JPH0625071B2 - 細胞供給剤 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 本発明は、細胞への生物学上活性な化合物の供給に関す
るものである。

種々の場合、生物学上活性な化合物を細胞膜を介して内
部細胞構造へ供給することが望ましい。たとえば、薬剤
又は細胞毒素は細胞膜外の媒体に捕えられると殆んど作
用を示さないが、一旦細胞内部に入ると極めて強力とな
る。

さらに、この種の生物学上活性な化合物は、異質細胞集
団における選択細胞へ供給することが望ましい。たとえ
ば、ウイルス感染した細胞又は形質転換された若しくは
悪性の細胞などの病変した又は感染した細胞を処置する
際、細胞毒素を病変した又は悪性の細胞へ供給するが正
常細胞へは供給しないことが望ましい。悪性細胞を標的
として開示された１つの方法は、抗体−毒素の結合体を
使用することである。抗体は悪性細胞に対し特異性であ
つて、これらへ毒素を供給する。有効となるためには、
この種の系は、標的細胞に対し高度の特異性を有するが
不必要に活性物質の効果を低下させないような毒素を供
給せねばならない。これらの問題は、目的が感染若しく
は病変細胞を生体内で正常細胞を阻害することなく破壊
することである場合、特に重要である。

リツツ（Ritz）等（１９８０）、ネイチヤー、第２８３
巻、第５８３−５８５頁は、一般的な急性リンパ芽球白
血病抗原に対し特異的であるモノクローナル抗体（Ｊ
５）を開示している。

バルビエリ（Barbieri）等（１９８２）、バイオケミス
トリー・ジヤーナル、第２０３巻、第５５−５９頁は、
ヤマゴボウ抗ウイルス蛋白−Ｓ（「ＰＡＰ−Ｓ」）とし
て知られた抗ウイルス蛋白の精製および部分特性化につ
き開示している。

ラマクリシナン（Ramakrishnan）等（１９８４）、キヤ
ンサー・リサーチ、第４４巻、第１３９８−１４０４頁
は、抗−Thy １．１すなわちモノクローナル抗体に対す
る結合性ＰＡＰ蛋白を開示している。この結合体は、Thy
１．１−陽性の標的白血病細胞における蛋白合成を選択
的に阻止するために使用される。結合体を形成するのに
使用されるリンカーはＮ−スクシンイミジル−３−（２
−ピリジル−ジチオ）−プロピオネートである。ジスル
フイド結合が分解されると、遊離のＰＡＰ毒素が生成さ
れる。

ネビル（Neville ）等、米国特許第４，３５９，４５７
号公報は、リンパ腫に対する腫瘍抑制組成物として使用
される抗−Thy １．２モノクローナル抗体とリシンとの
結合体を開示している。使用される結合剤はｍ−マレイ
ミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドであ
る。

上記方法はいずれも抗体−毒素結合体の毒性に依存する
か、或いはジスルフイド結合の開裂に依存し、この現象
は標的細胞への供給前に毒素の放出を防止すべく時間的
かつ空間的に制御するのが困難である。

リツチ（Rich）等（１９７５）、ジヤーナル・アメリカ
ン・ケミカル・ソサエテイー、第９７巻、第１５７５−
９頁は、固相ペプチド合成のため、アミノ酸を固定化す
るための３−ニトロ−ブロモメチルベンゾイルアミドポ
リスチレン樹脂を開示している。合成されたペプチドは
光分解によつて樹脂から脱着される。

パツチオルニク（Patchornik）等（１９７０）、ジヤー
ナル・アメリカン・ケミカル・ソサエテイ、第９２巻、
第６３３３−６３３５頁は、ペプチドのアミノ機能を保
護するためのｏ−ニトロベンジル誘導体の使用を開示し
ている。保護基は３２００Åより長い波長の光を照射し
て除去される。開示された特定のブロッキング基は６−
ニトロベラトリルオキシ−カルボニル（ＮＶＯＣ）及び
２−ニトロベンジルオキシカルボニル（ＮＢＯＣ）基で
ある。ペプチド鎖のカルボキシル末端機能に対する保護
基として2,2′−ジニトロジフエニルメタノールが開示
されている。

カプラン（Kaplan）等（１９７８）、バイオケミストリ
ー、第１７巻、第１９２９−１９３５頁は失活した
（「閉じ込めた」）アデノシン５′−トリホスフエート
（ＡＴＰ）を開示しており、これは２−ニトロベンジル
及び１−（２−ニトロ）フエネチル基に共有結合され
る。閉じ込めたＡＴＰを光に露出して、要求に応じＡＴ
Ｐを放出する。

ナルゲオツト（Nargeot）等（１９８０）、ＰＮＡＳ
（ＵＳＡ）、第８０巻、第２３９５−２３９９頁はcAMP
及びcGMPのｏ−ニトロベンジルエステルを、ＵＶ．照射
して、生物系においてcAMP及びcGMPを発生させることを
開示している。

発明の要点 本発明の一面は、生物学上活性な物質を選択標的細胞へ
供給しかつ放出するための光開裂性化合物を特徴とす
る。この化合物は、細胞表面リセプタに対する結合相手
と、生物学上活性な物質と、前記結合相手と生物学上活
性な物質との間における光開裂性ブリツジとを含む。化
合物を標的細胞及び非標的細胞の異質集団に露出する
と、これは標的細胞の表面におけるリセプタに選択結合
する。この化合物を光に露出してこれを開裂し、活性物
質を生成させる。

好適具体例において、生物学上活性な物質はペプチド細
胞毒素であり、かつ結合相手はたとえば病変若しくは感
染細胞、特に悪性若しくは形質転換細胞に対し特異的な
細胞表面抗原に対し選択的であるモノクローナル抗体の
ような化合物である。「ペプチド」という用語は、本明
細書において蛋白並びにそれより短鎖のペプチドを包含
するよう使用する。好ましくは、抗体はこれら細胞によ
り取り込まれるものである。ブリツジはｏ−ニトロベン
ジル機能であつて、ペプチドは開裂性結合を介しベンジ
ル炭素に結合され、かつ抗体は耐開裂性結合を介し芳香
族環に結合される。

