JPH0630587B2 - クロ−ン化されたトウモロコシのｐｐｃ遺伝子 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、トウモロコシの光合成的炭酸固定において中
心的役割を果たしている酵素、ホスホエノールピルビン
酸カルボキシラーゼ〔ＥＣ４．１．１．３１〕（以下Ｐ
ＥＰＣaseと略す）の実質的機能部分をコードしている
ＤＮＡ配列を有する遺伝子、および該ＤＮＡ配列を担持
しているプラスミドに関する。

発明の背景および目的 ＰＥＰＣaseは全ての高等植物、藻類、大部分の原生動
物および多くの細菌に存在しており、基本的には、下記
の反応式で示す様に、ホスホエノールピルビン酸(PEP)
に炭酸を固定し、オキザロ酢酸(OAA)とリン酸を生成す
る反応を不可逆的に触媒する酵素である： ＰＥＰＣaseの沈降定数、分子量およびサブユニット数
などの生化学的性状は、生物種間に若干の違いが見られ
る。トウモロコシのＰＥＰＣaseについては、電気泳動
的に均一な標品が得られており、その分子量は約４０万
と報告されている¹⁾（本明細書に於いて引用した文献
は、肩文字で示した引用番号と共に末尾に一括して示し
た。）その他、トウモロコシのＰＥＰＣaseについて
は、それがアロステリックな特質を有すること²⁾、トウ
モロコシの退色した葉やグリーニング中の植物体に強い
光の刺激を与えるとその活性が約５倍上昇すること³⁾、
およびこの活性上昇はｍＲＮＡレベルの増加によること
⁴⁾などが既に知られている。

しかしながら、トウモロコシのＰＥＰＣaseをコードし
ている遺伝子については、それが核のみならず葉緑体の
ＤＮＡにも存在するらしいという報告⁵⁾およびその遺伝
子の_cＤＮＡの一部(500bp)をクローニングしたという報
告⁶⁾があるに過ぎない。

記述した様に、トウモロコシのＰＥＰＣaseは光合成的
炭酸固定において重要な役割を果たしており、従ってこ
の酵素をコードしている遺伝子のクローニングおよびそ
のヌクレオチド配列の決定は、産業上重要な意義を有す
る。即ち、このＰＥＰＣase遺伝子のクローニングに成
功すれば、遺伝子操作によって該遺伝子を改良し、これ
を培養植物に組み込んでその炭素同化能力を増強し、効
率よくトウモロコシデンプンを収穫することが可能にな
ると予想される。本発明者は、かかる観点からトウモロ
コシのＰＥＰＣase遺伝子のクローニングについて検討
を重ねた結果、ｍＲＮＡの逆転写によって得られる_cＤ
ＮＡライブラリーから、ＰＥＰＣaseの実質的機能部分
をコードしている_cＤＮＡ断片を選択してこれをクロー
ニングし、そのヌクレオチド配列を決定することに成功
した。

即ち、本発明は、トウモロコシのＰＥＰＣaseの実質的
機能部分をコードしているＤＮＡ配列（遺伝子配列)(以
下、トウモロコシのppcと呼ぶ）を有する遺伝子および
該ppcを担持しているプラスミドを提供するものであ
る。

本明細書に於いて、トウモロコシＰＥＰＣaseの「実質
的機能部分をコードしているＤＮＡ配列」という用語
は、ＰＥＰＣaseの全アミノ酸配列をコードしているＤ
ＮＡ配列、該ＤＮＡ配列を含み、その転写および翻訳に
悪影響を及ぼすことのない余分のＤＮＡ配列が付加して
いるＤＮＡ配列、およびＰＥＰＣaseのアミノ酸配列の
全てをコードしていないがＰＥＰＣase活性を示すのに
必要な最小限のアミノ酸配列をコードしているＤＮＡ配
列、並びにこれらの構造遺伝子に、その発現に必要な調
節遺伝子（レギュレーター）およびその関連遺伝子が付
加しているＤＮＡ配列のいずれかを意味するものとす
る。即ち、この用語は、適当な宿主細胞中で、トウモロ
コシのＰＥＰＣase活性を実質的に発現することができ
るという意味で機能的に定義された用語であり、物理化
学的に単一の物質を指すものと解釈してはならない。こ
の様なトウモロコシＰＥＰＣaseの実質的機能部分をコ
ードしているＤＮＡ配列の一例を添付の第１図に示し
た。

以下に本発明を詳細に説明する。

トウモロコシのppcのクローニングおよび塩基配列の決
定 Ａ．実験に供した試薬 制限酵素ＥcoＲＩはニッポンジーン社より、その他の制
限酵素および遺伝子の分子量マーカーとして使用するλ
−ＤＮＡは宝酒造社より購入した。ＲＮaseＡ（ＲＮＡ
分解酵素Ａ）、ＲＮaseＴ₁、リゾチーム、ジチオトレイ
トールおよびＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）はＳigma社
より、エチジウムブロマイド(EtdBr)はＡldrich Ｃhem
ical社よりそれぞれ購入した。〔α−³²Ｐ〕ｄＣＴＰは
Ａmersham社より購入した。電気泳動用のアガロースと
しては、ドータイト・アガロースIIを用いた。

Ｂ．実験材料 本発明に用いた大腸菌Ｋ−１２株は、佐邊らによって分
離された変異株であるＰＣＲ１⁷⁾および京大・ウイルス
研より提供されたＤＨ１である。大腸菌Ｋ−１２ＰＣＲ
１株は工業技術院微生物工業技術研究所に寄託されてお
り（ＦＥＲＭＰ−７７８３）、ＤＨ１株は京大ウイルス
研よる分譲可能である。これらの遺伝子型もしくは表現
型は、それぞれＦ⁻，recA,rpsL(Str^r),thi,arg,the,le
u,ppc ^-(Glu^-)およびＦ⁻，recA1,endA1,gyrA96,thi-1,h
sdR17(r▲^- _k▲,m▲⁺ _k▲),supE４４である。またベクタ
ープラスミドとしては重定らの開発したpSＩ４００１を
用いた（京大ウイルス研より入手可能）。トウモロコシ
の種は京大・農学部・作物学講座より提供された交配種
を用いた。

