JPH0632608B2

JPH0632608B2 - 耐熱性ザルコシン・オキシダ−ゼｎの製造法

Info

Publication number: JPH0632608B2
Application number: JP61201290A
Authority: JP
Inventors: 泰二小山; 衛一中野; 勝鈴木; 秀子山本
Original assignee: KITSUKOOMAN KK; NODA SANGYO KAGAKU KENKYUSHO
Current assignee: KITSUKOOMAN KK; NODA SANGYO KAGAKU KENKYUSHO
Priority date: 1986-08-29
Filing date: 1986-08-29
Publication date: 1994-05-02
Anticipated expiration: 2009-05-02
Also published as: JPS6359885A

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は、耐熱性ザルコシン・オキシダーゼＮの製造法
に関する。

ザルコシン・オキシダーゼは、ザルコシン＋H₂O＋O₂→ グリシン＋ホルムアルデヒド＋H₂O₂ の反応を触媒する酵素であり、例えば、特開昭54-52789
号公報、ジャーナル・オブ・バイオケミストリー、第89
巻、第599頁、1981年ジャパン〔J.Biochem.89,599(198
1)JAPAN〕に記載され、公知である。

一方、クレアチニンあるいはクレアチンを酵素的に定量
する方法が報告され〔臨床化学シンポジウム、第19集，
第196頁(1979)〕、該定量法にザルコシン・オキシダー
ゼが使用されており、該酵素は、有用な酵素である。該
定量法は、下記の通りであり、下記の式中、括弧内は使
用酵素である。

クレアチニン＋H₂Oクレアチニン（クレアチニン・アミドヒドロラーゼ）クレアチニン＋H₂O→ザルコシン＋尿素（クレアチン・アミノヒドロラーゼ）ザルコシン＋H₂O＋O₂→ グリシン＋ホルムアルデヒド＋H₂O₂ （ザルコシン・オキシダーゼ）〔従来の技術〕先に、本発明者等の内の１人が、新たに土壌より分離し
たバチルス属に属する菌株を培養したものより、微酸性
でも充分酵素活性を示し、耐熱性で、ザルコシンに対す
るkm値の低い新規なザルコシン・オキシダーゼが得られ
ることを知り、耐熱性ザルコシン・オキシダーゼＮ及び
その製造法の特許出願を行なった（特開昭61-162174号
公報）。

〔発明が解決しようとする問題点〕

しかしながら、上記の耐熱性ザルコシン・オキシダーゼ
Ｎ製造法により、該酵素の収率を最大にするためには、
培地中に高価なクレアチニン、クレアチン及び／又はザ
ルコシンを添加することが必要であり、経済的に不利で
あり、また、製造操作も煩雑になる等の問題があった。

〔問題点を解決するための手段〕

そこで、本発明者等は、上記の問題点を解決すべく種々
検討した結果、耐熱性ザルコシン・オキシダーゼＮをコ
ードする遺伝子を含有するＤＮＡをベクターＤＮＡに挿
入した組み換え体ＤＮＡを得、この組み換え体をエッシ
ェリシア(Escherichia)属に属する微生物に含ませた耐
熱性ザルコシン・オキシダーゼＮ生産能を有する微生物
を培地に培養すると、培地中に、クレアチニン、クレア
チン及び／又はザルコシンを全く添加することなしに、
効率よく耐熱性ザルコシン・オキシダーゼＮが生産され
ること等の知見を得、本発明を完成した。

即ち、本発明はバチルス・エスピーNS-129株由来の耐熱
性ザルコシン・オキシダーゼＮをコードする遺伝子を含
有するＤＮＡをベクターＤＮＡに挿入した組み換え体Ｄ
ＮＡを含み、耐熱性ザルコシン・オキシダーゼＮ生産能
を有するエッシェリシア属に属する微生物を、培地に培
養し、培養物より耐熱性ザルコシン・オキシダーゼＮを
採取することを特徴とする耐熱性ザルコシン・オキシダ
ーゼＮの製造法である。

