JPH0627738B2 - 特異的結合アッセイ装置および方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、一般に、特異的結合アッセイを行うための装
置および方法に関する。さらに詳しくは、本発明は、試
薬および反応試料成分のクロマトグラフ移動に使用する
ための装置および方法に関する。

従来の技術および発明が解決しようとする課題 特異的結合アッセイを使用することは、臨床および他の
応用分野において大きな価値を有することがわかってい
る。そのようなアッセイには、リガンドおよびレセプタ
ーからなる特異的結合ペアの一員である分析対象物の検
出および決定が含まれる。リガンドとレセプターとの間
には、レセプターがリガンドに特異的に結合するため、
類似の特徴を有する他の試料成分からリガンドを識別す
ることができるという関係がある。このような特異的結
合アッセイには、抗体と抗原との間の反応、ＤＮＡとＲ
ＮＡとのハイブリダイゼーション反応、およびホルモン
や他の生物学的レセプターの関与する他の特異的結合反
応などの免疫学的アッセイが含まれる。特異的結合アッ
セイは、当該技術分野でよく知られた種々の方式に従っ
て行うことができる。そのようなアッセイの例として
は、競合結合アッセイ、「直接」および「間接」サンド
イッチアッセイおよび凝集アッセイ法が挙げられる。

一般に、特異的結合アッセイの結果は直接観察すること
ができないので、結合反応を間接的に観察することがで
きるように、特異的結合ペアの一方を標識すべく種々の
技術が考案されている。有用な標識の例としては、放射
性標識、発色団および蛍光団が挙げられ、これらの存在
は放射線検出器、分光光度計または肉眼で検出すること
ができる。特異的結合ペアが酵素標識により標識されて
いる場合には、シグナルを生じる基質／補助因子のグル
ープを含む反応システムの酵素的活性化により検出する
ことができ、その場合、色素などの化合物が活性化され
て検出可能なシグナルを生成する。

特異的結合アッセイ装置として、(a)反応部位に抗体ま
たは抗原のような特異的結合ペアの一方を含浸させた多
孔質捕捉物質、(b)該捕捉物質の上部に配置させた除去
用プレフィルター、および(c)該捕捉物質の下部に配置
させた吸収物質、を含む要素を垂直に配列させたものが
当該技術分野で知られている。血液、血清または他の生
物学的流体のような試料流体を上記装置に加えると、微
粒子や他の不純物はプレフィルターにより試料から取り
除かれる。こうして取り除かないと、このような微粒子
や他の不純物は、特異的結合捕捉物質の上端に捕捉され
てしまうであろう。試料内の分析対象物質は、捕捉物質
上に存在する特異的結合ペアの相手側との特異的結合反
応により捕捉される。試料溶液中の非分析対象成分は、
捕捉物質中を通り過ぎてしまい、吸収物質に吸収され
る。捕捉物質から非分析対象成分を除去するために洗浄
工程を行ってもよく、また、反応部位での分析対象物の
存在を示すために酵素基質、補助因子および染料前駆体
などの試薬をさらに加えてもよい。ついでプレフィルタ
ーは、反応部位に分析対象物質が存在するかしないかを
視覚的に決定するために取り除かなければならない。こ
のようなアッセイ装置は速度も速く、一般に信頼できる
ものであるが、試料中の分析対象物質が捕捉物質上の反
応部位の中を通過するものではなく、その周りを流れる
ものであるので、捕捉効率と感受性の点で限界がある。

本発明に関連する種々の文献がある。トム(Tom)らの米
国特許第4,366,241号明細書には、特異的結合試薬を含
む比較的小さな試験ゾーン、および免疫吸収ゾーンと液
体受容関係にある比較的大きな吸収ゾーンからなるイム
ノアッセイ装置が開示されている。分析対象物質の存在
を決定するためのイムノアッセイは、アッセイ装置を試
料溶液、酵素標識特異的結合物質を含む溶液、および酵
素触媒シグナルシステムを含む溶液に接触させることに
より行う。これらの溶液は免疫吸収ゾーンを通って液体
吸収ゾーン中に移動し、試料物質中の分析対象物質の存
在はシグナルシステムの酵素活性化により示される。

