JPH0634745B2 - Ｎ−保護ペプチドの酵素的合成法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、Ｎ−保護ペプチドの酵素的合成法に関し、更
に詳しくは少なくとも１つのカルボキシル基をもつＮ−
保護ペプチドの酵素的合成法に関する。

近年、ペプチド合成において、酵素を用いる方法がセラ
ミ化を起こさないという理由から注目を集め、種々のペ
プチド合成への利用が試みられている。ところで、この
方法では酵素として蛋白分解酵素を用いる為、通例、一
旦生成したペプチドの加水分解反応を伴う。因みに、こ
の蛋白分解酵素を用いる反応は、周知の如く、平衡反応
である。

従って、ペプチド結合生成反応を効率よく進める為には
加水分解反応を抑制するのが重要なポイントであり、現
状では、生成物を沈殿させて反応系外に除き加水分解反
応を妨げる方法や、水と混和しない有機溶媒を水に添加
した２相系反応媒体中で反応を行ない、生成物を有機溶
媒層側に抽出して反応系外に除く方法が主として用いら
れている。しかし、これらの方法では、生成物にカルボ
キシル基を持つものなどでは、通常の酵素反応の条件の
下では水に対する溶解度が高い為、沈殿もせず、有機溶
媒層にも抽出されず、反応は効率よく進行しない。特
に、基質のアミノ基の保護基として親水性の高いホルミ
ル基（以下、Forと略記する。）やアセチル基（以下Ac
と略記する。）を用いた場合は特に顕著である。ところ
で蛋白分解酵素にはエンド型とエキソ型があるが、エキ
ソ型の酵素であるカルボキシペプチダーゼを用いた場合
には、アミノ基側の基質としてアミノ酸を使用するの
で、生成物のペプチドのカルボキシル末端は遊離のカル
ボキシル基となり、正に上記の例にあてはまる。

そこで本発明者らは、Ｎ−保護したアミノ酸あるいはそ
の誘導体とアミノ酸あるいはその誘導体を蛋白分解酵素
を用いて反応させ、少なくとも１つのカルボキシル基を
有するＮ−保護ペプチドを効率よく合成する方法につき
鋭意検討した結果、驚くべきことに、本酵素反応を有機
溶媒と水との２相系反応媒体中で４級アンモニウム塩あ
るいは４級ホスホニウム塩の存在下に行なうことによ
り、本来有機溶媒層には移行しない生成物を親油性の４
級アンモニウム塩あるいは４級ホスホニウム塩として、
有機溶媒層に移行させ、ペプチド生成反応を効率よく進
行させ得る事を見出し、本発明を完成させるに至った。

本発明方法は、近年、優れた甘味剤として注目されてい
るアスパルテーム（α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニ
ルアラニンメチルエステル）の重要な製造中間体である
Ｎ−保護−α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニ
ン（以下、Ｎ−保護−α−APと略記する。）の合成に適
用すれば特に効力を発揮する。即ち、Ｎ−保護−α−AP
は容易にアスパルテームに変換される（特公昭６０−5
0,200）が、Ｎ−保護−α−APの製法としては唯一、Ｎ
−保護−Ｌ−アスパラギン酸無水物とＬ−フェニルアラ
ニンを酢酸中で反応させる方法がしられている（特公昭
５５−26,133）が、この方法ではＮ−保護−β−Ｌ−ア
スパルチル−Ｌ−フェニルアラニンが副生することや、
腐食性の高い酢酸を使用することなど、優れた方法とは
言いがたい。本発明方法を適用すれば、上記欠点を克服
し、Ｎ−保護−α−APのみを効率よく合成することがで
きる。

実施例に示すように、本発明方法を用いると、水中にお
ける酵素反応に比し、生成するＮ−保護ペプチドの収率
が大幅に向上する。例えば、保護基がアセチル基の場
合、水溶液中の反応では、Ｎ−アセチル−α−Ｌ−アス
パルチル−Ｌ−フェニルアラニン（以下、Ac−α−APと
略記する。）の収率は5.2％（比較例２）であるが、本
発明方法をもちいるとAc−α−APの収率は２０％（実施
例７）に向上する。又、保護基がベンジルオキシカルボ
ニル基の場合も、水溶液中の反応ではＮ−ベンジルオキ
シカルボニル−α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルア
ラニンの収率は2.4％（比較例６）であるが、本発明方
法を用いると８％（実施例１５）に向上した。

