JPH0632619B2 - 固定化菌体の製法 - Google Patents
固定化菌体の製法Info
- Publication number
- JPH0632619B2 JPH0632619B2 JP17852386A JP17852386A JPH0632619B2 JP H0632619 B2 JPH0632619 B2 JP H0632619B2 JP 17852386 A JP17852386 A JP 17852386A JP 17852386 A JP17852386 A JP 17852386A JP H0632619 B2 JPH0632619 B2 JP H0632619B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cells
- amino
- reaction
- immobilized cells
- aldehyde
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
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- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は固定化菌体の製法に関する。
該固定化菌体は酵素反応により種々の物質（例えば、ア
ミノ酸等）を製造するのに有用である。
ミノ酸等）を製造するのに有用である。
従来の技術 従来、酵素又は微生物菌体をポリー（２−メタクリロキ
シエチルトリアルキルアンモニウム）型のカチオン性合
成高分子凝集剤の水溶液中で凝集させたのち、グルタル
アルデヒドと反応させることにより、酵素又は微生物菌
体の固定化を行う方法（特開昭５８−６０９８７号公
報）、酵素を含む微生物細胞をカゼイン、血清アルブミ
ンなどの結合剤、ポリカチオン及びポリアニオン系凝集
剤並びにグルタルアルデヒドで処理する固定化酵素の製
法（特開昭５９−１５９７８１号公報）などが知られて
いる。
シエチルトリアルキルアンモニウム）型のカチオン性合
成高分子凝集剤の水溶液中で凝集させたのち、グルタル
アルデヒドと反応させることにより、酵素又は微生物菌
体の固定化を行う方法（特開昭５８−６０９８７号公
報）、酵素を含む微生物細胞をカゼイン、血清アルブミ
ンなどの結合剤、ポリカチオン及びポリアニオン系凝集
剤並びにグルタルアルデヒドで処理する固定化酵素の製
法（特開昭５９−１５９７８１号公報）などが知られて
いる。
発明が解決しようとする問題点 長期間繰り返して使用できる固定化菌体の開発が求めら
れている。
れている。
問題点を解決するための手段 本発明方法によると、菌体を一般式（Ｉ） （式中、Ｘはアミノ基又はアミノ基を一個有する炭素数
１〜４の飽和炭化水素基を表し、Ｙは水素原子又は低級
アルキル基を表し、ｎは１００〜５０００の整数を表
す）で表されるポリアミンとジアルデヒドとで処理する
ことにより、長期間操り返し使用に耐える固定化菌体を
得ることができる。
１〜４の飽和炭化水素基を表し、Ｙは水素原子又は低級
アルキル基を表し、ｎは１００〜５０００の整数を表
す）で表されるポリアミンとジアルデヒドとで処理する
ことにより、長期間操り返し使用に耐える固定化菌体を
得ることができる。
一般式（Ｉ）において、アミノ基を一個有する炭素数１
〜４の飽和炭化水素基としては、例えばアミノメチル、
２−アミノエチル、１−アミノエチル、３−アミノプロ
ピル、２−アミノプロピル、１−アミノプロピル、２−
アミノ−１−メチルエチル、１−アミノ−１−メチルエ
チル、４−アミノブチル、３−アミノブチル、２−アミ
ノブチル、１−アミノブチル、３−アミノ−２−メチル
プロピル、２−アミノ−２−メチルプロピル、１−アミ
ノ−２−メチルプロピル、３−アミノ−１−メチルプロ
ピル、２−アミノ−１−メチルプロピル、１−アミノ−