ドイチュ(Deutsch)らの米国特許第4,094,647号、第4,23
5,601号および第4,361,537号各明細書は、免疫学的およ
び他のタイプの特異的結合アッセイに関するものであ
り、これらのアッセイでは試薬はクロマトグラフ溶媒に
より移動する。その一実施態様によれば、放射性標識競
合結合アッセイキットは毛管現象により展開液を移動さ
せることのできるストリップ（小片）からなり、該スト
リップは、試料を適用する第一ゾーン、展開液により移
動され得る第一の試薬を含浸させた第二ゾーン、および
第二の試薬を含浸させた第三ゾーンを有する。さらに該
装置は測定ゾーンおよび遅延要素を含み、該遅延要素は
第二の試薬もしくはストリップの物質であってよい。第
一の試薬は、(1)試料、(2)試料および第二の試薬、およ
び(3)試薬と競合する第二の試薬よりなる群から選ばれ
た一つと反応することができ、決定しようとする特性に
依存した量の生成物を生成する。試料を第一ゾーンと接
触させ、ついでストリップを展開液に浸漬させて試料お
よび第一の試薬を移動させ反応生成物を生成させる。遅
延要素は、生成物かまたは第一の試薬（移動試薬）の移
動を遅くさせてこれら両者を隔離させる。ついで移動し
た要素の量を測定位置で測定する。

さらに本発明に関連するものとして、ゴードン(Gordon)
らと1986年９月29日に共同出願した米国特許出願第912,
878号明細書の開示がある。これは、分析対象物質およ
び試薬物質の連続クロマトグラフ移動を利用した特異的
結合アッセイを行うための装置に関するものである。洗
浄および添加工程は本来的に行うことができ、液の「微
細循環」(microcircuitory)をプログラムすることによ
り種々の多工程手順を行い、試料物質と試薬とが事前に
混合するのを防ぐことができる。特にゴードンらの連続
移動に関する出願は、試料中の分析対象物質を検出する
ための試験ストリップからなる装置に関する。該試験ス
トリップは、選択されたクロマトグラフ溶媒により非固
定化試薬および反応性試料成分の速やかなクロマトグラ
フ溶媒移動を行うことが可能な一定の長さのクロマトグ
ラフ物質からなる。

本発明はさらに関連するものとして、ピアッシオ(Piasi
o)らの米国特許第4,255,575号およびリットマン(Litma
n)らの米国特許第4,391,904号各明細書の開示が挙げら
れる。これらの文献は一般に特異的結合アッセイ法に関
し、固相マトリックス上への酵素基質バッファーおよび
補助因子の固定化を開示している。

課題を解決するための手段 本発明は、１もしくはそれ以上の特異的結合反応によ
る、試料中の分析対象物質の存在または量を決定するた
めの装置および方法に関する。本発明の装置は単一のク
ロマトグラフ媒体を含む。該クロマトグラフ媒体は毛管
現象を有し、反応性試料成分および非固定化試薬の１種
または２種以上をクロマトグラフ溶媒移動させることが
でき、また反応部位を含んでいる。該反応部位には、分
析対象物質および標識特異的結合物質よりなる群から選
ばれた１種と結合することのできる固定化試薬が固定化
されており、また該反応部位は、該クロマトグラフ媒体
の全領域を占めず上流部分および下流部分を残すような
領域を占める。本発明の装置はまた、該クロマトグラフ
媒体の上流部分に流体接触し、一定量の試料が該クロマ
トグラフ媒体に沿って該反応部位に移動されるまで保持
され得るように適合された試料適用手段、および反応部
位の下流に位置し該下流部分と流体接触している液体吸
収手段を含む。試料中に含まれる分析対象物質の存在ま
たは量を決定するために本発明の装置を使用する方法は
以下の工程を含む。

(a)分析しようとする試料の一定量を試料適用手段に適
用し、該試料適用手段に保持された試料を毛管現象によ
りクロマトグラフ媒体に沿い反応部位を通って液体吸収
手段まで移動させる、 (b)標識特異的結合物質を反応部位に接触させる、 (c)未結合試料物質および未結合標識特異的結合物質を
反応部位から取り除く、ついで (d)反応部位に固定化された標識特異的結合物質の存在
または量を測定することにより試料中の分析対象物質の
存在または量を決定する。