本発明方法によると、第１に２相系反応媒体を用いてＮ
−保護ペプチド合成反応を行ない、生成したＮ−保護ペ
プチドを親油性の４級アンモニウム塩あるいは４級ホス
ホニウム塩として有機溶媒層に移行させることによりペ
プチド生成反応を効率よく進行させ得るが、また、第２
にＮ−保護アミノ酸あるいはその誘導体とアミノ酸ある
いはその誘導体とを水中で蛋白分解酵素を用いて反応さ
せた後、有機溶媒と４級アンモニウム塩あるいは４級ホ
スホニウム塩を添加し、生成したＮ−保護ペプチドと原
料のＮ−保護アミノ酸あるいはその誘導体とアミノ酸あ
るいはその誘導体の有機溶媒／水の分配係数の差を利用
して生成したＮ−保護ペプチドを有機溶媒層に抽出する
ことも出来る。

有機溶媒層と水層とを分離した後、第１の方法により、
水層に再度、４級アンモニウム塩あるいは４級ホスホニ
ウム塩を含む有機溶媒を加えて２層系反応媒体中でペプ
チド生成反応を行ない、これを繰返して行なえば、ペプ
チド生成反応を効率よく進行させることが出来るのはい
うまでもない。もちろん、第２の方法によってペプチド
生成反応を繰返し行なってもよい。

本発明方法において用いられるＮ−保護−Ｌ−アスパラ
ギン酸およびその誘導体のＮ−保護基としては、通常の
ペプチド合成において使用される保護基、例えば、ホル
ミル基、アセチル基、ベンジルオキシカルボニル基、ｔ
−ブチルオキシカルボニル基、フェノキシアセチル基、
１−メチル−２−アセチルビニル基及びアセトアセチル
基が用いられる他、アミノ酸残基も用いられるが、中で
もホルミル基、アセチル基、ベンジルオキシカルボニル
基が好適にもちいられる。アミノ酸残基がＮ−保護基と
なっているＮ−保護アミノ酸としては、例えば、Ｎ−ホ
ルミル−Ｌ−アラニル−Ｌ−アスパラギン酸がある。ま
た、Ｎ−保護アミノ酸誘導体としては、例えば、Ｎ−ホ
ルミル−Ｌ−アスパラギン酸−α−メチルエステルがあ
る。

Ｎ−保護−Ｌ−アスパラギン酸またはその誘導体と反応
させるアミノ酸はＬ−フェニルアラニン又はその誘導体
であり、例えば、Ｌ−フェニルアラニンメチルエステル
がある。

なお、Ｎ−保護アミノ酸またはその誘導体とそれに反応
させるアミノ酸またはその誘導体との組合せは、生成す
るＮ−保護ペプチドまたはその誘導体が少くとも１つの
遊離のカルボキシル基をもつものでなければならない。
これは、前述のように、生成したＮ−保護ペプチドまた
はその誘導体を有機溶媒に溶解している４級アンモニウ
ム塩または４級ホスホニウム塩のカチオン部分と結合さ
せて新たにＮ−保護ペプチドまたはその誘導体の親油性
の４級アンモニウム塩または４級ホスホニウム塩とする
ためである。

又、有機溶媒としては、４級アンモニウム塩または４級
ホスホニウム塩を溶解し得てかつ水と均一に混和しない
もので出発物質及び目的生成物に特に活性なものでなけ
れば、いかなる溶媒も使用することが出来る。トルエ
ン、キシレン、ヘキサンのごとき炭化水素類、酢酸エチ
ル、酢酸ブチルのごときエステル類、クロロホルム、四
塩化炭素、エチレンジクロライドのごときハロゲン化炭
化水素類、ブタノール、アミルアルコールのごときアル
コール類、メチルエチルケトンのごときケトン類、ジエ
チルエーテル、ジイソプロピルエーテルのごときエーテ
ル類などが代表的なものであり、これらのうちの任意の
２種類以上からなる混合溶媒を使用することも出来る。

本発明の方法においてもちいられる酵素としては蛋白分
解酵素であれば特に制限はない。又、酵素反応を行なう
際の反応液のpHは使用する酵素の種類により異なり、例
えば、プロテアーゼＭ（天野製薬社製）及びオリエンタ
ーゼ５Ａ（オリエンタル酵母社製）の場合は３〜７で、
サモアーゼ（大和化成社製）の場合は６〜８である。本
発明の酵素反応は温度１０〜９０℃、酵素活性を維持す
る観点からは２０〜５０℃で行なうとよい。

