JPH0586802B2

JPH0586802B2 -

Info

Publication number: JPH0586802B2
Application number: JP60008303A
Authority: JP
Inventors: Ieruteen Suteran
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1984-01-23
Filing date: 1985-01-19
Publication date: 1993-12-14
Also published as: US4591640A; JPS60179401A; DE3562253D1; SE8400305L; SE441363B; SE8400305D0; EP0153910A1; EP0153910B1

Description

【発明の詳細な説明】本発明はアルカリ環境中で寒天生成物を架橋す
る（cross−linking）方法に関するものである。

アガロースはクロマトグラフイー、例えばゲル
ろ過（gel filtration）、イオン交換クロマトグラ
フイー、アフイニテイークロマトグラフイー
（affinity chromatogrphy）、染料配位子クロマ
トグラフイー（dye ligand chromatography）、
疎水性相互作用クロマトグラフイー
（hydrophoic interaction chromatography）な
どにおける生体高分子（biopolymer）の分離に
最もよく使用されているゲルマトリツクスであ
る。アガロースが広く使用されるのはそれが中性
であること、その親水性、誘導体生成と架橋の容
易さ、多孔性およびPH安定性のためである。最近
に至るまで、アガロースは通常の低圧クロマトグ
ラフイーに専ら使用されてきた。しかしアガロー
スが高速ないし高性能液体クロマトグラフイー
（HPLC）にも使用できることが明らかにされた
が、これによりアガロースの適用範囲がさらに広
くなつた。

基材（bed material）をHPLCに使用するため
の決定的な条件はそれと分かるほどの変形を生じ
ることなく比較的高い圧力に耐えることである。
しかし、若干の圧縮性は望ましい。何故なら空隙
容量（void volume）が全容量より以上に減少
し、これにより分離能が増加するからである。架
橋されたアガロースはなおタンパク質や粒子に対
して透過性があるが、上記要件を満足させる。

ジビニルスルフオン（divinylsulfone：DVS）
は高い移動率ないし流速（flow rate）を許容す
る架橋剤のグループに属している。

「J.Chromatogr.」103（1975）49−62からDVS
でアガロースゲルを架橋することは公知である
が、実際にはこの種のゲルはクロマトグラフイー
の基材物質としての有用性を制限する次のような
欠点を有していることが判明した。

(1) 空隙容量標識として使用されるブルーデキス
トラン（Blue Dextran）が不可逆的に吸着さ
れた。

(2) ある種のモデルタンパク質が（ヘモグロビン
不可逆的に）多少とも吸着された。

(3) 架橋実験における再現性が満足なものでなか
つた。なぜなら、実現可能な最大流速がバツチ
毎に変化し、時々比較的低かつた。

(4) 上記文献において、DVSで架橋されたゲル
はPH９以上で安定的でないと述べられている。

本発明の目的は、寒天生成物例えばアガロース
ビード（beads）をDVSで架橋してクロマトグラ
フイー特にHPLCのための基材として好適であ
り、かつこれまでに可能であつたよりも高い流速
を可能ならしめる物質を得る方法を提供すること
にある。

本発明の方法によればジビニルスルフオンが架
橋剤として使用されるが、架橋は還元剤の存在の
下にPH＞11で行なわれ、反応しなかつたビニル基
はいくつかの水酸基からなる中性親水性の脱活性
化（deactivating）物質によつて脱活性化され
る。

アガロースはフランス、ヴイルヌーヴ−ラーガ
レンヌ92390のIBFから、ブルーデキストランは
スウエーデン、ウツプサラのPharmacia Fine
Chemicalsから、DVSはスイスのFluka AGか
ら、また水素化ホウ素ナトリウム（sodium boro
−hydride）はドイツ、ホーヘンブルンバイ
ミユンヘン8011のMerck−Schuchardtからそれ
ぞれ入手できる。

アガロース粒子はBiochim.Biophys.Acta 79
（1964）393−398に記述されている方法によつて
調製した。

直径６mm、長さ300mmのカラムをプレキシグラ
ス（商標名）で自家製作し、アガロースベツドを
異つた高さに保持するための可動な上方プランジ
ヤーを設け、これらのベツドを2μmの金属フリツ
トで支持した。