未結合試料物質および未結合標識特異的結合物質を反応
部位から取り除くには洗浄工程により行えばよく、その
際、洗浄溶液は、好ましくは試料適用手段を通して反応
部位に加える。または、標識結合物質が充分に希釈され
ている場合には洗浄工程は必ずしも必要ではない。

発明の概要 以下、本発明をさらに詳しく説明する。

本発明は、クロマトグラフ特異的結合アッセイ法を行う
ための改良された装置および方法を提供するものであ
る。本発明による装置の特徴は捕捉効率が高いことであ
り、このことは特に、入手できる試料流体の量が限られ
ている小児科患者および老人病患者の診断に本発明の装
置を適用する場合に有利である。このような捕捉効率の
高さは、試料および他の反応性物質のクロマトグラフ移
動を、含浸させた媒体の狭い厚みの中を通すかまたはそ
の周囲で行うよりむしろ反応部位を通して水平に(later
ally)行うことにより、上記試料および反応性物質を、
特異的結合試薬を含むクロマトグラフ媒体の全長中を流
れるようにすることができることによる。

本発明の装置は、プレフィルターを用いる必要なしに、
微粒子物質の容量の大きい試料を分析するのに適してい
る。微粒子物質は反応部位での分析対象物質の決定を妨
害することはなく、試料適用手段とクロマトグラフ媒体
との間の中間面に集積する。にもかかわらず、たとえば
全血のように微粒子物質の容量が特に大きな試料の場合
には、プレフィルター、とりわけ非着脱性のプレフィル
ターを用いて試料適用手段に備えつけてもよい。

本発明の装置は、反応部位を有する単一のクロマトグラ
フ媒体（該反応部位は、該クロマトグラフ媒体の全領域
を占めず、上流部分および下流部分を残すような領域を
占める）、該クロマトグラフ媒体の上流に流体接触し、
一定量の試料が該クロマトグラフ媒体に沿って該反応部
位に移動されるまで保持され得るように適合された試料
適用手段、および反応部位の下流に位置し該下流部分と
流体接触している液体吸収手段からなる。該反応部位に
は、分析対象物質および標識特異的結合物質よりなる群
から選ばれた１種と結合することのできる固定化試薬が
固定化されている。上記クロマトグラフ媒体、試料適用
手段および液体吸収手段はケース内に配列するのが好ま
しい。試料物質および試薬は、試料適用手段へ一緒にま
たは連続して加える。該試料適用手段は、反応部位から
偏った領域、ウエル、吸収パッド、または該クロマトグ
ラフ媒体と接触した容量測定用放出装置からなっていて
よい。試料適用手段は、吸収物質から作ることができる
ようなウエルまたは吸収パッドであるのが好ましい。試
料適用手段は、該クロマトグラフ媒体の上流部分に流体
接触し、一定量の試料を該クロマトグラフ媒体に沿って
該反応部位に移動されるまで保持し得る。試料物質およ
び試薬はクロマトグラフ媒体中に吸収され、該クロマト
グラフ媒体に沿い反応部位を通って水平にクロマトグラ
フ移動する。分析対象物質および試薬物質は反応部位に
おいて特異的結合反応により固定化されるが、非分析対
象物質成分および非固定化試薬は、該クロマトグラフ媒
体を通り該反応部位からは下流に位置する液体吸収手段
に運ばれる。

以下、図面に基づいて説明する。

第１図〜第３図には、試料流体中の分析対象物質を検出
するための装置１０が示されている。該装置１０は、上
部ハウジング部１１、下部ハウジング部１２、および一
定の長さの単一のクロマトグラフ媒体１３からなり、該
クロマトグラフ媒体１３には、クロマトグラフ溶媒移動
が開始される第一の末端１４、クロマトグラフ溶媒移動
が終了する第二の末端１５、および分析対象物質および
標識特異的結合物質よりなる群から選ばれた１種と結合
することのできる試薬が固定化された反応部位１６が備
えられている。該装置１０はさらに、クロマトグラフ媒
体１３に隣接した支持ストリップ１７、上部ハウジング
部１１で区画されクロマトグラフ媒体１３の第一の末端
１４に隣接する試料ウエル１８、および反応部位１６の
上流に位置しクロマトグラフ媒体１３の第二の末端１５
に隣接する吸収物質１９からなる。