Ｃ．菌の培養およびトウモロコシの栽培 １．大腸菌の培養 大腸菌の培養に用いた液体培地は表１に示すとおりであ
る。通常の培養には、富栄養培地としてＬＢ−培地を用
いた。栄養要求性について選択培地は、最小培地である
Ｅ−培地を基本として調製し、大腸菌ＰＣＲ１の要求ア
ミノ酸に加えて炭素源としてグルコースのみを含むもの
をＧlu^-培地、Ｇlu^-培地にグルタミン酸を添加したもの
をＧlu⁺培地とした。また固体培地は液体培地に1.5％(w
/v)の寒天を加えて調製した。選択圧として抗生物質を
加える場合の濃度は、通常、ストレプトマイシン(Str)
が２５μｇ／ｍ、アンピシリン(Amp)が５０μｇ／ｍ
（富栄養培地の時）および２５μｇ／ｍ（その他の
時）になるように加えた。高圧蒸気滅菌を行うときは、
表１に示したように、培地成分を分けて、別々に滅菌し
た。また抗生物質は培地滅菌後、５５℃以下になってか
ら添加した。なお、液体培養はＴＡＩＹＯインキュベー
ターＭ−１００^Ｎを用いて３７℃で振とうして行い、固
体培地での培養は３２℃のふ卵器で行った。

大腸菌は、ＬＢ−培地で生育させ、静止期に入った培養
に、５０％になるようにグリセロールを加えて保存し
た。

２．トウモロコシの栽培 一昼夜流水中に浸しておいたトウモロコシの種を適当な
大きさの容器にしきつめた吸水脱脂綿上にまき、２８℃
の恒温室で遮光して発芽させ、発芽後１０日間を経過し
た葉に３日間光をあてて緑化させたものを採取し、ｍＲ
ＮＡの調製を使用した。葉を保存する必要がある時は、
−８０℃で保存した。

Ｄ．実験上の基本操作 １．試薬の略号 本明細書中で使用した試薬の略号を表２に示す。

２．ＤＮＡおよびＲＮＡの定量 それぞれの場合に応じて、以下の３通りの方法を使いわ
けた。

i)吸光度による定量 ２６０nmにおけるＤＮＡおよびＲＮＡの吸光度(A₂₆₀)に
より定量する方法であり、精製されたＤＮＡおよびＲＮ
Ａについてかなり正確に定量する場合に用いた。分光光
度計を用い、３２０nmから２２０nmまでスキャンさせ、
その時のA₂₆₀を測定した。ただし、１mg／ｍの溶液の
吸光度をＤＮＡではA₂₆₀＝２０、ＲＮＡではA₂₆₀＝２３
とした。

ii)蛍光法 本方法は、微量ＤＮＡを正確に定量する場合に用いた。
すなわち、過塩素酸処理によって遊離したＤＮＡのデオ
キシリボースとm-ジアミノ安息香酸・２ＨＣｌとの反応
を利用した蛍光による定量法である。これはデブナーミ
ラー(Doebner-Miller)のキナルシン合成で用いられた反
応⁸⁾であり、以下の反応式で示すようにデオキシリボー
スに特異的に生ずる強力な蛍光物質であるキナルジン類
似体を定量するものである。

蛍光測定は、日立２０４型分光蛍光光度計を用いて励起
光４０６nm、分析光５２０nmで測定した。標準ＤＮＡ標
品（λ−ＤＮＡおよびサケの精子ＤＮＡ）の濃度をA₂₆₀
測定によって決定し、この希釈シリーズを作製し、これ
をもとに検量線を作製して試料の定量を行った。蛍光測
定法としては、まず標品に最終濃度が0.5Ｍとなるよう
に過塩素酸を加え、７０℃で２０分間インキュベートし
た。次に等容の試薬（１ＭＮ_aＯＨに溶解させた１０mM
Na₂CO₃と２０％(w/v)ジアミノ安息香酸・２ＨＣｌの
３：１(v/v)混液を３７℃で１時間インキュベートした
もの）を加えることによって反応を開始させた。７０℃
で１時間インキュベートした後、6.25倍容の１ＭＨＣｌ
を加え、氷冷することによって反応を停止させ蛍光を測
定した。

iii)スポット・テスト法 本方法は、カラムなどを通して精製したＤＮＡおよびＲ
ＮＡがどの分画に含まれているかを決定する場合に用い
た。通常、標品7.5μにEtdBr(2μｇ／ｍ）2.5μ
を混合し、ペトリ皿上に拡げたサランラップ上にスポッ
トして、短波長ＵＶイルミネーターで観察し、写真を撮
り、蛍光強度を標準標品スポットと比較することによっ
て、標品の濃度を推定した。

Ｅ．トウモロコシポリＡ₊ＲＮＡの調製^4),9),10) １．総ＲＮＡの調製 トウモロコシppcを含むcDＮＡをクローニングするため
にポリＡ^＋ＲＮＡを調製した。ＲＮＡ試料の調製からク
ローニングの全過程を通じて最も注意を払わなければな
らないのは、ＲＮaseの混入防止である。したがって、
以下の操作において、容器、ピペット類、蒸留水、緩衝
液類はすべて滅菌したものを用い、操作は手袋をはめて
行い、試料に接触する容器や器具には決して素手で触れ
ないようにした。

