JPH0625066B2 - 血小板貯蔵培地 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は血小板を貯蔵する方法及び培地に関し、特にか
かる血小板を約１８゜−３０℃、好ましくは約２０゜−
２４℃の範囲で、さらに好ましくは約２２℃にて貯蔵す
る方法及び培地に関する。

血小板は全供血からの、また血小板フェレーシス(plate
letpheresis)過程による副産物として得られる。それら
は現在典型的に大気中の気体が透過し得る器壁を有する
プラスチック製容器内にて自身の血漿内に貯蔵されてい
る。通常かかる血小板に伴う血漿は正常な血漿の全成分
に加え抗凝固剤として加えられるクエン酸塩及び生理学
的レベルの５倍の右旋糖を含有する。右旋糖のレベルを
増大して加えてあるのは貯蔵中に赤色球がそれを必要と
するためであり、また血小板の貯蔵にも同様に必要であ
ると一般に理解されている。

通常の血液銀行での処理においては単位血液量（67.5凝
固剤に対し450ml）の供血は遠心処理されて３つの部分
−赤血球，血漿，及び血小板に分離される。一単位の血
液からの充填赤血球の体積は約 180mlで、残りの約 33
7.5mlの体積は血漿及び抗凝固剤である。本出願の以下
において「血漿」なる語は当初の採取の際加えられたあ
るゆる抗凝固剤をも含むものとする。赤血球（充填赤血
球と称する）は典型的に約47.5mlの血漿中に懸濁され
る。血小板は約５０mlの血漿中に懸濁される。この血小
板を含有する生成物を血小板濃縮物と典型的に称する。
残りの 240mlの血漿は新鮮冷凍血漿として冷凍される。

最近の進歩により血液銀行は血小板を２２℃にて５日間
貯蔵できるようになつた。これについてマーフィー他、
「新規な容器中における輸注のための血小板の改良され
た貯蔵」ブラッド，６０(1)： 194− 200（1982）；サ
イモン他、「血小板濃縮物の貯蔵の延長」，トランスフ
ュージョン，２３(3)： 207−212(1983)を参照された
い。２２℃での血小板貯蔵期間の延長は在庫管理を柔軟
にし、血小板が広く分散した場所においても必要な場合
に入手し得るようなす。しかし、上の貯蔵法においては
血小板は５０mlの血漿中に懸濁されることを必要とし、
その結果血漿も血小板に伴って患者内に注入されること
になる。

血小板を受皿者に注入される大量の血漿中に貯蔵するこ
とは多くの問題を有する。血漿の注入により疾病が伝搬
される可能性がある。ヘピテーチス−Ｂ（hepitatis−
Ｂ）及び非Ａ，非Ｂ−ヘピテーチスがかかる血漿注入に
より伝搬されうることは確実である。また最近発見され
た後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）も血漿注入により
伝搬される可能性が高い。また患者が血漿に対し少なか
らず面倒で、時には致命的なアレルギー反応を示すこと
もある。さらに血漿は特定の患者の治療のためアルブミ
ン及び凝固因子の如き成分へと分別されるので高価であ
る。１ミリリットルの血漿は４〜５セントする。従って
血小板を懸濁するのに用いられる血漿は１単位当り２ド
ル５０セントもする。合衆国では年間 400万単位の血小
板が投与されているので血小板の貯蔵のために血漿を用
いることは年間1000万ドルに達する血漿が無駄にされて
いることになる。さらに合衆国での血小板の使用は一般
的傾向として増加している。

人間の血小板細胞については非常に多くのことが知られ
ている。血小板の貯蔵に関する技術，材料及び方法につ
いて記述した一般的論文としてマーフィー他による「新
規な容器中における輸注のための血小板の改良された貯
蔵」，ブラッド ６０(1)，１９８２年７月；マーフィ
ーによる「輸注のための血小板の調製及び貯蔵」，マモ
ン，バーンハート，ラスター及びウォルシュ，ＰＪＤ
パブリケーションズ Ｌtd.,ウェストベリー，ニューヨ
ーク（1980）；マーフィーによる「血小板の輸注」，プ
ログレス イン ヘモステーシス アンド トロンボー
シス，第III巻，テオドーア Ｈ．スペート偏，グルー
ン アンド ストラットン，Inc.(1976)；及びマーフィ
ー他による「２２℃での血小板の貯蔵：生存力（viabil
ity）の維持に対するプラスチック容器を通るガス輸送
の役割」，ブラッド，４６(2)： 209− 218（1975）が
ある。各出版物は文献としてここに完全に引用してお
く。