本発明の装置１０を用いてサンドイッチ型アッセイを行
う一つの手順に従えば、分析対象物質の存在を試験しよ
うとする試料の一定量を試料ウエルに加える。試料物質
はクロマトグラフ媒体１３中に吸収され、第二の末端１
５に向かって流れ始める。分析対象物質を含有する試料
物質は、試薬が固定化された反応部位１６の中を流れて
ゆく。該試薬は分析対象物質と特異的に結合することが
できるので、分析対象物質が存在する場合は、特異的に
結合して該反応部位１６に固定化される。非分析対象物
質はクロマトグラフ媒体１３の中を第二の末端１５に向
かって流れてゆき、吸収物質１９により吸収される。

試料ウエル１８から吸収物質１９への試料物質の移動が
完了したら、分析対象物質と特異的に結合することので
きる標識試薬物質を試料ウエル１８に加え、該標識試料
物質がクロマトグラフ媒体１３により吸収され、反応部
位１６を通ってクロマトグラフ媒体１３の第二の末端１
５に移動し、吸収物質１９により吸収されるようにす
る。分析対象物質が反応部位１６に固定化されている
と、標識試薬物質は分析対象物質と反応し固定化され
る。試薬物質が放射性標識、発色団または蛍光団により
標識されている場合は、標識物質、従って分析対象物質
の存在を反応部位で検出することができる。試薬物質が
酵素標識されている場合は、分析対象物質の存在を示す
ために、さらに酵素基質、補助因子および染料前駆体な
どの試薬を試料ウエル１８に加えるか、または反応部位
１６に直接加える。

二つの別の実施態様に従って、標識特異的結合物質は、
クロマトグラフ媒体、反応部位の上流、または使用適用
手段の吸収物質中に含ませるかまたは乾燥させて、試料
を加えることによって再構成させることができる。

第１図〜第３図に示した装置１０はまた、競合型の特異
的結合アッセイを行うべく改変することができる。その
ような競合法の一法では、反応部位１６に固定化された
試薬との結合に分析対象物質と競合するように標識特異
的結合試薬を選択することができる。該固定化試薬は、
分析対象物質および標識特異的結合試薬の両方と結合す
ることができる。試料中に存在する分析対象物質の量
は、反応部位１６に結合する標識特異的結合物質の前以
て定められた量の比率を決定するであろう。量および／
または標識特異的結合物質の結合親和性を調節すること
により、試料中に存在する分析対象物質の量を決定する
ことができる。

本発明の装置を用いて他の種々の特異的結合アッセイを
行うことができる。たとえば、クロマトグラフ媒体のさ
らに別の反応部位に種々の固定化特異的結合試薬を含浸
させてもよい。そのようなさらに別の反応部位は、さら
に別の分析対象物質の検出に用いたり、または試料中に
存在する分析対象物質の量を定量するための競合型アッ
セイにおいて用いることができる。この別の反応部位
は、分析対象物質の正確な決定を妨害する物質を捕捉す
るために用いることができる。

クロマトグラフ媒体はまた他の試薬および物質を含浸さ
せてもよい。その例としては、染料化合物、酵素基質、
補酵素および補助因子が挙げられ、これらは技術分野で
よく知られているように酵素標識と反応して発色シグナ
ルを生じさせる。本発明の一実施態様において、標識特
異的結合剤が酵素標識されたものであり、該酵素標識の
存在がシグナル生成基質／補助因子の１種との反応によ
り決定されることを特徴とするものである場合、シグナ
ル生成基質／補助因子の第一のものがクロマトグラフ媒
体の反応部位に固定化されていてよい。基質／補助因子
グループの第二のものは、酵素標識が存在するときにシ
グナル生成システムを活性化することができるように適
当なときに加えてよい。シグナル生成基質／補助因子グ
ループの１種で反応部位を前以て含浸させておくことに
より、添加工程をなくすことができ、基質、補助因子お
よび染料前駆体を一緒に貯蔵したときの不安定さまたは
不溶性に関連する問題を回避することができる。さら
に、シグナル生成化合物のグループのある種のものはク
ロマトグラフ移動が小さい場合があるので、反応部位に
前以て含浸させておくことが特に好ましいということに
なる。

