JPH064019B2

JPH064019B2 - 微生物

Info

Publication number: JPH064019B2
Application number: JP20845585A
Authority: JP
Inventors: 隆三川; 玲子指田; 信伊東; 達也山形
Original assignee: Mitsubishi Chemical Industries Ltd
Current assignee: Mitsubishi Chemical Corp
Priority date: 1985-09-20
Filing date: 1985-09-20
Publication date: 1994-01-19
Anticipated expiration: 2009-01-19
Also published as: JPS6269981A

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野）本発明は、糖脂質分解酵素産生能を有する微生物に関す
る。

（従来の技術）糖脂質は細胞表層の主要な構成成分であり、細胞の膜抗
原、血液型物質、相互識別、分化等の重要な膜機能との
関連が注目され、糖鎖の構造と機能の解明が検討されて
いるが、このためには、特異性の高い酵素が重要な役割
を果す。

（発明が解決しようとする問題点）しかしながら、従来糖脂質の糖鎖切断用の酵素として
は、エキソ型糖脂質分解酵素のみが知られ、エンド型糖
脂質分解酵素は知られていない。

（問題点を解決するための手段）本発明者等は、糖脂質の糖鎖を切断する糖脂質分解酵素
を探索中のところ、エンド型糖脂質分解酵素を産生する
能力を有する微生物を見出し、本発明を達成したもので
ある。

すなわち、本発明の要旨は糖脂質を資化し、エンド型糖
脂質分解酵素の産性能を有するロドコツカスエスピーＧ
−７４（Rhodococcus sp.Ｇ−７４）にある。

以下、本発明を詳細に説明する。

本発明に係るロドコツカスエスピーＧ−７４は、本発明
者らにより東京都町田市で採取した土壌より分離された
ものであり、微工研菌寄第８４２４号（ＦＥＲＭＰ−
８４２４）として寄託されている。

上記ロドコツクスエスピーＧ−７４の形態学的特徴、各
種培地上の性状及び生理的、生化学的性質は以下に示す
通りである。

(1)形態学的特徴（ハート・インフュージヨン寒天培地
上で３０℃、６〜４８時間培養） (イ)細胞形態：培養後、７時間位まで細胞は不均一に伸
長し、菌糸状に生育し、稀に分岐が観察される。その
後、菌糸状細胞はジグザグ状に曲がり、漸次分裂を繰り
返す。２４時間以降の古い培養では、菌糸の分節（frag
mentation）が生起し、桿状（1.6〜6.6×1.0〜1.2μm）
から球状（1.0〜1.2μm）になる。