特に好適な１例において、化合物は単位： 〔式中、Ｘ若しくはＹのいずれかは生物学上活性な物質
に結合された第１リンカーからなり、Ｘ及びＹの他方は
結合相手に結合された第２リンカーからなり、かつＲ₁
−Ｒ₃はそれぞれ独立して−Ｈ、低級アルキル基、低級
アルコキシ基又は環式アルキル若しくはアリール基であ
る〕 からなつている。本明細書に使用する「低級」アルキル
若しくはアルコキシという用語は、Ｃ_５若しくはそれ以
下を意味する。

この具体例において、Ｘは特に好ましくはオキシカルボ
ニル機能であつて、たとえばベンジル炭素がオキシ機能
及び機能「Ｚ」に共有結合され、この機能Ｚは−Ｈ、低
級アルキル（最も好ましくは−ＣＨ₃）、環式アルキル
又はアリールである。

さらに、Ｘはホスフエート機能又はアミノカルボニル機
能とすることもでき、たとえば化合物は単位： 〔式中、Ｗは活性物質からなり、Ｙはリンカー及び細胞
結合相手からなり、かつＲ₁及びＲ₂は上記の意味を有す
る〕 からなつている。

上記化合物は、細胞系を光に露出しうるような腫瘍抑制
及びその他の癌治療に対し極めて有利である。化合物が
Ｕ.Ｖ.光から保護されている限り化合物は開裂せず、か
つ正常細胞は毒素の作用に対し安全である。たとえば抗
体−ブリツジ結合のような化合物における結合は、光の
不存在下で開裂耐性となつて、毒性活性を有する物質を
放出しうるような化合物の望ましくない開裂を防止する
よう設計される。

光開裂系は、化合物を照射する際の特定時間及び特定場
所にて活性物質を迅速かつほぼ定量的に放出する。たと
えば、結合相手が細胞により取り込まれる抗体である場
合、照射は上記化合物が細胞により取り込まれた後に活
性物質を放出させる。光は活性物質に作用しない。開裂
に要する光エネルギは、皮膚障害の治療に現在使用され
ているものと同等である。たとえば、Ｗ.Ｌ.モリソン
（Morrison）（１９８３）、「皮膚病の光治療及び光化
学治療」（プレガー出版社）を参照することができる。

本発明の第２の面は一般に、ｏ−ニトロベンジルブリツ
ジ成分を有する上記したような光開裂性化合物の合成方
法を特徴とする。生物学上活性な物質は、ペプチド窒素
をｏ−ニトロベンジルオキシ−カルボニル−クロライド
と反応させてブリツジに結合させたペプチドである。合
成法の好適具体例において、抗体はマレイミド基により
官能化されて、スルフイド−マレイミド結合を介しベン
ジル環に結合する。上記合成は、ペプチドとｏ−ニトロ
ベンジル機能との間で事前に形成された結合に影響を与
えないような条件下で、抗体の開裂耐性結合を可能にす
る。

好適実施例の説明 以下の記載は、本発明の特に好適な実施例及びその図面
の説明である。

図面 第１図はＪ５−ＮＢＳ−ＰＡＰ−Ｓ(6)（ここでＪ５は
抗体であり、ＮＢＳはニトロベンジルスルフイドブリツ
ジであり、かつＰＡＰ−Ｓは下記するような細胞毒性蛋
白である）の合成に対する流れ図であり、 第２図はＪ５−ＮＢＥ−ＰＡＰ−Ｓ（１０）の合成のた
めの流れ図であり、用語は上記の意味を有しかつＮＢＥ
はニトロベンジルエステルブリツジであり、 第３図はＪ５−ＮＢＳ−ＰＡＰ−Ｓ(6)及びＪ５−ＮＢ
Ｅ−ＰＡＰ−Ｓ（１０）の照射時間の関数としてＰＡＰ
−Ｓの出現を示すグラフである。

化合物の構造 好適具体例において、本発明による光開裂性化合物は３
種の成分を有する：(1)標的細胞集団に供給すべき生物
学上活性な物質；(2)標的細胞に特異性である細胞表面
リセプタに対する結合相手；及び(3)結合相手に対する
共有リンカーと生物学上活性な物質に対する共有リンカ
ーとを含む光開裂性ブリツジ。

好適な生物学上活性物質は細胞毒素、特にペプチド細胞
毒素、たとえば上記したようなヤマゴボウ抗ウイルス蛋
白ＰＡＰ、ＰＡＰII及びＰＡＰ−Ｓであつて、アービン
（Irvin）（１９８３）、フアーマス−テイカル・テラ
ピー、第２１巻、第３７１−３８７頁に記載されてい
る。他のペプチド細胞毒素はリシンＡ−鎖、アブリンＡ
−鎖、モデシンＡ−鎖並びにゲロニン及びたとえばバル
ビエリ等（１９８２）、キヤンサー・サーベー、第１
巻、第４８９−５２０頁に記載されたような他の単鎖リ
ボソーム失活用蛋白を包含する。

ペプチド毒素が好適である。何故なら、これらはブリツ
ジに容易に結合しかつ細胞内に極めて少量で存在する
際、細胞蛋白合成を阻止するのに極めて強力な毒素であ
るからである。ペプチドでない他の細胞毒素も本発明の
範囲内であるが、この種の細胞毒素又は細胞毒素薬剤の
例はクロラムブシル、メトトレキセート、アミノプテリ
ン及びメルフアランである。

化合物の好適結合相手は、細胞表面抗原に対するモノク
ローナル抗体である。特に好適なものは、病変、感染、
形質転換若しくは悪性の細胞に特異的であるが正常細胞
には特異的でない細胞表面抗原に対するモノクローナル
抗体である。限定はしないが、特にこれらは細胞により
取り込まれる抗体である。抗原が正常細胞に多量に存在
しないためこれら細胞による活性物質の顕著な取り込み
を可能にする限り、これら正常細胞が特異性抗原を完全
に欠如する必要はない。この種の１種の抗体は上記Ｊ５
であつて、クールター・イミユノロジー、ヒヤリー・フ
ロリダ（Hialeah Florida）から入手することができ
る。他の例は黒色腫表面抗原に対する抗体であり、たと
えばイマイ等（１９８３）、キヤンサー・イミユノロジ
ー、第１５巻、第２０６頁以降に記載されている。クー
ルター・イミユノロジーから入手しうる他の適する抗体
は、Ｔ細胞及びＴ細胞リンパ腫、たとえばＴ３、Ｔ４、
Ｔ１１及びＴ１２に見られる表面抗原に対する抗体を包
含する。