他にも多くの脊髄動物細胞を維持及び／又は培養するの
に適当な多くの培地及び／又は生理溶液がある。かかる
溶液にはアール液（組織培養用培地）；フォニオ液（血
小板の染色塗抹に用いられる）；ゲイ液（動物細胞培養
用）；ハンク液（動物細胞培養用）；ヘエム液（赤血球
細胞の計数前に用いられる血液希釈剤）；クレッブスー
リンゲル液（ＮａＣｌ，ＫＣｌ，ＣａＣｌ_３，ＭｇＳＯ
_４，及びリン酸塩バッファの混合により調製されるリン
ゲル液の変形，ｐＨ7.4）；乳酸加リンゲル液（ＮａＣ
ｌ，乳酸ナトリウム，ＣａＣｌ_２２水和物及びＫＣｌを
蒸留水中に含有）；ロック液（動物細胞培養用）；ロッ
ク−リンゲル液（ＮａＣｌ，ＣａＣｌ_２，ＫＣｌ，Ｍｇ
Ｃｌ_２，ＮａＨＣＯ_３，グルコース及び水を含有）；リ
ンゲル液（血清と類似し、塩類成分としてＮａＣｌ 8.6
グラム，ＫＣ10.3グラム，ＣａＣｌ_２ 0.33グラムを蒸
留水1000ml中に含有し、局所的に火傷及び創傷・挫傷に
用いられ、あるいは自然に生ずる生体物質、例えば血
清，組織抽出物及び／又はより複雑な化学的に規定され
る核溶液等と共に動物細胞の培養に用いられる）；及び
タイロード液（ロック液の変形）が含まれる。これらに
ついてはステッドマンの医学辞典，1300-1301頁，ウィ
リアムス アンド ウイルキンス，バルチモア，メリー
ランド（1982）を参照されたい。

生きた脊髄動物細胞の保存及び／又は培養は用いられる
特定の細胞のタイプにより異なった問題を生ぜしめる。
例えば血小板の如き血球は他のあるタイプの細胞のもの
と類似の多数の代謝特性を有することが知られている。
例えばブラッド ３０： 151(1967)には血球の代謝特性
はある面で腫瘍細胞のものと類似していることが示され
ている。一方血小板の如き安定な血球の懸濁の問題に特
に向けられた多数の先行技術がある。血小板の貯蔵に関
する従来の研究は血小板の貯蔵期間が血小板による右旋
糖からの乳酸の生成により限定されることを示した。こ
れは血小板にエネルギーを与えるはずが、乳酸が培地を
酸性化し、この酸性により血小板が破壊される。また血
小板は貯蔵中エネルギー生成のため酸素を消費すること
が示された。この過程の最終生成物は気体のＣＯ_２であ
り、これは乳酸と異なり通常血小板が貯蔵されている容
器のプラスチック壁を通って容器より脱出し得る。ＣＯ
_２の生成はかかる血小板用の貯蔵培地を酸性化しない。
右旋通の解糖作用の外に血漿中に典型的に存在する脂肪
酸及びアミノ酸が貯蔵された血小板の酸化的代謝作用の
基質として用いられることもある。

血液の有用な終局体への分別に関しては特許文献中に種
々の技術が開示されている。英国特許第1,283,723号に
は血漿を全血液より分離して血漿終局体を生成する方法
及び装置が開示されており、この場合は残った血液部分
は供血者に還元される。米国特許第4,269,718号（ペル
シドスキー）は塩類を洗浄及びディスプレースメント
（dsplacement）溶液として用いた血液からの血小板の
遠心分離法を開示している。パラディによる米国特許第
4,387,031号は血液中の赤血球と血漿を分離する構成を
開示している。

特許文献には血小板の貯蔵に関して有用な多くの保存及
び培養用培地が開示されている。米国特許第4,390,619
号（ハーメニング−ピッティグリオ）はリン酸塩バッフ
ァの低速放出のためのイオン交換樹脂を開示している。
この特許は血小板の酸化的リン酸化及び解糖作用機構、
及びそれらの血小板貯蔵に関する広範囲な論議を含んで
いる。米国特許第2,786,014号（テュリス）及び米国特
許第3,629,071号（セカール）では４〜５℃の温度範囲
での血小板の貯蔵での使用を意図された種々のグルコー
ス及び電解質を含有する血小板貯蔵培地が開示されてい
る。同様に米国特許第4,152,208号は安定化された白血
球を貯蔵する方法と培地を開示し、白血球は約４℃ない
し約３０℃の温度にて貯蔵し得ることが開示されてい
る。白血球は塩基性塩類溶液又は最少必須培地中に保た
れ、これは血液中における白血球の生存力を持続させ
る。米国特許第4,267,269号（グローデ他）においては
アデニン，グルコース又は果糖，塩化ナトリウム及びマ
ンニトールを含む赤白球貯蔵溶液が開示されている。米
国特許第3,814,687号（エリス他），米国特許第 3,850,
174号に（アレイス）及び前記英国特許第1,283,273号は
一般に血液分別過程における血漿から形成された要素の
分離に関する。米国特許第4,152,208号（カルタヤ）に
おいてはクエン酸ナトリウムの如き抗凝固剤と共に使用
される、特にグルタミン，ロイシン，イソロイシン，フ
ェニルアラニン，チロジン，リン酸塩及び塩化ナトリウ
ム及びカリウムを含むイーグルのＭＥＭ（コラム３及び
４）を含む種々の白血球保存溶液及びかかる溶液の血液
分別過程での使用が開示されている。さらに米国特許第
4,205,126号（カルタヤ）をも参照されたい。米国特許
第3,753,357号（シュワルツ）は血球の貯蔵に関して有
用な種々の保存又は培養培地を広範囲に開示している。