HPLCポンプは米国、ジヨージヤ州30093の
Micromeritics製を用いた。

最初にDVSによる架橋をJ.Chromatogr.に掲載
された上述の論文に記述された方法で行なつた。
しかし、前述したようにこの方法によつて架橋さ
れたゲルはブルーデキストランおよびある種のモ
デルタンパク質を強力に吸着することが判明し
た。この吸着を抑制するために水素化ホウ素ナト
リウムを反応混合物に添加し、アガロースの酸化
と破壊を回避した。これによりブルーデキストラ
ンの吸着は見られなくなつたが、同時に最大流速
が水素化ホウ素ナトリウムなしに架橋されたゲル
よりも相当低くなつた。（J.Chromatogr.の上述
の論文に記述された方法では水素化ホウ素ナトリ
ウムは用いられていない。）この流速の低下は水素化ホウ素ナトリウムから
遊離された水素によつてDVSの分子のあるもの
における二重結合の一方または両方の飽和による
と考えられる。

従つて水素化ホウ素ナトリウムを窒素の流れで
置き換えたが、その結果は満足できるものではな
かつた。なぜならブルーデキストランの吸着が依
然として非常に強かつたからである。

流速を減少させずに吸着を抑制する問題は流速
が、水素化ホウ素ナトリウムの存在の下で架橋が
行なわれたときのPHの関数として一定圧力で第１
図のように測定されるまでは解決されなかつた。

第１図の曲線が記録されたときの基材は12％ア
ガロースビード５〜40μmであつた。カラムは直
径６mm、長さ120μm、圧力は62気圧であつた。曲
線は、架橋が0.5M炭酸ナトリウムの溶液中で
行なわれたとき得られたものであり、曲線は架
橋が水中で行なわれたとき得られたものであり、
そのPH値はＸ軸上に示される値に随時調節した。

第１図はPH値が11より少し低くなると、流速が
相当減少することを示す。水素化ホウ素ナトリウ
ムの添加がJ.Chromatogr.における上述の論文に
より反応媒体として用いられた0.5M Na₂CO₃溶
液のPH値を変えたどうかを調査したところ、濃度
２％までの水素化ホウ素ナトリウムの添加により
PHが11.3から10.7に低下したことが判明した。こ
のPHの減少はより低い程度の架橋とより低い流速
（第１図と比較して）を与えるのに十分であつた。
架橋反応中にPHはさらに再現不可能に減少した。
さらに数週間の間貯蔵したあと、0.5MNa₂CO₃溶
液のPHは11.0から10.6に減少した。

これらの知見は架橋が水素化ホウ素ナトリウム
の存在下で行なわれると、なぜ流速が減少するか
を示している。

本発明によれば、ブルーデキストランとヘモグ
ロビンの吸着を抑制するために還元剤として水素
化ホウ素ナトリウムを用い、かつ、架橋の程度す
なわち流速を増加させるためにPH＞11で架橋が行
なわれる。

第１図から明らかなように、架橋が12.0〜12.5
のPH範囲で行なわれると、高く再現性のある流速
が得られる。

従つて、本発明によれば、架橋を還元条件下で
行なつてブルーデキストランとタンパク質の吸着
を阻止ないし最小にする。例えば、水素ガスのよ
うな他の還元剤も使用できるが水素化ホウ素ナト
リウムを使用するのが好ましい。何故ならそれは
高いPHでのアガロースの劣化を阻止するのに従来
から長らく使用されてきたからである。もちろん
アガロースの破壊のおそれはより高い温度で著し
い。従つて、本発明による全架橋工程は室温で行
なわれ、完全に白い生成物が得られる。（前述の
J.Chromatogr.に記述された方法では、反応の一
部は45℃で行なわれた。）第２図は、流速は架橋反応に使われる時間とは
４〜20時間の間では無関係であることを示してい
る。第２図による架橋は0.5M炭酸ナトリウム中
で初期PH12.5で行なわれた。

本発明によれば、数個の水酸基を含む中性の親
水性物質がDVS中の未反応のビニル基の脱活性
化のために使用される。本発明によれば、この脱
活性化物質はポリマーだけでなく低分子量成分か
ら構成できる。脱活性化物質の例としてはガラク
トース、マンニトール、グルコース、デキストラ
ン、アミロース、グアラン（guaran）などがあ
る。

これらの物質は次のような長所をもつ。

(1) 上記物質はマトリツクスの電荷（charge）
または疎水性を増加させず、タンパク質の吸着
のおそれを減少させる。前述のJ.
Chromatogr.103（1975）49−62で脱活性化物質
として推奨されているグリシンとメルカプトエ
タノール（mercapto−ethanol）はタンパク質
の吸着を生じさせる。これはグリシンがマトリ
ツクスを一層チヤージ状態（charged）にし、
メルカプトエタノールがマトリツクスを一層疎
水性にするからである。