以下、本発明について詳細に説明する。

先ず、耐熱性ザルコシン・オキシダーゼＮ（以下、ＳＯ
Ｎと略称する。）をコードする遺伝子を含有するＤＮＡ
の調製について述べる。

バチルス・エスピーNS-129〔微工研菌寄第2922号(FERM
BP-671)〕株を、特開昭61-162174号公報記載の方法と全
く同様にして培養し、培養物を得る。この培養物を、例
えば3000r.p.m.以上、好ましくは8000〜10000r.p.m.で
５分以上、好ましくは10〜15分間遠心分離してバチルス
・エスピーNS-129株の菌体を得る。

この菌体より、例えば斎藤、三浦の方法〔バイオケム．
バイオフィズ．アクタ．(Biochem.Biophys.Acta)、第72
巻、第619頁（1963年）〕等により染色体ＤＮＡを得る
ことができる。

ついで、この染色体ＤＮＡに、突出末端を生じさせる制
限酵素、例えばSau３ＡＩ（東洋紡績社製）を温度30℃
以上、好ましくは37℃、酵素濃度は１〜10ユニット/ml
で20分以上、好ましくは0.5〜２時間作用させて消化
し、種々の染色体ＤＮＡ断片混合物を得る。

このようにして得たＤＮＡ断片混合物から、例えば通常
のアガロースゲル電気泳動法によりＤＮＡ断片混合物を
得、更に例えばフェノール抽出等の精製手段により精製
し、また更に例えばエタノール沈澱法等の濃縮手段によ
り濃縮し、純化されたＤＮＡ断片混合物（この中にＳＯ
Ｎをコードする遺伝子を含有するＤＮＡ断片が含まれ
る）を得る。

一方、本発明において用いることのできるベクターＤＮ
Ａとしては、如何なるものでもよく、例えばプラスミド
ベクターＤＮＡ、バクテリオファージベクターＤＮＡ等
が挙げられるが、具体的には例えばプラスミドpBR322Ｄ
ＮＡ〔ベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズ(Bethesda
Research Laboratories)社製〕などが好ましい。

上記ベクターＤＮＡに、突出端末を生じさせる制限酵
素、例えばBamＨＩ（宝酒造社製）を、温度30℃以上、
好ましくは37℃、酵素濃度10〜1000ユニット／mlで１時
間以上、好ましくは２〜３時間作用させて消化し、切断
されたベクターＤＮＡを得る。

ついで、上記のようにして得たバチルス・エスピーNS-1
29由来で、ＳＯＮをコードする遺伝子を含有するＤＮＡ
断片混合物と、切断されたベクターＤＮＡを混合し、こ
れに例えば大腸菌ＤＮＡリガーゼ（ニュー・イングラン
ド・バイオ・ラブス社製）、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（ベー
リンガー・マンハイム社製）など、好ましくはＴ４ＤＮ
Ａリガーゼを、温度４〜37℃、好ましくは４〜16℃、酵
素濃度１〜100ユニット／mlで１時間以上、好ましくは
６〜24時間作用させて組み換え体ＤＮＡを得る。

この組み換え体ＤＮＡを用いて、例えば大腸菌Ｋ−12、
好ましくは大腸菌ＨＢ101（ＡＴＣＣ33694）、大腸菌Ｄ
ＨＩ（ＡＴＣＣ33849）、大腸菌Ｘ−1776（ＡＴＣＣ312
44）、などを形質転換あるいは形質導入してそれぞれの
菌株を得る。この形質転換はディー・エム・モーリソン
(D.M.Morrison)の方法〔メソヅ・イン・エンザイモロジ
ー(Methods in Enzymology)、第68巻、第326〜331頁（1
979年）〕により行なうことができる。また形質導入は
ビ・ホーン(B.Hohn)の方法〔メソヅ・イン・エンザイモ
ロジー第68巻、第299〜309頁（1979年）〕によって行な
うことができる。