本発明の範囲内にある他の結合相手は非抗体細胞膜輸送
因子、たとえばトランスフエリン及び蛋白ホルモン、た
とえばインシユリンを包含する。

好適ブリツジは２個の結合特性を有するｏ−ニトロベン
ジル機能であると思われ、結合特性の一方は活性物質に
対するものであり、他方は細胞結合相手に対するもので
ある。リンカーにより占有されない環部位における置換
基は、それぞれ独立して−Ｈ、低級アルキル若しくはア
ルコキシ基又は環式アルキル若しくはアリール基から選
択することができる。好ましくは、光開裂性部位は、毒
素とそのリンカーとの間の結合部位にあつて、天然毒素
がそれに結合された光開裂性化合物のアーティファクト
を生ずることなく放出される。

１種の特に好適な光開裂性リンカーは、必要に応じベン
ジル炭素に結合されたメチル基を有するｏ−ニトロベン
ジルオキシカルボニル機能である。オキシカルボニル機
能の代りに、ホスフエート若しくはチオカルボニル機能
も使用することもできる。さらに、上記７−ニトロイン
ドリニル−アミド機能を使用して活性物質を細胞結合相
手への光開裂的に結合させることもできる。活性物質が
ペプチドである場合、好ましくはアミノ窒素を介しオキ
シカルボニル機能のカルボニル炭素に結合される。

ブリツジと細胞結合相手との間の結合も重要である。何
故なら、この結合が天然作用により（たとえば、生体内
系における酵素により）望ましくない時間又は場所で開
裂すれば、結合相手の選択性が喪失しかつ毒素、又は潜
在的毒性活性を有する化合物が標的細胞を選択するため
の手段なしに細胞外部の媒体中に存在することになるか
らである。

適する１種の開裂耐性結合は、スルフヒドリル基と抗体
へ予め添加されたマレイミド機能との間に形成されるチ
オエーテル結合である。Ｊ５−ＮＢＳ−ＰＡＰ−Ｓ(6)
の下記構造を参照することができる。それ程好適でない
が他の開裂耐性結合は、抗体におけるマレイミド機能と
メルカプトプロパン酸エステルのスルフヒドリル基との
間に存在する。たとえばＪ５−ＮＢＥ−ＰＡＰ−Ｓ(10)
の下記構造を参照することができる。好ましくは、細胞
結合相手は−ＮＯ₂機能に対しメタ若しくはパラ位置に
て環に結合され、この結合は官能化抗体のマレイミド基
に結合されたスルフイドからなつている。

化合物の合成 一般に、好適化合物は、ペプチドをｏ−ニトロベンジル
環のペンジル炭素に基ずく機能と縮合させて合成され
る。抗体結合を形成するため後に使用する保護スルフヒ
ドリル基は予め環上へ導入されている。

たとえば、オキシカルボニル機能によりペプチドを結合
させる場合には、オキシカルボニルクロライド又はオキ
シカルボニルイミダゾールをペプチドのアミノ機能と縮
合させることができる。オキシカルボニルクロライド及
びオキシカルボニルイミダゾールは、ホスゲン及びカル
ボニルジイミダゾールをそれぞれ使用して対応のアルコ
ールから合成される。

リンカーがホスフエート機能であれば、対応するｏ−ニ
トロベンジルアルコールをオキシ塩化リンと反応させて
ジクロルホスフエートエステルを生成させ、これをペプ
チドと縮合させる。或いは、アルコールをジクロルエチ
ルホスフエートと縮合させてクロルエチルホスフエート
を生成させ、これをペプチドと縮合させる。

抗体とｏ−ニトロベンジル機能との間の共有結合は、ス
ルフヒドリル基を環へ結合させ、これを上記ペプチド結
合の際に保護し、次いで保護解除したスルフヒドリル基
をマレイミド官能化した抗体と反応させることにより得
られる。

２種の特異性細胞供給化合物に関する合成の詳細な以下
の説明により、上記合成法を説明する。これら２種の化
合物は、上記モノクローナル抗体Ｊ５の結合体と、同じ
く上記の毒素ＰＡＰ−Ｓであり、これらは若干異なるｏ
−ニトロベンジルリンカー機能を使用する。便宜上、こ
れら２種の化合物をＪ５−ＮＢＳ（ニトロベンジルスル
フイド）−ＰＡＰ−Ｓ(6)及びＪ５−ＮＢＥ（ニトロベ
ンジルエステル）−ＰＡＰ−Ｓ（１０）と呼ぶ。

Ｉ．Ｊ５−ＮＢＳ−ＰＡＰ−Ｓ(6)の合成 第１図はＪ５−ＮＢＳ−ＰＡＰ−Ｓと命名した抗体−蛋
白毒素結合体の合成を示している。以下の説明で括弧内
に使用する数字は、第１図に示した中間化合物及び生成
化合物に付けた数字を意味する。

Ａ．１−（５−ブロモエチル−２−ニトロフエニル）−
エタノール(2)の合成 化合物２は１−（５−メチル−２−ニトロフエニル）エ
タノン(1)から２工程で合成され、ドツプラー(Doppler)
等（１９７９）、エルベチカ・ヒミカ・アクタ、第６２
巻、第２９１−３０３頁に記載されたように得ることが
できる。特に、環のメチル基をＮ−ブロモスクシンイミ
ドによつて臭素化し、次いでベンジルケトンをアルコー
ルまで還元する。これらの手順を下記に説明する。