(2) 上記物質は未反応のビニル基の間を架橋し、
従つてアガロースゲルの剛性従つて流速を増加
させることができる。アガロース中のこれらの
ビニル基の間の距離が異なるので、互いに異な
る距離における多くの水酸基からなる物質が架
橋を生じる確率が高くなる。この観点からマン
ニトールがガラクトースよりも好ましい。

(3) 上記物質のOH基は異なる配位子（ligand）
をアガロースに結合させるのに用いることがで
きる。これは架橋工程によるアガロース鎖
（chain）中の使用可能なOH基の減少がガラク
トースとマンニトール中のOH基によつて相殺
ないし過補償すらされることを意味する。

前述のJ.Chromatogr.の論文には、アガロース
のDVS処理はPH＞９では不安定な生成物を生じ
ると報告されているので、本発明によつて調製さ
れた架橋されたアガロースも同じ弱点をもつかど
うかを検査した。

PH7.0、9.0、11.0および13.0のリン酸ナトリウ
ムの0.05M溶液で室温で行つた実験の結果を第３
図に示す。第３図から明らかなように、架橋は15
日間の実験期間中PH13でも安定していた。従つて
このゲルの安定性は抜群である。別の実験で、こ
の架橋は1M NaOHによる15時間の処理によつ
ても影響されなかつた。

実施例エルレンマイヤーフラスコに4M KOHによつ
てPH12.0〜12.5に調整した0.5M K₂HPO₄12mlを
入れ、これに前述のJ.Chromatogr.の論文に記述
されたように調製した沈澱した12％アガロース粒
子約10ｇを顕濁させる。（4M KOHを時々添加し
てPHを12.0〜12.5に維持すれば水中でもこの実験
を行なうことができる。）NaBH₄約0.06ｇを撹拌
しながら添加し、次いでDVS0.6mlを添加する。
撹拌を室温にて20時間続けてから、アガロース懸
濁液を10分間500×ｇで遠心分離する。上澄み液
を除き、このゲルをNaBH₄0.06ｇを含む4M
KOHでPH11.5〜12に調整された水約12ml中に再
び懸濁させる（これより多量のNaBH₄では流速
を減少させるように思われる）。撹拌後、懸濁液
を再び遠心分離し、上澄み液を除去する。３回の
洗浄後過剰のDVSがほとんど除去された。反応
しなかつたビニル基の脱活性化のために、4M
KOHでPH12に調整された水20ml中に懸濁された
粒子にＤ−マンニトール２ｇとNaBH₄50mgを添
加する。６時間の撹拌後、ゲル粒子を遠心分離に
より５回または中性になるまで水で洗浄する。そ
れから粒子を蒸溜水で溶離させるかまたはふるい
にかけてより一層均一な大きさの分布を得る。カ
ラムへの充填も蒸溜水で行なう。

以下本発明の諸態様を要約するが本発明はこれ
らに限られないことはもちろんである。

(1) ジビニルスルフオンを架橋剤として使用し、
架橋を還元剤の存在の元にPH＞11で行ない、反
応しなかつたビニル基を数個の水酸基からなる
中性親水性脱活性化物質によつて脱活性化する
ことからなるアルカリ環境下で寒天生成物を架
橋する方法。

(2) 架橋をPH11.5〜13.5で行なう(1)項の方法。

(3) 架橋をPH12.0〜12.5で行なう(2)項の方法。

(4) 架橋を室温で行なう(1)項の方法。

(5) 還元剤が水素化ホウ素ナトリウムまたは水素
ガスである(1)項の方法。

(6) 脱活性化物質がポリマーのみでなく低分子量
成分からなる(1)項の方法。

(7) 脱活性化物質がガラクトース、マンニトー
ル、グルコース、デキストラン、アミロース、
グアラン等からなる(6)項の方法。

【図面の簡単な説明】

第１図は水素化ホウ素ナトリウムの存在下にお
ける架橋工程の当初におけるPHの関数としての流
速を示すグラフ、第２図は流速と架橋反応時間の
関係を示すグラフ、第３図は本発明により、
DVSで架橋されたアガロースビードのPH安定性
を示すグラフである。

Claims

【特許請求の範囲】

１ジビニルスルフオンを架橋剤として使用し、
架橋を還元剤の存在の元にPH＞11で行ない、反応
しなかつたビニル基を数個の水酸基からなる中性
親水性脱活性化物質によつて脱活性化することを
特徴とする寒天生成物の架橋方法。