以下検討する如く、本発明の一つの好ましい実施例はグ
ルタミンが加えられた合成血小板貯蔵培地を利用する。
血球の貯蔵又は培養には関係しないが、以下の出版物は
グルタミンがあるタイプのガン細胞，すなわちＨｅＬａ
細胞における酸化的附リン酸反応の基質として用いうる
ことを開示する。ワイス他による「糖の非存在下におけ
る脊髄動物細胞の連続的成長」，ジャーナル オブ バ
イオロジカルケミストリー，256（15）：7812-7819(198
1)；ライツァー他による「ペネトースサイクル」，ジャ
ーナル オブ バイオロジカルケミストリー，255(1
2)：5616-5626(1980)；及びライツァー他による「糖で
なくグルタミンが培養ＨｅＬａ細胞の主要エネルギー源
であることの証拠」，ジャーナルオブ バイオロジカル
ケミストリー，254(8)：2669-2676(1979)を参照された
い。さらにクフラーによるバイオケミカルメソッズ ア
ンド セルカルチュラル アンド ヴァイロロジー，ハ
ルステッド プレス (1977)の８３頁，８７−８８頁を
も参照されたい。

この分野でなされた大量の研究にもかかわらず、人間の
血小板を生存状態で貯蔵し一方で他の目的を使用のため
自由にされる血漿の量を増加せしめる簡単で安全、かつ
安価な方法がなお必要とされている。

本発明は血小板を生存状態で３日か７日間、好ましくは
少なくとも５日間以上、約１８゜−３０℃の温度で、特
に約２０゜−２４℃で、さらに好ましくは約２２℃にて
貯蔵する新規な方法及び貯蔵用培地を提供する。本発明
による方法は血漿中に血小板に富んだ血小板懸濁液を形
成する段階と；この懸濁液から上澄の血漿を１単位の血
小板につき１ないし１５mlの血漿が残るように抽出し、
かかる血小板より血小板の小さなかたまりとしての濃縮
された血小板ボタンを作る段階と；該濃縮血小板ボタン
に緩衝されたリンゲル形クエン酸塩溶液を加える段階
と；生じた溶液を撹拌して血小板を再懸濁させてかかる
血小板の合成懸濁液を形成する段階と；合成懸濁液を酸
素が透過し得る容器内で約２２℃で必要になるまで貯蔵
する段階とを有する。リンゲルクエン酸塩溶液は１単位
の血小板及び１５mlを超えない随伴する血漿のｐＨを、
これが１単位当り６０mlの培地と共に酸素を透過し得る
２２℃に維持された容器内に７日間貯蔵された場合、6.
2以上に維持するよう緩衝されるのが好ましい。

他の血小板貯蔵培地はさらにグルタミンの如き酸化的附
リン酸反応のための血小板に浸透しうる非解糖基質を有
する。他の基質にはオキサロ酢酸塩，マリン酸塩，フマ
ル酸塩，コハク酸塩，α−ケトグルタル酸塩，オキサロ
コハク酸塩，イソクエン酸塩，cis−アコニット酸塩，
及び／又はグルタミン酸塩あるいはアスパラギン酸塩の
如き、クエン酸サイクルの中間体へと変換されうるアミ
ノ酸が含まれる。

さらに別の基質にはロイシン，イソロイシン，フェニル
アラニン，チロシン，アセト酢酸，アセトン及びベータ
位酸化により代謝さる脂肪酸を含む、アセチル−ＣｏＡ
を生じるアミノ酸及び脂肪酸が含まれる。特に現時点で
好ましいのはグルタミンを酸化的リン酸化の基質として
添加することである。酸化的リン酸化の基質としてのグ
ルタミンの添加は貯蔵された血小板の活発な代謝を延長
し、その結果その生存力が７日間までも延長されること
が見出された。