そして、上記菌株よりＳＯＮ生産能を有する微生物をス
クリーニングすることにより、ＳＯＮをコードする遺伝
子を含有するＤＮＡをベクターＤＮＡに挿入した組み換
え体ＤＮＡを含み、ＳＯＮ生産能を有するエッシェリシ
ア属に属する微生物を得ることができる。

このようにして得られた微生物より純化された組み換え
体ＤＮＡを得るには、例えばピー・グーリー(P.Guerry)
等の方法〔ジェイ．バクテリオロジー(J.Bacteriology)
第116巻、第1064〜1066頁（1973年）〕、デー．ビー・
クレウェル(D.B.Clewell)の方法〔ジェー・バクテリオ
ロジー第110巻、第667〜676頁（1972年）〕などにより
得ることができる。

そして、以上の如くして得られ、かつ純化された組み換
え体ＤＮＡ中のＳＯＮをコードする遺伝子を含有するＤ
ＮＡには、ＳＯＮをコードする遺伝子以外に不用なＤＮ
Ａが存在するため、以下の操作により該不用なＤＮＡを
除去するのである。

次いで、このようにして得られ、かつ純化された組み換
え体ＤＮＡに、制限酵素、例えばHpa I及びBgl II（夫
々、宝酒造社製）を、温度30℃以上、好ましくは37℃、
酵素濃度10〜1000ユニット／mlで20分以上、好ましくは
１〜６時間作用させて消化し、ＤＮＡ断片混合物を得
る。

一方、本発明において用いることのできるベクターＤＮ
Ａとしては、如何なるものでもよく、例えばプラスミド
ベクターＤＮＡ、バクテリオファージベクターＤＮＡ等
が挙げられるが、具体的には例えばプラスミドpUC18、p
UC12、pUC8ＤＮＡ〔ファルマシア社製〕などが好まし
い。

上記ベクターＤＮＡに、制限酵素、例えばBamＨＩ及びH
inc II（夫々、宝酒造社製）を、温度30℃以上、好まし
くは37℃、酵素濃度夫々10〜1000ユニット／mlで１時間
以上、好ましくは１〜３時間作用させて消化し、切断さ
れたベクターＤＮＡを得る。

ついで、上記のようにして得たバチルス・エスピーNS-1
29由来で、ＳＯＮをコードする遺伝子を含有するＤＮＡ
断片混合物と、切断されたベクターＤＮＡを混合し、こ
れに例えば大腸菌ＤＮＡリガーゼ（ニュー・イングラン
ド・バイオ・ラブス社製）、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（ベー
リンガー・マンハイム社製）など、好ましくはＴ４ＤＮ
Ａリガーゼを、温度４〜37℃、好ましくは４〜16℃、酵
素濃度１〜100ユニットで１時間以上、好ましくは６〜2
4時間作用させて組み換え体ＤＮＡを得る。

この組み換え体ＤＮＡを用いて、例えば大腸菌Ｋ−12、
好ましくは大腸菌ＪＭ101（ＡＴＣＣ33876）、大腸菌Ｈ
Ｂ101（ＡＴＣＣ33694）、大腸菌ＤＨＩ（ＡＴＣＣ3384
9）、大腸菌Ｘ−1776（ＡＴＣＣ31244）、などを形質転
換あるいは形質導入してそれぞれの菌株を得る。この形
質転換はディー・エム・モーリソン(D.M.Morrison)の方
法〔メソヅ・イン・エンザイモロジー(Methods in Enzy
mology)、第68巻、第326〜331頁（1979年）〕により行
なうことができる。また形質導入はビ・ホーン(B.Hohn)
の方法〔メソヅ・イン・エンザイモロジー第68巻、第29
9〜309頁（1979年）〕によって行なうことができる。

