JPH0636744B2 - キメラチトクロムｐ−４５０遺伝子 - Google Patents
キメラチトクロムｐ−４５０遺伝子Info
- Publication number
- JPH0636744B2 JPH0636744B2 JP61076633A JP7663386A JPH0636744B2 JP H0636744 B2 JPH0636744 B2 JP H0636744B2 JP 61076633 A JP61076633 A JP 61076633A JP 7663386 A JP7663386 A JP 7663386A JP H0636744 B2 JPH0636744 B2 JP H0636744B2
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- Japan
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- gene
- yeast
- region
- strain
- cytochrome
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0071—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14)
- C12N9/0077—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14) with a reduced iron-sulfur protein as one donor (1.14.15)
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- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
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Description
【発明の詳細な説明】 産業上の技術分野 本発明は、キメラチトクロムＰ−４５０遺伝子、それを
含む酵母発現プラスミド及びそれらのプラスミドを菌体
内に保持する酵母菌株並びにれらの製造方法に関する。
含む酵母発現プラスミド及びそれらのプラスミドを菌体
内に保持する酵母菌株並びにれらの製造方法に関する。
従来技術および問題点 チトクロムＰ−４５０（以下Ｐ−４５０と略称する）
は、微生物から哺乳動物にいたるまで広く生物界に存在
するヘムタンパク質であり、多くの分子種が存在する。
各々のＰ−４５０分子種は基質特異性を異にしている
が、共通して脂溶性基質に対して一原子酵素添加反応を
触媒する。
は、微生物から哺乳動物にいたるまで広く生物界に存在
するヘムタンパク質であり、多くの分子種が存在する。
各々のＰ−４５０分子種は基質特異性を異にしている
が、共通して脂溶性基質に対して一原子酵素添加反応を
触媒する。
近年、本発明者らは、酵母を宿主としてラット肝チトク
ロムＰ−４５０Ｃ（Ｐ−４５０Ｃ）を発現させる酵母発
現ベクターｐＡＭＣ１を構築し酵母でＰ−４５０Ｃを大
量に生産させることに成功した（特願昭５９−１２２９
５３）。
ロムＰ−４５０Ｃ（Ｐ−４５０Ｃ）を発現させる酵母発
現ベクターｐＡＭＣ１を構築し酵母でＰ−４５０Ｃを大
量に生産させることに成功した（特願昭５９−１２２９
５３）。
酵母内で、Ｐ−４５０Ｃはミクロソームに存在し、酵母
ＮＡＤＰＨ−チトクロムＰ−４５０還元酵素と連携して
電子伝達系を形成し、一原子酸素添加反応（酸化活性）
を示す。
ＮＡＤＰＨ−チトクロムＰ−４５０還元酵素と連携して
電子伝達系を形成し、一原子酸素添加反応（酸化活性）
を示す。
本発明者らの特許出願（特願昭６０−１３９１２８）に
記載したように、Ｐ−４５０Ｃ発現酵母菌株を用いて、
アセトアニリドをパラ位水酸化し、アセトアミノフェン
を製造することが可能である（特願昭６０−１３９１２
８）。
記載したように、Ｐ−４５０Ｃ発現酵母菌株を用いて、
アセトアニリドをパラ位水酸化し、アセトアミノフェン
を製造することが可能である（特願昭６０−１３９１２
８）。
さらに、本発明者らは、キメラＰ−４５０遺伝子を２種
以上のＰ−４５０遺伝子から構築し、酵母菌体内で発現
させることにに成功した（特願昭６０−２４２７７
３）。この特許出願に記載のキメラＰ−４５０ｃｃｄの
基質特異性は、Ｐ−４５０Ｃから由来するものであり、
本キメラＰ−４５０は、高い酸化活性とＰ−４５０Ｃの
基質特異性を有するものである。
以上のＰ−４５０遺伝子から構築し、酵母菌体内で発現
させることにに成功した（特願昭６０−２４２７７
３）。この特許出願に記載のキメラＰ−４５０ｃｃｄの
基質特異性は、Ｐ−４５０Ｃから由来するものであり、
本キメラＰ−４５０は、高い酸化活性とＰ−４５０Ｃの
基質特異性を有するものである。
発明の背景 本発明者らは、種々研究の結果、Ｐ−４５０の基質特異
性を決定する領域、即ち、基質結合部位は、ラット肝Ｐ