２０．０ｇ（０．１１１モル）の１−（５−メチル−２
−ニトロフエニル）エタノンと２１．８５ｇ（０．１２
３モル）のＮ−ブロモスクシンイミドと２６９mg（１．
１１ミリモル）の過酸化ベンゾイルとの１００mlのＣＣ
ｌ_４中における混合物を、Ｎ_２の下で還流下に４時間加
熱する。この段階で、反応の際に生成したスクシンイミ
ドが黄色溶液の上部に浮上する。この混合物を冷却し、
過しそして液を蒸発乾固させる。ＣＨ₂Ｃｌ_２にお
ける残渣の溶液を水洗し、次いで乾燥する（ＭｇＳ
Ｏ_４）。溶剤を蒸発させて黄色溶液を得る。エーテルか
らの再結晶化により臭素化物を微細な白色針状結晶とし
て得る。得られた臭素化化合物、すなわち１−（５−ブ
ロモエチル−２−ニトロフエニル）エタノンは次の特性
により同定することができる： 融点７７−７８゜ ＩＲ（ＣＨＣｌ_３）νｍａｘ１７２０（Ｃ＝０）、１３
５０（ＮＯ_２）：^１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３）δ２．５
３（ｓ、３Ｈ、ＣＨ_３）、４．４６（ｓ、２Ｈ、ＣＨ₂
Ｂｒ）、７．２−８．２（ｍ、３Ｈ、ＡｒＨ） 次いで、３６０mg（９．４７ミリモル）のＮａＢＨ_４を
５分間かけ２５mlのジオキサンと３５mlのメタノールと
における４−（５−ブロモメチル−２−ニトロフエニ
ル）−エタノン５ｇ（１９．４ミリモル）の氷冷溶液へ
添加して、化合物２を製造する。１０分後、混合物を室
温まで加温し、かつ１０分間撹拌する。残留する還元剤
をアセトンで急冷し、溶剤を蒸発させる。ＣＨＣｌ_３中
における残渣の溶液を飽和ＮａＣｌ水溶液で洗浄し、次
いで乾燥する（ＭｇＳＯ_４）。かくして、溶液は粘性の
黄色油状物まで濃縮され、静置すると固化する。

化合物２は次の特性を有する： 融点３６−３９゜ ＩＲ（薄膜）νｍａｘ３４００（Ｏ
Ｈ）、１５２５（ＮＯ_２）、１３５０（ＮＯ_２）．^１Ｈ
ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３）δ１．６０（ｄ、Ｊ＝７Ｈｚ、
３Ｈ、ＣＨＣＨ_３）、４．４５（ｓ、２Ｈ、ＣＨ₂Ｂ
ｒ）、５．４５（ｑ、Ｊ＝７Ｈｚ、１Ｈ、ＣＨＣ
Ｈ_３）、７．２−８．０（ｍ、３Ｈ、ＡｒＨ）． Ｂ．〔４−ニトロ−３−（１−ヒドロキシエチル）フエ
ニル〕メチル−３−Ｓ−アセチルチオン酸エステル(3)
の合成 化合物３は、上記化合物２から臭素の代りに次のように
アセチルチオン酸エステル機能を使用して製造される。

５mlのＤＭＦにおけるチオ酢酸０．３５ml（５ミリモ
ル）の溶液を室温で撹拌しながら、水酸化テトラブチル
アンモニウムの40％水溶液３．２８ml（５ミリモル）を
徐々に加える。これにＤＭＦ５mlにおける臭化ベンジル
(2)の１．００ｇ（３．８５ミリモル）を加え、撹拌を
３０分間続ける。溶剤を蒸発させ、エーテル中の残渣の
溶液を飽和ＮａＣｌ水溶液で抽出し、乾燥し（ＭｇＳＯ
_４）かつ蒸発させる。３×２０cmのＳｉＯ_２カラムにお
いて溶出剤として石油エーテル中の４０％エーテルを用
いたフラツシユクロマトグラフイーによる残渣の精製
は、粘性黄色油状物として０．５３４ｇ（５４％）の化
合物(3)を与える。

化合物３は次の特性を有する： ＩＲ（薄膜）νｍａｘ３４００（ＯＨ）、１６８０（Ｃ
＝０）、１５１５（ＮＯ_２）、１３４０（ＮＯ_２）、¹
Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３）δ１．５５（ｄ、Ｊ＝６Ｈ
ｚ、３Ｈ、ＣＨＣＨ_３）、２．３３（ｓ、３Ｈ、ＣＯＣ
Ｈ_３）、２．５（ｂｒ．ｓ、１Ｈ、ＯＨ）、４．１３
（ｓ、２Ｈ、ＡｒＣＨ_２）、５．４（ｑ、Ｊ＝６Ｈｚ、
１Ｈｚ、１Ｈ、ＣＨＣＨ_３）、７．２−８．０（ｍ、３
Ｈ、ＡｒＨ） Ｃ．ベンジルアルコール(3)からベンジルオキシカルボ
ニルクロライド(4)への変換 化合物３を、次のようにトリクロルメチルクロルホーメ
ート（ジホスゲン）を用いて対応のベンジルオキシカル
ボニルクロライド(4)に変換させる。

乾燥ジオキサン４mlにおける化合物(3)の２２５mg
（０．８８ミリモル）の溶液へ７１μ（０．８８ミリ
モル）のピリジンを加え、次いで１０５μ（０．８８
ミリモル）のトリクロルメチルクロルホーメート（ジホ
スゲン）を加える。沈殿物が直ちに沈降する。反応に続
いて、溶出剤としての石油エーテル中の５０％酢酸エチ
ルを使用してＴＬＣにかけ、これを１時間で完結させ
る。ジオキサンを蒸発させ、高減圧を残渣に１時間かけ
て全ての残留ジホスゲンを除去する。石油エーテル中の
５０％エーテルにおける生成物の混合物をセライトで
過し、かつ溶剤を蒸発させて化合物(4)を黄色油状物と
して得る。

化合物(4)は次の特性を有する： ＩＲ（薄膜）νmax1775(Ｃ＝０、クロルホーメート)、
１６８０（Ｃ＝０、Ｓ−アセテート）、１５２５（ＮＯ
_２）、１３５０（ＮＯ_２）．¹Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣ
ｌ_３）δ１．９０（ｄ、Ｊ＝６Ｈｚ、３Ｈ、ＣＨＣ
Ｈ _３）、２．４５（ｓ、３Ｈ、ＣＯＣＨ_３）、４．２
（ｓ、２Ｈ、ＡｒＣＨ₂Ｓ）、６．４（ｇ、Ｊ＝６Ｈ
ｚ、１Ｈ、ＡｒＣＨＣＨ_３）、７．２−８．２（ｍ、３
Ｈ、ＡｒＨ） Ｄ．ＮＢＳ−ＰＡＳ−(5)の製造 フイトラツカ・アメリカーナ（Phytolacca americana）
の種子からのＰＡＰ−Ｓの単離はバルビエリ等（上記）
に記載されている。ＰＡＰ−Ｓを化合物(4)のベンジル
オキシカルボニルクロライド機能と反応させて、次のよ
うにＮＢＳ−ＰＡＰ−Ｓを生成させる。