このようにして得られた微生物より純化された新規な組
み換え体ＤＮＡを得るには、例えばピー・グーリー(P.G
uerry)等の方法〔ジェイ．バクテリオロジー(J.Bacteri
ology)第116巻、第1064〜1066頁（1973年）〕、デー・
ビー・クレウェル(D.B.Clewell)の方法〔ジェー・バク
テリオロジー第110巻、第667〜676頁（1972年）〕など
により得ることができる。

上記のようにして得られたＳＯＮをコードする遺伝子を
含有するＤＮＡをベクターＤＮＡに挿入した組み換え体
ＤＮＡを含み、ＳＯＮ生産能を有するエッシェリシア属
に属する微生物を用いてＳＯＮを生産するには、この微
生物を通常の固体培養法で培養してもよいが、なるべく
液体培養法を採用して培養するのが好ましい。

また、上記微生物を培養する培地としては、例えば酵母
エキス、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカー
あるいは大豆もしくは小麦襖の浸出液等の１種以上の窒
素源に、リン酸第１カリウム、リン酸第２カリウム、硫
酸マグネシウム、塩化マグネシウム、塩化第２鉄、硫酸
第２鉄あるいは硫酸マンガン等の無機塩類の１種以上を
添加し、更に必要により糖質原料、ビタミン等を適宜添
加したものが用られる。

なお、培地の初発ｐＨは、７〜９に調整するのが適当で
ある。また培養は30〜42℃、好ましくは37℃前後で４〜
24時間、好ましくは６〜８時間、通気攪拌深部培養、振
盪培養、静置培養等により実施するのが好ましい。

培養終了後、該培養物よりＳＯＮを採取するには、通常
の酵素採取手段を用いて得ることができる。

例えば、常法により菌体を、超音波破壊処理、磨砕処理
などするか、または、リゾチーム等の溶菌酵素を用いて
本酵素を抽出するか、またはトルエン等の存在下で振盪
もしくは放置して自己消化を行なわせ本酵素を菌体外に
排出させる。この溶液を濾過、遠心分離などして固形部
分を除去し、必要によりストレプトマイシン硫酸塩、プ
ロタミン硫酸塩あるいは硫酸マンガンにより除核酸した
のち、これに硫安、アルコール、アセトン等を添加して
分画し、沈澱物を採取し、これを水に対し透析したのち
真空乾燥して粗酵素標品を得る。

そして本酵素は、必要により酵素の単離精製の常法に従
って、例えば、(1)ＤＥＡＥ−セルロースのカラムクロ
マトグラフィー、(2)硫安分画、(3)ＱＡＥ−セファデッ
クスのカラムクロマトグラフィー、(4)ＴＳＫ−ＧＥＬ
ブチル−トーヨーパール650Ｃ〔東洋ソーダ（株）製〕
の疎水クロマトグラフィー、(5)セファデックスによる
ゲル濾過等の方法、又はその他の方法を必要に応じて組
み合わせて用いることにより高度に精製されたＳＯＮ標
品を得ることができる。

上記精製手段により得られる精製ＳＯＮの理化学的物質
は、特開昭61-162174号公報記載のＳＯＮの理化学的性
質と全く同様である。

〔発明の効果〕

上述したことから明らかな如く、本発明の新規な組み換
え体ＤＮＡを含むエッシェリシア属に属する微生物を培
地に培養すると、クレアチン、クレアチニン、ザルコシ
ン等を添加使用することなく、ＳＯＮを効率よく得るこ
とができるので、本発明は産業上究めて有用なものであ
る。

〔実施例〕

以下、実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明す
る。

実施例 (1)バチルス・エスピーNS-129株の染色体ＤＮＡの調整バチルス・エスピーNS-129(FERM BP-671)株を、Ｔ−Ｙ
培地〔１％（Ｗ／Ｖ）バクト−トリプトン(Bacto-trypt
on〔ディフコ(Difco)社製〕、0.5％（Ｗ／Ｖ）バクト−
イースト・エキストラクト(Bacto-yeast extract)〔デ
ィフコ(Difco)社製〕、0.5％（Ｗ／Ｖ）NaCl(pH7.2)〕2
00mlに接種し、温度30℃で16時間振盪培養し、培養物を
得た。