−４５０ｄにおいては、Ｎ末端から１８４番目〜３７０
番目のアミノ酸配列であると考えられること、及びＰ−
４５０Ｃの酵母ミクロソームへの局在化に関与する領域
は、Ｐ−４５０MCの場合、そのＮ末端から約数十アミノ
酸残基程度（約３０程度）の領域であり、この領域を含
む遺伝子により生産されるＰ−４５０は、ミクロソーム
に局在化し、安定に保たれ、酸化活性を示すことを明ら
かにした。
性を決定する領域、即ち、基質結合部位は、ラット肝Ｐ
−４５０ｄにおいては、Ｎ末端から１８４番目〜３７０
番目のアミノ酸配列であると考えられること、及びＰ−
４５０Ｃの酵母ミクロソームへの局在化に関与する領域
は、Ｐ−４５０MCの場合、そのＮ末端から約数十アミノ
酸残基程度（約３０程度）の領域であり、この領域を含
む遺伝子により生産されるＰ−４５０は、ミクロソーム
に局在化し、安定に保たれ、酸化活性を示すことを明ら
かにした。
発明の構成 本発明は、Ｐ−４５０Ｃのアミノ酸末端領域部分をコー
ドする遺伝子領域の後に他の分子種のＰ−４５０をコー
ドする遺伝子の対応するＣ末端側部分を結合することに
より構築したキメラムＰ−４５０遺伝子、該遺伝子を含
みこれを酵母菌体内で発現させる酵母発現プラスミド、
該発現プラスミドで形質転換することにより創製した形
質転換体酵母、および発現産物のキメラＰ−４５０を提
供する。
ドする遺伝子領域の後に他の分子種のＰ−４５０をコー
ドする遺伝子の対応するＣ末端側部分を結合することに
より構築したキメラムＰ−４５０遺伝子、該遺伝子を含
みこれを酵母菌体内で発現させる酵母発現プラスミド、
該発現プラスミドで形質転換することにより創製した形
質転換体酵母、および発現産物のキメラＰ−４５０を提
供する。
問題解決の手段 発明のキメラＰ−４５０遺伝子は、Ｐ−４５０Ｃの酵母
ミクロソームへの局在化に関与する領域即ち、Ｎ末端か
ら約数十程度のアミノ酸残基を含む領域をコードするＰ
−４５０Ｃ遺伝子の断片を、例えば、Ｐ−４５０Ｃ遺伝
子を含むプラスミドｐＴＦ１，ｐＴＦ２，ｐＡＭＣ１な
ど（特願昭５９−１６９４４７）などから分離し、他の
分子種のＰ−４５０のＣ末端部分と接続することにより
製造することができる。
ミクロソームへの局在化に関与する領域即ち、Ｎ末端か
ら約数十程度のアミノ酸残基を含む領域をコードするＰ
−４５０Ｃ遺伝子の断片を、例えば、Ｐ−４５０Ｃ遺伝
子を含むプラスミドｐＴＦ１，ｐＴＦ２，ｐＡＭＣ１な
ど（特願昭５９−１６９４４７）などから分離し、他の
分子種のＰ−４５０のＣ末端部分と接続することにより
製造することができる。
より具体的に説明すれば、例えば、Ｐ−４５０Ｃ遺伝子
のＮ末端の１８６のアミノ酸残基をコードする領域の後
に、他の分子種のＰ−４５０遺伝子の対応するＣ末端部
分、例えばＰ−４５０ｄ（J.Biochem.96,793-804,(198
4)）の１８４番目から５１３番目のアミノ酸をコードす
る領域を接続することにより得ることができる（この様
にして構築したキメラＰ−４５０をキメラＰ−４５０ｃ
ｄｄ２と称する）。
のＮ末端の１８６のアミノ酸残基をコードする領域の後
に、他の分子種のＰ−４５０遺伝子の対応するＣ末端部
分、例えばＰ−４５０ｄ（J.Biochem.96,793-804,(198
4)）の１８４番目から５１３番目のアミノ酸をコードす
る領域を接続することにより得ることができる（この様
にして構築したキメラＰ−４５０をキメラＰ−４５０ｃ
ｄｄ２と称する）。
Ｐ−４５０ｄのＣ末端部分は、Ｐ−４５０ｄをコードす
る領域を含むプラスミドｐＴＺ３３０〔J.Biochem.,96,
793-804,(1984)に記載の方法で製造することができる〕
から分離することができる。キメラプラスミドｐＡＣＤ
Ｄ２構築の概略を第２図に示す。
る領域を含むプラスミドｐＴＺ３３０〔J.Biochem.,96,
793-804,(1984)に記載の方法で製造することができる〕
から分離することができる。キメラプラスミドｐＡＣＤ
Ｄ２構築の概略を第２図に示す。
この様にして得られた本発明のキメラＰ−４５０は、そ
のＣ末端側に用いた各種のＰ−４５０分子種の基質特異
性を有し、本発明によれば、種々の基質特異性を有する
キメラＰ−４５０を製造することが可能である。
のＣ末端側に用いた各種のＰ−４５０分子種の基質特異
性を有し、本発明によれば、種々の基質特異性を有する
キメラＰ−４５０を製造することが可能である。
本発明のキメラＰ−４５０遺伝子を保持する酵母発現用
プラスミドは、例えば、酵母アルコールデヒドロゲナー
ゼI遺伝子のプロモーターと同ターミネーターを保持す
る酵母発現用ベクタープラスミドｐＡＡＨ５（Wachingt
on Research Foundationから入手可能、Methods in Enz
ymology,101 part C p192-201,Ammererらの方法により
製造できる）や酵母発現ベクターｏＪＤＢ２１９〔Natu
re,275,104(1979)〕等の酵母発現ベクターに上述のよう
