JPH0632610B2 - リパーゼの製造方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、酵母によるリパーゼの製造法に関する。

［従来技術］ 脂質分解酵素であるリパーゼについては、発見が古いわ
りには他の酵素に比較して研究の遅れが見られた。しか
し昨今洗剤、エステル合成試薬、医薬品、製紙用ピッチ
分解剤等各方面への工業的利用が広がりつつあり、その
有用性が再認識されはじめている。

微生物による工業的なリパーゼの生産は、ペニシリウム
(Penicillium)属、アスペルギリス(Aspergillus)属、リ
ゾプス(Rhizopus)属その他の糸状菌類、或いはシュード
モナス(Pseudomonas)属等の細菌類などが知られてい
る。しかし酵母によるリパーゼの生産は、キャンディダ
(Candida)属やその他わずかの菌株しか知られていな
い。

［発明が解決しようとする課題］ 糸状菌によるリパーゼの生産は菌の性質からして培養期
間が長く、生産性の面で不利な点が多い。また液体培養
などにおいても菌糸の伸長によるトラブルが発生し易
い。一方、細菌による生産は菌体の分離に多大のエネル
ギーが必要となる。また生産されるリパーゼの活性範囲
は主として中性〜アルカリ性であり、酸性側では極めて
不安定である。酵母によるリパーゼの工業的生産は、こ
れらの欠点を補うものと考えられる。

しかしながら、酵母については、リパーゼの生産能は、
キャンディダ・シリンドラセア(Candida cylindrace
a)、或はキャンディダ・リフォリチカ(Candida lipholy
tica)など数種の菌株が知られているにすぎない。

従って、本発明は、キャンディダ以外の酵母菌株による
リパーゼの製造法、つまり、従来リパーゼ生産能を有す
ることが知られていない酵母菌株によるリパーゼの製造
法を提供するものである。

［課題を解決する為の手段］ 本発明者らは、キャンディダ属以外の酵母菌によるリパ
ーゼ生産菌株を取得する目的で、自然界を対象に広範囲
なスクリーニングを行った。その結果、野性鳥獣糞から
分離したハンゼヌラ属に属する菌株が高活性のリパーゼ
を生産することを見出した。

この菌株の菌学的性質は、次の通りである。

５％麦芽エキス寒天培地での生育（２５℃、３０日
間）； 細胞は球状及びやや伸長状である。大きさは１．９〜
４．１×２．１〜６．１μｍである。単細胞となるが時
として小さなかたまりをつくってぶどう状となる。生育
はブチロウス(butyrous)であり、わずかに黄褐色を呈す
る。

ダルマウ平板での生育（２５℃、７日間）； カバーグラス下での生育は旺盛であり、偽菌糸を分岐す
る。好気的に生育し、色は白からやや黄褐色を帯びた白
であり、一般的にはブチロウスである。菌体は平滑かつ
輝光を有する。コロニーは全縁状である。常にわずかな
がら香り成分を生産する。

胞子形成； ヘテロタリックな有性生殖をおこなうが、胞子嚢になる
二倍体を形成する。二倍体細胞は直接子嚢となり１〜４
個の帽子型の胞子を形成する。胞子は５％麦芽エキス寒
天培地及びＶ８寒天培地で観察される。

糖類の醗酵； グルコース ＋ ガラクトース ± シュークロース ＋ マルトース ± ラクトース − ラフィノース ± 炭素化合物の資化性； ガラクトース ± シュークロース ＋ マルトース ＋ セロビオース ＋ トレハロース ＋ ラクトース ＋ ラフィノース ＋ 可溶性でんぷん ＋ Ｄ−キシロース ＋ Ｌ−アラビノース ± Ｄ−リボース ± Ｌ−ラムノース − エリスロトール ＋ リビトール ± Ｄ−マンニトール ＋ コハク酸 ＋ クエン酸 ＋ イノシトール − Ｌ−ソルボース − メリビオース − メレジトース ＋ イヌリン − Ｄ−アラビノース − α−メチル−Ｄ−グルコサイド ＋ サリシン ＋ ＤＬ−乳酸 ＋ 硝酸塩の資化性；＋ ビタミン無添加培地での生育；＋ 酵母ナイトロジェン基本培地＋１０％Ｎａｃｌ＋５％
グルコースでの生育；± ３７℃での生育；± 上記の菌学的性質は、The yeasts;N.J.W.Kreger-van Ri
ji Groningen著，第３版(1984)記載のハンゼヌラ・アノ
マラ(Hansenula anomala)の諸性質と一致したのでそれ
と同定した。