(ロ)分裂様式：スナツピング（napping）型 (ハ)運動性：なし (ニ)胞子形成：なし (ホ)グラム染色性：陽性 (ヘ)抗酸性：弱い抗酸性 (2)各種培地上の性状 (イ)３０℃のシユクロース−硝酸塩寒天培地：生育微
弱；コロニー色は無色；気中菌糸なし；拡散性色素なし (ロ)３０℃のグルコース−アスパラギン寒天培地：生育
微弱；コロニー色は無色；期中菌糸なし；拡散性色素な
し (ハ)３０℃のグリセリン−アスパラギン寒天培地：生育
微弱；コロニー色は無色；期中菌糸なし；拡散性色素な
し (ニ)３０℃のスターチ寒天培地：生育微弱；コロニー色
は無色；気中菌糸なし；拡散性色素なし (ホ)３０℃のチロシン寒天培地：生育微弱；コロニー色
は無色；気中菌糸なし (ヘ)３０℃の普通寒天培地：生育良好；コロニー色は黄
味白色に近い薄橙色；気中菌糸なし；拡散性色素なし (ト)３０℃のイーストー麦芽寒天培地：生育良好；コロ
ニー色はにぶ橙色；気中菌糸なし；拡散性色素なし (チ)３０℃のオートミール寒天培地：生育微弱；コロニ
ー色は無色；気中菌糸なし；拡散性色素なし (3)生理的性質 (イ)生育温度範囲（ハートインフュージヨン寒天培
地）：１０〜３７℃ (ロ)空気中での発育：良好 (ハ)嫌気条件下での発育：生育せず (ニ)カタラーゼ：陽性 (ホ)オキシダーゼ：陽性 (ヘ)Ｏ−Ｆテスト：陰性 (ト)酸の生成（グルコース）：陰性 (チ)ゼラチンの液化：陰性 (リ)スターチの加水分解：陰性 (ヌ)脱脂牛乳の凝固、ペプトン化：陰性 (ル)リトマスミルク：変化なし (オ)メラニン様色素の生成（チロシン寒天培地及びペプ
トン−イースト鉄寒天培地）：陰性 (ワ)糖類の資化性（プリドハム−ゴトリーブ寒天培地上
で３０℃、２１日間培養）：Ｌ−アラビノース − Ｄ−キシロース − Ｄ−グルコース＋Ｄ−フラクトース ± シュクロース − イノシトール − Ｌ−ラムノース − ラフイノース − Ｄ−マンニツト − (カ)糖脂質の資化性（プリドハム−ゴトリーブ寒天培地
上で３０℃、２１日間培養）：ガングリオシド＋＋ (4)生化学的性質 (イ)ＤＮＡの塩基組成ＧＣ含量：69.5％ (ロ)細胞壁の主要なアミノ酸組成：ＤＬ−ジアミノピメ
リン酸 (ハ)グリコレート：テスト：グリコリル型 (ニ)ミコール酸の総炭素数：Ｃ₄₀〜Ｃ₄₆ (5)分類学的考察〔高次の分類学上の位置〕本菌株は、セルサイクル（cell cycle）に多形性を示
し、培養初期に菌糸状に生育し、古い培養では菌糸の断
裂が起つて、桿状〜球状の細胞になり、細胞の分裂様式
はスナツピング（snapping）型を示す。また、グラム染
色性は強い陽性を示し、抗酸性染色は弱陽性を呈する。
更に、本菌のＤＮＡのＧＣ含量は69.5％と高いＧＣ量を
示し、細胞壁の主要なアミノ酸組成はＤＬ−ジアミノピ
メリン酸を有し、ペプチドグリカン糖鎖部はグリコリル
型を示す。

本菌株（Ｇ−７４）は、以上に示した形態的、生理的、
生化学的特性からして、ミコバクテリア料（Mycobacter
iaceae）あるいはノカルデイア科（Nocardiaceae）に所
属するものと考えられる。

一方Journal of General Microbiology、７１巻、７７頁
（１９７２）の記載及びJournal of General Microbiol
ogy、８８巻、２００頁（１９７５）の記載によれば、放
線菌関連群の分類にミコール酸の存在又はその構造をと
り挙げ、これが今日広く受け入れられている。この分類
体系によれば、ミコバクテリア科（Mycobacteriaceae）
の菌はＣ₆₀〜Ｃ₉₀の炭素数のミコール酸を含有し、ノカ
ルデイア科（Nocardiaceae）の菌はＣ₄₀〜Ｃ₆₀の炭素数
のミコール酸を含有する。

本菌株についてミコール酸の分析を行なつた結果、本菌
株はＣ₄₀〜Ｃ₄₆の炭素数のミコール酸を含有しているこ
とが判明した。よつて、本菌はノカルデイア科に属する
菌種であることが明らかである。

〔属レベルの同定〕バージエイのマニユアル〔Bergey's Manual〕第８版
（１９７４）によれば、ノカルデイア科に属するものと
しては、ノカルデイア（Nocardia）属とシユウドノカル
デイア（Pseudonocardia）属の２種が含まれている。

とくに、ノカルデイア属は培養初期の形態や気中菌糸の
有無によつて３種の型に大別されていたが、今日では、
これ等のうちＩ、II型に属する菌種の多くは、形態的特
性、細胞壁組成、リン脂質、メナキノン型、ミコール酸
の構造等の相違により、新属ロドコツカス（Rhodococcu
s）属に移されている。

〔International Journal of Systematic Bacteriolog
y、２４巻、２７８頁（１９７０）の記載及びJournal of
General Microbiology、１００巻、９９頁（１９７７）
の記載を参照〕。

本菌株（Ｇ−７４）は細胞の分裂様式から、シユウドノ
カルデイア属とは容易に区別され、Ｃ₄₀〜Ｃ₄₆の炭素数
を持つたミコール酸を含有していることから、ノカルデ
イア属（Ｃ₄₆〜Ｃ₅₂）とも識別される。