に製造したキメラＰ−４５０遺伝子を組み込むことによ
り製造することができる。この場合において、酵母発現
ベクターは、特に限定されるものではなく、また、使用
するプロモーターやターミモーターについても、酵母内
で効率良く機能するプロモーター、ターミネーターであ
ればよく、こらに限定されすものではない。また、プラ
スミド上のプロモーター、、キメラＰ−４５０遺伝子、
ターミネーター以外の構造も限定されるものではなく、
酵母内で安定に保持されるものであればよい。
プラスミドは、例えば、酵母アルコールデヒドロゲナー
ゼI遺伝子のプロモーターと同ターミネーターを保持す
る酵母発現用ベクタープラスミドｐＡＡＨ５（Wachingt
on Research Foundationから入手可能、Methods in Enz
ymology,101 part C p192-201,Ammererらの方法により
製造できる）や酵母発現ベクターｏＪＤＢ２１９〔Natu
re,275,104(1979)〕等の酵母発現ベクターに上述のよう
に製造したキメラＰ−４５０遺伝子を組み込むことによ
り製造することができる。この場合において、酵母発現
ベクターは、特に限定されるものではなく、また、使用
するプロモーターやターミモーターについても、酵母内
で効率良く機能するプロモーター、ターミネーターであ
ればよく、こらに限定されすものではない。また、プラ
スミド上のプロモーター、、キメラＰ−４５０遺伝子、
ターミネーター以外の構造も限定されるものではなく、
酵母内で安定に保持されるものであればよい。
キメラＰ−４５０ｃｄｄ遺伝子を保持する酵母発現用プ
ラスミドｐＡＣＤＤ２により形質転換された酵母菌株に
おける菌体当たり、あるいはｐ−４５０１分子当たりの
アセトアニリドｐ位水酸化活性は、従来のプラスミドｐ
ＡＭＣ１によって形質転換された酵母菌株の約５〜６倍
であり、バイオリアクターとして有用性が高いことがわ
かる。また、本発明の酵母菌体は、キメラＰ−４５０遺
伝子を含むプラスミドにより、アルカル金属法、あるい
はプロヒプラスト法などでサッカロミセス属に属する酵
母を形質転換することによって得られる。サッカロミセ
ス・セレビシェーＡＨ２２株を用いることができるが、
この株に限定されるものではない。
ラスミドｐＡＣＤＤ２により形質転換された酵母菌株に
おける菌体当たり、あるいはｐ−４５０１分子当たりの
アセトアニリドｐ位水酸化活性は、従来のプラスミドｐ
ＡＭＣ１によって形質転換された酵母菌株の約５〜６倍
であり、バイオリアクターとして有用性が高いことがわ
かる。また、本発明の酵母菌体は、キメラＰ−４５０遺
伝子を含むプラスミドにより、アルカル金属法、あるい
はプロヒプラスト法などでサッカロミセス属に属する酵
母を形質転換することによって得られる。サッカロミセ
ス・セレビシェーＡＨ２２株を用いることができるが、
この株に限定されるものではない。
以下に実施例を挙げ本発明を更に詳細に説明する。本発
明は、以下の実施例のみに限定されるものではなく、本
発明の技術分野に於ける通常の変更をすることができ
る。
明は、以下の実施例のみに限定されるものではなく、本
発明の技術分野に於ける通常の変更をすることができ
る。
実施例１ プラスミドｐＡＣＤＤ２の構築 第２図にプラスミドｐＡＣＤＤ２の構築の概略を示す。
本発明者らの発明に係る特許出願（特願昭５９−１２２
５９３）に記載したプラスミドｐＴＦ１を制限酵素Ｂａ
Ｉで部分切断し、さらにＳｔｕＩで切断した後、低融
点アガロースゲル電気泳動を行い、約4.2kbのＤＮＡ断
片を含むゲルを切り出して、これを６５℃で５分間加熱
した。融解したゲルに２倍容のＴＥ緩衝液〔１０ｍＭト
リス−塩酸０．５ｍＭＥＤＴＡ（pH8.0）〕を加え、次
にＴＥ緩衝液で飽和したフェノールを等量加えて攪拌し
た。遠心分離後、上層を分取し、２倍容の冷エタノール
を加えてＤＮＡを沈澱させ、回収した。以後のＤＮＡ断
片の回収はすべてこの方法で行った。約4.2kbのＤＮＡ
断片約100ngをアルカリホスファクターゼ処理した後、
公知のプラスミドｐＴＺ３３０（J.Biochem.96 793-80
4,(1984)をＢａＩ、ＳｔｕIで切断して得たＤＮＡ断
片約５０ｎｇと混合し、リガーゼ反応を行った。反応後
の混液により大腸菌ＤＨ１（F-recA1,endA1,gyrA96,thi
-1,hsdR17,supE44,λ-）を形質転換し、100μｇ／ｍ
のアンピシリンを含むプレートに広げ出現するコロニー
からプラスミドＤＮＡを単離した。得られたＤＮＡ約１
００ｎｇをＢａｌIで部分切断した後、アルカリホスフ
ァクターゼ処理し、ｐＴＦ１から得た約１９０ｂｐのＢ
ａｌI−ＢａｌIＤＮＡ断片約５０ｎｇと混合し、リガー
ゼ反応を行った。反応混液にて形質転換した大腸菌ＤＨ
１のコロニーからプラスミドＤＮＡを調製し、ｐＴＦｃ
ｄｃと名付けた（第２図）。
５９３）に記載したプラスミドｐＴＦ１を制限酵素Ｂａ
Ｉで部分切断し、さらにＳｔｕＩで切断した後、低融