１−メチルプロピル、１−（アミノメチル）プロピル、
１−アミノ−1,1−ジメチルエチル等があげられる。
〜４の飽和炭化水素基としては、例えばアミノメチル、
２−アミノエチル、１−アミノエチル、３−アミノプロ
ピル、２−アミノプロピル、１−アミノプロピル、２−
アミノ−１−メチルエチル、１−アミノ−１−メチルエ
チル、４−アミノブチル、３−アミノブチル、２−アミ
ノブチル、１−アミノブチル、３−アミノ−２−メチル
プロピル、２−アミノ−２−メチルプロピル、１−アミ
ノ−２−メチルプロピル、３−アミノ−１−メチルプロ
ピル、２−アミノ−１−メチルプロピル、１−アミノ−
１−メチルプロピル、１−（アミノメチル）プロピル、
１−アミノ−1,1−ジメチルエチル等があげられる。
低級アルキル基としては、炭素数１〜４のもので例え
ば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチ
ル、イソブチル、第二ブチル、第三ブチル等があげられ
る。
ば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチ
ル、イソブチル、第二ブチル、第三ブチル等があげられ
る。
一般式（Ｉ）で表される化合物の具体例としては、ポリ
アリルアミン、ポリビニルアミン、ポリ（４−アミノ−
１−ブテン）、ポリ（３−アミノ−１−ブテン）、ポリ
（１−アミノ−２−ブテン）、ポリ（５−アミノ−１−
ペンテン）、ポリ（４−アミノ−１−ペンテン）、ポリ
（３−アミノ−１−ペンテン）、ポリ（５−アミノ−２
−ペンテン）、ポリ（４−アミノ−２−ペンテン）、ポ
リ（１−アミノ−３−ペンテン）等があげられる。
アリルアミン、ポリビニルアミン、ポリ（４−アミノ−
１−ブテン）、ポリ（３−アミノ−１−ブテン）、ポリ
（１−アミノ−２−ブテン）、ポリ（５−アミノ−１−
ペンテン）、ポリ（４−アミノ−１−ペンテン）、ポリ
（３−アミノ−１−ペンテン）、ポリ（５−アミノ−２
−ペンテン）、ポリ（４−アミノ−２−ペンテン）、ポ
リ（１−アミノ−３−ペンテン）等があげられる。
ジアルデヒドとしては、炭素数１０以下の脂肪族又は芳
香族アルデヒドが用いられ、具体的には、グリオキサー
ル、マロンアルデヒド、スクシンアルデヒド、グルタル
アルデヒド、アジピンアルデヒド、ピメリンアルデヒ
ド、スベリンアルデヒド、アゼラインアルデヒド、セバ
シンアルデヒド、マレインアルデヒド、フマルアルデヒ
ド、フタルアルデヒド、イソフタルアルデヒド、テレフ
タルアルデヒド等が用いられる。
香族アルデヒドが用いられ、具体的には、グリオキサー
ル、マロンアルデヒド、スクシンアルデヒド、グルタル
アルデヒド、アジピンアルデヒド、ピメリンアルデヒ
ド、スベリンアルデヒド、アゼラインアルデヒド、セバ
シンアルデヒド、マレインアルデヒド、フマルアルデヒ
ド、フタルアルデヒド、イソフタルアルデヒド、テレフ
タルアルデヒド等が用いられる。
本発明に用いられる菌体としては、細菌、放線菌、糸状
菌、酵母、カビ、藻類等の菌体があげられる。
菌、酵母、カビ、藻類等の菌体があげられる。
具体的には、サルモネラ属、シトロバクター属、エシェ
リヒア属等に属する微生物の菌体があげられる。該微生
物の代表例としては、サルモネラ・チフィムリウム(Sal
monella typhimurium)ATCC 19585、シトロバクター・フ
ロインディ(Citrobacter freundi)ATCC 6750、エシェリ
ヒア・コリ(Escherichia coli)ATCC 11303等が用いられ
る。
リヒア属等に属する微生物の菌体があげられる。該微生
物の代表例としては、サルモネラ・チフィムリウム(Sal
monella typhimurium)ATCC 19585、シトロバクター・フ
ロインディ(Citrobacter freundi)ATCC 6750、エシェリ