本発明の方法において、両出発物質の使用濃度には特に
制限はないが、ペプチド生成反応をより効率よく進行さ
せるためには、高い方が望ましい。ペプチド生成反応を
進行させるという観点からは、出発物質の濃度が重要で
あって、両者の使用比率には特に制限はない。

本発明方法において用いられる４級アンモニウム塩ある
いはホスホニウム塩としては特に制限はなく、トリオク
チルメチルアンモニウムクロリド（ヘンケル社製Aliqua
t３３６など），セチルジメチルベンジルアンモニウム
クロリド、テトラｎ−ブチルホスホニウムブロマイドな
どが好適にもちいられる。又、その量は両出発物質に対
して多ければ多い程、目的生成物を有機溶媒層に移行さ
せ得るが、あまり多すぎると酵素活性を低下させる場合
があるので、両出発物質の総量に対して0.5〜5.0重量倍
の比率でもちいられる。

有機溶媒層に第４級アンモニウム塩またはホスホニウム
塩の形で移行したＮ−保護ペプチドまたはその誘導体を
分離回収するには、例えば、次のようにするとよい。４
級アンニウム塩またはホスホニウム塩の形になったＮ−
保護ペプチドまたはその誘導体は例えば食塩水等と混合
することにより遊離させることができる。すなわち、分
離した有機溶媒層から食塩水で抽出すればよい。食塩水
の濃度は２〜２０（重量）％がよい。

以下、実施例、比較例により、本発明をさらに説明す
る。

実施例１ Ｎ−アセチル−Ｌ−アスパラギン酸（以下、Ac-Aspと略
記する。）0.54ｇ（3.1mmol）とＬ−フェニルアラニン
（以下、Pheと略記する。）0.1ｇ（0.6mmol）を適量の
水に溶解し、水酸化ナトリウム水溶液を加えてpH4.5に
調整した後、全体を５mlにした。この水溶液にプロテア
ーゼＭ（天野製薬社製）５０mgを添加した。完全に溶解
させた後、トリオクチルメチルアンモニウムクロリド
（Aliquat３３６）1.25ｇ（3.1mmol）のトルエン溶液１
０mlを加え、４０℃で２４時間振盪した。

反応液中（水層及びトルエン層）のAc−α−APを高速液
体クロマトグラフィー（以下、HPLCと略記する。）にて
定量したところ、Pheに対して4.2％の収率で生成してい
た（水層1.2％，トルエン層3.0％）。

実施例２ Ac-Asp0.54ｇ（3.1mmol）とPhe 0.1ｇ（0.6mmol）を適
量の水に溶解し、水酸化ナトリウム水溶液を加えてpH4.
5に調整した後、全体を５mlにした。この水溶液にプロ
テアーゼＭ（天野製薬社製）５０mgを添加した。完全に
溶解させた後、トリオクチルメチルアンモニウムクロリ
ド(Aliquat３３６）1.25ｇ（3.1mmol）の四塩化炭素溶
液１０mlを加え、４０℃で２４時間振盪した。

反応液中（水層及び四塩化炭素層）のAc−α−APを、HP
LCにて定量したところ、Pheに対して4.3％の収率で生成
していた（水層1.1％，四塩化炭素層3.2％）。

実施例３ Ac-Asp 0.54ｇ（3.1mmol）とPhe 0.1ｇ（0.6mmol）を適
量の水に溶解し、水酸化ナトリウム水溶液を加えてpH4.
5に調整した後、全体を５mlにした。この水溶液にプロ
テアーゼＭ（天野製薬社製）５０mgを添加した。完全に
溶解させた後、セチルジメチルベンジルアンモニウムク
ロリド1.23ｇ（3.1mmol）のクロロホルム溶液１０mlを
加え、４０℃で２４時間振盪した。

反応液中（水層及びクロロホルム層）のAc−α−APを、
HPLCにて定量したところ、Pheに対して4.2％の収率で生
成していた（水層1.2％，クロロホルム層3.0％）。