点アガロースゲル電気泳動を行い、約4.2kbのＤＮＡ断
片を含むゲルを切り出して、これを６５℃で５分間加熱
した。融解したゲルに２倍容のＴＥ緩衝液〔１０ｍＭト
リス−塩酸０．５ｍＭＥＤＴＡ（pH8.0）〕を加え、次
にＴＥ緩衝液で飽和したフェノールを等量加えて攪拌し
た。遠心分離後、上層を分取し、２倍容の冷エタノール
を加えてＤＮＡを沈澱させ、回収した。以後のＤＮＡ断
片の回収はすべてこの方法で行った。約4.2kbのＤＮＡ
断片約100ngをアルカリホスファクターゼ処理した後、
公知のプラスミドｐＴＺ３３０（J.Biochem.96 793-80
4,(1984)をＢａＩ、ＳｔｕIで切断して得たＤＮＡ断
片約５０ｎｇと混合し、リガーゼ反応を行った。反応後
の混液により大腸菌ＤＨ１（F-recA1,endA1,gyrA96,thi
-1,hsdR17,supE44,λ-）を形質転換し、100μｇ／ｍ
のアンピシリンを含むプレートに広げ出現するコロニー
からプラスミドＤＮＡを単離した。得られたＤＮＡ約１
００ｎｇをＢａｌIで部分切断した後、アルカリホスフ
ァクターゼ処理し、ｐＴＦ１から得た約１９０ｂｐのＢ
ａｌI−ＢａｌIＤＮＡ断片約５０ｎｇと混合し、リガー
ゼ反応を行った。反応混液にて形質転換した大腸菌ＤＨ
１のコロニーからプラスミドＤＮＡを調製し、ｐＴＦｃ
ｄｃと名付けた（第２図）。
ｐＴＦｃｄｃをＳｔｕＩ，ＨｉｎｄIIIで切断して得ら
れた約３．９ｋｂのＤＮＡ断片約１００ｎｇをアルカリ
ホスファクターゼ処理した後、下記に示した配列を有す
る合成リンカーＤＮＡ約１００ｎｇと混合し、リガーゼ
反応を行った。合成リンカーの塩基配列： ＣＣＴＧＧＣＣＡＣＧＣＴＴＣＴＣＣＡＡＧＴＧＡ ＧＧＡＣＣＧＧＴＧＣＧＡＡＧＡＧＧＴＴＣＡＣＴＴＣ
ＧＡ 反応混液によって形質転換した大腸菌ＤＨ１のコロニー
からプラスミドＤＮＡを調製した。このプラスミドＤＮ
Ａ約１００ｎｇをＳｔｕＩで切断してアルカリホスファ
ーゼ処理、ｐＴＺ３３０をＳｔｕＩで切断して得た約４
２０ｂｐのＤＮＡ約１００ｎｇと混合し、リガーゼを行
った。反応混合液によって形質転換した大腸菌ＤＨ１の
コロニーからプラスミドＤＮＡを調製し、ｐＴＦｃｄと
名付けた。
れた約３．９ｋｂのＤＮＡ断片約１００ｎｇをアルカリ
ホスファクターゼ処理した後、下記に示した配列を有す
る合成リンカーＤＮＡ約１００ｎｇと混合し、リガーゼ
反応を行った。合成リンカーの塩基配列： ＣＣＴＧＧＣＣＡＣＧＣＴＴＣＴＣＣＡＡＧＴＧＡ ＧＧＡＣＣＧＧＴＧＣＧＡＡＧＡＧＧＴＴＣＡＣＴＴＣ
ＧＡ 反応混液によって形質転換した大腸菌ＤＨ１のコロニー
からプラスミドＤＮＡを調製した。このプラスミドＤＮ
Ａ約１００ｎｇをＳｔｕＩで切断してアルカリホスファ
ーゼ処理、ｐＴＺ３３０をＳｔｕＩで切断して得た約４
２０ｂｐのＤＮＡ約１００ｎｇと混合し、リガーゼを行
った。反応混合液によって形質転換した大腸菌ＤＨ１の
コロニーからプラスミドＤＮＡを調製し、ｐＴＦｃｄと
名付けた。
次に、約１００ｎｇのｐＴＦｃｄｄをＳａ１Ｉで切断し
た後、ＤＮＡポリメラーゼI Klenow酵素でフィル・イン
し、さらにアルカリホスファターゼ処理を施した。これ
に約５００ｎｇのＨｉｎｄIIIリンカーを加えてリガー
ゼ反応を行った。反応混液により大腸菌ＤＨ１を形質転
換し得られたコロニーからプラスミドＤＮＡを調製し、
ＨｉｎｄIIIで切断してＤＮＡ構造を確認し、得られた
プラスミドをｐＴＦｃｄｄ（Ｈ）と名付けた。ｐＴＦｃ
ｄｄ（Ｈ）をＨｉｎｄIIIで切断し、約１．６ｋｂのＤ
ＮＡ断片を回収した。
た後、ＤＮＡポリメラーゼI Klenow酵素でフィル・イン
し、さらにアルカリホスファターゼ処理を施した。これ
に約５００ｎｇのＨｉｎｄIIIリンカーを加えてリガー
ゼ反応を行った。反応混液により大腸菌ＤＨ１を形質転
換し得られたコロニーからプラスミドＤＮＡを調製し、
ＨｉｎｄIIIで切断してＤＮＡ構造を確認し、得られた
プラスミドをｐＴＦｃｄｄ（Ｈ）と名付けた。ｐＴＦｃ
ｄｄ（Ｈ）をＨｉｎｄIIIで切断し、約１．６ｋｂのＤ
ＮＡ断片を回収した。
次に酵母発現ベクターｐＡＡＨ５（Washington Researc
h Fundationから入手可能、Method in Enzymology,101
part C p192-201の方法により製造できる），約１００
ｎｇをＨｉｎｄIIIで切断し、アルカリホスファーゼ処
理を行った後、 １．６ｋｂのＤＮＡ断片約２００ｎｇと混合し、リガー
ゼ反応を行った後、反応混液により大腸菌ＤＨ１株を形
質転換し、得られたコロニーからプラスミドＤＮＡを調
製し、ＢａｍＨＩ，ＳｔｕＩで切断てＤＮＡの構造を確
認し、得られたプラスミドをｐＡＣＤＤ２と名付けた。
h Fundationから入手可能、Method in Enzymology,101
part C p192-201の方法により製造できる），約１００
ｎｇをＨｉｎｄIIIで切断し、アルカリホスファーゼ処