本発明の装置は、単独で、ペアで、または複数で配置し
てハウジングすることができる。このハウジングは、漏
出を防ぐために好ましくは防水にすべきであり、種々の
不活性物質で製造することができるが、製造するのが容
易なことからポリマー物質が好ましい。試料ウエルは、
本発明に使用しようとする試料または試薬のいかなる所
要量をも収容することができるように充分な容積を有し
ていなければならない。液体吸収手段が装置のハウジン
グ内に封じ込められている場合には、該液体吸収手段
は、アッセイ手順のあいだに装置に加えられる試料、洗
浄水および試薬物質がすべて吸収されるように充分な容
積を有していなければならない。クロマトグラフ媒体が
０．４cm幅のニトロセルロース物質からなるストリップ
である本発明の好ましい実施態様では、１０μ〜１５
０μの範囲の容積の試料および試薬が収容される。

反応部位は試料適用手段の下流に位置しており、両側か
ら見ることができ、封じ込められていないかまたは透明
な物質で覆われている。反応部位は封じ込められていな
いのが好ましく、そうすることにより反応部位からのシ
グナルの存在の有無の観察が容易になり、また試薬およ
び／または洗浄溶液を反応部位に加えることができるよ
うになる。

反応部位の下流に位置する液体吸収手段は、試料物質、
試薬および洗浄溶液を吸収し、そうすることにより、反
応部位を通ってクロマトグラフ媒体の第一の末端から第
二の末端へ試料および他の物質のクロマトグラフ移動を
行うことができるようになる。そのような吸収がないと
クロマトグラフ移動は止まってしまい、反応部位を通っ
て試料が水平に流れることによる効率の良さという利点
は失われることになるであろう。

液体吸収手段はクロマトグラフ媒体そのものをも含むこ
とができ、その場合には、試料および試薬物質は長いク
ロマトグラフ媒体により移動し吸収される。本発明の特
に好ましい実施態様は、液体吸収手段がクロマトグラフ
媒体に隣接しかつ反応部位の下流に位置し該下流部分に
流体接触しているものである。液体吸収手段をクロマト
グラフ媒体に隣接して位置させることにより、吸収容量
がさらに得られる。液体吸収手段を反応部位からは下流
に偏在させることにより、反応部位の上流に加えた試料
物質および他のすべての物質が、垂直にではなく主とし
て水平に反応部位を通って流れることが保証される。

液体吸収手段は延長されたクロマトグラフ媒体からなっ
ていてよいが、多量の吸収物質からなるのが好ましい。
木材パルプからのセルロース性吸収物質または木綿が適
している。吸収物質はクロマトグラフ媒体と同じ大きさ
である必要はなく、一般にクロマトグラフ媒体よりも幅
も広く厚さも厚い。吸収物質は、クロマトグラフ媒体か
らの流体が吸収物質中へ流れ込むように、クロマトグラ
フ媒体に隣接してさえおればよい。特に好ましい吸収物
質は、ジェイムズ・リバー・タイプ(James River Type)
５２ポイント吸収物質（ジェイムズ・リバー・ペーパー
(James River Paper Co.,Inc.,)、リッチモンド、Ｖ
Ａ）である。好ましくは液体吸収手段は、試料物質の全
容量を吸収することができなければならず、さらに別の
試薬を吸収し、しかもそれを相当速やかに行うことがで
きることが好ましい。