実施例４ Ac-Asp 0.54ｇ（3.1mmol）とPhe 0.1ｇ（0.6mmol）を適
量の水に溶解し、水酸化ナトリウム水溶液を加えてpH4.
5に調整した後、全体を５mlにした。この水溶液にプロ
テアーゼＭ（天野製薬社製）５０mgを添加した。完全に
溶解させた後、テトラｎ−ブチルホスホニウムブロマイ
ド1.05ｇ（3.1mmol）の１，２−ジクロルエタン溶液１
０mlを加え、４０℃で２４時間振盪した。

反応液中（水層及び１，２−ジクロルエタン層）のAc−
α−APを、HPLCにて定量したところ、Pheに対して3.1％
の収率で生成していた（水層1.6％，１，２−ジクロル
エタン層1.5％）。

比較例１（実施例１〜５に対する比較例） Ac-Asp 0.54ｇ（3.1mmol）とPhe 0.1ｇ（0.6mmol）を適
量の水に溶解し、水酸化ナトリウム水溶液を加えてpH4.
5に調整した後、全体を５mlにした。この水溶液にプロ
テアーゼＭ（天野製薬社製）５０mgを添加した。完全に
溶解させた後、４０℃で２４時間振盪した。

水液中のAc−α−APをHPLCにて定量したところ、Pheに
対して1.6％の収率で生成していた。

実施例５ Ac-Asp 2.17ｇ（12.4mmol）とPhe 0.1ｇ（0.6mmol）を
適量の水に溶解し、水酸化ナトリウム水溶液を加えてpH
4.5に調整した後、全体を５mlにした。この水溶液にプ
ロテアーゼＭ（天野製薬社製）５０mgを添加した。完全
に溶解させた後、トリオクチルメチルアンモニウムクロ
リド(Aliquat３３６）1.25ｇ（3.1mmol）のトルエン溶
液１０mlを加え、４０℃で４４時間振盪した。

反応液中（水層及びトルエン層）のAc−α−APを、HPLC
にて定量したところ、Pheに対して11.1％の収率で生成
していた（水層3.3％，トルエン層7.8％）。

実施例６ Ac-Asp 2.17ｇ（12.4mmol）とPhe 0.1ｇ（0.6mmol）を
適量の水に溶解し、水酸化ナトリウム水溶液を加えてpH
4.5に調整した後、全体を５mlにした。この水溶液にプ
ロテアーゼＭ（天野製薬社製）５０mgを添加した。完全
に溶解させた後、トリオクチルメチルアンモニウムクロ
リド(Aliquat３３６）1.25ｇ（3.1mmol）のトルエン／
ヘキサン（１／１）溶液１０mlを加え、４０℃で４４時
間振盪した。

反応液中（水層及びトルエン／ヘキサン層）のAc−α−
APを、HPLCにて定量したところ、Pheに対して11.0％の
収率で生成していた（水層3.1％，トルエン／ヘキサン
層7.9％）。

実施例７ Ac-Asp 2.17ｇ（12.4mmol）とPhe 0.1ｇ（0.6mmol）を
適量の水に溶解し、水酸化ナトリウム水溶液を加えてpH
4.5に調整した後、全体を５mlにした。この水溶液にプ
ロテアーゼＭ（天野製薬社製）５０mgを添加した。完全
に溶解させた後、セチルジメチルベンジルアンモニウム
クロリド2.46ｇ（6.2mmol）のクロロホルム溶液２０ml
を加え、４０℃で４４時間振盪した。

反応液中（水層及びクロロホルム層）のAc−α−APを、
HPLCにて定量したところ、Pheに対して20.1％の収率で
生成していた（水層5.1％，クロロホルム層15.0％）。

比較例２（実施例５〜７に対する比較例） Ac-Asp 2.17ｇ（12.4mmol）とPhe 0.1ｇ（0.6mmol）を
適量の水に溶解し、水酸化ナトリウム水溶液を加えてpH
4.5に調整した後、全体を５mlにした。この水溶液にプ
ロテアーゼＭ（天野製薬社製）５０mgを添加した。完全
に溶解させた後、４０℃で４４時間振盪した。

水液中のAc−α−APをHPLCにて定量したところ、Pheに
対して5.2％の収率で生成していた。

実施例８ Ac-Asp 0.54ｇ（3.1mmol）とPhe 0.1ｇ（0.6mmol）を適
量の水に溶解し、水酸化ナトリウム水溶液を加えてpH4.
5に調整した後、全体を５mlにした。この水溶液にプロ
テアーゼＭ（天野製薬社製）２００mgを添加した。完全
に溶解させた後、トリオクチルメチルアンモニウムクロ
リド（Aliquat３３６）1.25ｇ（3.1mmol）のトルエン溶
液１０mlを加え、４０℃で４８時間振盪した。