この培養物を10000r.p.m.で10分間常法により遠心分離
処理し、湿潤菌体0.5ｇを得たのち、該菌体から斎藤、
三浦の方法〔バイオケム、バイオフィズ．アクタ．(Bio
chem.Biophys.Acta.)、第72巻、第619頁（1963年）〕に
より染色体ＤＮＡを得た。

ついで、この染色体ＤＮＡ0.1mg及び制限酵素Sau３ＡＩ
（東洋紡績社製）２ユニットを、10mMトリス塩酸緩衝液
（50mM NaCl、10mM MgSO₄及び１mMジチオスレイトール
含有）(pH7.4)にそれぞれ混合し、温度37℃で45分間反
応させた。反応終了液を常法により0.7％（Ｗ／Ｖ）ア
ガロースゲル（宝酒造社製）電気泳動処理したものよ
り、４〜８Kb（キロベースペアー）の大きさのＤＮＡ断
片をアール・シー・エイ・ヤング(R.C.A.Yang)等の方法
〔メソゾ・イン・エンザイモロジー(Methods in Enzymo
logy)、第68巻、第176〜182頁（1979年）〕により溶出
して溶出物を得、これから常法によりフェノール抽出処
理し、更にエタノール沈澱処理してSau３ＡＩで消化さ
れたバチルス・エスピーNS-129株の染色体ＤＮＡ断片10
μｇを得た。

(2)組み換え体プラスミドpKLS601ＤＮＡの作製プラスミドpBR322ＤＮＡ〔ベセスダ・リサーチ・ラボラ
トリーズ(Bethesda Research Laboratories)社製〕10μ
ｇと制限酵素BamＨＩ（宝酒造社製）100ユニットを50mM
トリス塩酸緩衝液（100mM NaCl、及び10mM MgSO₄含有）
(pH7.4)に混合し、温度37℃で２時間反応させて消化液
を得、該液を常法によりフェノール抽出及びエタノール
沈澱処理して、BamＨＩで消化されたプラスミドpBR322
ＤＮＡを得た。

ついで、このBamＨＩで消化されたプラスミドpBR322Ｄ
ＮＡ10μｇ、上記(1)で得られたSau３ＡＩで消化された
バチルス・エスピーNS-129株の染色体ＤＮＡ断片10μｇ
及び５ユニットのＴ４ＤＮＡリガーゼ〔ベーリンガー・
マンハイム(Boehriger Mannheim)社製〕を6.6mM MgC
l₂、10mMジチオスレイトール及び10mMＡＴＰを含有する
66mMトリス塩酸緩衝液(pH7.5)に添加し、温度16℃で16
時間反応し、ＤＮＡを連結させた。

ついで、ディー・エム・モーリソン(D.M.Morrison)の方
法〔メソヅ・イン・エンザイモロジー(Methods in Enzy
mology)、第68巻、第326〜331頁（1979年）〕で、塩化
カルシウム処理した大腸菌ＤＨＩ株（ＡＴＣＣ33849）
を、上記のように連結させたＤＮＡで形質転換し、アン
ピシリン耐性及びテトラサイクリン感受性の形質転換株
1000株を得た。