ヒア・コリ(Escherichia coli)ATCC 11303等が用いられ
る。
本発明において、微生物菌体をポリアミンとジアルデヒ
ドとで処理するには、微生物の培養液にポリアミンとジ
アルデヒドとを添加するか、培養液から微生物菌体を分
離した後、該菌体をポリアミンとジアルデヒドとを含む
溶液に懸濁してもよい。使用するポリアミンとジアルデ
ヒドとの重量は共に微生物菌体の乾燥重量の１／１００
〜５倍、好ましくは１／１０〜１／２倍の範囲である。
ドとで処理するには、微生物の培養液にポリアミンとジ
アルデヒドとを添加するか、培養液から微生物菌体を分
離した後、該菌体をポリアミンとジアルデヒドとを含む
溶液に懸濁してもよい。使用するポリアミンとジアルデ
ヒドとの重量は共に微生物菌体の乾燥重量の１／１００
〜５倍、好ましくは１／１０〜１／２倍の範囲である。
微生物菌体を処理する液中のポリアミン及びジアルデヒ
ドの濃度は共に0.1〜５％好ましくは１〜３％の範囲で
ある。
ドの濃度は共に0.1〜５％好ましくは１〜３％の範囲で
ある。
処理は温度１〜４０℃、好ましくは４〜２５℃、0.5〜
３時間、好ましくは１〜２時間、ｐＨ５〜８、好ましく
は６〜７で行う。
３時間、好ましくは１〜２時間、ｐＨ５〜８、好ましく
は６〜７で行う。
ｐＨ調整剤としては、酢酸、リン酸、クエン酸等の緩衝
液、硫酸、塩酸、リン酸等の酸、苛性ソーダ、苛性カ
リ、アンモニア等のアルカリが用いられる。
液、硫酸、塩酸、リン酸等の酸、苛性ソーダ、苛性カ
リ、アンモニア等のアルカリが用いられる。
処理液から固定化微生物菌体を分離する方法としては、
該処理液を１０００〜５０００Ｇ、好ましくは２０００
〜４０００Ｇ（Ｇは重力加速度）で５〜３０分間、好ま
しくは１０〜２０分間遠心分離するか、又は１〜１００
μｍ、好ましくは５〜５０μｍの粒子径を有する過材
（紙、布、メンブランフィルター等）で過する方
法が用いられる。
該処理液を１０００〜５０００Ｇ、好ましくは２０００
〜４０００Ｇ（Ｇは重力加速度）で５〜３０分間、好ま
しくは１０〜２０分間遠心分離するか、又は１〜１００
μｍ、好ましくは５〜５０μｍの粒子径を有する過材
（紙、布、メンブランフィルター等）で過する方
法が用いられる。
以下に実施例を示す。
実施例１ グルコース５％、コーンスチープリカー２％、硫酸アン
モニウム１％、リン酸一カリウム0.05％、リン酸二カリ
ウム0.05％、硫酸マグネシウム・７水和物0.025％から
なる培地（ｐＨ7.0）にサルモネラ・チフィムリウムATC
C 19585を植菌し、２８℃で１７時間培養した。得られ
た湿菌体5.0ｇ（乾燥重量1.2ｇ）をＰＡＡ−ＨＣｌ−１
０Ｓ（重合度５３０〜８９０のポリアリルアミン塩酸
塩：日東紡績（株）製）２％を含む0.2Ｍ酢酸緩衝液
（ｐＨ７）２０mlに懸濁した。ついで、２５℃で攪拌し
ながら、この懸濁液に２５％グルタルアルデヒド水溶液
1.6mlを加えた後、ｐＨ6.5±0.5で１時間攪拌した。
モニウム１％、リン酸一カリウム0.05％、リン酸二カリ
ウム0.05％、硫酸マグネシウム・７水和物0.025％から
なる培地（ｐＨ7.0）にサルモネラ・チフィムリウムATC
C 19585を植菌し、２８℃で１７時間培養した。得られ
た湿菌体5.0ｇ（乾燥重量1.2ｇ）をＰＡＡ−ＨＣｌ−１
０Ｓ（重合度５３０〜８９０のポリアリルアミン塩酸
塩：日東紡績（株）製）２％を含む0.2Ｍ酢酸緩衝液
（ｐＨ７）２０mlに懸濁した。ついで、２５℃で攪拌し
ながら、この懸濁液に２５％グルタルアルデヒド水溶液
1.6mlを加えた後、ｐＨ6.5±0.5で１時間攪拌した。
次に、該懸濁液を２０００Ｇで１０分間遠心分離した。
得られた沈殿物を生理食塩水３０mlで２回洗浄すること
により微生物菌体を得た。該微生物菌体をフェニルピル
ビン酸ナトリウム0.28Ｍ、アスパラギン酸ナトリウム0.