反応液中（水層及びトルエン層）のAc−α−APを、HPLC
にて定量したところ、Pheに対して5.0％の収率で生成し
ていた（水層1.5％，トルエン層3.5％）。

実施例９ Ac-Asp 0.54ｇ（3.1mmol）とPhe 0.1ｇ（0.6mmol）を適
量の水に溶解し、水酸化ナトリウム水溶液を加えてpH3.
0に調整した後、全体を５mlにした。この水溶液にプロ
テアーゼＭ（天野製薬社製）５０mgを添加した。完全に
溶解させた後、トリオクチルメチルアンモニウムクロリ
ド（Aliquat３３６）1.25ｇ（3.1mmol）のトルエン溶液
１０mlを加え、４０℃で２２時間振盪した。

反応液中（水層及びトルエン層）のAc−α−APを、HPLC
にて定量したところ、Pheに対して3.4％の収率で生成し
ていた（水層0.9％，トルエン層２５％）。

実施例１０ Ac-Asp 0.54ｇ（3.1mmol）とPhe 0.1ｇ（0.6mmol）を適
量の水に溶解し、水酸化ナトリウム水溶液を加えてpH4.
5に調整した後、全体を５mlにした。この水溶液にプロ
テアーゼＭ（天野製薬社製）５０mgを添加した。完全に
溶解させた後、トリオクチルメチルアンモニウムクロリ
ド（Aliquat３３６）1.25ｇ（3.1mmol）のトルエン溶液
１０mlを加え、２５℃で９６時間振盪した。

反応液中（水層及びトルエン層）のAc−α−APを、HPLC
にて定量したところ、Pheに対して4.0％の収率で生成し
ていた（水層1.2％，トルエン層2.8％）。

実施例１１ Ｎ−ホルミル−Ｌ−アスパラギン酸（以下、For-Aspと
略記する。）0.5ｇ（3.1mmol）とPhe 0.1ｇ（0.6mmol）
を適量の水に溶解し、水酸化ナトリウム水溶液を加えて
pH4.5に調整した後、全体を５mlにした。この水溶液に
プロテアーゼＭ（天野製薬社製）５０mgを添加した。完
全に溶解された後、トリオクチルメチルアンモニウムク
ロリド（Aliquat３３６）1.25ｇ（3.1mmol）のトルエン
溶液１０mlを加え、４０℃で７２時間振盪した。

反応液中（水層及びトルエン層）のＮ−ホルミル−α−
Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン（以下、For
−α−APと略記する。）をHPLCにて定量したところ、Ph
eに対して2.9％の収率で生成していた（水層0.7％，ト
ルエン層2.2％）。

比較例３（実施例１１に対する比較例） For-Asp 0.5ｇ（3.1mmol）とPhe 0.1ｇ（0.6mmol）を適
量の水に溶解し、水酸化ナトリウム水溶液を加えてpH4.
5に調整した後、全体を５mlにした。この水溶液にプロ
テアーゼＭ（天野製薬社製）５０mgを添加した。完全に
溶解させた後、４０℃で７２時間振盪した。

水液中のFor−α−APをHPLCにて定量したところ、Pheに
対して0.8％の収率で生成していた。

実施例１２ For-Asp 2.0ｇ（12.4mmol）とPhe 0.1ｇ（0.6mmol）を
適量の水に溶解し、水酸化ナトリウム水溶液を加えてpH
4.5に調整した後、全体を５mlにした。この水溶液にプ
ロテアーゼＭ（天野製薬社製）５０mgを添加した。完全
に溶解させた後、トリオクチルメチルアンモニウムクロ
リド（Aliquat３３６）1.25ｇ（3.1mmol）のトルエン溶
液１０mlを加え、４０℃で７６時間振盪した。

反応液中（水層及びトルエン層）のFor−α−APをHPLC
にて定量したところ、Pheに対して6.3％の収率で生成し
ていた（水層2.0％，トルエン層4.3％）。

実施例１３ For-Asp 0.5ｇ（3.1mmol）とPhe 0.1ｇ（0.6mmol）を適
量の水に溶解し、水酸化ナトリウム水溶液を加えてpH4.
5に調整した後、全体を５mlにした。この水溶液にオリ
エンターゼ５Ａ（オリエンタル酵母社製）５０mgを添加
した。完全に溶解させた後、トリオクチルメチルアンモ
ニウムクロリド（Aliquat３３６）1.25ｇ（3.1mmol）の
酢酸エチル溶液１０mlを加え、４０℃で７１時間振盪し
た。