このようにして得られた形質転換株がＳＯＮ活性を有す
るか否かを以下のようにして試験した。

各菌株を、0.5％（Ｗ／Ｖ）ザルコシン（東京化成工業
社製）及び50μｇ／mlアンピシリンを含有するＴ−Ｙ培
地５mlに接種し、温度30℃で24時間培養して培養液を得
た。これを3500r.p.m.で10分間遠心分離処理して湿潤菌
体を得、該菌体を１％（Ｗ／Ｖ）ザルコシンを含有する
10mMリン酸緩衝液(pH7.0)１mlに懸濁し、これに、20μ
ｌトルエンを添加し、温度37℃で１時間反応させた液を
常法により3500r.p.m.で10分間遠心分離処理して反応液
を得、この反応液に１％（Ｗ／Ｖ）４−アミノ−３−ヒ
ドラジノ−５−メルカプト−1,2,4−トリアゾール、23
％（Ｗ／Ｖ）水酸化カリウム及び0.08％（Ｗ／Ｖ）メタ
過ヨウ素ナトリウムを夫々0.15mlずつ添加し、反応液が
紫色に変化したものがＳＯＮ活性を有する形質転換株で
あり、ＳＯＮ活性を有する形質転換株である大腸菌(E.c
oli)ＤＨＩ(pKLS 601)株を得た。

(3)組み換え体プラスミドpKLS601ＤＮＡの単離トリプトン１％（Ｗ／Ｖ）、酵母エキス0.5％（Ｗ／
Ｖ）、及びNaCl 0.5％（Ｗ／Ｖ）からなる培地１に、
該培地を用い温度37℃で16〜24時間前培養して得た大腸
菌(E.coli)ＤＨＩ(pKLS 601)の培養液20mlを接種し、温
度37℃で３時間振盪培養したのち、培養液にクロラムフ
ェニコール0.2ｇを添加し、更に同一温度で20時間培養
し、培養液を得た。

ついで、この培養液を、常法により10000r.p.m.で10分
間遠心分離処理して湿潤菌体を得、これを20mlの25％
（Ｗ／Ｖ）ショ糖を含有する50mMトリス塩酸緩衝液(pH
8.0)に懸濁したのち、更に、これに、リゾチーム10mg、
0.25MＥＤＴＡ溶液(pH8.0)8ml及び20％（Ｗ／Ｖ）ドデ
シル硫酸ナトリウム溶液８mlをそれぞれ添加し、温度60
℃で30分間保温して溶菌し、溶菌液を得た。

この溶菌液に、５M NaCl溶液13mlを添加し、温度４℃で
16時間処理したものを常法により15000r.p.m.で30分間
遠心分離して抽出液を得、常法によりフェノール抽出処
理したのち、常法によりエタノール沈澱処理し、沈澱物
を得た。

ついで、この沈澱物を通常の減圧乾燥処理したものを、
１mMＥＤＴＡを含有する10mMトリス塩酸緩衝液６ml(pH
7.5)に溶解し、更に、これに塩化セシウム６ｇ及び10mg
／mlエチジウムブロマイド0.2mlを添加したものを、常
法により39000r.p.m.で42時間超遠心分離機を用いて平
衡密度勾配遠心処理を行ない組み換え体プラスミドpKLS
601ＤＮＡを単離し、また、更に、ノルマルブタノール
を使用してエチジウムブロマイドを除去したのち、１mM
ＥＤＴＡを含有する10mMトリス塩酸緩衝液(pH7.5)に対
して透析を行ない純化された組み換え体プラスミドpKLS
601ＤＮＡ（大きさは、9.1Kbである）2700μｇを得た。

(4)新規な組み換え体pKLS612ＤＮＡの作製プラスミドpU
C18ＤＮＡ（ファルマシア社製）0.2μｇ並びに制限酵素
Hinc II（宝酒造社製）及びBamＨＩ（宝酒造社製）を夫
々10ユニットずつを10mMトリス塩酸緩衝液（50mM NaC
l、10mM MgSO₄及び１mMジチオスレイトール含有）(pH7.
4)に混合し、温度37℃で１時間反応させて消化液を得、
該液を常法によりフェノール抽出及びエタノール沈澱処
理して、Hinc II及びBamＨＩで消化されたプラスミドpU
C18ＤＮＡを得た。

次いで、上記(3)で得られた組み換え体pKLS601ＤＮＡ12
μｇ並びに、HpaＩ（宝酒造社製）12ユニット及びBgl I
I（宝酒造社製）30ユニットを10mMトリス塩酸緩衝液（5
0mM NaCl、10mM MgSO₄及び１mMジチオスレイトール含
有）(pH7.4)に混合し、温度37℃で５時間反応させて消
化液を得た。