また、本発明者らが分離に成功した菌株であるハンゼヌ
ラ・アノマラは、工業技術院微生物工業技術研究所に微
工研菌寄第１１５１９号（ＦＥＲＭ Ｐ−１１５１９）
として寄託されている。

本発明で使用されるハンゼヌラ菌株は、好気的及び通性
好気的条件下で当該技術分野で公知の成分からなる培
地、資化性炭素源及び窒素源と他の微量栄養源とをいっ
しょに含む培地で培養できる。望ましい炭素源は炭水化
物、脂質及び他のエステル類である。また窒素源は硝酸
塩、硫酸塩、アンモニウム塩などの無機物あるいは酵母
エキス、コーンスチープリカー、大豆粉その他の有機物
が望ましい。培地のｐＨは３〜９、好ましくは５〜８で
ある。培養温度は１０〜４０℃、望ましくは２０〜３５
℃である。培養後遠心分離あるいはフィルタープレスな
どによって菌体を除去し、培養ろ液を得、リパーゼ粗酵
素液とすることができる。またエバポレーション、逆浸
透膜などにより濃縮粗酵素液とすることもできる。これ
らのリパーゼ粗酵素液は、硫安分画、透析、カラムクロ
マトグラフィー、高速液体クロマトグラフィーなどによ
る精製、あるいはアセトン、エタノールなどの水可溶性
溶媒などを用いて適宜精製することができる。

［実施例］ 以下実施例をもって本発明を詳細に説明する。なおこれ
によって本発明が限定されるものではない。

（実施例１） グルコース２％、ソイビーンミル２％、オリーブ油２
％、(NH₄)₂SO₄０．１％、K₂HPO₄０．５％、MgSO₄・７H₂
０．１％、CaCO₃０．５％を含む液体培地をｐＨ５０に
調整後、Ｌ字型試験管に７ｍ１分注し、オートクレーブ
で殺菌した。あらかじめ同一培地で３０℃、２４時間、
Ｌ字型試験管で振盪培養したハンゼヌラ・アノマラの菌
体液０．７ｍｌを上記培地に接種した。これを３０℃で
４日間振盪培養し、遠心分離により菌体を分離し、ろ液
を取得した。このろ液１ｍｌを粗酵素液として、オリー
ブ油を基質としたＰＶＡエマルジョン法でリパーゼ活性
を測定した。得られた粗酵素液のリパーゼ活性は１ｍｌ
当り１０Ｕであった。

（実施例２） カゼイン製ペプトン１．７％、大豆製ペプトン０．３
％、K₂HPO₄０．２５％、グルコース０．２５％、Nacl
０．５％を含む培地をｐＨ５．５とし、５００ｍｌ容坂
口コルベンに１００ｍｌ分注し、オートクレーブで殺菌
した。あらかじめ同一培地で３０℃、２４時間、Ｌ字型
試験管で振盪培養したAN2293-Jの前培養菌体液１０ｍｌ
をコルベンに接種した。これを３０℃で３日間振盪培養
し、遠心分離により菌体を分離し、ろ液を取得した。ろ
液１ｍｌを粗酵素液として実施例１と同様にリパーゼ活
性を測定した。粗酵素液のリパーゼ活性は１２Ｕ／ｍｌ
であった。

［発明の効果］ 本発明は、ハンゼヌラ属の酵母菌、特にハンゼヌラ・ア
ノマラによって、リパーゼが生産できることを初めて明
らかにしたものであって、キャンディダ属以外の酵母菌
によるリパーゼの工業的生産の可能性が証明されたこと
は、リパーゼの生産、利用に大きく貢献するものであ
る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 秦 邦男 東京都北区王子５丁目21番１号 十條製紙 株式会社中央研究所内 (72)発明者 今野 宏 秋田県仙北郡西仙北町字刈和野248

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】ハンゼヌラ(Hansenula)属に属し、リパー
   ゼ生産能を有する酵母を栄養培地で培養し、該培養物か
   らリパーゼを採取することを特徴とするリパーゼの製造
   法。
2. 【請求項２】酵母がハンゼヌラ・アノマラ(Hansenula a
   nomala)であることを特徴とする請求項１記載のリパー
   ゼの製造法。