理を行った後、 １．６ｋｂのＤＮＡ断片約２００ｎｇと混合し、リガー
ゼ反応を行った後、反応混液により大腸菌ＤＨ１株を形
質転換し、得られたコロニーからプラスミドＤＮＡを調
製し、ＢａｍＨＩ，ＳｔｕＩで切断てＤＮＡの構造を確
認し、得られたプラスミドをｐＡＣＤＤ２と名付けた。
実施例２ プラスミドｐＡＣＤＤ２による酵母の形質転
換 ＹＰＤ培地（１％Yeast Extract，２％ポリペプトン、
２％グルコース）１ｍにサッカロミセス・セレビシエ
ーＡＨ２２株を植菌し、３０℃で１８時間振盪した後、
遠心分離により集菌した。
換 ＹＰＤ培地（１％Yeast Extract，２％ポリペプトン、
２％グルコース）１ｍにサッカロミセス・セレビシエ
ーＡＨ２２株を植菌し、３０℃で１８時間振盪した後、
遠心分離により集菌した。
得られた菌体を１ｍの0.2MＬｉＣ溶液に懸濁した
後、再び遠心分離し、得られたペレットに２０μの１
ＭＬｉＣ溶液３０μの７０％ポリエチレングリコー
ル4000溶液、約１μｇのｐＡＣＤＤ２を含む10μの溶
液を添加した。十分に混合した後、３０℃で１時間イン
キュベートし、さらに１４０μの滅菌水を加えて攪拌
した。この溶液をＳＤ合成培地プレート（２％グルコー
ス，0.67％窒素源アミノ酸不含，２０μ１／ｍ１ヒスチ
ジン，２％寒天）の上にまき、３０℃で３日間インキュ
ベートし、ｐＡＣＤＤ２を保有する形質転換菌株ＡＨ２
２（ｐＡＣＤＤ２）を得た。
後、再び遠心分離し、得られたペレットに２０μの１
ＭＬｉＣ溶液３０μの７０％ポリエチレングリコー
ル4000溶液、約１μｇのｐＡＣＤＤ２を含む10μの溶
液を添加した。十分に混合した後、３０℃で１時間イン
キュベートし、さらに１４０μの滅菌水を加えて攪拌
した。この溶液をＳＤ合成培地プレート（２％グルコー
ス，0.67％窒素源アミノ酸不含，２０μ１／ｍ１ヒスチ
ジン，２％寒天）の上にまき、３０℃で３日間インキュ
ベートし、ｐＡＣＤＤ２を保有する形質転換菌株ＡＨ２
２（ｐＡＣＤＤ２）を得た。
実施例３ キメラＰ−４５０タンパク質（Ｐ−４５０ｃ
ｄｄ）の分析 実施例２で得たＡＨ２２（ｐＡＣＤＤ２）株をＳＤ合成
培地（２％グルコース，0.67％窒素源アミノ酸不含，２
０μｌ／mlヒスチジン）で各々1.5×107cells／mlまで
培養した後、集菌し、ザイモリエース溶液（1.2Ｍソル
ビトール，５０ｍＭリン酸カリウム（pH7.2），１４ｍ
Ｍ２−メルカプトエタノール，0.4mg／ｍザイモリエ
ース60,000）に懸濁し、３０℃で３０分インキュベート
した。遠心分離により集めたスフェロプラストに１００
℃に熱した緩衝液（１％ＳＤＳ，50mM Tris-HCl(pH6.
8)，１０％メルカプトエタノール，４０％グリセロー
ル、0.02％ブロモフェノールブルー，１mMフェニルメチ
ルスルホニルフロリド）を添加して可溶化した。遠心分
離で得られた上清（約３×１０６菌体分）を１０％ポリ
アクリルアミドゲルを用いて電気泳動した。さらに、ゲ
ル中のタンパク質を２５mM Tris-HCl(pH8.3),192mMグリ
シン−２０％メタノール中で電気泳動的にニトロセルロ
ースフィルター上にブロットした。次に、フィルターを
ＴＢＳ緩衝液〔５０mMTris-HCl(pH7.5)200mM NaCl〕に
浸した後、３％ゼラチン0.05% Tween２０を含むＴＢＳ
緩衝液中、３７℃で４０分インキュベートし、さらに３
０μｇの精製抗−Ｐ−４５０MC IgG，１％ゼラチン，0.
05% Tween２０をふくむＴＢＳ中３７℃で２時間インキ
ュベートした。その後、0.05% Tween２０を含む緩衝液
中、３７℃で３０分インキュベートする操作を４回繰り
返した後、３％ゼラチン，0.05% Tween２０を含むＴＢ
Ｓ緩衝液中に３７℃で２０分インキュベートした。次
に、２μCiの〔125Ｉ〕−プロテインＡ，１％ゼラチン
0.05% Tween２０を含むＴＢＳ緩衝液中、３７℃で７０
分インキュベートした後、0.05% Tween２０を含むＴＢ
Ｓ中３７℃で３０分インキュベートする操作を４回繰り
返した。フィルターを風乾した後、オートラジオグラフ
ィーを行ったところ、ラットＰ−４５０Ｃとほぼ同じ泳
動位置にP-450cddのバンドが認められた。バンドの濃さ
から、ＡＨ２２（ｐＡＣＤＤ２）株は菌体あたり少なく
とも２×１０５分子のP-450cddを産生していることが推
定された。
ｄｄ）の分析 実施例２で得たＡＨ２２（ｐＡＣＤＤ２）株をＳＤ合成
培地（２％グルコース，0.67％窒素源アミノ酸不含，２
０μｌ／mlヒスチジン）で各々1.5×107cells／mlまで
培養した後、集菌し、ザイモリエース溶液（1.2Ｍソル
ビトール，５０ｍＭリン酸カリウム（pH7.2），１４ｍ
Ｍ２−メルカプトエタノール，0.4mg／ｍザイモリエ
ース60,000）に懸濁し、３０℃で３０分インキュベート
した。遠心分離により集めたスフェロプラストに１００
℃に熱した緩衝液（１％ＳＤＳ，50mM Tris-HCl(pH6.