該消化液を0.7％（Ｗ／Ｖ）アガロースゲル電気泳動し
たものより1.7KbのＤＮＡ断片を、アール・シー・エイ
・ヤング(R.C.A.Yang)等の方法〔メソズ・イン・エンザ
イモロジー(Methods in Enzymology)、第08巻、第176〜
182頁（1979年）〕により溶出して溶出物を得、常法に
よりフェノール抽出及びエタノール沈澱処理してＤＮＡ
断片1.3μｇを得た。

なお、該断片は、ＳＯＮをコードする遺伝子を含有する
ＤＮＡ断片である。

そして、上記ＤＮＡ断片を、Bgl II、Dra I、Pvu II、H
ind III、Hpa I〔いずれも宝酒造社製、制限酵素〕、As
u II（プロメガバイオテク社製、制限酵素）及びBst
E II（ニッポンジーン社製、制限酵素）を夫々用い単一
消化及び２重消化して得られたＤＮＡ断片をアガロース
ゲル電気泳動法により移動度パターンを分析し、得られ
た移動度パターンと、λＤＮＡを、前記Hind IIIにより
消化して得られたＤＮＡ断片の標準移動度パターンと対
比することにより得られた分子量は、1,700bp（ベース
ペアー）であり〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バ
イオロジー(Journal of Molecular Biology)第98巻、55
1〜564頁、1975年参照〕、上記ＤＮＡ断片の制限酵素に
よる切断地図は、第１図に示すとおりであった。

このようにして得たＤＮＡ断片0.15μｇ、Hinc II及びB
amＨＩで消化されたプラスミドpUC18ＤＮＡ0.2μｇ及び
Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（ベーリンガーマンハイム社製）１
ユニットを、66mMトリス塩酸緩衝液(6.6mM MgCl₂、10mM
ジチオスレイトール及び10mMＡＴＰ含有）(pH7.5)に混
和し、温度４℃で16時間反応させてＤＮＡを連結させ
た。

次いで、前述のディー・エム・モーリソン(D.M.Morriso
n)の方法により塩化カルシウム処理した大腸菌ＪＭ101
（ＡＴＣＣ33876)を、上記のように連結させたＤＮＡで
形質転換し、得られた形質転換株を50μｇ／mlアンピシ
リン、0.5mMイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド
及び0.004％（Ｗ／−）５−ブロモ−４−クロロ−３−
インドリル−β−Ｄ−ガラクトシドを、夫々含有するＴ
−Ｙ寒天平板培地を用いて温度37℃で24時間培養し、白
色のコロニーを形成するものがＳＯＮを生産する株であ
るので、白色のコロニーを形成する大腸菌ＪＭ101(pKLS
612)を得た。

このようにして得られたＳＯＮ生産能を有する形質転換
株である大腸菌(E.coli)ＪＭ101(pKLS612)は、工業技術
院微生物工業技術研究所に微工研条寄第１１４６号（FE
RM BP−１１４６）として寄託されている。

(5)組み換え体プラスミドpKLS612ＤＮＡの単離トリプトン１％（Ｗ／Ｖ）、酵母エキス0.5％（Ｗ／
Ｖ）、及びNaCl 0.5％（Ｗ／Ｖ）からなる培地１に、
該培地を用い温度37℃で16〜24時間前培養して得た大腸
菌(E.coli)ＪＭ101(pKLS612)の培養液20mlを接種し、温
度37℃で３時間振盪培養したのち、培養液にクロラムフ
ェニコール0.2ｇを添加し、更に同一温度で20時間培養
し、培養液を得た。