遮光した条件で発芽させ、１０日を経過したトウモロコ
シに３日間の光誘導を行った葉約3.8ｇを液体窒素で凍
結させ、予め−２０℃に冷やしておいた乳鉢と乳棒で粉
末状になるまで砕いた。これに抽出緩衝液を加えてホモ
ゲナイズした。抽出緩衝液には、５０ｇのフルカ(Fluk
a)社製特級チオシアン酸グアニジン、0.5ｇのＮ−ラウ
ロイルサルコシン酸ナトリウム、２５ｍの１Ｍクエン
酸ナトリウム(pH7.0)および0.7ｍの２−メルカプトエ
タノールに室温で１００ｍになるまで脱イオン水を加
え、１ＮNaＯＨでpHを7.0にあわせて、ミリポアフィル
ターを通したものを用いた。チオシアン酸グアニジンお
よびＮ−ラウロイルサルコシン酸ナトリウムは、強力な
タンパク質変性剤であり、これらの存在下ではＲＮase
は失活する。次にホモゲネートを３０ｍのＣＯＲＥＸ
チューブに移し、BeckmanJ−２１Ｂ遠心機ＪＡ−２０ロ
ーターを用いて１０℃において13,000rpmで１０分間遠
心して上清を回収した。この上清に対して同様に遠心
し、上清をＳＷ50.1ポリアロマーチューブ中の1.2ｍ
の5.7ＭCsCl、0.1ＭＮa₂・ＥＤＴＡ(pH7.0)上に重層し
た。これを日立６５Ｐ超遠心機を用いて、２５℃、35,0
00rpmで１２時間遠心した。遠心後、上清に分離したタ
ンパク質(RNaseを大量に含む）が、底に沈殿したＲＮＡ
（透明ゲル状）に接触しないようにアスピレーターを用
いて、注意深く除いた。本方法はＲＮＡ分子が全生体高
分子の中で最も密度が高いことを利用したものである。
このＲＮＡを99.5％エタノールで数回洗ってCsClを除い
た後、凍結乾燥して、0.2MNaClに溶かした。これに2.5
倍容の９５％エタノール(-２０℃）を加え、一夜放置
し、エタノール沈殿させた。これを0.5ｍの滅菌水に
溶解して総ＲＮＡ（総量１８００μｇ）とした。

２．オリゴ(dT)セルロースカラムによるポリＡ^＋ＲＮＡ
の選別 本方法は、高塩濃度で総ＲＮＡをカラムに通した時、ポ
リＡ^＋ＲＮＡがオリゴ(dT)セルロースと水素結合を形成
して吸着されるので、これを，低塩濃度緩衝液を用いて
水素結合を分離させて溶出することにより、ポリＡ^＋Ｒ
ＮＡを選別するという原理に基づいている。セルロース
はPharmaciaＰ−Ｌ Biochemical社のオリゴ(dT)セルロ
ースタイプ７を用いた。まず、カラム（ベッド容量0.5
ｍ、内径0.5〜0.8cm）を、３倍容の滅菌水、次に0.1
ＭＮａＯＨ−５ｍＭＥＤＴＡ、そして滅菌水で順次洗
い、溶出液のpHが８以下になったことをチエックした。
次にカラムを吸着緩衝液（ＴＥ緩衝液(pH7.5)、0.5MNaC
l)で平衡化し、５倍容の吸着緩衝液で洗った。次に、予
め６５℃で５分間加熱し、２倍容の吸着緩衝液を加えて
氷上で急冷させた総ＲＮＡをカラムに乗せた。これは、
分子内で水素結合を形成しているランダムコイル状のＲ
ＮＡを変性させ、ポリＡ端が有効にオリゴ(dT)セルロー
スと水素結合するのを助けるためのものである。ここで
の溶出液を再度同様の処理に付し、再びカラム乗せて溶
出させ、３０滴（約1.2ｍ）ずつエッペンドルフチュ
ーブに回収した。この時の流速は、0.31ｍ／分とし
た。吸着緩衝液約１０ｍを流し終えた時点で、２ｍ
の溶出緩衝液（ＴＥ緩衝液(pH7.5))を流し、１０滴（約
0.4ｍ）ずつをそれぞれエッペンドルフチューブに回
収した。ここでの溶出液中にポリＡ^＋ＲＮＡが含まれて
いる。この時の流速は、0.16ｍ／分とした。次にスポ
ットテスト法により、ポリＡ^＋ＲＮＡが含まれていると
思われる分画（約1.2ｍ）を決定した。これに４ＭNa
Ｃｌ６３μを加え、2.5倍容の９５％エタノール（−
２０℃）でエタノール沈殿を行い、−７０℃で一夜放置
した。ここで沈殿を水に溶かし、A₂₆₀で定量したがＲＮ
Ａは存在しなかった。そこで上清を0.1Ｍ酢酸ナトリウ
ム(pH5.2)に調整し、エタノール沈殿を行ったところ、A
₂₆₀での測定によると、3.51μｇ(234μｇ／ｍ）のＲ
ＮＡが得られた。このとき、A₂₆₀／A₂₈₀＝２．７５であ
った。このＴＥ緩衝液に溶解させたポリＡ^＋ＲＮＡ溶液
は、これに2.5倍容の９５％エタノールを加えて、−７
０℃で保存し、cDＮＡクローニングのための標品として
用いた。

Ｆ．トウモロコシppcのcDＮＡのクローニングと塩基配
列の決定 １．トウモロコシｐｐｃのcDＮＡライブラリーの作製 上述のポリＡ^＋ＲＮＡを用いてcDＮＡのライブラリーを
作製した。ここで用いた方法はＯkayama−Ｂerg法
^9),10),11)である。従来のcDＮＡクローニングの方法と
しては、一般に逆転写酵素反応で合成した第一鎖cDＮＡ
から、セルフプライミング現象を利用して一端にヘアピ
ン構造を持った二重鎖ＤＮＡをつくり、このヘアピン部
をＳ１ヌクレアーゼで削り取った後、ホモポリマー鎖あ
るいは適当な制限酵素に対するリンカーを介してベクタ
ーＤＮＡに組み込むという手続きが取られていた。しか
し、この方法では原理的にｍＲＮＡの５′末端配列が必
然的に失われるという欠点があるほか、素材上、操作上
の制約から全体としての効率が低く、長いcDＮＡが得に
くい。これらの難点を大幅に解消した新しい方法がＯka
yama−Ｂerg法である。