反応液中（水層及び酢酸エチル層）のFor−α−APをHPL
Cにて定量したところ、Pheに対して1.1％の収率で生成
していた（水層0.3％，酢酸エチル層0.8％）。

比較例４（実施例１３に対する比較例） For-Asp 0.5ｇ（3.1mmol）とPhe 0.1ｇ（0.6mmol）を適
量の水に溶解し、水酸化ナトリウム水溶液を加えてpH4.
5に調整した後、全体を５mlにした。この水溶液にオリ
エンターゼ５Ａ（オリエンタル酵母社製）５０mgを添加
した。完全に溶解させた後、４０℃で７１時間振盪し
た。

水液中のFor−α−APをHPLCにて定量したところ、Pheに
対して0.4％の収率で生成していた。

実施例１４ Ｎ−ホルミル−Ｌ−アスパラギン酸−α−メチルエステ
ル（以下、For-Asp-OMeと略記する。）0.54ｇ（3.1mmo
l）とPhe 0.1ｇ（0.6mmol）を適量の水に溶解し、水酸
化ナトリウム水溶液を加えてpH4.5に調整した後、全体
を５mlにした。この水溶液にプロテアーゼＭ（天野製薬
社製）５０mgを添加した。完全に溶解させた後、トリオ
クチルメチルアンモニウムクロリド（Aliquat３３６）
1.25ｇ（3.1mmol）のトルエン溶液１０mlを加え、４０
℃で６５時間振盪した。

反応液中（水層及びトルエン層）のFor−α−APをHPLC
にて定量したところ、Pheに対して7.2％の収率で生成し
ていた（水層1.9％，トルエン層5.3％）。

比較例５（実施例１４に対する比較例） For-Asp-OMe 0.54ｇ（3.1mmol）とPhe 0.1ｇ（0.6mmo
l）を適量の水に溶解し、水酸化ナトリウム水溶液を加
えてpH4.5に調整した後、全体を５mlにした。この水溶
液にプロテアーゼＭ（天野製薬社製）５０mgを添加し
た。完全に溶解させた後、４０℃で６５時間振盪した。

水液中のFor−α−APをHPLCにて定量したところ、Pheに
対して2.1％の収率で生成していた。

実施例１５ Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−アスパラギン酸
（以下、Ｚ−Aspと略記する。）0.83ｇ（3.1mmol）とPh
e 0.1ｇ（0.6mmol）を適量の水に溶解し、水酸化ナトリ
ウム水溶液を加えてpH4.5に調整した後、全体を５mlに
した。この水溶液にプロテアーゼＭ（天野製薬社製）５
０mgを添加した。完全に溶解させた後、トリオクチルメ
チルアンモニウムクロリド（Aliquat３３６）1.25ｇ
（3.1mmol）のトルエン溶液１０mlを加え、４０℃で４
４時間振盪した。

反応液中（水層及びトルエン層）のＮ−ベンジルオキシ
カルボニル−α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラ
ニン（以下、Ｚ−α−APと略記する。）をHPLCにて定量
したところ、Pheに対して8.1％の収率で生成していた
（水層1.1％，トルエン層7.0％）。

比較例６（実施例１５に対する比較例） Ｚ−Asp 0.83ｇ（3.1mmol）とPhe 0.1ｇ（0.6mmol）を
適量の水に溶解し、水酸化ナトリウム水溶液を加えてpH
4.5に調整した後、全体を５mlにした。この水溶液にプ
ロテアーゼＭ（天野製薬社製）５０mgを添加した。完全
に溶解させた後、４０℃で４４時間振盪した。

水液中のＺ−α−APをHPLCにて定量したところ、Pheに
対して2.4％の収率で生成していた。

実施例１６ Ｚ−Asp 0.67ｇ（2.5mmol）とＬ−フェニルアラニンメ
チルエステル（以下、ＰＭと略記する。）0.45ｇ（2.5m
mol）を適量の水に溶解し、水酸化ナトリウム水溶液を
加えてpH6.2に調整した後、全体を１８mlにした。この
水溶液にサモアーゼ（大和化成社製）１２０mgを添加し
た。完全に溶解させた後、トリオクチルメチルアンモニ
ウムクロリド（Aliquat３３６）2.06ｇ（5.1mmol）のト
ルエン溶液２０mlを加え、４０℃で３時間振盪した。

