JPH0630567B2

JPH0630567B2 - 抗生物質生産用培地

Info

Publication number: JPH0630567B2
Application number: JP60057485A
Authority: JP
Inventors: 智大村; 芳武田中; 碌郎増間
Original assignee: Kitasato Institute
Current assignee: Kitasato Institute
Priority date: 1985-03-20
Filing date: 1985-03-20
Publication date: 1994-04-27
Anticipated expiration: 2009-04-27
Also published as: JPS61216682A

Description

【発明の詳細な説明】産業上の利用分野本発明は抗生物質生産能を有する微生物を培養して抗生
物質を培養物中に生成蓄積させるための培地（以下、抗
生物質生産用培地という）に関する。

従来の技術抗生物質は微生物によつて生産され、微生物その他の細
胞の発育を阻害し、あるいは特異的な薬理作用や酵素阻
害作用を有する物質（田中信男、中村昭四郎著、抗生物
質大要第２版、第１頁、1977年、東京大学出版）であつ
て、現在、医薬、農薬、動物飼料添加物、駆虫剤などに
多数使用されている。

抗生物質生成量を増加させるために改良された公知の培
地の例は次の通りである。

(1)抗生物質生合成の有効な前駆体を含有する培地〔ジ
ヤーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサエテイ
（J.Am.Chem.Soc.）第68巻、第1669頁（1946年）〕 (2)培養液のpHを最適範囲に保つのに有効な緩衝液を含
有する培地〔ドメイン（Demain）アーカイブ・オブ・マ
イクロバイオロジー（Arch.Microbil.）第115巻、第169
頁（1977年）〕 (3)有効な界面活性剤を含有して発泡を抑え、あるいは
抗生物質生産微生物の細胞内より細胞外への抗生物質の
溢出を有利にする培地（上野芳夫、大村智編著、微生物
薬品化学、第176頁、1979年、南江堂） (4)培地の栄養素（炭素源、窒素源、リン酸根など）と
して各種物質の中から有効なものを選択して各々を最適
濃度に含有する培地（同上）このような各種の組成を組合わせることによつて一つ一
つの抗生物質の生産に適した培地が決定される。しか
し、このためには通常、膨大な労力と長時間を要し、し
かもある抗生物質の生産に有利な培地が別の抗生物質の
生産にとつては逆に不利である場合が決して少なくなか
つた。従つて広範囲の抗生物質生産への応用性と高い生
産性とを有する抗生物質生産用培地の提供が望まれてい
た。

さきに本発明者は、ゼオライトを含有する培地を用いて
抗生物質を常法により生産すると、多数の抗生物質の生
産量を著しく増加し得ることを見出した（特開昭57-206
380号）。

発明が解決しようとする問題点本発明の目的は、抗生物質生産能力を有する微生物を常
法により培養して抗生物質を生成蓄積させるための培地
として、簡便、容易に抗生物質の生成蓄積量を増加させ
ることができる培地を提供することにある。

問題点を解決するための手段本発明の培地は、従来常法される培地に含有する組成物
のほかにシリカアルミナ質ゲルを含有することを特徴と
している。本発明による培地を用いて、抗生物質生産能
を有する微生物を常法により培養すると、その生産量を
一般に数倍たとえば２倍以上増加させることができる。

以下に本発明を詳細に説明する。

本発明培地を利用して抗生物質を生産する際に使用する
微生物としては、抗生物質を生成する能力を有する微生
物であれば何でもよい。たとえば野生株でもよいし、ま
た特定の栄養要求性、特定物質に対する抵抗性あるいは
感受性を有する株でもよい。あるいは特定物質を分解ま
たは不活性化する性質を有していてもいなくてもよい。
従つて、公知の広範囲のカビ、酵母、細菌、放線菌を含
む各種の抗生物質生産能力を有する微生物を用いること
ができる。また、その微生物は天然界、たとえば土壌、
河川水、海水または空気中等に存在したものであつても
よいし、予め本発明培地以外の培地で生育させたもので
もよい。

本発明に用いるシリカアルミナ質ゲルは天然に粘土状で
存在する鉱石の一種であり、学名はアロフエン（Alloph
ane）と称される。

鉱物学によれば、このような粘土は結晶性シリカアルミ
ナ金属塩の鉱石から自然界での風化により生ずる。従つ
て、カオリナイト（Kaolinite）やゼオライト（Zeolit
e）等とは非晶質であることにおいて明確に区別され
る。