本発明に有用なクロマトグラフ媒体には、毛管現象を有
し、非固定化試薬および試料成分のクロマトグラフ媒体
移動を行うことができるクロマトグラフ基体物質が含ま
れる。本発明に用いるクロマトグラフ媒体は、ストリッ
プ（小片）の形態であるのが好ましい。ペーパークロマ
トグラフィーに用いる織物または不織繊維状物質などを
含む広い範囲の種々のクロマトグラフ物質が本発明に用
いるのに適しているが、微多孔質または微小顆粒薄層ク
ロマトグラフィー基体が特に適している。というのは、
これらの物質が本発明によるアッセイのスピードおよび
解析力を高めるからである。クロマトグラフ物質は好ま
しくは不活性でなければならず、一般に、試料成分、試
薬バッファーまたは反応生成物のいずれとも物理的また
は化学的に反応してはならない。１９８６年９月２９日
および１９８７年７月１３日にそれぞれ共同出願し継続
中の米国特許出願第912,878号および第072,459号各明細
書には、適当な種々のクロマトグラフ基体物質が広い範
囲にわたって開示されている。しかしながら、特に好ま
しいのは、タイプＳＭＷＰ（ミリポア・コーポレーショ
ン(Millipore Corp.,)ベッドフォード、マサチューセッ
ツ）と呼ばれる孔径が５μｍの微多孔質ニトロセルロー
ス物質を使用することである。

本発明の装置のクロマトグラフ媒体は化学的に不活性で
あることが好ましいので、溶媒移動に対して特異的結合
試薬を固定化することが望まれるいかなる反応部位にお
いても活性化されなければならない。試薬を固定化させ
るには、試薬の特定の化学的性質に従って種々の方法が
必要とされるであろう。一般にクロマトグラフ媒体がニ
トロセルロースまたは混合ニトロセルロースエステルで
ある場合は、試薬を固定化させるために特別の化学的結
合を必要としない。他の物質および試薬の場合には種々
の方法が必要とされ、それらにはカルボニルジイミダゾ
ール、グルタールアルデヒドまたはコハク酸のような物
質で官能化すること、または臭化シアンなどの物質で処
理することが含まれる。他の適当な反応には、アルデヒ
ド基、カルボニル基およびアミノ基を還元するためにシ
ッフ塩基および水素化ホウ素で処理することが含まれ
る。ＤＮＡ、ＲＮＡおよびある種の抗原は、クロマトグ
ラフ媒体上に焼き付けることにより溶媒移動に対し固定
化することができる。焼き付けは約６０℃〜約１２０℃
の範囲の温度で約５分〜約１２時間の範囲の時間で行っ
てよいが、約８０℃で約２時間行うのが好ましい。

本反応に有用な特異的結合試薬は、当業者には容易に同
定し得るものであり、リガンドおよびレセプターからな
る特異的結合ペアの成員のような物質が含まれる。リガ
ンドとレセプターとの間には、レセプターがリガンドに
特異的に結合するため、同様の特徴を有する他の物質か
らリガンドを識別することができるという関係がある。
本発明による装置および方法は、免疫学的アッセイ法を
行うのに特に有用であり、この場合は特異的結合試薬は
抗原および抗体（抗体断片および合成抗体を含む）であ
る。アビジン、ビオチン、ストレプトアビジンおよび抗
ビオチンなどの特異的結合物質もまた標識し本発明の特
異的結合クロマトグラフアッセイに利用することができ
る。本発明の方法、キットおよび装置はまた、ＤＮＡお
よびＲＮＡハイブリダイゼーションアッセイ、およびホ
ルモンレセプターや他の生物学的に活性な因子の関与す
る他の特異的結合アッセイを行う上でも有用なことがわ
かっている。

本発明の特異的結合用装置の調製に有用なブロッキング
剤は、クロマトグラフ媒体上の過剰の結合部位をブロッ
キングすることができるような剤であり、このような過
剰の結合部位は本発明の試料物質または試薬のクロマト
グラフ溶媒移動を妨げるものである。本発明の装置を構
築するに際しては、クロマトグラフ媒体に試薬を含浸さ
せて所望の位置に固定化させる。一担、試薬を所望の部
位に固定化させると、ついでストリップを加工して他の
試薬または試料物質に対し過剰の結合部位をブロッキン
グするのが好ましい。特に適しているのは、カゼイン、
ゼラチン、アルブミンまたは全血清などのタンパク質か
らなるブロッキング溶液を使用することである。そのよ
うなタンパク質は、アッセイの試薬物質を妨害しないか
または交差反応しないように選択する。反応部位のブロ
ッキングは、クロマトグラフ基体物質を生理食塩水中の
０．２％カゼイン溶液中に浸し、ストリップ物質を空気
乾燥させることによって行う。他の方法としては、０．
１％ゼラチン溶液または０．１％ウシ血清アルブミン溶
液中に浸し、クロマトグラフ基体物質を空気乾燥させる
方法がある。