本方法の概要を第３図に、使用するベクタープライマー
ＤＮＡとリンカーＤＮＡの構造を第２図に示す（このリ
ンカーＤＮＡも京大ウイルス研より入手可能である）。
まず第一鎖cDＮＡの合成には、ベクターとなるＤＮＡ片
の一端にdT鎖を付けたもの（ベクター・プライマー）を
プライマーとして使う。次に第二鎖の合成は、ＲＮＡ鎖
はそのままで、先に、第１鎖cDＮＡの３′末端をベクタ
ー・プライマーＤＮＡの他端に継いで環状化しておいて
から、最後のＲＮaseＨ、ＤＮＡポリメラーゼＩおよび
ＤＮＡリガーゼを組み合わせた修復反応でＲＮＡをＤＮ
Ａに置き換えるという方法をとる。セルフプライミング
とその後のＳＩヌクレアーゼによる消化という操作がな
いために、本方法では第一鎖cDＮＡの３′端末配列が失
われることがない。またcDＮＡ第二鎖合成の際、単鎖Ｄ
ＮＡ鋳型では部分的に２次構造が生じ易く、ＤＮＡポリ
メラーゼＩの複製反応がそこで中断する可能性があった
が、ここではｍＲＮＡ：cDＮＡハイブリッドを修復反応
で二重鎖ＤＮＡに変えるため、そのような危険性が減っ
ている。以上のような原理上の特徴に加えて、実験操作
上でも各反応が微量遠心チューブ内で連続して行えるよ
うに工夫してあり、面倒で損失の多い産物のサイズ選別
操作を途中に含まないために、cDＮＡの合成とベクター
への組み込みの全過程を収率良く、しかも短時間で完了
することができる。

ステップ１ cDＮＡ合成 ポリＡ^＋ＲＮＡ溶液１５μ(2３４μｇ／ｍ）を熱処
理して変性させ、減圧乾燥した後、１６μの水と１μ
のメチル水銀を加え、１０分間室温で放置した。これ
に３μの0.7Ｍβ−メルカプトエタノールを加えて５
分間室温で放置した。これに、予め３７℃にしておいた
反応混液４０μ〔５０mMトリス−HCl緩衝液(pH8.3)、
８mMMgCl₂、３０mMKCl、３mMジチオトレイトール、２mM
dAＴＰ、dTＴＰ、dGＴＰ、dCＴＰ、0.25μCi/nmol〔α
−³²P〕dCＴＰ、ベクター・プライマーＤＮＡ１μｇ〕
を加え、５分間３７℃でプレインキュベートした後、リ
バーストランスクリプターゼ(12.9単位／μ，生化学
工業）５μを加え、３７℃で６０分間反応を行わせ
た。反応開始時、３０分後および６０分後に１μずつ
抜き取って³²PのＴＣＡ沈殿への取り込みを測定し、cD
ＮＡ合成反応をモニターした。4.5μの0.25ＭＥＤＴ
Ａと4.5μの１０％ＳＤＳを加えて反応を止めた後攪
拌し、６０μのフェノール・クロロホルムで抽出し
た。水層に６０μの４Ｍ酢酸アンモニウムと２４０μ
の９５％エタノールを加えて混合した後、−７０℃で
１５分間凍らせた。これを15,000rpmで１０分間遠心
し、沈殿を３０μのＴＥ緩衝液(pH7.3)に溶かし、３
０μの４Ｍ酢酸アンモニウムと１２０μの９５％エ
タノールを加え、同様のエタノール沈殿操作を行い、次
のステップに移った。

ステップ２ dC鎖の付加 ステップ１の沈殿を反応混液４５μ〔１４０mMカコジ
ル酸ナトリウム、３０mMトリス−ＨＣｌ緩衝液(pH6.
8)、１mMCoCl₂、0.1mMジチオトレイトール、0.66μポ
リＡ、３３０μＭ〔α−³²P〕dCＴＰ（１０μＣi)〕に
溶かし、３７℃で２〜３分温めた後、５４Ｕのターミナ
ルトランスフェラーゼ(Life Science社）を加えた。５
分間インキュベートした後、０℃に急冷して反応を中断
し、１μを抜きとって、³²PのＴＣＡ沈殿への取り込
みを測り、dC鎖の長さを見積もった。その結果平均２０
塩基のdC鎖が付加したと推測されたので（１０〜２０塩
基が適当）、0.2５ＭＥＤＴＡと１０％ＳＤＳの混液
(1：１，v/v)6.75μを加えて、反応を止めた。フエノ
ール・クロロホルム(4５μ）抽出、エタノール沈殿(2
回)、エタノール洗浄を前ステップと同様に行った。

ステップ３ HindIIIによる切断 沈殿を３０μのHindIII切断用緩衝液に溶かし、５Ｕ
のHindIII(NＥＢ社製）を加え、３７℃で６０分間消化
した。ＥＤＴＡ・ＳＤＳ混液（前出）３μで反応を停
止させ、フエノール・クロロホルム(30μ）抽出、エ
タノール沈殿（２回）と洗浄を前記と同様に行った。沈
殿を１５μのＴＥ緩衝液(pH7.3)に溶かし、１５μ
のエタノールを加え、−２０℃で保存した。これよりト
ランスフォーメーションまでのステップは、１μずつ
の試料を様々な条件下でテストし、その結果に従って実
験計画をたてた。

ステップ４ dG鎖付加リンカーＤＮＡによる環状化 ベクター・cDＮＡ：mRＮＡは収率４０％として0.03pmol
/μ、リンカーＤＮＡは0.10pmol/μであった。ベク
ター・cDＮＡ：mRＮＡとリンカーＤＮＡの混合比を0.1
μと0.2μ(#1)、1.0μと0.4μ(#２Ａ、２Ｂ、
２C)、1.0μと0.6μ(#3)として、それぞれに以下の
操作を行った。１０μのＴＥ緩衝液(pH7.5)＋0.1MNaC
l中、６５℃で５分間、ついで４２℃で３０分間（アニ
ーリング）インキュベートした後０℃に冷やした。これ
は先にＧＣ対をつくらせて環状化した後、ライゲーショ
ンを行うためである。次に環状化反応緩衝液〔１mMＤＴ
Ｔ、２０mMトリス−ＮＣｌ緩衝液(pH7.5)、4mMMgCl₂、10
mM(NH₄)₂SO₄、0.1MRCl、0.1mMβ−ＮＡＤ（ニコチンアミ
ドアデニンジヌクレオチド）、５０μｇ／ｍＢＳＡ〕
９０μを加え、＃１、＃２、＃３にそれぞれ２Ｕ、＃
２Ａに0.5Ｕ、＃２Ｃに１０Ｕの大腸菌ＤＮＡリガーゼ
(NＥＢ社製）を加え、１２℃で一夜インキュベートし
た。