以上のとおり、本菌株は１）好気性のグラム陽性菌であ
り、２）多形性で、３）培養初期にプリミテイブ（prim
itive）な菌糸を形成し、すぐに分節して桿状〜球状に
なる、４）ミコール酸（Ｃ₄₀〜Ｃ₄₆）を含有する、５）
ＧＣ含量69.5％の特徴を持つていること等からして、本
菌株は、ロドコツカス（Rhodococcus）属の概念に良く
合致した。

よつて、本菌株（Ｇ−７４）は、ロドコツカスエスピー
（Rhodococcus sp.）と同定した。

本発明に係る上記ロドコツカスエスピーＧ−７４は、糖
脂質を基質として培養することにより、培地中にエンド
型糖脂質分解酵素を分泌産生するので、培地から硫安塩
析によつて容易にこの酵素を採取することができる。こ
の微生物の培養に使用される培地は、たとえばペプトン
培地が好適に使用されるが、糖脂質を含むことが必要で
ある。糖脂質としては、たとえば糖鎖にシアル酸が結合
したガングルシド又はそれを含む牛脳アセトンパウダー
が好適に使用される。もちろん、培地中には、上記以外
の各種の炭素源、窒素源等を添加することができる。

培地のpHは通常５〜９、好適には７附近、温度は２０〜
３５℃程度、好適には28〜30℃が選ばれる。

培養は、１〜１０日間程度、好ましくは２〜６日間が選
ばれる。

酵素の生産に際しては、増殖菌体、休止菌体のいずれを
も用いることができる。

培養物からの酵素の採取、精製は、たとえば次のような
方法によることができる。

即ち、まず上記の菌株の培養液を、遠心分離して上清を
採取し、固形硫安を飽和溶液の８０％になるように添加
して塩析し、沈澱物を蒸留水に溶解し、カラムクロマト
グラフイーにより精製することにより精製する。

次に、この酵素の理化学的性質について詳細に説明する
が、酵素活性の測定は以下の方法によつた。

〔酵素活性の測定〕

酵素液１００μ 基質１００μ 〔0.1Ｍの酢酸緩衝液（pH６．０）に５mg／mlの牛脳ガ
ングリオシド及び１mg／mlのＴＤＣ（タウロデオキシコ
ール酸ナトリウム、界面活性剤）を加えたもの〕上記の酵素液及び基質を混合し、３７℃で酵素活性の強
さに応じて、１時間〜１夜間反応させた後、反応液１０
０μを採取し、パーク・ジヨンソン（Park-Johnson〕
法により還元力を測定し、１分間に１μmolのグルコー
スに対応する還元力を生じる酵素量を１単位とする。反
応液は薄層クロマトグラフイーで分析してオリゴ糖及び
セラミドが生じているかどうかを確認する。

〔酵素の理化学的性質〕

(イ)作用糖脂質に作用し、糖鎖とセラミドの間を切断してオリゴ
糖とセラミドを生成する。

動物界に広く存在していることが知られているスフイン
ゴ糖脂質は、スフインゴ塩基の第一級アルコール性水酸
基がグリコシド結合によつて単糖又はオリゴ糖と結合
し、更に脂肪酸がスフインゴ塩基に酸アミド結合したも
のであり、このスフインゴ塩基と脂肪酸からなる部分を
セラミドと呼んでいる。（脂質の化学、３６５頁、１９
７４年、東京化学同人社発行）。

この酵素は、この糖脂質に作用して、オリゴ糖の糖鎖と
セラミドの間を切断してオリゴ糖とセラミドを生成する
作用を有する。

即ち、ガングリオシド（ganglioside）系列の酸性糖脂
質、例えば、ＧＴ、ＧＴ_1a、ＧＤ_1b、ＧＭ_1a、ＧＭ₂、
ＧＭ₃（脂質の化学、３８９〜３９１頁、１９７４年、
東京化学同人社発行）、及びラクトシルセラミド、パラ
グロポシド、フコシルペンタグリコシルセラミドのよう
な中性糖脂質等を分解して、オリゴ等とセラミドを生成
する。

(ロ)基質特異性上記のように、この酵素は、オリゴ糖とセラミドとが結
合した糖脂質の、糖鎖とセラミドとの間を切断してオリ
ゴ糖を生成する。即ち、所謂エンドグリコシダーゼ活性
を有するが、単糖は生成しない。換言すれば、エキソグ
イコシダー活性は有しない。