ついで、この培養液を、常法により10000r.p.m.で10分
間遠心分離処理して湿潤菌体を得、これを20mlの25％
（Ｗ／Ｖ）ショ糖を含有する50mMトリス塩酸緩衝液(pH
8.0)に懸濁したのち、更に、これに、リゾチーム10mg、
0.25MＥＤＴＡ溶液(pH8.0)８ml及び20％（Ｗ／Ｖ）ドデ
シル硫酸ナトリウム溶液８mlをそれぞれ添加し、温度60
℃で30分間保温して溶菌し、溶菌液を得た。

ついで、この沈澱物を通常の減圧乾燥処理したものを、
１mMＥＤＴＡを含有する10mMトリス塩酸緩衝液６ml(pH
7.5)に溶解し、更に、これに塩化セシウム６ｇ及び10mg
／mlエチジウムブロマイド0.2mlを添加したものを、常
法により39000r.p.m.で42時間超遠心分離機を用いて平
衡密度勾配遠心処理を行ない組み換え体プラスミドpKLS
612ＤＮＡを単離し、また、更に、ノルマルブタノール
を使用してエチジウムブロマイドを除去したのち、１mM
ＥＤＴＡを含有する10mMトリス塩酸緩衝液(pH7.5)に対
して透析を行ない純化された組み換え体プラスミドpKLS
612ＤＮＡ（大きさは、4.4Kbである。）2300μｇを得
た。

(6)大腸菌(E.coli)ＪＭ101(pKLS612)によるＳＯＮの生
産及び該酵素の分離、精製トリプトン１％（Ｗ／Ｖ）、酵母エキス0.5％（Ｗ／
Ｖ）、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド／mM、
及び食塩0.5％（Ｗ／Ｖ）からなる培地２を攪拌式小
型培養装置（いわしや社製）の培養槽に分注し、常法に
より高圧滅菌処理したものに、上記と同一組成の培地で
予め温度37℃で24時間振盪培養した大腸菌(E.coli)ＪＭ
101(pKLS612)の培養液20mlを接種し、温度37℃で８時間
通気攪拌培養する操作を５回繰り返して湿潤菌体35ｇを
得た。

この菌体を0.01Mリン酸緩衝液(pH8.0)100mlに懸濁し、
常法により超音波破壊処理したのち、15000r.p.m.で30
分間通常の遠心分離処理し、ＳＯＮの粗酵素液120ml(29
0ユニット／ml）を得た。

このようにして得た粗酵素液に硫酸ストレプトマイシン
を用いて除核酸処理を施したものを、温度50℃で１時間
加熱処理を行なったのち、不溶性物質を10000r.p.m.で1
0分間遠心分離処理して除去した。

0.01Mリン酸緩衝液で平衡化済みのＱＡＥ−セファデッ
クスＡ-50カラム（1.4×40cm）に吸着させたのち、0.27
塩化カリウムを含有する0.01Mリン酸緩衝液で洗浄した
のち、0.37M塩化カリウムを含有する0.01Mリン酸緩衝液
を用いて溶出し、ＳＯＮ含有溶出液を得た。

このＳＯＮ含有溶出液を、常法により濃縮したのち、凍
結乾燥することにより純化されたＳＯＮ粉末20,800単位
を得た。なお、収率は、60％であった。

【図面の簡単な説明】

第１図は、ＳＯＮをコードする遺伝子を含有するＤＮＡ
断片の制限酵素による切断地図を示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 15/53 Ｃ１２Ｒ 1:07）

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】バチルス・エスピーNS-129株由来の耐熱性
ザルコシン・オキシダーゼＮをコードする遺伝子を含有
するＤＮＡをベクターＤＮＡに挿入した組み換え体ＤＮ
Ａを含み、耐熱性ザルコシン・オキシダーゼＮ生産能を
有するエッシェリシア属に属する微生物を、培地に培養
し、培養物より耐熱性ザルコシン・オキシダーゼＮを採
取することを特徴とする耐熱性ザルコシン・オキシダー
ゼＮの製造法。
【請求項２】ベクターＤＮＡが、プラスミドpUC18ＤＮ
Ａである特許請求の範囲第１項記載の耐熱性ザルコシン
・オキシダーゼＮの製造法。