アロフエンは我が国では鹿沼土、粟土、味噌土等と呼ば
れるコロイド状粘土の主要成分であるが欧米でも見出さ
れる。アロフエンは、火山性ガラス質岩石が長期間の自
然界の風化により金属塩が溶脱して生成した含水シリカ
アルミナゲルであり、これら溶脱した分子の抜け落ちに
より非常に小さな気孔を多く残している。この微細気孔
が優れた吸着特性を示し吸着材として使用される例が多
い。また、成分的には含水シリカアルミナ質であるが、
その分子構造は非晶質であり、例えばムライト（3Al₂O₃
2SiO₂）カオリナイト〔Al₄(OH)₈Si₄O₁₀）のような結晶
質鉱物とは異なり、塩酸に容易に反応してゼラチン状に
なるなど化学的に非常に活性である。本発明に用いるシ
リカアルミナ質ゲルは天然産のアロフエンをそのまま、
もしくは精製して用いることができる。

天然シリカアルミナ質ゲルは、産地、存在状態により混
入物の種類や量が異なるためか、色調や化学組成が、ひ
いては物理化学的性状が少しずつ異なる。１例として、
実施例に用いたシリカアルミナ質ゲルの１つであるアロ
フエンの性状を第１表に示す。

アロフエンが無機の酸や空気中の水分を吸着する能力を
有することは公知であり、従来除湿剤として利用されて
いるが、抗生物質生産培地に添加することによつて、抗
生物質の生産量を増加させ得ることは知られていなかつ
た。本発明培地に用いるシリカアルミナ質ゲルは単独で
用いてもよいし、さきに本発明者らが教示したゼオライ
ト等と組合わせて用いることもできる。

本発明に用いるシリカアルミナ質ゲルは市販されている
粉末製品をそのまま用いてもよいが、110゜−500℃で数
時間熱処理してから用いると抗生物質生産に好結果を与
えやすい。

培地中に含有させるシリカアルミナ質ゲルの濃度はその
粒度や使用微生物や培養条件を考慮して決定すべきであ
るが、通常0.1−５％の濃度が好適である。

ある抗生物質の生産に対する至適温度、時間、pH等の諸
条件は、公知の当該抗生物質生産培地の培養に準じれば
よい。

本発明培地は、シリカアルミナ質ゲルのほかに、従来常
用される抗生物質生産培地の例にならい、使用微生物の
利用し得る炭素源、窒素源、無機物、その他必要な栄養
素を程良く含有する。本発明培地の種類としては、天然
培地、合成培地のいずれでもよく、またその形態として
は液体培地、固形培地のいずれでもよい。本発明培地が
シリカアルミナ質ゲルのほかに含有する栄養素を詳細に
示せば、炭素源としては、たとえば、グルコース、グリ
セロール、フラクトース、マルトース、マンニツト、キ
シロース、ガラクトース、ラクトース、リボース、澱粉
またはその加水分解物等の種々の炭水化物が使用でき
る。その濃度は通常、培地に対して0.1−５％（グルコ
ース換算）が好ましい。またグルコン酸、ピルビン酸、
乳酸、酢酸等の各種有機酸、グリシン、グルタミン酸、
アラニン等の各種アミノ酸、さらにはメタノール、エタ
ノール等のアルコール類やノルマルパラフイン等各種の
非芳香族系炭化水素、あるいは植物性もしくは動物性の
各種油脂等も使用可能である。

窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸
アンモニウム、硝酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、
乳酸アンモニウム等各種の無機酸あるいは有機酸のアン
モニウム塩類、尿素、ペプトン、NZ-アミン、肉エキ
ス、酵母エキス、乾燥酵母、コーンスリープリカー、カ
ゼイン加水分解物、フイツシユミールあるいはその消化
物、大豆粉あるいはその消化物、脱脂大豆あるいはその
消化物、蛹加水分解物等の含窒素有機物質、さらにはグ
リシン、グルタミン酸、アラニン等の各種アミノ酸が使
用可能である。