従って、本発明の目的は人間の血小板を処理し貯蔵する
新規な方法を提供するにある。

本発明はさらに実質的な量の自然の血漿が他の目的のた
めに自由にされる、新規な血小板貯蔵培地を提供するに
ある。

本発明のこれら及び他の目的は以下の詳細な説明より明
らかになろう。

本発明の目的は血小板を少なくとも５日間、約１８゜−
３０℃の温度で、好ましくは約２０゜−２４℃で、また
最も好ましくは約２２℃にて貯蔵することを可能とする
血小板の疾病のない人工貯蔵用培地を提供するにある。
貯蔵の末期にあっても血小板は生存力を有さねばならな
い。これは貯蔵されていた血小板が受体への注入後正常
に循環することを意味する。いくつかの研究によると血
小板の生存力は正常な血小板の形態の維持に関係してい
ることが示されている。マーフィ他による「新規な容器
中における輸注のための血小板の改良された貯蔵」ブラ
ッド，６０(1)： 194-200(1982)；クニキ他による
「『室温』で貯蔵された血小板の品質に影響する変数に
ついての研究」，トランスフュージョン，１５(5)： 41
4-421(1975)；及びホルム他による「２２℃での血小板
の貯蔵：撹拌のタイプが形態，生存力，及び試験管中で
の機能に与える影響」，ブラッド，５２(2)： 425-435
(1978)を参照されたい。その名の如く、血小板は薄い突
起のない小円板として循環する。多くの場合生存力の損
失は球状化，膨張及び偽足形成に関係している。以下説
明する実験では血小板形態を生存力の指標として用い
た。これは通常の位相差顕微鏡を用いることにより得ら
れた。さらに、トロンビンに対する血小板形態変化及び
クールターカウンターによる大きさ分布の分散が客観的
に測定された。上記のマーフィー他及びホルム他の論文
に報告された如く、これら測定は顕微鏡下での形態と生
体内での生存力とを相関づけることが示された。

生存力を維持するためには細胞はそのエネルギーの需要
に合わせて連続的に新たなアデノシン三リン酸（ＡＴ
Ｐ）を生成せねばならない。これには通常２通りの経路
−解糖作用と酸化的リン酸化−が可能である。

解糖作用では１分子のグリコースが２分子の乳酸に変換
され、２分子のＡＴＰを生じる。酸化の場合はグルコー
ス，脂肪酸，あるいはアミノ酸がクエン酸サイクルに入
り二酸化炭素（ＣＯ_２）と水に変換される。この経路で
は適量の酸素の供給が必要である。これは解糖作用より
はるかに効率的なシステムである。例えばグルコースか
らＣＯ_２への酸化的代謝は３６分子のＡＴＰを生じる。

血小板はそのエネルギーの需要に対しその生存力を保っ
た状態での長期間の貯蔵とは必ずしも相容れない方法で
適合することが認識された。適度な酸素が与えられると
血小板はＡＴＰの大部分を酸化によって生ぜしめるが、
全ての代謝グルコースを酸化経路にふりむけず乳酸をも
生じさせ続ける。血漿内での血小板の貯蔵の間乳酸濃度
は１日当り約 2.5ミリモル上昇する。マーフィー他によ
る「２２℃での血小板の貯蔵：生存力の維持に対するプ
ラスチック容器を通るガス輸送の役割」，ブラッド，４
６(2)： 209-218(1975)を参照されたい。これはｐＨの
徐々な低下をもたらす。前記マーフィー他による論文中
に説明された如く、乳酸濃度が２０ミリモル以上に上昇
するとｐＨ（7,2にて開始）は6.0に到達する。血小板の
生存力はｐＨが 6.1あるいはそれ以下に落ちると不可逆
的に失なわれるので血小板保存に関する主要な限定変数
はｐＨである。マーフィー他による「２２℃での血小板
の貯蔵」，ブラッド，３５(4)： 549-557(1970)を参照
されたい。この乳酸生成速度においてｐＨは基本的には
二炭酸ナトリウムである自然に生ずる血漿緩衝剤がなか
った場合はるかに急速に落ちていたであろう。

本発明は人間の血小板を処理し貯蔵する方法を提供す
る。本発明は血漿（当初の採血の際加えらたあらゆる抗
凝固剤を含む）中の血小板よりなる血小板濃縮物を形成
する段階と；該濃縮物より血漿上澄を１単位の血小板当
り約１ないし１５（好ましくは４ないし１５）ミリリッ
トルの血漿が残るように抽出し血小板ボタン及びそれに
伴い残留する血漿とを形成する段階と；緩衝されたリン
ゲルクエン酸液を該血小板ボタン及びそれに伴う残留血
漿に加える段階と；該液を撹拌し該血小板を再懸濁し血
小板の合成懸濁液を形成する段階と；該合成懸濁液を酸
素が透過し得る容器内に約１８゜−３０℃の温度で、好
ましくは約２０゜−２４℃で必要になるまで貯蔵する段
階を含む。上記リンゲルクエン酸塩溶液は約 120- 30
0，好ましくは約 170- 180，さらに好ましくは175ｍＥ
ｑ／Ｌ（ミリ当量／リットル）のナトリウムと；約０−
１０，好ましくは約２−５，さらに好ましくは約３ mＥ
ｑ／Ｌのカリウムと；約０〜１０，好ましくは２−５，
さらに好ましくは約 3.4mEq/Lのカルシウムと；約８０
− 180，好ましくは約 110- 125，さらに好ましくは約1
17mEq/Lの塩化物と；約１０−３５，好ましくは約１５
−２５，さらに好ましくは約２１ mEq/Lのクエン酸塩
と；１単位の血小板と１５mlを超えない該伴う血漿のｐ
Ｈを、血小板が１単位当り６０mlの該培地と共に、酸素
を透過し得、最も好ましい２２℃の温度の如く特定の温
度に維持された容器中に７日間貯蔵されても 6.2以上に
維持するのに有効な緩衝剤とよりなる。好ましい血小板
貯蔵培地はこのようにさもなくば凝固を開始させうるカ
ルシウムを結合するために含まれているある濃度のクエ
ン酸塩の他に生理学的レベルのナトリウム，カリウム，
カルシウム及び塩化物を含有する。デゴス他による「血
小板貯蔵の際の血小板解通作用III。外因性クエン酸塩
を利用する際の血小板の不安定性」，トランスフュージ
ョン，１９(5)： 601-603(1979)を参照されたい。グル
コースは、必然的な乳酸の生成を招来し、許容できない
ｐＨの低下及び血小板生存力の損失を来たすもので、本
培地には含有されない。