8)，１０％メルカプトエタノール，４０％グリセロー
ル、0.02％ブロモフェノールブルー，１mMフェニルメチ
ルスルホニルフロリド）を添加して可溶化した。遠心分
離で得られた上清（約３×１０６菌体分）を１０％ポリ
アクリルアミドゲルを用いて電気泳動した。さらに、ゲ
ル中のタンパク質を２５mM Tris-HCl(pH8.3),192mMグリ
シン−２０％メタノール中で電気泳動的にニトロセルロ
ースフィルター上にブロットした。次に、フィルターを
ＴＢＳ緩衝液〔５０mMTris-HCl(pH7.5)200mM NaCl〕に
浸した後、３％ゼラチン0.05% Tween２０を含むＴＢＳ
緩衝液中、３７℃で４０分インキュベートし、さらに３
０μｇの精製抗−Ｐ−４５０MC IgG，１％ゼラチン，0.
05% Tween２０をふくむＴＢＳ中３７℃で２時間インキ
ュベートした。その後、0.05% Tween２０を含む緩衝液
中、３７℃で３０分インキュベートする操作を４回繰り
返した後、３％ゼラチン，0.05% Tween２０を含むＴＢ
Ｓ緩衝液中に３７℃で２０分インキュベートした。次
に、２μCiの〔125Ｉ〕−プロテインＡ，１％ゼラチン
0.05% Tween２０を含むＴＢＳ緩衝液中、３７℃で７０
分インキュベートした後、0.05% Tween２０を含むＴＢ
Ｓ中３７℃で３０分インキュベートする操作を４回繰り
返した。フィルターを風乾した後、オートラジオグラフ
ィーを行ったところ、ラットＰ−４５０Ｃとほぼ同じ泳
動位置にP-450cddのバンドが認められた。バンドの濃さ
から、ＡＨ２２（ｐＡＣＤＤ２）株は菌体あたり少なく
とも２×１０５分子のP-450cddを産生していることが推
定された。
実施例４ ヘムを含有するP-450cddの定量 サッカロミセス・セレビシュ（Saccharomycescerevisia
e）ＡＨ２２（ｐＡＣＤＤ２）株の培養液（ＳＤ合成培
地、菌体濃度約1.5×107 cells/ml）１００mlを集菌
し、１０mlの１００mMリン酸カリウム緩衝液（pH7.0）
に懸濁した後、遠心分離した。得られたペレットを新た
に２ｍの１００mMリン酸カリウム緩衝液（pH7.0）懸
濁し、２本のキュベットに１mlずつ分注した。サンプル
側のキュベットに一酸化炭素を吹きこんだ後、両キュベ
ット内にジチオナイト５〜１０mgを添加し、攪拌した
後、２０分間放置した。その後、キュベット中の液を攪
拌して400〜500nmの差スペクトルを測定し、△ε447〜4
90＝91mM-1cm-1という大村、佐藤らの値を元にしてP-45
0濃度を算出した。その結果、サッカロミセス・セレビ
シェ（Saccharomyces serevisiae）ＡＨ２２（ｐＡＣＤ
Ｄ２）株は菌体あたり約1.5×105分子のヘムタンパク質
を産生していることがわかった。
e）ＡＨ２２（ｐＡＣＤＤ２）株の培養液（ＳＤ合成培
地、菌体濃度約1.5×107 cells/ml）１００mlを集菌
し、１０mlの１００mMリン酸カリウム緩衝液（pH7.0）
に懸濁した後、遠心分離した。得られたペレットを新た
に２ｍの１００mMリン酸カリウム緩衝液（pH7.0）懸
濁し、２本のキュベットに１mlずつ分注した。サンプル
側のキュベットに一酸化炭素を吹きこんだ後、両キュベ
ット内にジチオナイト５〜１０mgを添加し、攪拌した
後、２０分間放置した。その後、キュベット中の液を攪
拌して400〜500nmの差スペクトルを測定し、△ε447〜4
90＝91mM-1cm-1という大村、佐藤らの値を元にしてP-45
0濃度を算出した。その結果、サッカロミセス・セレビ
シェ（Saccharomyces serevisiae）ＡＨ２２（ｐＡＣＤ
Ｄ２）株は菌体あたり約1.5×105分子のヘムタンパク質
を産生していることがわかった。
実施例５ 酵母菌体のアセトアニリドｐ位水酸化活性の