ステップ５ ＲＮＡ鎖のＤＮＡ鎖への置換 上記反応液に４μの基質混液〔１mMdATP、dTTP、dGTP、d
CTP、1.25mMβ−ＮＡＤ〕を加え、大腸菌ＤＮＡリガー
ゼ、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ(Pharmacia PL Bioche
micals)、大腸菌ＲNaseH(Pharmacia PL Biochemicals)
を、それぞれ＃１、＃２、＃３に0.6Ｕ、2.8Ｕ、0.2
Ｕ、＃２Ａに1.0Ｕ、0.7Ｕ、0.1Ｕ、 ＃２Ｃに３
Ｕ、１４Ｕ、1.0Ｕをそれぞれに加え、これらを１２℃
および２５℃で順次６０分間ずつインキュベートして−
２０℃で凍結保存した。

ステップ６ 大腸菌（ＤＨ１株）のトランスフォーメー
ション −７０℃で凍結保存したＤＨ１株のコンピテント細胞を
融かし、２００μずつを微量遠心チューブにとり、０
℃で１５分間放置した。これに適量の試料ＤＮＡを加
え、３０分間０℃に放置し、４２℃で９０秒間熱ショッ
クを加えた後、氷浴上に２分間置いた。Ψ培容（室温）
〔２％(w/v)バクト・トリプトン、0.5％バクト・酵母エ
キス（共にDifco社のもの）、１０mMNaCl、2.5mMKCl、
１０mMMgSO₄、１０mMMgCl₂；ＫＯＨでpH＝7.6に調整〕
を、１本当たり８００μ加え、３７℃で緩やかに振盪
しながら６０分間インキュベートした。これを適量、５
０μｇ／ｍのアンピシリンを含むＬ−ブロスプレート
にまいた。また、トランスフォーメーション後、菌を全
部まとめて５０倍容のブロス中に投入し、３７℃で３時
間振盪培養した後、アンピシリンを１００μｇ／ｍに
なるように加え、さらに一昼夜培養し、これをトウモロ
コシcDＮＡのライブラリーとした。

実験結果 以上のcDＮＡクローニングのいくつかのステップにおけ
る標品をアガロースゲル電気泳動、アルカリアガロース
ゲル電気泳動、オートラジオグラフィー等に付して途中
経過の確認を行ったので、その結果を以下に示す。

ステップ３におけるHindIII消化後の標品１μとベク
ター・プライマーＤＮＡ0.7μｇをHindIII消化したもの
を、アガロースゲル電気泳動に付した。ベクター・プラ
イマーＤＮＡのHindIII消化後の標品では、ベクター・
プライマーＤＮＡに特異的な２つのHindIII断片、即ち
約2.6kbと約0.35kbのバンドが観察された。またステッ
プ３のHindIII消化後の標品において、ベクター・プラ
イマーＤＮＡのHindIII消化後の標品の約2.6kbのバンド
に相当する部位が、泳動開始点に向かって大きく広がっ
ていた。これは、様々の長さのトウモロコシmRＮＡがベ
クター・プライマーＤＮＡに組み込まれたためである。
トウモロコシppcのmRＮＡは約３kbと予想されるが、レ
ーン１には約5.6kb付近にも相当なＤＮＡがあり、以後
のスクリーニングにあたって十分なライブラリーが得ら
れることが有望であることが確認された。

２．トウモロコシppccDＮＡのスクリーニング Ａ．概要 トウモロコシppcのcDＮＡを組み込んだプラスミド（以
下pMと呼ぶ）を保持している大腸菌ＤＨ１株をアルカリ
法¹⁴⁾で処理することによってプラスミド（cDＮＡライ
ブラリー）を調製し、ルビジウム法^15),16),17)によ
り、グルタミン酸要求性の大腸菌株ＰＣＲ１をトランス
フォームし、グルタミン酸要求性を相補することを指標
として、スクリーニングを行った。アルカリ法でプラス
ミドを調製するときは、その時の目的に応じてアルカリ
処理を１回にするか２回にするか、およびＲＮaseＡま
たはＲＮaseＴ₁処理をするかしないかなど適宜変えた。

またpMのトウモロコシcDＮＡの転写のためのプロモータ
ーが大腸菌の野生株の1acプロモーターであるので、Ｇl
u^-培地でpMによってトランスフォームされたＰＣＲ１を
スクリーニングするときは、培容に1acオペロンのイン
デューサでラクトース類似体であるＩＰＴＧ（イソプロ
ピルβ−Ｄ−チオガラクトサイド）を、2.5×１０^-5Ｍ
加え、炭素源としては、異化産物抑制が解除されるよう
に、グルコースの代わりにグリセロールを用いた。スク
リーニングの操作のときは、常に培地にアンピシリンを
規定濃度加えておいた。培養温度はトウモロコシＰＥＰ
Ｃaseの至適温度と思われる３０℃とした。ＰＣＲ１の
Ｇlu要求性を相補すると思われるプラスミドは、適宜制
限酵素処理を行い、アガロースゲル電気泳動に付してそ
の特性化を行った。

Ｂ．実験結果 トウモロコシcDＮＡライブラリーのプラスミドを保持す
る大腸菌ＤＨ１株の菌体よりアルカリ法（アルカリ処理
２回）で、1.77mg/ｍ(3.55mg)〔A₂₆₀による〕のプラ
スミドＤＮＡ(pM)を得た。このうち0.5ｍをＲＮaseＡ
およびＲＮaseＴ₁で処理して、1.11mg/ｍ(0.44mg)〔A
₂₆₀による〕のpM′を得た。pMおよびpM′を、それぞれ
アガロースゲル電気泳動に付したところ、それぞれ3.30
kb、2.30kb付近にメインバンドが観察された。