本発明による好ましい実施例では貯蔵された血小板によ
り利用可能で、従って乳酸生成用基質として作用するグ
ルコースの量が限定されるよう設計されている。血小板
濃縮物より除去されたグルコースを含有する血漿上澄及
び血小板並びにそれに伴う残留血漿に加えられたグルコ
ースを含有しない貯蔵培地の量は生ずる合成懸濁液中で
のグルコース濃度が貯蔵用開始時点で確実に約１０ mM/
L以下になるよう選ばれる。好ましくは抽出及び貯蔵培
地追加過程は生成する懸濁液中のグルコース濃度が約５
mM/Lとなるよう実行される。以下説明する如く、この
グルコース濃度は解糖作用が約 1.5mMの濃度が達成され
るまで進行することを許し、これは本発明の好ましい方
法及び培地を用いると貯蔵後約３日後に起こる。

生じた血小板合成懸濁液のｐＨを許容し得るレベルに維
持するため前記培地もまた貯蔵開始時点でのｐＨが 7.0
を超え、好ましくは約 7.2〜 7.4の間にあるよう製剤さ
れる。

上記の如く、リンゲルクエン酸塩溶液は懸濁液のｐＨを
７日間の貯蔵後で 6.2以上に維持する。これは溶液内の
ＨＰＯ_４濃度が約０−100m Eq/L，好ましくは８ mEq/L
のリン酸塩緩衝剤，好ましくはリン酸ナトリウムを用い
て達成される。以下に示す如く、この緩衝作用は血小板
グリコゲン及び濃縮物調整中に除去されなかった残留血
漿中のグルコースの代謝作用により誘導された乳酸を受
容するに十分である。

現時点では貯蔵に先立ち合成血小板懸濁液に酸化的リン
酸化のため血小板透過性・非解糖基質をさらに加えるの
が好ましい。グルタミンが酸化的リン酸化のための好ま
しい非解糖基質である。好ましい実施例においてグルタ
ミンは血小板貯蔵培地内に５ないし２５，好ましくは２
０ mM/Lの濃度で成分として含有される。あるいは酸化
的附リン酸反応のための非解糖基質はオキサロ酢酸塩，
マリン酸塩，フマル酸塩，コハク酸塩，α−ケトグルタ
ル酸塩，オキサロコハク酸塩，イソクエン酸塩，cis−
アコニット酸，グルタミン，クエン酸サイクル中間生成
物のアミノ酸前駆体，アセチル−ＣｏＡ（アセチル−コ
エンザイム Ａ）のアミノ酸及び／又は脂肪酸前駆体及
びこれら混合物よりなるグループより選択してもよい。
かかるクエン酸サイクル中間生成物のアミノ酸前駆体は
グルタミン酸，アスパラギン酸及びこれらの混合物より
選ばれたものを含む。かかるアセチル−ＣｏＡ前駆体は
ロイシン，イソロイシン，フェニルアラニン，チロシ
ン，アセト酢酸，アセトン，ベータ位酸化により代謝さ
れた脂肪酸及びこれら混合物よりなるグループより選ば
れる。

現時点ではさらに貯蔵対象培地にマグネシウムを添加す
るのが好ましい。これはこの元素が正しい細胞機能に重
要だからである。これを用いる場合はマグネシウムは０
−３，好ましくは約 2.0mEq/Lの濃度で存在せねばなら
ない。