無機物としては、各種リン酸塩、硫酸マグネシウム、食
塩等、さらに微量の重金属塩が使用される。

また栄養要求性を示す変異株を用いる場合には、当然そ
の栄養要求性を満足させる物質を培地に加えなければな
らないが、この種の栄養素は天然物を含む培地を使用す
る場合にはとくに添加を必要としない場合がある。

本発明に応用し得る公知の培地組成の例をあげると次の
通りである。

(1)グルコース２％，ペプトン0.5％，酵母エキス0.3
％，肉エキス0.5％，NaCl 0.3％，CaCO₃0.3％（pH7.0） (2)グルコース１％，ペプトン0.3％，肉エキス0.5％，N
aCl 0.3％，寒天1.2％（pH7.2） (3)グリセリン１％、グリコース0.2％，大豆粉１％，Na
Cl 0.3％（pH7.5） (4)澱粉２％，コーンスチープリカー２％，MgSO₄・7H₂O
0.1％（pH7.5） (5)デキストリン２％，ペプトン0.5％，大豆粉１％，KH
₂PO₄ 0.05％，MgSO₄・7H₂O 0.05％（pH7.0） (6)グルコース４％，(NH₄)₂SO₄0.5％，KH₂PO₄ 0.02％，
MgSO₄ 0.1％，FeSO₄・7H₂O 0.01％，CuSO₄・5H₂O 0.001
％，ZnSO₄・7H₂O 0.001％，MnSO₄・4H₂O 0.001％，CaCl₂・
2H₂O 0.001％，CaCO₃ 0.3％（pH6.5） (7)グルコース２％，カザミノ酸１％，K₂HPO₄0.1％，Mg
SO₄・7H₂O 0.1％，KCl 0.05％，ZnSO₄・7H₂O 0.01％，MnS
O₄・5H₂O 0.005％，FeSO₄・7H₂O 0.005％，CaCO₃0.3％（p
H7.5）本発明培地を用いて微生物を培養するに際してその培養
条件は常法に準じて行なう。すなわち、培養液のpHは通
常３−９の範囲、培養温度は通常20℃−40℃の範囲が好
結果をもたらし得る。培養期間は通常１−10日間であ
る。もちろん、これ以外の条件、たとえば酸性条件やア
ルカリ性条件でより旺盛に生育する微生物や、あるいは
20℃以下の低温や40℃以上の高温条件をとくに好む微生
物を用いる場合には、それぞれ望ましい環境下で培養す
る。

また、培養開始から培養完了時までの適当な時期に、抗
生物質の生産量をさらに増加させる目的で各種の添加
物、たとえば有効な前駆体、各種界面活性剤、各種溶
剤、飽和または不飽和の脂肪酸などを培地に添加しても
よい。

本発明培地を用いて微生物を培養するに際して、どのよ
うな組成の本発明培地がどのような微生物に最適である
かについて、現段階では規則性を確認できない。すなわ
ち、特定の組成を有する本発明の培地を用いて抗生物質
生産能力を有する微生物を培養すると、常法による培養
法で、一般的には抗生物質の生産量を従来の培地を用い
た場合よりも著しく増加させ得るが、使用する微生物に
よつては生産量の増加が認められない場合があることは
事実である。しかし、このことが本発明の実用的価値を
害するとはいえない。なぜなら、下記のような簡単な実
験的培養によつて、特定の微生物に対する特定の本発明
による培地の適合性、シリカアルミナ質ゲルの種類およ
び使用量などの条件をきわめて容易に判断することがで
きるからである。この種の実験的培養が、従来の最適培
地組成決定に要求された複雑な試行錯誤手法よりもはる
かに簡便であることは、当業者の容易に理解できるとこ
ろである。

実験例菌株として、ナナオマイシン生産菌ストレプトマイセス
・ローザ・サブエスピー・ノトエンシス（Streptomyces
rosa subsp.notoensis）ATCC31135、タイロシン生産菌
ストレプトマイセス・フラジイエ（Streptomyces fradi
ae）ATCC19609を使用した。

これらの菌株を培養して抗生物質を生産させるための培
地として、放線菌の培養に常用される下記のＩ〜Ｖの培
地を実験培地として選択した。各々の培地にシリカアル
ミナ質ゲル、商品名セカード（Sekado，品川白煉瓦社
製，48メツシユ）0.5％を含ませた培地、およびＩの培
地にカオリン（関東化学製）を0.5％含ませた合計６種
類の培地を調製し、坂口フラスコにそれぞれの培地を10
0m分注し、27℃で、ナナオマイシンの生産には３日
間、タイロシンの生産には５日間、常法通り往復振とう
培養した。