乾燥ジオキサン中における０．０１Ｍベンジルオキシカ
ルボニルクロライド(4)（２０μ、０．２μモル）の
溶液を、ｐＨ８．３の１００ｍＭのＮａＨＣＯ_３水溶液
（４ml）におけるＰＡＰ−Ｓ（４mg、０．１３μモル）
の溶液に加える。室温にて３５分後、この試料を遠心分
離して少量の生成沈殿物を除去する。上澄液を、１ｍＭ
ＥＤＴＡを含有するホスフエート緩衝塩水（ＰＢＳ）
で平衡化したセフアデツクスＧ−２５（微細）カラムに
おけるゲル過によつて精製する。ホスフエート緩衝塩
水（ＰＢＳ）は、ｐＨ７．２の１０ｍＭリン酸カリウム
と１４５ｍＭのＮａＣｌとを意味する。蛋白改変の程度
は、リウ（Liu）等の方法（バイオケミストリー、第１
８巻（１９７９）、第６９０−６９７頁）により試料
（１．２ml）をｐＨ７．３の０．５Ｍヒドロキシルアミ
ン（０．１２ml）で３５分間室温にてアミノリシスによ
つて決定し、遊離するチオールの量は５，５′−ジチオ
−ビス（２−ニトロ安息香酸）との反応により評価する
〔ＤＴＮＢ、エルマン（Ellman）（１９５９）、Arch.
Biochem. Biophys.第８２巻、第７０−７７頁参照〕。
分析は、ＰＡＰ−Ｓが蛋白１分子当り平均０．６１個の
ニトロベンジル基を含有することを示した。蛋白濃度
は、ニトロベンジル基に基ずく吸光度（水中のε₂₈₀＝
６８１０）につき補正した後、２８０ｎｍにおける吸光
度 から決定する。

Ｅ．Ｊ５−ＮＢＳ−ＰＡＰ−Ｓ(6)の製造 モノクローナル抗体Ｊ５を上記リツツ等（１９８０）に
記載されたように作成し、これをアイ（Ey）等、（１９
７８）、イミユーノケミストリー、第１５巻、第４２９
−４３６頁により記載されたように蛋白Ａセフアロース
４Ｂ−Ｃｌにおける親和性クロマトグラフイーに続いて
カルボキシメチルセルロースにおける陽イオン交換クロ
マトグラフイーによつて精製する。次いで、下記II．
Ｄ．項に記載するようなマレイミド基により官能化され
たＪ５を次のように化合物(5)に結合させる。

ＰＢＳ １．４９mlにおける５．７４mgのＮＢＳ−ＰＡ
Ｐ−Ｓ(5)（０．８５ニトロベンジル基／蛋白分子）の
溶液へ、１ｍＭ ＥＤＴＡを含有するｐＨ７．３の０．
５Ｍヒドロキシルアミン溶液０．１５mlを加える。室温
にて３０分後、溶液を、０．５ｍＭ ＥＤＴＡを含有す
るｐＨ７．０の１００ｍＭリン酸カリウムで平衡化させ
たセフアデツクスＧ−２５(微細)カラムに加える。かく
して遊離のスルフヒドリル基を含有する改変ＮＢＳ−Ｐ
ＡＰ−Ｓ（５ａ）をマレイミド−官能化Ｊ５抗体（５．
７４mg）に加え、４℃にて１晩保つた。結合体の精製
は、Ｊ５−ＮＢＥ−ＰＡＰ−Ｓ（１０）について下記す
ると同様である。ポリアクリルアミド−ＳＤＳゲル電気
泳動は、精製された結合体が主として１：１のＪ５−Ｐ
ＡＰ−Ｓ（６６％）アダクトよりなり、少量の高分子量
アダクトと遊離のＪ５抗体（９％）とを含有することを
示す。

II．Ｊ５−ＮＢＥ−ＰＡＰ−Ｓ（１０）の製造 第２図はＪ５−ＮＢＥ−ＰＡＰ−Ｓ（１０）の合成にお
ける工程を示している。化合物６及び１０はＪ５をニト
ロベンジル構成要素（entity）に結合させる手段におい
てのみ異なる。

Ａ．〔４−ニトロ−３−〔１−ヒドロキシエチル）フエ
ニル〕メチル−３−（２−ピリジルジチオプロパン酸）
エステル(7)の合成 化合物７は、１−（５−ブロモメチル−２−ニトロフエ
ニル）−エタノール(2)から環の臭素を次のようにピリ
ジルジチオプロパノエート基で置換することにより合成
される（Ｉ．Ａ．上記参照）。

ＤＭＦ５mlにおける１．０７ｇ（４．９９ミリモル）の
ピリジルジチオプロパン酸の溶液を室温にて撹拌しなが
ら、４０％水酸化テトラブチルアンモニウム水溶液３．
２４ml（４．９９ミリモル）を徐々に加える。生成した
無色のカルボキシレート塩の溶液へＤＭＦ５mlにおける
化合物(2)１．０ｇ（３．８４ミリモル）を加え、撹拌
を２時間続ける。溶剤を蒸発させ、ＣＨ₂Ｃｌ_２におけ
る残渣の溶液を順次に水と飽和ＮａＣｌ水溶液とで洗浄
する。この溶液をＭｇＳＯ_４で乾燥しかつ蒸発させる。
３×２６cmカラムにおいて石油エーテル中の４０％酢酸
エチルを用いるフラツシユクロマトグラフイーによる残
渣の精製は、(7)を粘性黄色油として与える。