42Ｍ及びリン酸ピリドキサール0.01ｍＭからなる基質液
１０ml（ｐＨ７）に懸濁させ、３５℃で２４時間反応さ
せ、フェニルアラニン0.41ｇを得た。
得られた沈殿物を生理食塩水３０mlで２回洗浄すること
により微生物菌体を得た。該微生物菌体をフェニルピル
ビン酸ナトリウム0.28Ｍ、アスパラギン酸ナトリウム0.
42Ｍ及びリン酸ピリドキサール0.01ｍＭからなる基質液
１０ml（ｐＨ７）に懸濁させ、３５℃で２４時間反応さ
せ、フェニルアラニン0.41ｇを得た。
反応後、該菌体を２０００Ｇで１０分間遠心分離し、こ
れを上記と同じ組成の基質液に懸濁させ２回目の反応を
行った。この様にして繰り返し反応を行ったところ、反
応１０回目及び１５回目におけるフェニルアラニンの生
成量はそれぞれ0.41ｇ及び0.39ｇであった。
れを上記と同じ組成の基質液に懸濁させ２回目の反応を
行った。この様にして繰り返し反応を行ったところ、反
応１０回目及び１５回目におけるフェニルアラニンの生
成量はそれぞれ0.41ｇ及び0.39ｇであった。
実施例２ 実施例１において、サルモネラ・チフィムリウムＡＴＣ
Ｃ１９５８５の代わりにシトロバクター・フロインディ
ＡＴＣＣ６７５０を用い、実施例１と同様に培養した。
得られた湿菌体１０ｇ（乾燥重量2.4ｇ）をＰＡＡ−Ｈ
Ｃｌ−１０Ｓの１％水溶液（苛性ソーダでｐＨ7.0に調
節したもの）４０mlに懸濁させ、これに２５％グルタル
アルデヒド水溶液1.6mlを２５℃で攪拌しながら３０分
間滴下した。この間、希アンモニア水で液のｐＨを6.5
〜7.0に調節した。その後、２５℃でさらに３０分間攪
拌を続けてから菌体を４０００Ｇで５分間遠心分離し
た。得られた沈殿物を生理食塩水４０mlで３回洗浄する
ことにより、固定化菌体を得た。該微生物菌体をフェニ
ルピリビン酸ナトリウム0.2Ｍ、フマル酸二アンモニウ
ム0.3Ｍ、リン酸ピリドキサール0.01ｍＭ及び塩化マグ
ネシウム・６水和物0.005％からなる基質液（ｐＨ７）
２０mlに懸濁させ、３０℃で２４時間反応させフェニル
アラニン0.30ｇを得た。反応後、固定化菌体は沈殿して
いたので反応液の上清を抜き取った。反応器に残った菌
体に新しい基質液を加えて懸濁させて２回目の反応を行
った。この様にして繰り返し反応を行ったところ、反応
３０回目におけるフェニルアラニンの生成量は１回目と
同じく0.30ｇであった。
Ｃ１９５８５の代わりにシトロバクター・フロインディ
ＡＴＣＣ６７５０を用い、実施例１と同様に培養した。
得られた湿菌体１０ｇ（乾燥重量2.4ｇ）をＰＡＡ−Ｈ
Ｃｌ−１０Ｓの１％水溶液（苛性ソーダでｐＨ7.0に調
節したもの）４０mlに懸濁させ、これに２５％グルタル
アルデヒド水溶液1.6mlを２５℃で攪拌しながら３０分
間滴下した。この間、希アンモニア水で液のｐＨを6.5
〜7.0に調節した。その後、２５℃でさらに３０分間攪
拌を続けてから菌体を４０００Ｇで５分間遠心分離し
た。得られた沈殿物を生理食塩水４０mlで３回洗浄する
ことにより、固定化菌体を得た。該微生物菌体をフェニ
ルピリビン酸ナトリウム0.2Ｍ、フマル酸二アンモニウ
ム0.3Ｍ、リン酸ピリドキサール0.01ｍＭ及び塩化マグ
ネシウム・６水和物0.005％からなる基質液（ｐＨ７）
２０mlに懸濁させ、３０℃で２４時間反応させフェニル
アラニン0.30ｇを得た。反応後、固定化菌体は沈殿して
いたので反応液の上清を抜き取った。反応器に残った菌
体に新しい基質液を加えて懸濁させて２回目の反応を行
った。この様にして繰り返し反応を行ったところ、反応
３０回目におけるフェニルアラニンの生成量は１回目と
同じく0.30ｇであった。
実施例３ 種菌としてエシェリヒア・コリATCC11303を用い、実施