本発明はさらに以下の実例より理解されよう。

血小板に富んだ血漿（ＰＲＰ）及び血小板濃縮物（Ｐ
Ｃ）はクエン酸塩−リン酸塩−右旋糖（ＣＰＤ）又は酸
クエン酸塩右旋糖により抗凝固処置された全供血よりブ
ラッド，５２(2)： 425- 435に述べられた如く、ただし
上澄血漿がフェンワル血漿抽出器（フェンワル ラボラ
トリーズ、ディアフィールド，イリノイ）を用いて血小
板ボダンを有する袋から可能な限り完全に抽出される点
を除いて、調製される。血漿残留量は４ないし１５ml範
囲である。４５mlのリンゲル液（トラヴェノール ラボ
ラトリーズ，ディアフィールド，イリノイ）及び１５ml
の 2.5％クエン酸塩溶液が血小板ボタンを有する袋に加
えられる。袋は血小板撹拌器（ヘルマーラブズ，セント
ポール，ミシガン）に再懸濁のため載置される前に４５
分間静置される。かかる培養段階を血小板を再懸濁すべ
く液を撹拌する前に少なくとも３０分間実行するのが好
ましい。２時間の撹拌後、血小板は完全に再懸濁され
る。ＰＣは次いでＰＬ／723容器（フェンワル Inc.）
に移される。ブラッド，６０(1)： 194- 200(1982)に参
照されたい。テストせんとする種々の追加物が次いで撹
拌器上に２２℃にて貯蔵されている容器に加えられる。
テストされた終局的な培地は下の如くである（ここで示
した濃度は終局的濃度である）： １． リンゲル液及びクエン酸塩のみ：Ｒｉ−Ｃｉ（ナ
トリウム175mEq/L；カリウム３ mEq/L；カルシウム 3.4
mEq/L；塩化物117mEq/L；クエン酸塩２１ mEq/L）。

２． リンゲル液−クエン酸塩及びリン酸塩：Ｒｉ−Ｃ
ｉ−Ｐｈｏ（ＨＰＯ_４，８ mEq/L）。

３． リンゲル液−クエン酸塩，リン酸塩及びグルタミ
ン：Ｒｉ−Ｃｉ−Ｐｈｏ−Ｇｌｕｔ（Ｌ−グルタミン）
（ＧＩＢＣＯラブズ，グアンド アイランド，ニューヨ
ーク），２０ mM）。

４． リンゲル液−クエン酸塩，リン酸塩及びグルコー
ス：Ｒｉ−Ｃｉ−Ｐｈｏ−Ｇｌｕｃ（グルコース，２５
mM）。

５． 血漿対照。ＰＣのいくつかは血漿中に比較の目的
で通常通り再懸濁された。

血小板計数，平均血小板体積，及び寸法分布の分散（幾
何学的標準偏差）はクールターカウンターを用いて決定
された。

ｐＯ_２及びｐＨは前記の如くｐＨ／血液ガス分析器を用
いて決定した。

酸素消費速度Ｃ（Ｏ_２）（ｎモル／分／１０⁹血小板）
は定常状態技術： により決定された。

ＫＯ_２は容器のＯ_２輸送能力（ｎモル／分／原子）であ
る。上記状態方程式は容器内の血小板の酸素消費速度が
容器壁を通る酸素の流れと等しいことを意味する。

乳酸及びグルコース濃度は先に述べた如く決定した。
（ブラッド，４６(2)： 209- 218(1975)を参照）。

血小板のトロンビン（１ml当り１Ｕの最終濃度）による
形態変化の程度はペイトン アグレゴメータを用いて計
測した。これは消滅比Ｅ₁₂₀₀ｌ／Ｅ₁₂₀₀により定量化さ
れた。ここでＥ₁₂₀₀はトロンビンの添加前における血小
板の消滅であり、Ｅ₁₂₀₀ｌはその後の消滅である。ホル
ム他によるジャーナル オブ ラボラトリカル アンド
クリニカル メディスン，９７(5)，： 610- 622(198
1)を参照。

３mlのＰＣ研究試料が１，３，５及び７日目に取出され
た。ＰＣの最終体積は７日目で５１〜５８mlの範囲であ
った。

血小板が塩基性リンゲル−クエン酸培地Ｒｉ−Ｃｉ中に
貯えられた場合 6.2未満へのｐＨレベルの減少が観察さ
れた。リン酸ナトリウムの追加、すなわちＲｉ−Ｃｉ−
ＰｈｏはこのｐＨの降下の大部分を防止した。グルタミ
ンの追加、すなわちＲｉ−Ｃｉ−Ｐｈｏ−ＧｌｕｔはＲ
ｉ−Ｃｉ−Ｐｈｏで観察された一連のｐＨ測定を変化さ
せなかった。しかしグルコースが培地に加えられた場
合、すなわちＲｉ−Ｃｉ−Ｐｈｏ−Glucの場合、リン酸
塩の緩衝能力はｐＨを維持するのに十分でなかった。グ
ルコースの存在は乳酸の蓄積の増大を招き、Ｒｉ−Ｃｉ
−Ｐｈｏの緩衝能力を上回った。かかるｐＨ結果を表Ｉ
に示す。

以下の表IIはＲｉ−Ｃｉ液にグルコースが加えられると
乳酸生成が増大することを確認する。

表IIIはかかる貯蔵条件下でのグルコース濃度を示す。
グルコースの消費と乳酸の生成はグルコースが 1.5mM以
上の濃度で存在している限り継続することは明白であ
る。かかる乳酸生成は緩衝能力は超過する。Ｒｉ−Ｃｉ
−Ｐｈｏ−Ｇｌｕｔの場合基質が枯渇するため３日目に
乳酸生成は停止する。これらの結果もまたグルコースが
存在すると人工培地中の乳酸生成速度と血漿中のそれと
は同様であることを裏付ける。