つぎに、本発明を実施例に基づいてさらに詳しく説明す
るが、本発明はこれらに限定されるものではない。

実施例１ 本実施例では、Ｂ型肝炎表面抗原(HBsAg)を検出するた
めのサンドイッチ型イムノアッセイ装置を調製し使用し
た。厚さ約０．１５mm、孔径５μｍの微多孔質ニトロセ
ルロース物質（ミリポアSMWP）を、フィルムドライヤー
器具中、６０〜６５℃でマイラー(Mylar)および接着剤
（モノコート(Monokote)、トップ・フライト・モデルズ
(Top Flite Models,Inc.,)、シカゴ、ＩＬ．）にラミネ
ートさせた。膜および支持物質を幅０．４cm、長さ２．
５cmのストリップにカッティングした。抗HBsAg抗体
（アボット・ラボラトリーズ、ノースシカゴ、ＩＬ．）
（０．１〜１．５μ、１．５mg／ｍ）を反応部位に
加え、周囲条件下で１５分間インキュベートした。つい
でクロマトグラフ媒体上の非特異的結合部位をブロッキ
ングし、１０mMトリスおよび１５０mM NaCl(pH７．６）
中の０．１％魚ゼラチン、１％ショ糖および０．１４mg
／ｍニトロブルーテトラゾリウムからなる溶液を用い
周囲温度で１０分間インキュベートすることにより共同
基質(cosubstrate)を結合させた。ついでストリップを
４０℃で約１時間乾燥させ、乾燥剤の存在下、周囲温度
で貯蔵した。含浸ストリップおよびジェイムズ・リバー
５２ポイント吸収物質（１．０cm×２．４cm）を利用
し、上記吸収物質をストリップの第二の末端上に置いて
液体吸収手段として機能させることにより、第１図〜第
３図に示した装置に概して類似した装置を調製した。

各試験装置の試料適用ウエルに、種々の濃度のHBsAgを
加えておいた再固化(recalcified)血漿の試料３０μ
を加えた。試料をニトロセルロース物質の第一の末端に
浸漬し、反応部位を通ってニトロセルロースの第二の末
端まで移動させ、吸収物質により吸収させた後、ビオチ
ン標識抗HBsAg抗体（１μｇ／ｍ）の１５μアリコ
ートを各試料ウエルに加えた。この溶液が装置中を移動
した後、アルカリホスファターゼ標識抗ビオチン（２μ
ｇ／ml）（アボット・ラボラトリーズ、ノースシカゴ、
ＩＬ．）の１５μアルコートを各試料ウエルに加え、
各試料ウエルにトリスバッファー生理食塩溶液中の１％
トリトンＸ１００からなる洗浄溶液１５μを加えるこ
とにより反応部位を２回洗浄した。ついで０．５mg／ｍ
ブロモクロロインドリルホスフェート、０．１mg／ｍ
MgCl₂および２−アミノ−２−メチルプロパノール（p
H９．８）からなる顕色溶液の１５μアリコートを各
試料ウエルに加え、１０mMエチレンジアミン四酢酸(EDT
A)溶液１５μを加えて反応を停止させる前に、呈色反
応させて１０分間顕色させた。HBsAgを含まない試料溶
液はシグナルを生ぜず、反応部位は白色である。０．１
ng／ｍもの少量のHBsAgを含有する試料溶液で、反応
部位に青〜灰色の肉眼で見えるスポットが容易に生じ
た。全アッセイ時間は２５分であった。

実施例２ 本実施例では、HBsAg検出用のサンドイッチ型アッセイ
装置を調製し使用したが、標識特異的結合物質は、本発
明者らの出願中の米国特許出願第072,459号明細書に記
載の方法に従ってコロイド状金粒子で標識した。使用し
た装置および物質は、ニトロブルーテトラゾリウムをブ
ロッキング溶液から除いた他は実施例１に記載したもの
と同一であった。