培地組成Ｉ．グリセロール２％，バクトソイトン１％，NaCl 0.3
％（pH7.0） II．グリセロール２％，大豆粉２％，NaCl 0.3％（pH7.
0） III．グルコース２％，ペプトン0.5％，乾燥酵母0.3
％，肉エキス0.5％，NaCl 0.3％，CaCO_0.3％（pH6.0） IV．グルコース１％，スターチ２％，ペプトン0.5％，
酵母エキス0.5％，CaCO₃0.4％，Ｌ−アスパラギン酸0.3
％（pH7.2）Ｖ．スターチ２％，グルコース0.5％，硫酸アンモニウ
ム0.2％，乳酸ナトリウム0.3％，K₂HPO₄ 0.05％，MgSO₄
・7H₂O 0.05％，CaCO₃0.3％，微量金属塩（鉄，マンガ
ン，亜鉛，銅，コバルト）各３mg／（pH7.0）培養終
了後、培養液中に生成蓄積した抗生物質量を測定したと
ころ、第２表に示す結果が得られた。比較のためにセカ
ードまたはカオリンを含まない培地で同様に培養した結
果も示す。

第２表からナナオマイシンの生産にはＩの培地、タイロ
シンの生産にはIVの培地にそれぞれ0.5％セカードを含
有させたものが適していることが容易にわかる。また第
２表から、本発明による培地において、公知の培地より
も著しく多量の抗生物質が生産されることが明らかであ
る。Ｉの培地に添加するものとしては、本発明に用いる
セカードが適していることがわかる。

本発明による培地での生産に好適な抗生物質の例として
ナナオマイシン、タイロシン、プロタイロノライド、ス
トレプトマイシン、ジエンタミシン、カナマイシン、ネ
オマイシン、ブチロシン、ペニシリン、セフアロスポリ
ン、セフアマイシン、チエナマイシン、クロールテトラ
サイクリン、バンコマイシン、リストマイシン、キヤン
デイシジン、ナイスタチン、ポリミキシンなど工業的に
重要なマクロライド系、ポリエンマクロライド系、アミ
ノグリコシド系、β−ラクタム系、テトラサイクリン
系、キノン系、ペプチド系抗生物質があげられる。

本発明に用いるシリカアルミナ質ゲルがどのようなメカ
ニズムで抗生物質の生産を増加させるかについては、現
在その詳細は明らかではない。しかし、本発明者らは、
本発明を完成させる研究の過程で、シリカアルミナ質ゲ
ルがもつ培養液中の遊離のリン酸根の濃度を低下させる
作用と抗生物質生産の増加とが密接に関係していること
を示唆する事実をつきとめた。その試験例を次に示す。

試験例試験菌としてナナオマイシン生産菌ストレプトマイセス
・ローザ・サブエスピー・ノトエンシス（Streptomyces
rosa subsp.notoensis）ATCC31135を使用した。また、
ナナオマイシン生産用の基礎培地として次の組成のもの
を使用した。

グリセロール２％，バクトソイトン１％，NaCl 0.3％
（pH7.0）この組成の基礎培地に、シリカアルミナ質ゲルの１つで
あるセカード（品川白煉瓦社製，48メツシユ以下）を０
または0.5、およびKH₂PO₄を０または100μg/mの４つ
の組合わせで添加した４種の生産培地を調製した。この
４種の生産培地を300mずつ含む２容坂口フラスコに
試験菌を植菌し、常法により27℃で３日間振とう培養し
た。この時、培養液中には第３表に示す通りナナオマイ
シンが生成蓄積した。

第３表から次のことを明らかである。

第１に、ナナオマイシンの生産はリン酸根により阻害さ
れる（実験番号１と３との比較）。

第２に、セカードを添加した場合、リン酸根濃度が低下
し、ナナオマイシン生産量が増加する（実験番号１と２
との比較）。

第３に、リン酸根を添加してナナオマイシン生産を阻害
した条件においても、セカードをさらに添加するとリン
酸根濃度が低下して、ナナオマイシン生産は回復する
（実験番号３と４との比較）。