表IVは貯蔵中にいくらかの酸素消費の減少があったこと
を示す。しかしこの減少は血漿中に貯蔵された血小板の
場合でも生じているので培地中におけるグルコースある
いは血漿の非存在とは関係しない。Ｒｉ−Ｃｉ−Ｐｈｏ
−Ｇｌｕｔにおける結果はグルコースが消費されない場
合酸素消費は３日目から７日目まで継続することを確立
する。

血小板の形態はリンゲル−クエン酸塩培地中のリン酸塩
及びグルタミンの追加と共に貯蔵された場合３ないし５
日間は良好に保存される。血小板の凝集は５日目にいく
らか明らかになった。これはその時点での血小板計数の
１０％の減少に反映されている（表Ｖ）。１０％の血小
板計数の減少はまた血小板が血漿中に貯蔵されている場
合も観察された。

位相差顕微鏡を用いるとリン酸塩及びグルタミンと共に
リンゲル−クエン酸塩中に貯蔵された血小板は３日及び
５日目においても大部分円板状で完全な内部構造を有し
ていた。内部崩壊し膨張した（気球状）血小板のパーセ
ントは５日間の貯蔵で５−１０％の範囲内にあった。こ
れらの主観的な印象は血小板形状変化の程度についての
客観的測定（表VI）及びクールタ寸法分布の分散（表VI
I）に反映されている。

従来の研究において生体中における血小板の生存力は分
散が 2.0未満で形状変化の程度が 1.08を越える場合に
維持されるのが観察された。

ブラッド，６０(1)： 194- 200及びブラッド，５２(2)
425- 435を参照。本実験では血小板がリン酸塩及びグル
タミンと共にリンゲル液−クエン酸培地中に貯蔵されて
いる場合３日及び５日間にて分散測定値が 2.0未満、ま
た形状変化の程度の測定値が 1.10の近傍であった。

上記実験のいくつかは異なるバッチの血小板ボタンを用
いてくりかえされた。このグループにおいても血漿残留
量はやはり４ないし１５mlであった。これらのテストの
間先のテストで用いられたリン酸塩の濃度の計算に誤り
があったことが明らかとなった。上に報告した如く、現
在では上記テストは８ mEq/Lのリン酸塩を用いて（親出
願で先に報告した５０ mEq/Lではなく）行なわれたもの
と信じられる。

以下のテストは各試料が７又は８日目に観察された点を
除き上記と同様に実行された。以下のデータに見られる
如くこれらの研究は先の結果を確認する。この特定の一
連のテストの間、リンゲル−クエン酸塩培地を用いたｐ
Ｈは 6.2より下に降下するのは観察されないばかりか約
6.5であり、その後の観察では上昇するのが観察され
た。それでもなおこれらの研究はリンゲル−クエン酸塩
溶液にリン酸塩を追加して用いて培地のｐＨをこれらの
値より実質的に上に維持するのが好ましいことが確認
し、またさらにリン酸塩と共にあるいは単独でのグルコ
ースの添加は許容し得ない低いｐＨ値への降下を生ずる
ことが確認された。

このように血小板は人工培地内に満足すべきｐＨ，酸素
消費及び形態をもって少なくとも５日間貯蔵し得ること
が示された。これらの発見は保持された形態より予測さ
れる如く生体中における生存力及び臨床的降下と相容れ
る。ブラッド，６０(1)： 194- 200；トランスフュージ
ョン，１５(5)： 414- 421及びブラッド，５２(2)： 4
25- 435を参照。リンゲル−クエン酸塩培地にｐＨの降
下を防ぐため緩衝剤を加えることの必要性が明白に示さ
れた。本発明になる方法に従っても濃縮物中には常に残
留血漿が存在する。残留血漿には、血漿中のグルコース
が乳酸に変換される場合ｐＨが降下するのを防ぐ十分な
緩衝能力がなく、加えられたクエン酸塩は培地の緩衝能
力を十分には補わない。同様にリン酸塩の追加も貯蔵用
培地にグルコースが著しく追加されるとかかる追加が乳
酸生成をさらに生ぜしめるのでｐＨを維持するのに十分
でない。

グルコースは従って血小板代謝用の主要な基質に選ばな
かった。その代り、各細胞の代謝的要求は参加的附リン
酸反応の基質として作用する内因性あるいは外因性アミ
ノ酸又は脂肪酸により応じられる。出願者等の発見は、
ちょうどワイス他及び他の著者がＨｅＬａ細胞の如きあ
る種の組織培養細胞がグルタミンを主要エネルギー源と
して成長し得ることを示した如く、糖の非存在下でも人
間の血小板が維持されることを示唆する。ワイス他によ
る「糖の非存在下における脊髄動物細胞の連続的成
長」，ジャーナル オブ バイオロジカルケミストリ
ー，256(15)：7812-7819(1981)；及びライツァー他によ
る「糖でなくグルタミンが培養されたＨｅＬａ細胞の主
要エネルギー源であることの証拠」，ジャーナル オブ
バイオロジカルケミストリー，254(8)：2669-2676(19
79)を参照されたい。