これらpMおよびpM′を用いてルビジウム法により大腸菌
ＰＣＲ１(ppc^-)をトランスフォームした。アンピシリン
耐性を獲得したトランスフォーマント約８４００コロニ
ーをレプリカ法によりＧlu^-培地プレートにまいたとこ
ろ、この培地で成長したコロニーを１個得た。この菌体
が保持するプラスミドがＰＣＲ１のＧlu要求性を相補し
たことになる。このプラスミドをpM５とした。ＰＣＲ１
／pM５からアルカリ法により、１３８μｇのプラスミド
ＤＮＡ(pM5)を得た。pM５を用いて再びＰＣＲ１をトラ
ンスフォームしたところ、アンピシリン耐性を獲得した
トランスフォーマントは、全てＧlu^-培地でも生長し
た。以上のことから、pM５はＰＣＲ１のＧlu要求性を相
補する能力を有することが確認された。さらにpM５をＰ
vuＩ処理したところ、cDＮＡクローニング・ベクターに
特異的な1.82kbのＤＮＡ断片が得られ、pM５がクローニ
ング・ベクター由来であることが確認された。

pM５は約6.30kbのプラスミドであり、組み込まれたＤＮ
Ａは約3.40kbであるので、トウモロコシＰＥＰＣaseの
分子量から判断して、これはppc cDＮＡ全長が組み込ま
れているのに十分な長さであることがわかる。次にＰＣ
Ｒ１／pM５から単一コロニーを得、それからプラスミド
pM５２（１０６μｇ）を調製した。さらに、このプラス
ミドの制限酵素切断点地図を作製するために、pM５２を
１３種類の６カッター制限酵素で処理して、、アガロー
スゲル電気泳動に付し、pM５２の制限酵素切断点地図を
作製した（第４図）。プラスミドpM５２を導入した大腸
菌Ｋ−１２ＰＣＲ１／pM５２は前記微生物工業技術研究
所に寄託されている（ＦＥＲＭ Ｐ−８４１３、寄託
日：昭和６０年８月１４日）。

pM５２から挿入されたppcを切断し、その塩基配列をサ
ンガー(Sanger,F)により開発され¹⁸⁾、(Messing,J)らに
より改良された配列決定法¹⁹⁾により決定した（第１
図）。

Ｇ．組換えプラスミドを保持するＰＣＲ１の無細胞抽出
液の検討 １．大腸菌の無細胞抽出液のＰＥＰＣase活性の測定お
よびエフェクター感受性の検討⁷⁾ i)概要 pMでトランスフォームすることによって、Ｇlu要求性が
相補されたＰＣＲ１の無細胞抽出液を調製し、ＰＥＰＣ
ase活性を測定した。ＰＥＰＣaseの活性測定はリンゴ酸
脱水素酵素(MＤＨ，〔ＥＣ１．１．１．３７〕）との共
役系を用い、ＮＡＤＨの酸化に伴う３４０nmにおける吸
収減少を測定することによって行った²⁰⁾。測定の大部
分は片桐の方法²¹⁾に従った。すなわち、菌を懸濁する
緩衝液として、１００mMリン酸カリウム緩衝液(pH7.5)
を用い、音波破砕の際は同じ緩衝液に２０％グリセロー
ルと１mMジチオトレイトールを加えた。また適宜、エフ
ェクターと思われる物質を加え活性の変化を測定した。
表３に活性測定に用いた反応混液の組成をあげる。片桐
の方法と異なるのはトリス−ＨＣｌ緩衝液(pH8.0)の代
わりにトリス−Ｈ₂ＳＯ₄緩衝液(pH8.0)を用いた点であ
る。これはCl^-が大腸菌ＰＥＰＣaseを阻害するからであ
る²²⁾。なお、タンパク質定量は、Ｌowry法²³⁾によっ
た。

さらに大腸菌のＰＥＰＣase活性を阻害する３種のモノ
クローナル抗体²⁴⁾および抗トウモロコシＰＥＰＣase抗
血清²⁵⁾が本酵素活性に与える影響を検討した。

ii)実験結果 ＰＣＲ１／pM５１の無細胞抽出液のＰＥＰＣase活性と
エフェクター感受性を測定した（表４）。対照として大
腸菌Ｋ−１２野生株のＷ３１１０を用いた。その結果、
ＰＣＲ１／pM５１はＰＥＰＣase活性を有し、そのエフ
ェクター感受性はトウモロコシに特徴的なものであるこ
とが分かった。

２．組み換えプラスミド産物の電気泳動的特性化 i)概要 ＰＣＲ１およびＰＣＲ１／pMの無細胞抽出液を、ポリア
クリルアミド電気泳動(PＡＧＥ)、ＳＤＳ−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動(SＤＳ−ＰＡＧE)および活性染色に
付して比較検討し、トウモロコシＰＥＰＣaseの分子量
などの特性化を行った。

ii)実験結果 大腸菌無細胞抽出液を、ＰＡＧＥに付した後、活性染色
および蛋白染色を行なった。さらに、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
に付した後、蛋白染色を行なった。活性染色では、ＰＣ
Ｒ１／pM５２は大腸菌ＰＥＰＣaseよりも下方に幅広い
バンドが観察された。

３．抗トウモロコシＰＥＰＣase抗血清との反応性の検
討 i)概要 pMによってＧlu要求性が相補されたＰＣＲ１の無細胞抽
出液と抗トウモロコシＰＥＰＣase抗血清が反応するか
どうか、反応するとすればどれぐらいの抗血清濃度が適
当か、あるいは他生物種ＰＥＰＣaseとの交差反応性は
どうかということをDot-Immnoblotting法²⁴を用いて検
討した。

本方法は、膜上に標品をスポットし、一次抗体（ウサギ
の抗トウモロコシＰＥＰＣase抗血清）と反応後、二次
抗体（ヒツジの抗−ウサギIgG、複合ペルオキシダーゼ
と共に）と反応させ、発色剤と二次抗体のペルオキシダ
ーゼによる呈色反応を行わせ、各スポットの色の濃淡を
比較することによって抗原と一次抗体との反応性、さら
には抗原あるいは一次抗体の希釈シリーズを作製するこ
とによって、抗原の定量あるいは一次抗体の力価を決定
するものである。