反応液中（水層及びトルエン層）のＮ−ベンジルオキシ
カルボニル−α−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステル
（以下、Ｚ−α−APMと略記する。）をHPLCにて定量し
たところ、Pheに対して54.6％の収率で生成していた
（水層18.0％，トルエン層36.6％）。

比較例７（実施例１６に対する比較例） Ｚ−Asp 0.67ｇ（2.5mmol）とＰＭ0.45ｇ（2.5mmol）を
適量の水に溶解し、水酸化ナトリウム水溶液を加えてpH
6.2に調整した後、全体を１８mlにした。この水溶液に
サモアーゼ（大和化成社製）１２０mgを添加した。完全
に溶解させた後、４０℃で３時間振盪した。

水液中のＺ−α−APMをHPLCにて定量したところ、Pheに
対して19.4％の収率で生成していた。

実施例１７ 比較例３と同様に反応させて得られたFor-Asp 2.5ｇ，F
or−α−AP 0.009ｇ及びＬ−Phe 0.5ｇを含む酵素反応
液２５mlにトリオクチルメチルアンモニウムクロリド6.
25ｇのトルエン溶液５０mlを加え、pHを6.0に調整した
後、３７℃で１５分間振盪した。

トルエン層を分離し、For-Asp,For−α−AP及びＬ−Phe
をHPLCにて定量したところ、トルエン層中にFor−α−A
Pは７６％抽出されていた。一方、For-Asp,Pheは、それ
ぞれ、９％，７％抽出されたにすぎなかった。因みに、
For−α−AP,For-Asp及びPheの水−トルエン間の分配係
数は、それぞれ、1.35,0.04,0.03であった。

比較例８（実施例１７に対する比較例） トリオクチルメチルアンモニウムクロリドを添加しない
以外は、実施例１８と同様の実験を行なったところ、Fo
r−α−APはトルエン層中に全く抽出されず、その分配
係数は０であった。

実施例１８ 比較例１と同様に反応して得られたAc-Asp 2.6ｇ，Ac−
α−AP 0.015ｇ及びPhe 0.5ｇを含む酵素反応液２５ml
にトリオクチルメチルアンモニウムクロリド6.25ｇのト
ルエン溶液５０mlを加え、pHを4.4に調整した後、３７
℃で１５分間振盪した。

トルエン層を分離し、Ac-Asp,Ac−α−AP及びＬ−Pheを
HPLCにて定量したところ、トルエン層中にAc−α−APは
６３％抽出されていた。一方、Ac-Asp,Pheは、それぞ
れ、９％，２％抽出されたにすぎなかった。因みに、Ac
−α−AP,Ac-Asp及びＬ−Pheの水−トルエン間の分配係
数は、それぞれ、1.03,0.07,0.01であった。

比較例９（実施例１８に対する比較例） トリオクチルメチルアンモニウムクロリドを添加しない
以外は、実施例１９と同様の実験を行なったところ、Ac
−α−APはトルエン層中に全く抽出されず、その分配係
数は０であった。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】Ｎ−保護−Ｌ−アスパラギン酸またはその
   誘導体とＬ−フェニルアラニンまたはその誘導体とを、
   ４級アンモニウム塩または４級ホスホニウム塩を溶解し
   た水非混和性有機溶媒と水との２相系反応媒体中におい
   て水層で蛋白分解酵素を用いて反応させ、生成したＮ−
   保護−α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンま
   たはその誘導体を親油性の４級アンモニウム塩または４
   級ホスホニウム塩として有機溶媒相に移行させることを
   特徴とするＮ−保護−α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェ
   ニルアラニンまたはその誘導体の酵素的合成法。
2. 【請求項２】Ｎ−保護−Ｌ−アスパラギン酸またはその
   誘導体とＬ−フェニルアラニンまたはその誘導体とを水
   中で蛋白分解酵素を用いて反応させ、生成したＮ−保護
   −α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンまたは
   その誘導体を４級アンモニウム塩または４級ホスホニウ
   ム塩を溶解した水非混和性有機溶媒で抽出回収すること
   を特徴とするＮ−保護−α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フ
   ェニルアラニンまたはその誘導体の酵素的合成法。