例１と同組成の培地で培養して得られた湿菌体１０ｇ
（乾燥重量2.4ｇ）に実施例２と同様な操作を行って、
固定化菌体を得た。該菌体をフマル酸二アンモニウム0.
4Ｍ及び塩化マグネシウム・６水和物0.005％からなる基
質液（ｐＨ７）２００mlに懸濁させ、３０℃で２４時間
反応させることによりアスパラギン酸10.1ｇを得た。反
応後、固定化菌体は沈降していたので反応液の上清を抜
き取った。反応器に残った固定化菌体に上記組成の新し
い基質液を加えて懸濁させて２回目の反応を行った。こ
の様にして繰り返し反応を行ったところ、反応１０回目
におけるアスパラギン酸生成量は反応１回目と同じく1
0.1ｇであった。
例１と同組成の培地で培養して得られた湿菌体１０ｇ
（乾燥重量2.4ｇ）に実施例２と同様な操作を行って、
固定化菌体を得た。該菌体をフマル酸二アンモニウム0.
4Ｍ及び塩化マグネシウム・６水和物0.005％からなる基
質液（ｐＨ７）２００mlに懸濁させ、３０℃で２４時間
反応させることによりアスパラギン酸10.1ｇを得た。反
応後、固定化菌体は沈降していたので反応液の上清を抜
き取った。反応器に残った固定化菌体に上記組成の新し
い基質液を加えて懸濁させて２回目の反応を行った。こ
の様にして繰り返し反応を行ったところ、反応１０回目
におけるアスパラギン酸生成量は反応１回目と同じく1
0.1ｇであった。
発明の効果 本発明方法により、長期間繰り返し使用できる固定化菌
体を得ることができる。
体を得ることができる。
Claims (1)
- 【請求項１】菌体を一般式（Ｉ） （式中、Ｘはアミノ基又はアミノ基を１個有する炭素数
１〜４の飽和炭化水素基を表し、Ｙは水素原子又は低級
アルキル基を表し、ｎは１００〜５０００の整数を表
す）で表されるポリアミンとジアルデヒドとで処理する
ことを特徴とする固定化菌体の製法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP17852386A JPH0632619B2 (ja) | 1986-07-29 | 1986-07-29 | 固定化菌体の製法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP17852386A JPH0632619B2 (ja) | 1986-07-29 | 1986-07-29 | 固定化菌体の製法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6336785A JPS6336785A (ja) | 1988-02-17 |
| JPH0632619B2 true JPH0632619B2 (ja) | 1994-05-02 |
Family
ID=16049959
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP17852386A Expired - Lifetime JPH0632619B2 (ja) | 1986-07-29 | 1986-07-29 | 固定化菌体の製法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0632619B2 (ja) |
-
1986
- 1986-07-29 JP JP17852386A patent/JPH0632619B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS6336785A (ja) | 1988-02-17 |
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