をなくするための実際的な方法である。
生体内でのPEG−修飾たんぱく質に毒性がない
ことは、背景組織の結合を低減するための方法、
並びに、ヒト中の抗体の診断用及び治療用におけ
る免疫原性を低減するための方法をも提供するも
のであることを示唆している。
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