測定 ＳＤ合成培地中で約1.4×107cells/mlまで培養したサッ
カロミセス・セレビシェ（Saccharomyces cerevisiae）
ＡＨ２２（ｐＡＡＨ５）、ＡＨ２２（ｐＡＭＣｌ）株お
よび1.2×107cells/mlまで培養したＡＨ２２（ｐＡＣＤ
Ｄ２）株の培養液中に1.5Mアセトアニリド（メタノール
溶液）を添加し、終濃度２５mMとした。
測定 ＳＤ合成培地中で約1.4×107cells/mlまで培養したサッ
カロミセス・セレビシェ（Saccharomyces cerevisiae）
ＡＨ２２（ｐＡＡＨ５）、ＡＨ２２（ｐＡＭＣｌ）株お
よび1.2×107cells/mlまで培養したＡＨ２２（ｐＡＣＤ
Ｄ２）株の培養液中に1.5Mアセトアニリド（メタノール
溶液）を添加し、終濃度２５mMとした。
その後、３０℃で振盪培養（120 cycle/min）し、１時
間ごとに少量ずつ分取し遠心分離で得た上清をＨＰＬＣ
で分析し生成したアセトアミノフェンを定量した。ＨＰ
ＬＣの条件を以下に示す。
間ごとに少量ずつ分取し遠心分離で得た上清をＨＰＬＣ
で分析し生成したアセトアミノフェンを定量した。ＨＰ
ＬＣの条件を以下に示す。
カラム：μBondapak C18（φ４mm×300mm） 溶媒：メタノール：水：酢酸＝15:84:1（Ｖ／Ｖ） 検出：A245nm 流速：2.0ml／min 温度：室温（20〜25℃） 培養0,4,7時間における菌体あたりのP-450含量はＡＨ２
２（ｐＡＭＣｌ）株が約5.5×105分子／菌体，ＡＨ２２
（ｐＡＣＤＤ２）株が約1.5×105分子／菌体であった
が、コントロールＡＨ２２（ｐＡＡＨ５）株ではＰ−４
５０は検出できなかった。各々の株の活性からＡＨ２２
（ｐＡＡＨ５）株の活性をさしひいた。Ｐ−４５０依存
性の活性をＰ−４５０含有で割ることにより、ＡＨ２２
（ｐＡＣＤＤ２）株にかけるP-450cddの１分子あたりの
活性はＡＨ２２（ｐＡＭＣ１）株におけるP-450MC１分
子あたりの活性の約５〜６倍であることがわかった。
２（ｐＡＭＣｌ）株が約5.5×105分子／菌体，ＡＨ２２
（ｐＡＣＤＤ２）株が約1.5×105分子／菌体であった
が、コントロールＡＨ２２（ｐＡＡＨ５）株ではＰ−４
５０は検出できなかった。各々の株の活性からＡＨ２２
（ｐＡＡＨ５）株の活性をさしひいた。Ｐ−４５０依存
性の活性をＰ−４５０含有で割ることにより、ＡＨ２２
（ｐＡＣＤＤ２）株にかけるP-450cddの１分子あたりの
活性はＡＨ２２（ｐＡＭＣ１）株におけるP-450MC１分
子あたりの活性の約５〜６倍であることがわかった。
実施例６ 酵母菌体の７−エトキシクマリンＯ−脱エチ
ル化活性の測定 ＳＤ合成培地中で約1.2×107cells／ｍまで培養した
ＡＨ２２（ｐＡＣＤＤ２），ＡＨ２２（ｐＡＭＣ１）株
の培養液中に２０mM７−エトキシクマリン（５０％メタ
ノール水溶液）を添加し、終濃度0.5mMとした。その
後、３０℃で振盪培養し、１時間ごとに0.25ｍずつ分
取し、遠心分離で得た上清0.2mlに２０％トリクロ酢酸2
3.5μクロロホルム1.0ｍを添加し、激しく攪拌し
た。遠心分離後、クロロホルム層0.5ｍに2.0ｍの0.
01N NaOH-0.1MＮａＣ水溶液を加えた後、激しく攪拌
し、遠心分離後、水層を励起波長366nm，螢光波長452nm
で螢光測定し、生成物７−ヒドロキシクマリンを定量し
た。
ル化活性の測定 ＳＤ合成培地中で約1.2×107cells／ｍまで培養した
ＡＨ２２（ｐＡＣＤＤ２），ＡＨ２２（ｐＡＭＣ１）株
の培養液中に２０mM７−エトキシクマリン（５０％メタ
ノール水溶液）を添加し、終濃度0.5mMとした。その
後、３０℃で振盪培養し、１時間ごとに0.25ｍずつ分
取し、遠心分離で得た上清0.2mlに２０％トリクロ酢酸2
3.5μクロロホルム1.0ｍを添加し、激しく攪拌し
た。遠心分離後、クロロホルム層0.5ｍに2.0ｍの0.