実験操作は、Bio-Dot^TM装置(BＩＯ−ＲＡＤ社）を用い
て行った。操作手順はＢＩＯ−ＲＡＤ社のマニュアルに
従ったが多少の変更があるので以下にそれを述べる。ニ
トロセルロース膜をＴＢＳ緩衝液〔５０mMトリス−ＨCl
緩衝液(pH7.4)、0.2MNaCl〕に浸し、ろ紙上に５分間放
置して、ニトロセルロース膜を装置にセットアップし
た。吸引しながらＴＢＳで１回各ウェルを洗浄した。吸
引装置をはずしてから抗原溶液（無細胞抽出液）１μ
をスポットして、自然ろ過後吸引して乾燥した。各ウェ
ルに２５０μのブロッキング溶液〔３％(w/v)ゼラチ
ン(BＩＯ−ＲＡＤ社，ＥＩＡ等級）／ＴＢＳ〕を加え、
３０分間自然ろ過させ、残ったブロッキング溶液は吸引
して乾燥させた。各ウェルに２００μのＴＴＢＳ緩衝
液〔0.05%(V/V)ツウイーン２０／ＴＢＳ〕を吸引しなが
ら加えた。これに５μの一次抗体を加え、３０分から
１時間自然ろ過させて吸引乾燥させた。なお一次抗体の
希釈にはＡＢＳ緩衝液〔１％ゼラチン／ＴＢＳ〕を用い
た。上記と同様に２００μのＴＴＢＳ緩衝液で各ウェ
ルおよびスポットを３回洗浄した。この後、１００μ
の二次抗体を加え３０分から１時間ろ過させて吸引乾燥
して、２００μのＴＴＢＳ緩衝液で３回洗浄した。こ
の時点で抗原・一次抗体・二次抗体複合体が膜上に固定
されたことになる。この膜を発色溶液〔使用直前に、６
０mgの４−クロロ−α−ナフトールを２０ｍの冷メタ
ノールを溶かしたものと、約４０％H₂O₂６０μを１０
０ｍＴＢＳに加えたものを混合したもの〕に浸して適
当に発色したところで水洗して反応を止めた。膜は暗所
で乾燥させた後、黄色のフィルターを用いて写真を撮っ
た。

ii)実験結果 ＰＣＲ１、ＰＣＲ１／pM５２の無細胞抽出液およびトウ
モロコシＰＥＰＣase粗酵素標品と、抗トウモロコシＰ
ＥＰＣase抗体血清との反応性をDot-Immunoblotting法
を用いて検討した。トウモロコシＰＥＰＣase粗酵素標
品との比較により、pM５２の産物は、トウモロコシＰＥ
ＰＣaseであることが確認された。

４．ウェスタン・ブロッティング²⁶⁾ i)概要 この方法はＳＤＳ−ＰＡＧＥに付されたタンパク質を、
そのバンド・パターンをそのままに電気的にポリアクリ
ルアミドゲルから、タンパク質吸着性の膜に移す方法と
して考案されたものである。膜上に固定されたタンパク
質は特定のタンパク質に特異的な一次抗体と、ラベルさ
れたり、蛍光物質やペルオキシダーゼなどと結合させて
検出可能となった一次抗体に特異的な二次抗体を用いる
ことによって、特定のタンパク質を検出、同定すること
ができる。さらにＳＤＳ−ＰＡＧＥのバンド・パターン
は膜上でも維持されているので、分子量マーカーの移動
度と比較することによって特定タンパク質の分子量を決
定することができる。本研究では、pMによってＧlu要求
性が相補されたＰＣＲ１の無細胞抽出液をＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥに付したあと、ゲル上のトウモロコシＰＥＰＣase
に相当するバンドを同定し、さらにその分子量を決定す
るために本方法を用いた。膜上でトウモロコシＰＥＰＣ
ase抗血清と反応するバンドが見出されればpMがトウモ
ロコシppccDＮＡを保持している。即ちトウモロコシppc
cDＮＡがクローニングされたという有力な証拠の一つと
なる。

ＰＣＲ１／pMおよびＰＣＲ１の無細胞抽出液とトウモロ
コシＰＥＰＣase部分精製標品をＡＴＴＯ社のミニスラ
ブディスク電気泳動装置を用いて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
(7.5％ゲル、８０mm×６０mm×１mm)に付した。泳動
後、ガラス板をはずしてゲルをあらかじめ冷やしたトラ
ンスファー緩衝液〔２５mMトリス・１９２mMグリシン／
２０％(v/v)メタノール(pH8.3)〕に浸し、５分間放置し
てゲルをＸ線フィルムの不要なものですくいあげ、予め
トランスファー緩衝液に浸したろ紙(Tpyo No.526)にの
せた。この際ゲルとろ紙の間に空気が入らないようにし
た。ゲルの上にトランスファー緩衝液に浸した膜(Milli
pore社，ＧＶＨＰ）をのせた。この時も膜とゲルの間に
空気が入らないようにした。その上に同様にトランスフ
ァー緩衝液に浸したろ紙をのせ、スポンジパッドとホル
ダーではさみトランスファー装置〔Trans-Blot^TMSyste
m〕(BＩＯ−ＲＡＤ社）に入れた。これに予め冷した
（約４℃）トランスファー緩衝液を３加えておき、そ
の中にパッドではさまれたゲルを入れた。このとき、あ
わはできる限り取り除いた（装置を軽く上下に動かし振
動させるとよい。）。６５Ｖにて２〜３時間で膜上にタ
ンパク質を移した。膜上のタンパク質の検出、同定法
は、Dot-Immunobotting法と同様である。まず、膜をブ
ロッキング溶液に浸し室温で３０分から１時間放置し
た。これを一次抗体（現役を７０倍希釈したもの）中で
１〜２時間インキュベートし、水で１回、ＴＴＢＳ緩衝
液で２回、それぞれ１０分間洗浄した。次に二次抗体中
で１時間インキュベートし、同様に洗浄した。洗浄操作
が十分ではいと非特異的な結合がおこり結果が汚くなる
ので注意を要する。膜の水分をよくきった後、発色溶液
に浸し適当な発色がみられたところで水洗し反応を停止
した。なお分子量を決定するために分子量マーカーと共
に泳動したゲルは別に染色するか、あるいは膜に移した
後、膜を切って当該部位をアミドブラック(0.1％アミド
ブラック１０Ｂ、５％酢酸、５０％メタノール）で染色
した。

ii)実験結果 ウェスタン・ブロッテイングの結果を第５図に示す。Ｐ
ＣＲ１／pM５２およびトウモロコシＰＥＰＣaseのレー
ンに有意とみなされるバンドが形成された。これよりク
ローン化されたトウモロコシppcのcDＮＡの産物は、分
子量約９万と推定された。活性染色の場合と同様に抗体
と反応した領域は幅が広くなっている。

以下に、本明細書に於いて引用した文献を列挙する。

1)ウエダン(Uedan,K.F.)およびスギヤマ(Sugiyama,T.)
(1976)；プラント・フィジオロジィー(Plant Physio
l.),57,906-910 2)ウォング(Wong,K.F.)およびデービス(Davis,D.D.)(19
73)；バイオケミカル・ジャーナル(Biochem.J.),131,45
1-458 3)ヘイグ(Haugue,D.R.)およびシームス(Sims,T.L.)(198
0)；プラント・フィジオロジー(Plant Physioi.),66,50
5-509 4)シームス(Sims,T.L.)(1981)；ジャーナル・オブ・バ
イオロジカル・ケミストリィー(J.Biol.Chem.)256,8252
-8255 5)マリエー(Marie,S.)およびシリア(Sylia.L.)(1983)；
フォトシンセチカ(Photosynthetica),17,379-385 6)ネルソン(Nelson,T.),ハープスター(Harpster,M.H.),
メイフィールド(Mayfield,S.P.)およびテイラー(Taylo
r,W.C.)(1984)；ジャーナル・オブ・セル・ハイオロジ
ィー(J.Cell.Biol.)98,558-564 7)佐邉壽孝(1982)昭和５６年度 修士学位論文 8)キセン(Kissane,J.M.)およびロビン(Robin,E.)(195
8)；ジャーナル・オブ・バイオロジカル・カミストリー
(J.Biol.Chem.),233,184-188 9)マニアティス(Maniatis,T.),フリッシュ(Fritsch,E.
F.)およびサムブロック(Sambrook,J.)(1982)；モレキュ
ラー・クローニング(in“Molecular Cloning”)p.197,C
old Spring Habor Laboratory 10)重定勝哉(1983)細胞工学,2,616-626 11)オカヤマ(Okayama,H.)およびバーグ(Berg,P.)(198
2)；モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジィー
(Mol.Cell.Bioi.)2,161-170 12)オカヤマ(Okayama,H.)およびバーグ(Berg,P.)(198
3)；モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジィー
(Mol.Cell.Bioi.)3,280-289 13)＝１０） 14)バーンボイム(Birnboim,H.C.)およびドリィー(Doly,
J.)(1979)；ヌクレイック・アシッド・リサーチ(Nucl.A
cids Res.),7,1513-1523 15)クスナー(Kusnner,S,R.)(1978)；ジェネティック・
エンジニアリング（ｉｎ“Genetic Enginieering”)p1
7,Elsevier 16)ボリバーＬ(Bolivar,F.)およびバックマン(Backman,
K.)(1979)；メソッド・イン・エンザイモロジー（ｉｎ
“Methods in Enzymology"),68p.253,Academic Press,N
ew York 17)高木康敬：遺伝子操作マニュアル,PP.４７−４９
（講談社,1982) 18)サンガー(Sanger,F)；サイエンス(Science),214,120
5-1210 19)メッシング(Messing,J.),クレア(Crea,R.)およびシ
ーバーグ(Seeburg,P.H.)；ヌクレイック・アシッド・リ
サーチ(Nucl.Acids.Res.),9,309-321(1981) 20)ヨシナガ(Yoshinaga,T.),イズイ(Izui,K.)およびカ
ツキ(Katsuki,H.)(1970)；ジャーナル・オブ・バイオケ
ミストリー(J.Biochem.),68,747-750 21)片桐文章(1984)昭和５８年度 特殊研究論文 22)イズイ(izui,K.),ニシキド(Nishikido,T.),イシハラ
(Ishihara,K.)およびカツキ(Katsuki,H)(1970)；ジャーナ
ル・オブ・バイオケミストリー(J.Biochem.),68,215-22
6 23)ローリー(Lowry,O.H.),ローズブロー(Rosebrough,N.
J.),ファール(Farr,A.L.)およびロンダル(Rondall,R.
J.)(1951)；ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオ
ロジー(J.Mol.Bioi.),193,265-275 25)石嶌純夫、田口正明、平井圭介、難波雄二郎、花岡
正男、泉井桂、香月裕彦(1983)生化学，５５，８１５ 25)パーソナル・コミュニケーション(personal communi
cation) 26)トービン(Towbin,H.),スターヘリン(Staehelin,T.)
およびゴードン(Gordon,J.)(1979)；プロシーディング
ス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス
(Proc.Natl.Acad.Sci.)USA,76,4350-4354

【図面の簡単な説明】

第１図はトウモロコシのＰＥＰＣaseの実質的機能部分
をコードしている遺伝子の塩基配列およびそれに対応す
るアミノ酸配列の模式図、第２図はトウモロコシcDＮＡ
ライブラリー作製に使用するベクター・プライマーおよ
びリンカーＤＮＡの構造を示す模式図、第３図はＯｋａ
ｙａｍａ−Ｂｅｒｇ法の工程図、第４図はpM５２の制限
酵素切断点地図の模式図、第５図は各種無細胞抽出液を
ウエスタン・ブロッティングにかけた結果を撮影した写
真の模式図である。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】トウモロコシのホスホエノールピルビン酸
   カルボキシラーゼの実質的機能部分をコードし、第１図
   に記載のＤＮＡ配列を有する遺伝子。
2. 【請求項２】トウモロコシのホスホエノールピルビン酸
   カルボキシラーゼの実質的機能部分をコードし、第１図
   に記載のＤＮＡ配列を含有しているプラスミド。
3. 【請求項３】第４図に記載の制限酵素切断点地図で表さ
   れる特許請求の範囲第２項に記載のプラスミドｐＭ５
   ２。