化合物(7)の特性は次の通りである： ＩＲ（薄膜）νｍａｘ３３００（ＯＨ）、１７４０（Ｃ
＝０）、１５２０（ＮＯ_２）、１４２０（ＮＯ_２）、¹
Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３）δ１．５５（ｄ、Ｊ＝６Ｈ
ｚ、３Ｈ、ＣＨＣＨ_３）、２．８−３．３（ｍ、４Ｈ、
ＣＨ₂ＣＨ_２）、５．１３（ｓ、２Ｈ、ＡｒＣＨ_２）、
５．５（ｑ、Ｊ＝６Ｈｚ、１Ｈ、ＣＨＣＨ_３）、６．９
−７．９（ｍ、６Ｈ、ＡｒＨ）、３．８−８．５（ｍ、
１Ｈ、ＡｒＨ） Ｂ．ベンジルアルコール(7)からベンジルオキシカルボ
ニルクロライド(8)への転化 ベンジルアルコール(7)を、下記の通りにジホフゲン
（Ｉ．Ｃ．上記参照）へ露出することによつて対応する
ベンジルオキシカルボニルクロライド(8)に転化させ
る。

乾燥ジオキサン１．０２mlにおける１００mg（０．２５
４ミリモル）の(7)の溶液へ、３０．５μ（０．２５
４ミリモル）のジホスゲンを加える。室温にて２０時間
後、溶剤を蒸発させかつ高減圧を残渣に３０分間かけ
る。得られた１０の塩酸塩を１０mlの無水ジオキサン中
へ超音波処理（sonication）によつて微分散させ、かつ
これをさらに精製することなくＮＢＥ−ＰＡＰ−Ｓ(9)
の製造に使用する。

化合物８を分析するため、遊離塩基の分析試料を、塩酸
塩のジオキサン懸濁物へ過剰のＮ−エチルモルホリンを
添加することにより得る。この混合物を１０分間撹拌
し、溶剤を高減圧下で蒸発させる。エーテル中の生成物
の懸濁物をセライトで過し、液を黄色油状物まで濃
縮する。得られた遊離塩基の特性は次の通りである： ＩＲ（ＣＤＣｌ_３）νｍａｘ１７４０（Ｃ＝０）、１５
３０（ＮＯ_２）、１４２０（ＮＯ_２）．¹Ｈ ＮＭＲ
（ＣＤＣｌ_３）δ１．６０（ｄ、Ｊ＝６Ｈｚ、３Ｈ、Ｃ
ＨＣＨ_３）、２．６−３．１（ｍ、４Ｈ、ＣＨ₂Ｃ
Ｈ_２）、５．１０（ｓ、２Ｈ、ＡｒＣＨ_２）、６．１０
（ｑ、Ｊ＝６Ｈｚ、１Ｈ、ＣＨＣＨ_３）、６．９−８．
４（ｍ、７Ｈ、ＡｒＨ） Ｃ．ＮＢＥ−ＰＡＰ−Ｓ(9)の製造 上記Ｉ．Ｄ．に記載したように作成したＰＡＰ−Ｓを次
のように化合物(8)に結合させる。

乾燥ジオキサンにおける２５．４ｍＭのベンジルオキシ
カルボニルクロライド(8)（０．４ml、１０．２μモ
ル）の溶液をｐＨ８．３の１００ｍＭ ＮａＨＣＯ_３水
溶液（１２ml）におけるＰＡＰ−Ｓの溶液（１２mg、
０．４μモル）に加える。室温にて３０分後、沈殿物を
遠心分離により除去する。上澄液を、１ｍＭ ＥＤＴＡ
を含有するＰＢＳで平衡化させたセフアデツクスＧ−１
００カラムにおけるゲル過で精製する。蛋白改変の程
度は、ジチオエリスリトールでの還元及び遊離したチオ
ピリジンの測定により決定する〔カールソン（Carlsso
n）等（１９７８）、バイオケミストリー・ジヤーナ
ル、第１７３巻、第７２３−７３７頁〕。この分析は、
蛋白質が含有するニトロベンジル基の平均値が蛋白１分
子当り約０．６０であることを示す。蛋白濃度は、ニト
ロベンジルエステルによる吸光度（ε₂₈₀＝８８９０）
につき補正した後、２８０ｎｍにおける吸光度から測定
する。

Ｄ．Ｊ５−ＮＢＥ−ＰＡＰ−Ｓ（１０）の製造 化合物１４をＪ５モノクローナル抗体（上記Ｉ．Ｅ．参
照）へ次のように結合させる。

ｐＨ７かつ３０℃の１００ｍＭリン酸カリウム及び０．
５ｍＭ ＥＤＴＡの７．５９mlにおけるＪ５の７．５９
mlの溶液へ、ジオキサン中の１０ｍＭスクシンイミジル
−４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１
−カルボン酸エステル（ＳＭＣＣ、ピアス・ケミカル・
カンパニー社）４１．５μを加える。３０℃にて３０
分後、抗体を、上記緩衝剤で平衡化したセフアデツクス
Ｇ−２５（微細）のカラムによるゲル過で過剰の試薬
から分離する。１５mlの容量で溶出する改変抗体を、下
記のように改変したＮＢＥ−ＰＡＰ−Ｓで処理する。

過剰のジチオエリトリトールを、１ｍＭ ＥＤＴＡを含
有する３．７mlのＰＢＳにおける５．７４mgのＮＢＥ−
ＰＡＰ−Ｓ(9)（０．６０ニトロベンジル基／蛋白分
子）の溶液に加える。室温にて１５分間後、過剰の還元
剤を、ｐＨ７の１００ｍＭリン酸カリウム及び０．５ｍ
Ｍ ＥＤＴＡで平衡化させたセフアデツクスＧ−２５
（微細）でのゲル過によつて除去する。生成物（９
ａ）をマレイミド官能化されたＪ５抗体に加え、そして
４℃にて１晩保つ。

反応混合物をアイ等（１９７８）、イミユノケミストリ
ー（上記）に記載されたように３mlの蛋白Ａ−セフアロ
ースカラムに加えかつＰＢＳで洗浄する。抗体と抗体含
有結合体とを蛋白Ａにより結合させ、０．１５ＭのNaCl
を含有する０．１Ｍ酢酸で溶出させる。この蛋白混合物
をｐＨ６．５の３５ｍＭ ＮａＣｌを含有する５ｍＭリ
ン酸カリウムで透析し、これを同じ緩衝液で平衡化させ
た３mlのＣＭ−セルロースカラムに加える。未結合抗体
は、これらの条件下でＣＭ−セルロースにより結合され
ない。このカラムを１５０mlの緩衝液で洗浄し、かつ結
合体をｐＨ６．５の５ｍＭリン酸カリウム及び０．５Ｍ
ＮａＣｌで溶出させ、かつＰＢＳで透析する。ポリア
クリルアミド−ＳＤＳゲル電気泳動を使用して、Ｊ５−
ＰＡＰ−Ｓアダクト、遊離Ｊ５抗体及びより高分子量の
アダクトに関する結合体の組成を確認する。