第４に、セカードの存在下では、100μg/mのリン酸の
添加は実質的なリン酸の増加をもたらさないし、ナナオ
マイシン生産の実質的な低下をひきおこさない（実験番
号２と４との比較）。

これはナナオマイシン生産を例に示したものであるが、
他の抗生物質の生産を例に試験をしても同様の結果が得
られる。

培地にリン酸を添加したにもかわらず遊離リン酸根濃度
が著しく増加しない原因がセカードのリン酸吸着（もし
くは結合）作用にあることは、別にリン酸水中にセカー
ドを添加して振とうした後の遊離リン酸根濃度が明らか
に低下していることにより確認した。

一方、ナナオマイシンのみならずタイロシンをはじめ多
くの抗生物質の生産は、培養液中に、ある濃度以上の遊
離のリン酸根が存在する条件下では著しく低下すること
が知られている。これについては、たとえば、マーチン
（J.F.Martin），ドメイン（A.L.Demain），バクテリオ
ロジカル・レビユー（Bacteriological Review）第44
巻，第230頁（1980年）等に詳述されている。抗生物質
生産の阻害を示しはじめる遊離リン酸根の濃度は、生産
菌や培地により異なる。また阻害の詳細な機構は明らか
でない場合が多い。抗生物質の生産がリン酸根の存在に
より阻害されることが知られている例としては、ナナオ
マイシン、タイロシン、ストレプトマイシン、ペニシリ
ン、キヤンデイシジン、ポリミキシン等があげられる
が、前記例示の本発明培地での生産に好適な抗生物質と
重複するものが多い。これらの事実と、試験例の結果等
から、本発明培地においては遊離リン酸根が低下するこ
とにより、通常の培地において遊離リン酸根がひきおこ
す抗生物質生産阻害が実質的に緩和されるためであるこ
とがわかる。

実施例１種菌としてナナオマイシン生産菌株ストレプトマイセス
・ローザ・サブエスピー・ノトエンシス（Streptomyces
rosa subsp.notoensis）ATCC31135を使用した。

グルコース２％，ペプトン0.5％，肉エキス0.5％，乾燥
酵母0.3，NaCl 0.5％，CaCO₃0.3％からなる種培地（pH
7.0）100mを含む500m容坂口フラスコに種菌を植菌
し、27℃で２日間振とう培養した。

グリセロール２％，バクトソイトン１％，NaCl 0.3％，
セカード（品川白煉瓦社製，48メツシユ）0.5％からな
る生産培地（pH7.0）300mを含む２容坂口フラスコ
に上記の通りに得た種培養液６mを植菌し、27℃で５
日間往復振とう培養したところ、培養液中に第４表に示
す通りナナオマイシンが生成蓄積した。

実施例２種菌としてタイロシン生産菌株ストレプトマイセス・フ
ラジイエ（Streptomyces fradiae）ATCC19609を使用し
た。

グルコース２％，ペプトン0.5％，肉エキス0.5％，乾燥
酵母0.3％，NaCl 0.5％，CaCO₃0.3％からなる種培地（p
H7.0）10mを含む50m容大型試験管（２×20cm）に種
菌を植菌し、27℃で２日間振とう培養した。

グルコース１％，スターチ２％，ペプトン0.5％，酵母
エキス0.5％，CaCO₃0.4％，L-アスパラギン酸0.3％，セ
カード（品川白煉瓦社製，48メツシユ）0.5％からなる
生産培地（pH7.2）100mを含む500m容坂口フラスコ
に上記の通りに得た種培養液２mを植菌し、27℃で３
日間往復振とう培養したところ、培養液に第４表の通り
タイロシンが生成蓄積した。

発明の効果本発明による培地を用いて、抗生物質生産能を有する微
生物を培養すると、その生産量を著しく増加させること
ができる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所 (Ｃ１２Ｐ 17/06 Ｃ１２Ｒ 1:465） (Ｃ１２Ｐ 19/62 Ｃ１２Ｒ 1:54）

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】抗生物質生産能力を有する微生物を培養し
て、抗生物質を培養物中に生成蓄積させるための培地に
おいて、有効量のアロフェンを含有する培地。
【請求項２】培地に対して0.1−５％（重量）の上記ア
ロフェンを含有する特許請求の範囲第１項記載の培地。