各装置の試料ウエルに、種々の量のHBsAgを加えておい
た再固化血漿の試料５０μを加えた。試料をニトロセ
ルロース物質の第一の末端に浸漬した後、５μｇ／ｍ
で吸着させた４０nmコロイド状金粒子（アボット・ラボ
ラトリーズ）で標識した抗HBsAg抗体の５０μアリコ
ートを各試料ウエルに加えた。全アッセイ時間は１５分
であった。HBsAgを含有しない試料溶液はバックグラウ
ンドに対してシグナルを生じなかった。１．０ng／ｍ
もの少量のHBsAgを含有する試料溶液で、反応部位に肉
眼で見える紫色のスポットを生じた。抗体金粒子は充分
に希薄であったので洗浄工程は必要でなかった。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明によるアッセイ装置の見取り図、第２図
は第１図に示した本発明のアッセイ装置の上面図、第３
図は第２図に示した本発明のアッセイ装置の３−３線に
沿った断面図である。 （図面の主要符号） １０……本発明のアッセイ装置 １３……クロマトグラフ媒体 １４……第一の末端 １５……第二の末端 １６……反応部位 １８……試料ウエル １９……吸収物質

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 チャールズ・スチュワート・グリデル・ピ ュー アメリカ合衆国ウイスコンシン 53140、 ケノウシャ、シックスティナインス・スト リート 519番 (56)参考文献 特開 昭57−63454（ＪＰ，Ａ) 特開 昭61−145455（ＪＰ，Ａ) 特開 昭61−142463（ＪＰ，Ａ) 特開 昭58−179357（ＪＰ，Ａ) 特開 昭60−234600（ＪＰ，Ａ) 特開 昭61−265100（ＪＰ，Ａ) 特開 昭53−47894（ＪＰ，Ａ)

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】(a)毛管現象を有し、反応性試薬成分およ
   び非固定化試薬の１種または２種以上をクロマトグラフ
   溶媒移動させることができる単一のクロマトグラフ媒
   体、該媒体は分析対象物質および標識特異的結合物質よ
   りなる群から選ばれた１種と結合することのできる固定
   化試薬が固定化された反応部位を含み、該反応部位は、
   該媒体の全領域を占めず上流部分および下流部分を残す
   ような領域を占め、 (b)該クロマトグラフ媒体の上流部分と流体接触し、一
   定量の試料が該クロマトグラフ媒体に沿って該反応部位
   に移動されるまで保持され得るように適合された試料適
   用手段、および (c)該反応部位の下流に位置し、該下流部分と流体接触
   している該一定量の試料を吸収し得る液体吸収手段から
   なることを特徴とする、１または２以上の特異的結合反
   応により試料中の分析対象物質の存在または量を決定す
   るための試験装置。
2. 【請求項２】前記試料適用手段がウエルである特許請求
   の範囲第(1)項記載の試験装置。
3. 【請求項３】前記試料適用手段が吸収パッドである特許
   請求の範囲第(1)項記載の試験装置。
4. 【請求項４】前記液体吸収手段がクロマトグラフ媒体と
   流体接触する一定量の吸収物質である特許請求の範囲第
   (1)項記載の試験装置。
5. 【請求項５】特許請求の範囲第(1)項記載の試験装置を
   用い、 (a)分析しようとする試料の一定量を試料適用手段に適
   用し、該試料適用手段中に保持された試料を毛管現象に
   よりクロマトグラフ媒体に沿い反応部位を通って液体吸
   収手段まで移動させ、 (b)標識特異的結合物質を反応部位に接触させ、ついで (c)反応部位に固定化された標識特異的結合物質の存在
   または量を測定することにより試料中の分析対象物質の
   存在または量を決定する ことを特徴とする試料中の分析対象物質の存在または量
   を決定する方法。
6. 【請求項６】洗浄工程により未結合試料物質および未結
   合特異的結合物質を取り除く特許請求の範囲第(5)項記
   載の方法。