上に示す如く、血小板は糖の非存在下でも酸化的代謝作
用を維持し得るもののようである。最初の３日間の貯蔵
で全てのグルコースが代謝された後も血小板は形態を維
持し、グルタミンが存在しクエン酸サイクルに酸化する
場合さら４日間酸素消費を持続した。またグルタミンが
リンゲル−クエン酸塩−リン酸塩培地より省略された際
もかなりの程度形態及び酸素消費の維持がなされたこと
は驚くべきである。クエン酸塩は外因性基質としては用
い得ないという文献報告を受入れるならば貯蔵中内因性
基質が血小板により使われたように見うけられる。

以上のことより数種の新規な人間の血小板の合成貯蔵培
地が人間の血小板を処理し約２２℃にて酸素の透過し得
る容器内に貯蔵する新規な方法にて使用し得ることが理
解されよう。かかる物質及び方法は現在貯蔵中に血小板
の保存に専用されている天然の血漿の実質的な節約をも
たらす。さらにここで説明した物質及び方法は血小板の
輸注により疾病が伝達される可能性を実質的に減少させ
ることが予想される。

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】（ａ）血漿内の血小板よりなる血小板濃縮
   物を形成する段階と、（ｂ）該濃縮物より上澄血漿を抽
   出し血小板１単位当り約１ないし１５mlの血漿を残し、
   血小板の小さなかたまりよりなる血小板ボタンと残留す
   る付随血漿とを形成する段階と、（ｃ）該血小板ボタン
   及び付随残留血漿に緩衝されたリンゲル−クエン酸塩溶
   液を加える段階と、（ｄ）該溶液を撹拌して該血小板を
   再懸濁し、血小板の合成懸濁液を形成する段階と、
   （ｅ）該合成系を必要になるまで約２０゜ないし２４℃
   にて維持された酸素が透過し得る容器内に貯蔵し、該血
   小板は少なくとも３ないし７日間の間生存力を保持する
   ことを特徴とする人間の血小板を処理し貯蔵する方法で
   あって、 段階（ｂ）及び（ｃ）は該合成懸濁液の中のグルコース
   濃度が貯蔵開始時点で１０ｍＭ／Ｌ未満であるように実
   行されることを特徴とする方法。
2. 【請求項２】貯蔵に先立ち懸濁液に酸化的リン酸化のた
   め非解糖反応的基質を加えることを特徴とする請求の範
   囲第１項記載の方法。
3. 【請求項３】該基質はグルタミンであることを特徴とす
   る請求の範囲第２項記載の方法。
4. 【請求項４】段階（ｂ）及び（ｃ）は該懸濁液中のグル
   コース濃度が貯蔵開始時点で約５ｍＭ／Ｌであるように
   実行されることを特徴とする請求の範囲第１項記載の方
   法。
5. 【請求項５】段階（ｂ）は血小板１単位当り４ないし１
   ５mlの血漿を残すことを有することを特徴とする請求の
   範囲第１項記載の方法。
6. 【請求項６】ナトリウム１７０ないし１８０ｍＥｑ／
   Ｌ；カリウム約２ないし５ｍＥｑ／Ｌ；カルシウム約２
   ないし５ｍＥｑ／Ｌ；塩化物約１１０〜１２５ｍＥｑ／
   Ｌ；クエン酸塩約１５〜２５ｍＥｑ／Ｌ；及び血小板１
   単位並びにそれに伴随する１５mlを超えない量の血漿の
   ｐＨを、１単位当り６０mlの該培地と共に約２０ないし
   ２４℃に維持された酸素が透過し得る容器内に７日間貯
   蔵した場合６．２を超えるｐＨに維持するのに有効な緩
   衝剤とし、貯蔵開始時点のグルコース濃度が１０ｍＭ／
   Ｌ未満であることを特徴とする人間の血小板用合成貯蔵
   培地。
7. 【請求項７】酸化的附リン酸反応のための血小板用に浸
   透可能な非解糖反応基質を特徴とする請求の範囲第６項
   記載の人間の血小板合成貯蔵培地。
8. 【請求項８】該非解糖反応の基質はグルタミンであるこ
   とを特徴とする請求の範囲第７項記載の人間の血小板用
   合成貯蔵培地。
9. 【請求項９】オキサロ酢酸塩、マリン酸塩、フマル酸
   塩、オキサロコハク酸塩、イソクエン酸塩、ｃｉｓ−ア
   コニット酸塩、グルタミン、クエン酸サイクル中間体の
   アミノ酸前駆体、アセチル−ＣｏＡのアミノ酸及び脂肪
   酸前駆体、及びこれらの混合物よりなるグループより選
   ばれた酸化的リン酸化の非解糖反応基質をさらに特徴と
   する請求の範囲第６項記載の培地。