また、グルコース、ガラクトース等の単糖とセラミドと
が結合したセレブロシド（cerebroside）は分解しな
い。

更に、特筆すべきことは、この酵素は糖脂質におけるセ
ラミドに直接結合するグルコースとセラミドの間を切断
するのみでなく、例えば、トリガラクトシルセラミドの
ようなセラミドに直接結合するガラクトースとセラミド
の間を切断する作用をも有することである。

(ハ)至適pH ６ (ニ)安定pH ５〜９ (ホ)作用最適温は３７℃であり、３０〜４０℃の範囲で
適用可能である。

(ヘ)分子量ＳＤＳ−１０％ポリアクリルアミドゲル電
気泳動による分子量は約６６０００である。

なお、本酵素はセフアデツクスＧ−１００ゲル過にお
いては、ボイドボリュ―ム（void volume）位置に溶出
された（見かけ上の分子量約１５万）。

(ト)安定性３７℃で一夜間安定であり、また、凍結乾
燥品は−２５℃で少なくとも数ケ月間安定である。

(チ)阻害酵素活性は銅イオン及び水銀イオンにより阻
害されるが、カルシウムイオン及びマグネシウムイオン
による影響はない。

(リ)活性化酵素の基質に対する活性は界面活性剤の添
加により顕著に増大する。即ち、反応の際に、前記ＴＤ
Ｃを０．５mg／ml添加すると、無添加の場合に比して反
応は２．５倍に増大する。

この酵素を利用して以下の事項を解明することができ
る。

(1)糖脂質における糖鎖の役割を知ることができる。

(2)本酵素で切り出したオリゴ糖は、簡単な方法によつ
て〔^３Ｈ〕−標識又は２−アミノピリジンその他の螢光
物質による標識をすることができ、このため、従来の数
百倍の感度で糖鎖の構造決定ができる。

(3)本酵素は糖脂質に対して特異的に作用し、糖蛋白質
に対しては作用しないので、微量の試料についても、糖
蛋白質であるか、糖脂質であるかの識別を容易に行なう
ことができる。

以上の事項から、本酵素を使用して例えば細胞表層のウ
イルス・レセプター、細胞毒素（例えばコレラトキシ
ン）のレセプター、特異的ガン抗原、発生・分化に伴う
特異抗原等の構造決定及び糖鎖の役割などを調べること
が可能となり、その結果、それらに対する診断薬、治療
薬等の開発が期待される。

（実施例）以下、実施例により本発明をさらに説明する。

実施例 (1)菌の培養と培養上清の調製ロドコツカスエスピーＧ−７４（Rhodococcus sp.Ｇ−
７４）（微工研菌寄第８４２４号（ＦＥＲＭＰ−８４
２４））を、ポリペプトン0.5％、イーストエキス0.1
％、塩化ナトリウム0.2％及び誘引剤（ガングリオシド
0.1％又は牛脳アセトンパウダー１％）を含む２０００m
lの液体培地（pH7.0〜7.2）を用いて２８〜３０℃で４
日間培養した後、培養液を遠心分離（６０００rpm、３
０分間）し、上清を採取した。

(2)酵素の調製上記に得た上清液１８００mlに固形硫安を、飽和溶液の
８０％濃度となるように加え５℃で一夜間放置した後、
同温度で４０分間遠心分離（６０００rpm）して沈澱物
を採取し、１２５mlの蒸留水に溶解し、セフアデツクス
Ｇ−１００（セフアデツクスは商標）のカラム（５×８
６cm）に導入し、0.2Ｍの食塩を含む０．０１Ｍの酢酸
緩衝液（pH6.0）を用いて展開して、酵素活性を有する
画分を採取した。こうして得られた本酵素の比活性は
５．８ｍ単位／mg蛋白質であり、他のグリコシダーゼ及
びプロテアーゼ等を全く含まず、構造解析用試薬として
充分使用可能であつた。

（発明の効果）本発明に係る微生物は、特異性の高いエンド型糖脂質分
解酵素を産生する。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】糖脂質を資化し、エンド型糖脂質分解酵素
の産生能を有するロドコツカスエスピーＧ−７４（Rhod
ococcus sp.Ｇ−７４）。