光分解及び使用 これら化合物の光開裂は、これらを低エネルギのＵ．
Ｖ．光（たとえば、ピーク強度約３６５ｎｍ）に露出し
かつポリアクリルアミド−ＳＤＳゲル電気泳動を用いて
毒素及び抗体の出現速度を測定して示すことができる。
Ｊ５−ＮＢＳ−ＰＡＰ−Ｓ(6)及びＪ５−ＮＢＥ−ＰＡ
Ｐ−Ｓ（１０）については、９６穴のポリスチレン組織
培養プレートに含有させた試料をブラツクレイ長波長紫
外ランプ（モデルＢ−１００Ａ型、ウルトラバイオレツ
ト・プロダクツ・インコーポレーシヨン社、カリホルニ
ア州、サンガブリエル在）から１５cmの距離で照射す
る。１部（１０μ）を取り出し、蛋白をグリセリン
（１０容量％）、ヨードアセトアミド（１０ｍＭ）及び
ブロモフエノールブルーを含有するｐＨ６．８の０．１
２５Ｍトリス−ＨＣｌ緩衝液における５％（ｗ／ｖ）Ｓ
ＤＳの溶液（１０μ）を添加して変性させる。９０℃
にて２分間加熱した後、これら試料を５−１２％ポリア
クリルアミド−ＳＤＳ勾配ゲルに施こし、電気泳動にか
ける。このゲルをクーマシー青で染色し、バンド強度を
ヘレナ・ラボラトリース社のゲルスキヤンナで定量す
る。第３図は、理論的に可能な時間に対する収率と比較
したＰＡＰ−Ｓの生成％を示している。ＰＡＰ−Ｓの大
部分は、光へ露出し始めてから２分以内に放出される。

放出された毒素アリコートの毒性を測定し、これは化学
改変及び開裂が毒素の活性を変化させないことを証明す
る。蛋白合成のセルフリー分析は、たとえばＰＡＰ−Ｓ
のような毒素に対するこの目的に充分である。セルフリ
ーの蛋白質合成の分析は、マサチユーセツツ州、ニユー
イングランド・ヌクレア・コーポレーシヨン社から購入
したウサギ網状赤血球溶解物系を用いて行なう。

一般に、これら化合物は、異質細胞集団における標的細
胞に対し生物学的活性物質を供給するのに有用である。
たとえば、工業目的で細胞を処理する場合、特異的な所
望の又は望ましくない特性を有する細胞を、毒素又は栄
養物をこれら細胞へ選択的に導入して選択処理するのが
有用である。

医学上、これら化合物は生体内の腫瘍抑制に有用であ
る。何故なら、活性の未改変型の毒素は、悪性細胞への
み選択的に供給されるからである。この処理は、全ゆる
病変又は感染細胞、たとえば癌細胞に対し有用であり、
たとえば皮膚癌、血液病（患者の外部で血球を循環させ
る）又はたとえば患者から除去しうる或いは置換しうる
骨髄細胞のような他の細胞など露光しうる細胞に対し有
用である。

化合物を開裂するのに使用する光は、毒素構成要素に影
響を及ぼすことなく迅速かつ効果的な定量分解を生ぜし
めるのに充分なエネルギーを有すべきである。ｏ−ニト
ロベンジル機能の場合、一般に２５０〜３８０ｎｍ、最
も好ましくは３５０〜３８０ｎｍのピーク波長を使用す
ることができる。さらに光は、系中の他の吸光性物質、
たとえばヘモグロビンからの干渉を受けないように選択
せねばならない。

照射は、活性物質の最大放出を生ぜしめるのに充分な長
さかつ細胞の阻害を回避するよう充分な短さの時間で行
なわねばならない。照射の時間は、一般に好適系につい
ては２〜１０分間（第３図参照）とすべきであるが、光
源のピーク波長及び波長分布並びにピーク強度及び細胞
系の感度に応じて変化することもできる。望ましくない
波長を阻止するためのフイルタを使用することもでき
る。

他の実施態様 他の実施態様については後記請求の範囲に記載する。た
とえば、好適具体例に記載した機能の代りに、他のｏ−
ニトロベンジル機能を使用することもできる。メトキシ
機能又は他の電子吸引機能をニトロベンジル環における
１個若しくはそれ以上の位置で置換することができる。
光開裂性７−ニトロインコリンを光開裂性ブリツジとし
て使用することもできる。これら化合物及びその製造に
ついては、アミツト（Amit）等（１９７６）、ジヤーナ
ル・アメリカン・ケミカル・ソサエテイ、第９８巻、第
８４３頁以降に記載されている。提案されたブリツシジ
の光開裂特性は、ペプチドの代りにその出現が容易に追
跡される有機機能を使用して試験することができる。た
とえば、２−エチル酪酸機能又はベンジルアミン機能を
使用することができる。

他の抗体、たとえばそれ自身では細胞膜を横断して移動
されない抗体を、遊離状態で自己移動するが抗体には結
合されない活性物質と組み合せて使用することもでき
る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ０７Ｋ 3/08 8517−4Ｈ 15/12 8517−4Ｈ (72)発明者 ブラトラー，ウオルター エイ アメリカ合衆国 02146 マサチユーセツ ツ，ブルツクライン，グリグス ロード 77

Claims (23)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】生物学上活性な物質を選択細胞へ供給しか
   つ放出するための光開裂性の細胞特異的薬剤であって、
   該薬剤は、 細胞の特異的表面リセプタに対する細胞結合相手と、 生物学上活性な物質と、 前記結合相手と生物学上活性な物質との間の光開裂性ブ
   リッジとを含み、 該ブリッジは、下記の構造を含み ［式中、Ｘ及びＹの１つは生物学上活性な物質に結合さ
   れた第１リンカーを含み、Ｘ及びＹの他方は結合相手に
   結合された第２リンカーを含み、Ｒ_１−Ｒ_３はそれぞれ
   独立して−Ｈ、低級アルキル基、低級アルコキシ基又は
   環式アルキル若しくはアリール基から選択される］、且
   つ、 前記細胞表面リセプタに結合しうると共に、光に露出す
   ることにより物質の生物学活性を破壊することなく開裂
   しうることを特徴とする 上記の細胞特異的薬剤。
2. 【請求項２】細胞表面リセプタが抗原であり、かつ結合
   相手がこの抗原に対する抗体であって前記リセプタを含
   有する細胞膜を横断して運搬され、 これにより細胞特異的薬剤をリセプタに結合させうると
   共に膜を横断して輸送することができ、さらにこの薬剤
   を光に露出して生物学上活性な物質が遊離される請求の
   範囲第１項記載の薬剤。
3. 【請求項３】生物学上活性な物質がペプチドである請求
   の範囲第１項記載の薬剤。
4. 【請求項４】生物学上活性な物質が細胞毒性である請求
   の範囲第１項記載の薬剤。
5. 【請求項５】細胞毒性物質が蛋白合成阻止剤である請求
   の範囲第４項記載の薬剤。
6. 【請求項６】細胞毒素がリボソーム失活性蛋白を含む請
   求の範囲第５項記載の薬剤。
7. 【請求項７】細胞毒素がヤマゴボウ抗ウイルス蛋白、ゲ
   ロニン、リシンＡ−鎖、アブリンＡ−鎖又はモデシンＡ
   −鎖を含む請求の範囲第６項記載の薬剤。
8. 【請求項８】Ｘがオキシカルボニル機能を有する光開裂
   性結合を含む請求の範囲第１項記載の薬剤。
9. 【請求項９】Ｘが式： ［式中、ＺはＨ、低級アルキル、環式アルキル若しくは
   アリールである］ を有するオキシカルボニル機能を含む請求の範囲第８項
   記載の薬剤。
10. 【請求項１０】Ｘがホスフェート機能を有する光開裂性
    結合を含む請求の範囲第１項記載の薬剤。
11. 【請求項１１】Ｘがアミノカルボニル機能を有する光開
    裂性結合を含む請求の範囲第１項記載の薬剤。
12. 【請求項１２】下記の単位： ［式中、Ｗは活性物質を含み、Ｙはリンカーと細胞結合
    相手とを含み、Ｒ_１及びＲ_２は上記の意味を有する］ を含む請求の範囲第１１項記載の薬剤。
13. 【請求項１３】Ｙが−ＮＯ_２に対しメタ若しくはパラの
    位置に存在しかつスルフィド結合を有する開裂耐性リン
    カーを含む請求の範囲第１項記載の薬剤。
14. 【請求項１４】スルフィドが官能化抗体のマレイミド基
    に結合されている請求の範囲第１３項記載の薬剤。
15. 【請求項１５】活性物質が開裂性リンカーのカルボニル
    炭素に共有結合された窒素を有する蛋白であり、Ｙが非
    開裂性リンカーに結合された細胞表面リセプタに対する
    抗体であり、かつＲ_１−Ｒ_３がそれぞれ独立して−Ｈ及
    び−Ｏ−ＣＨ_３から選択される請求の範囲第９項記載の
    薬剤。
16. 【請求項１６】細胞結合相手がＴ細胞表面抗原に対する
    抗体である請求の範囲第１項記載の薬剤。
17. 【請求項１７】Ｔ細胞表面抗原がＴ３、Ｔ４、Ｔ１１又
    はＴ１２である請求の範囲第１６項記載の薬剤。
18. 【請求項１８】細胞結合相手が黒色腫表面抗原に対する
    抗体である請求の範囲第１項記載の薬剤。
19. 【請求項１９】細胞結合相手がＪ５抗体である請求の範
    囲第２項記載の薬剤。
20. 【請求項２０】Ｊ５−ＮＢＥ−ＰＡＰ−Ｓ（１０）又は
    Ｊ５−ＮＢＳ−ＰＡＰ−Ｓ（６）である請求の範囲第１
    項記載の薬剤。
21. 【請求項２１】生物学上活性なペプチドを選択細胞へ供
    給しかつ放出するための光開裂性の細胞特異的薬剤の製
    造方法であって、該薬剤は、 細胞の特異的表面リセプタに対する細胞結合相手と、 生物学上活性なペプチドと、 前記結合相手と生物学上活性なペプチドとの間の光開裂
    性ブリッジとを含み、 該ブリッジは、下記の構造を含み ［式中、Ｘ及びＹの１つは生物学上活性なペプチドに結
    合された第１リンカーを含み、Ｘ及びＹの他方は結合相
    手に結合された第２リンカーを含み、Ｒ_１−Ｒ_３はそれ
    ぞれ独立して−Ｈ、低級アルキル基、低級アルコキシ基
    又は環式アルキル若しくはアリール基から選択され
    る］、且つ、 前記細胞表面リセプタに結合しうると共に、光に露出す
    ることによりペプチドの生物学活性を破壊することなく
    開裂しうることを特徴とし、 該方法が、 ｏ−ニトロベンジル機能を与え、 活性化オキシカルボニル機能を前記機能のベンジル炭素
    上に生成させ、 前記活性化オキシカルボニル機能を前記ペプチドと反応
    させ、及び、 その生成物を前記結合相手と結合された第２リンカーと
    反応させる ことを含む上記の方法。
22. 【請求項２２】活性化オキシカルボニル機能がオキシカ
    ルボニルクロライド又はオキシカルボニル−イミダゾー
    ルである請求の範囲第２１項記載の方法。
23. 【請求項２３】ｏ−ニトロベンジル機能が、−ＮＯ_２機
    能に対しメタ若しくはパラ位置にてニトロベンジル環に
    結合された連鎖における保護されたスルフヒドリル機能
    を含み、かつ前記ペプチド反応の後に前記保護スルフヒ
    ドリル機能を保護解除し、次いでこれをマレイミド官能
    化抗体と反応させて前記スルフヒドリル基を前記マレイ
    ミド機能に共有結合させる請求の範囲第２１項記載の方
    法。