01N NaOH-0.1MＮａＣ水溶液を加えた後、激しく攪拌
し、遠心分離後、水層を励起波長366nm，螢光波長452nm
で螢光測定し、生成物７−ヒドロキシクマリンを定量し
た。
その結果、ＡＨ２２（ｐＡＣＤＤ２）株におけるP-450c
ddの１分子あたりの活性はＡＨ２２（ｐＡＣＭ１）株に
かけるP-450C１分子あたりの活性の約１５％であること
がわかった。上述したアセトアニリドｐ位水酸化活性は
P-450dの方がP-450Cよりも高いことが既知であるが、７
−エトキシクマリンＯ−脱エチル化活性は逆にP-450Cの
ほうが高いことが既知である。ここで得られた結果か
ら、P-450cddはP-450dの基質特異性を有すると推測でき
る。
ddの１分子あたりの活性はＡＨ２２（ｐＡＣＭ１）株に
かけるP-450C１分子あたりの活性の約１５％であること
がわかった。上述したアセトアニリドｐ位水酸化活性は
P-450dの方がP-450Cよりも高いことが既知であるが、７
−エトキシクマリンＯ−脱エチル化活性は逆にP-450Cの
ほうが高いことが既知である。ここで得られた結果か
ら、P-450cddはP-450dの基質特異性を有すると推測でき
る。
第１図は、ｐＡＣＤＤ２の塩基配列およびアミノ酸配列
を示す図である。 第２図はプラスミドｐＡＣＤＤ２の構築の概略を示す。 Sa,P,B,St,Hはそれぞれ制限酵素SalI,PatI,BalI,StuI,H
indIIIの切断部位を示す。 第３図はＡＨ２２（ｐＡＣＤＤ２）、ＡＨ２２（ｐＡＭ
Ｃ１）株の培養液中の生成アセトアミフェン濃度（nmol
／ml）及び菌体濃度（×108cells／ml）の経時変化を示
したものである。 ■，□は、それぞれＡＨ２２（ｐＡＣＤＤ２）株のアセ
トアミノフェン濃度、菌体濃度を示す。 ▲，△は、それぞれＡＨ２２（ｐＡＭＣ１）のアセトア
ミノフェン濃度、菌体濃度を示す。 第４図は、各菌株の培養液中の生成７−ヒドロキシクマ
リン濃度及び菌体濃度の経時変化を第３図と同様に示し
た図である。
を示す図である。 第２図はプラスミドｐＡＣＤＤ２の構築の概略を示す。 Sa,P,B,St,Hはそれぞれ制限酵素SalI,PatI,BalI,StuI,H
indIIIの切断部位を示す。 第３図はＡＨ２２（ｐＡＣＤＤ２）、ＡＨ２２（ｐＡＭ
Ｃ１）株の培養液中の生成アセトアミフェン濃度（nmol
／ml）及び菌体濃度（×108cells／ml）の経時変化を示
したものである。 ■，□は、それぞれＡＨ２２（ｐＡＣＤＤ２）株のアセ
トアミノフェン濃度、菌体濃度を示す。 ▲，△は、それぞれＡＨ２２（ｐＡＭＣ１）のアセトア
ミノフェン濃度、菌体濃度を示す。 第４図は、各菌株の培養液中の生成７−ヒドロキシクマ
リン濃度及び菌体濃度の経時変化を第３図と同様に示し
た図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:865）
Claims (6)
- 【請求項１】ラット肝チトクロムＰ−４５０ｃ遺伝子の
酵母ミクロソームへの局在化を司る領域を含むアミノ酸
末端側領域と、ラット肝チトクロムＰ−４５０ｄ遺伝子
のアミノ基末端側を除いた領域からなる下記塩基配列で
表されるキメラチトクロムＰ−４５０遺伝子 - 【請求項２】ラット肝チトクロムＰ−４５０ｃ遺伝子の
酵母ミクロソームへの局在化を司る領域を含むアミノ酸
末端側領域と、ラット肝チトクロムＰ−４５０ｄ遺伝子
のアミノ基末端側を除いた領域からなる下記塩基配列で
表されるキメラチトクロムＰ−４５０遺伝子を含み該遺
伝子を酵母内で発現させる酵母発現プラスミド - 【請求項３】ラット肝チトクロムＰ−４５０ｃ遺伝子の
酵母ミクロソームへの局在化を司る領域を含むアミノ酸
末端側領域と、ラット肝チトクロムＰ−４５０ｄ遺伝子
のアミノ基末端側を除いた領域からなる下記塩基配列で
表されるキメラチトクロムＰ−４５０遺伝子を含み該遺
伝子を酵母内で発現させる酵母発現プラスミドで形質転
換されたキメラチトクロムＰ−４５０を菌体内で発現す
る酵母菌株 - 【請求項４】下記の制限酵素地図で表されることを特徴
とする特許請求の範囲第２項記載の発現プラスミドｐＡ
ＣＤＤ２ - 【請求項５】下記の制限酵素地図で表される発現プラス
ミドｐＡＣＤＤ２を保持することを特徴とする特許請求
の範囲第３項記載の酵母菌株 - 【請求項６】酵母菌株がサッカロミセス・セレビシェー
ＡＨ２２株であることを特徴とする特許請求の範囲第５
項記載の菌株
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61076633A JPH0636744B2 (ja) | 1986-04-04 | 1986-04-04 | キメラチトクロムｐ−４５０遺伝子 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61076633A JPH0636744B2 (ja) | 1986-04-04 | 1986-04-04 | キメラチトクロムｐ−４５０遺伝子 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS62236485A JPS62236485A (ja) | 1987-10-16 |
| JPH0636744B2 true JPH0636744B2 (ja) | 1994-05-18 |
Family
ID=13610778
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61076633A Expired - Lifetime JPH0636744B2 (ja) | 1986-04-04 | 1986-04-04 | キメラチトクロムｐ−４５０遺伝子 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0636744B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2561122B2 (ja) * | 1988-04-13 | 1996-12-04 | 寳酒造株式会社 | 機能性ポリペプチド |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0630584B2 (ja) * | 1985-10-31 | 1994-04-27 | 工業技術院長 | 複数のチトクロムｐ−４５０遺伝子から構築したキメラチトクロムｐ−４５０遺伝子、およびそれを含む酵母内発現用プラスミドとその製造法、ならびに菌体内にそれらのプラスミドを保有する酵母菌株 |
-
1986
- 1986-04-04 JP JP61076633A patent/JPH0636744B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS62236485A (ja) | 1987-10-16 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |