JPH064038B2 - Ｌ−フコ−スの定量方法 - Google Patents
Ｌ−フコ−スの定量方法Info
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- JPH064038B2 JPH064038B2 JP61017435A JP1743586A JPH064038B2 JP H064038 B2 JPH064038 B2 JP H064038B2 JP 61017435 A JP61017435 A JP 61017435A JP 1743586 A JP1743586 A JP 1743586A JP H064038 B2 JPH064038 B2 JP H064038B2
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- dehydrogenase
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- C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
- C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
- C12Y302/01051—Alpha-L-fucosidase (3.2.1.51)
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
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- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
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- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
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- C12Q1/32—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase involving dehydrogenase
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、中性付近に至適pHをもつＬ−フコース・デヒ
ドロゲナーゼを用いて、被検液中のＬ−フコースを定量
する方法に関する。
ドロゲナーゼを用いて、被検液中のＬ−フコースを定量
する方法に関する。
高等動物由来の複合糖鎖の非還元末端または枝分れ部分
に存在するα−Ｌ−フコシル基は細胞認識、免疫応答な
どに重要な役割を果たしている、例えばABO式およびル
イス式血液型では抗原決定基となつており、これら血液
型物質の糖鎖構造と抗原特異性を解明する研究が最近注
目されている。また、細胞の癌化は糖脂質の糖鎖変化と
して顕著に表われており、癌関連糖脂質は癌が発生する
組織に固有の糖鎖が非還元末端で変化したものが多く、
組織の分化と密接に関係している。即ち、各種臓器癌に
それぞれ特異的なＬ−フコース含有糖脂質が蓄積される
ということである。これら癌関連糖鎖抗原は血中にも放
出されるから、血中の糖鎖抗原の構造解析による臓器癌
の診断が行われている。α−Ｌ−フコシダーゼは複合糖
質中のα−Ｌ−フコシル基に作用して、Ｌ−フコースを
遊離する酵素でこれら種々の糖鎖に含まれるＬ−フコー
スの結合位置の解析に有効であり、上記酵素の作用によ
り、または0.1Ｎトリクロロ酢酸存在下で、１００℃、
１時間処理する化学的方法によりＬ−フコース残基を遊
離させた後、Ｌ−フコースを定量すれば癌化の程度まで
診断が可能である。また、癌の進行につれ血中Ｌ−フコ
ース含量が減少し、化学療法による癌の退行とともに血
中Ｌ−フコース含量が増加することから血中Ｌ−フコー
ス含量の測定も癌化レベルの指標となりつつある。
に存在するα−Ｌ−フコシル基は細胞認識、免疫応答な
どに重要な役割を果たしている、例えばABO式およびル
イス式血液型では抗原決定基となつており、これら血液
型物質の糖鎖構造と抗原特異性を解明する研究が最近注
目されている。また、細胞の癌化は糖脂質の糖鎖変化と
して顕著に表われており、癌関連糖脂質は癌が発生する
組織に固有の糖鎖が非還元末端で変化したものが多く、
組織の分化と密接に関係している。即ち、各種臓器癌に
それぞれ特異的なＬ−フコース含有糖脂質が蓄積される
ということである。これら癌関連糖鎖抗原は血中にも放
出されるから、血中の糖鎖抗原の構造解析による臓器癌
の診断が行われている。α−Ｌ−フコシダーゼは複合糖
質中のα−Ｌ−フコシル基に作用して、Ｌ−フコースを
遊離する酵素でこれら種々の糖鎖に含まれるＬ−フコー
スの結合位置の解析に有効であり、上記酵素の作用によ
り、または0.1Ｎトリクロロ酢酸存在下で、１００℃、
１時間処理する化学的方法によりＬ−フコース残基を遊
離させた後、Ｌ−フコースを定量すれば癌化の程度まで
診断が可能である。また、癌の進行につれ血中Ｌ−フコ
ース含量が減少し、化学療法による癌の退行とともに血
中Ｌ−フコース含量が増加することから血中Ｌ−フコー
ス含量の測定も癌化レベルの指標となりつつある。
これらのＬ−フコースの定量法としては、試料中の遊離
Ｌ−フコース画分をゲル過またはイオン交換法によつ
て精製し、ガスクロマトグラフイーで定量する方法（メ
ソツズ・イン・エンジモロジー第２８巻、第７３８頁、
１９７２年）、過ヨウ素酸酸化によつて生ずるアセトア
ルデヒドを定量する方法（ジヤーナル・オブ・バイオロ
ジカル・ケミストリー、第２４５巻、第１６５９頁、１
９７０年）などがあるが操作は非常に繁雑であり、また
精度にも問題がある。以上の化学法に比べてＬ−フコー
ス・デヒドロゲナーゼを用いる酵素法では試料中のＬ−
フコースを精製する必要もなく、迅速かつ正確に定量す
ることが可能となる。Ｌ−フコース・デヒドロゲナーゼ
は微生物では既にプルラリア・プルラン（Pullularia p
ullulans）に、また動物組織ではブタ肝臓やウサギ肝臓
などにその存在が報告されているが、いずれの起源の酵
素も反応至適pHが１０付近にあることから、細胞に障害
を与えることなく、Ｌ−フコースを定量するためには満
足なものではない。さらに前記α−Ｌ−フコシダーゼは
反応至適pHが酸性乃至弱酸性にあり、pH１０付近ではほ
とんど作用を示さない。それ故複合糖鎖中のＬ−フコー
スをα−Ｌ−フコシダーゼとＬ−フコース・デヒドロゲ
ナーゼで同時に処理して定量することは反応性の面から
非常に困難であり、まず、酸性乃至弱酸性域で試料にα
−Ｌ−フコシダーゼを作用させて、遊離Ｌ−フコースを
得たのち、アルカリ側にpHを調整し、これにＬ−フコー
ス・デヒドロゲナーゼを作用させ遊離Ｌ−フコースを定
量するという繁雑な方法を用いなければならなかつた。
Ｌ−フコース画分をゲル過またはイオン交換法によつ
て精製し、ガスクロマトグラフイーで定量する方法（メ
ソツズ・イン・エンジモロジー第２８巻、第７３８頁、
１９７２年）、過ヨウ素酸酸化によつて生ずるアセトア
ルデヒドを定量する方法（ジヤーナル・オブ・バイオロ
ジカル・ケミストリー、第２４５巻、第１６５９頁、１
９７０年）などがあるが操作は非常に繁雑であり、また
精度にも問題がある。以上の化学法に比べてＬ−フコー
ス・デヒドロゲナーゼを用いる酵素法では試料中のＬ−
フコースを精製する必要もなく、迅速かつ正確に定量す
ることが可能となる。Ｌ−フコース・デヒドロゲナーゼ
は微生物では既にプルラリア・プルラン（Pullularia p
ullulans）に、また動物組織ではブタ肝臓やウサギ肝臓
などにその存在が報告されているが、いずれの起源の酵
素も反応至適pHが１０付近にあることから、細胞に障害
を与えることなく、Ｌ−フコースを定量するためには満
足なものではない。さらに前記α−Ｌ−フコシダーゼは
反応至適pHが酸性乃至弱酸性にあり、pH１０付近ではほ
とんど作用を示さない。それ故複合糖鎖中のＬ−フコー
スをα−Ｌ−フコシダーゼとＬ−フコース・デヒドロゲ
ナーゼで同時に処理して定量することは反応性の面から
非常に困難であり、まず、酸性乃至弱酸性域で試料にα
−Ｌ−フコシダーゼを作用させて、遊離Ｌ−フコースを
得たのち、アルカリ側にpHを調整し、これにＬ−フコー
ス・デヒドロゲナーゼを作用させ遊離Ｌ−フコースを定
量するという繁雑な方法を用いなければならなかつた。
本発明の目的は、中性付近に反応至適pHを有するＬ−フ
コース・デヒドロゲナーゼを用いて、Ｌ−フコースの迅
速・簡便かつ安価な定量法を提供することにある。
コース・デヒドロゲナーゼを用いて、Ｌ−フコースの迅
速・簡便かつ安価な定量法を提供することにある。
本発明者等は、被検液中のＬ−フコースを定量法につい
て鋭意検討を重ねた結果、特定のＬ−フコース・デヒド
ロゲナーゼを用いて、迅速・簡便かつ安価なＬ−フコー
スの定量法をここに見出した。
て鋭意検討を重ねた結果、特定のＬ−フコース・デヒド
ロゲナーゼを用いて、迅速・簡便かつ安価なＬ−フコー
スの定量法をここに見出した。
本発明は被検液中のＬ−フコースを定量するに際し、α
−Ｌ−フコシダーゼの存在下または不存在下、被検液に
至適pHが中性付近であるＬ−フコース・デヒドロゲナー
ゼを作用させ、生成する還元型ニコチンアミドアデニン
ジヌクレオチドを測定することからなるＬ−フコースの
定量法にある。
−Ｌ−フコシダーゼの存在下または不存在下、被検液に
至適pHが中性付近であるＬ−フコース・デヒドロゲナー
ゼを作用させ、生成する還元型ニコチンアミドアデニン
ジヌクレオチドを測定することからなるＬ−フコースの
定量法にある。
即ち本発明はＬ−フコースの定量法に関するものであつ
て、その特徴とするところは、被検液中のＬ−フコース
を定量するに当り、中性付近に至適pHを有する特定のＬ
−フコース・デヒドロゲナーゼを用いて定量することで
ある。さらに上記酵素を用いるＬ−フコースの定量がニ
コチンアミドアデニンジヌクレオチド（NAD）の存在下
で行われ、生成する還元型ニコチンアミドアデニンジヌ
クレオチド（NADH）の紫外部の吸収の増加を測定するこ
と、およびＬ−フコースの定量が、NAD、テトラゾリウ
ム塩（酸化型）およびジアホラーゼまたはフエナジンメ
トサルフエイト（酸化型）またはメトキシフエナジンメ
トサルフエイト（酸化型）の存在下で行われ、生成する
ホルマザン色素を定量することを特徴とする。
て、その特徴とするところは、被検液中のＬ−フコース
を定量するに当り、中性付近に至適pHを有する特定のＬ
−フコース・デヒドロゲナーゼを用いて定量することで
ある。さらに上記酵素を用いるＬ−フコースの定量がニ
コチンアミドアデニンジヌクレオチド（NAD）の存在下
で行われ、生成する還元型ニコチンアミドアデニンジヌ
クレオチド（NADH）の紫外部の吸収の増加を測定するこ
と、およびＬ−フコースの定量が、NAD、テトラゾリウ
ム塩（酸化型）およびジアホラーゼまたはフエナジンメ
トサルフエイト（酸化型）またはメトキシフエナジンメ
トサルフエイト（酸化型）の存在下で行われ、生成する
ホルマザン色素を定量することを特徴とする。
また、本発明に供される被検液としては、遊離Ｌ−フコ
ースおよび／または生体成分に結合したＬ−フコースを
含有する被検液がある。
ースおよび／または生体成分に結合したＬ−フコースを
含有する被検液がある。
次に、本発明に用いられるＬ−フコース・デヒドロゲナ
ーゼは、中性付近に至適pHを有するという点で、コリネ
バクテリウム属より選ばれたＬ−フコース・デヒドロゲ
ナーゼ生産菌（コリネバクテリウムsp.FS−００７７）
より取得される酵素（このＬ−フコース・デヒドロゲナ
ーゼについては本願出願人により昭和６０年１２月２６
日付で発明の名称「Ｌ−フコース・デヒドロゲナーゼの
製造法」として特許出願済である）を使用するのが有利
である。
ーゼは、中性付近に至適pHを有するという点で、コリネ
バクテリウム属より選ばれたＬ−フコース・デヒドロゲ
ナーゼ生産菌（コリネバクテリウムsp.FS−００７７）
より取得される酵素（このＬ−フコース・デヒドロゲナ
ーゼについては本願出願人により昭和６０年１２月２６
日付で発明の名称「Ｌ−フコース・デヒドロゲナーゼの
製造法」として特許出願済である）を使用するのが有利
である。
まず、本発明で使用されるＬ−フコース・デヒドロゲナ
ーゼの各性質を示す。
ーゼの各性質を示す。
Ｌ−フコース・デヒドロゲナーゼの酵素化学的および理
化学的性質； (1)作用： 本酵素は下記反応式のごとく、Ｌ−フコースを酸化して
Ｌ−フコノ−δ−ラクトンを生成する。
化学的性質； (1)作用： 本酵素は下記反応式のごとく、Ｌ−フコースを酸化して
Ｌ−フコノ−δ−ラクトンを生成する。
Ｌ−フコース＋NAD+→Ｌ−フコノ−δ−ラクトン＋NADH＋H+ (2)基質特異性： 本酵素はＬ−フコースに最も特異性が高いが、Ｌ−ガラ
クトース、Ｄ−アラビノースなどにも作用する（第１
表）。
クトース、Ｄ−アラビノースなどにも作用する（第１
表）。
また、本酵素は補酵素としてNADを要求し、NADPには全
く作用を示さない。
く作用を示さない。
(3)至適pHおよびpH安定性： 本酵素の至適pHは７．５〜８．０付近にある。また、本
酵素を３０℃において、それぞれのpHで６０分間処理し
たときはpH６．０〜１０．５まで安定であつた。
酵素を３０℃において、それぞれのpHで６０分間処理し
たときはpH６．０〜１０．５まで安定であつた。
(4)至適温度および熱安定性： 本酵素は４３℃に至適温度を有している。また、本酵素
をpH８．０においてそれぞれの温度で１０分間処理した
とき４０℃まで安定であつたが、６０℃では完全に失活
した。
をpH８．０においてそれぞれの温度で１０分間処理した
とき４０℃まで安定であつたが、６０℃では完全に失活
した。
(5)分子量： 本酵素の分子量はセフアクリルＳ−２００（フアルマシ
ア製）によるゲル過法では26000であつた。
ア製）によるゲル過法では26000であつた。
(6)等電点： フアルマイト（pH５〜８、フアルマシア製）を用いた等
電点電気泳動法により求めた本酵素の等電点は5.85であ
つた。
電点電気泳動法により求めた本酵素の等電点は5.85であ
つた。
(7)金属イオンの影響： 本酵素は第２表に示すように、Hg2+およびAg+により強
力に阻害された。
力に阻害された。
(8)Km値： ラインウイバー−バーク（Lineweaver-Burk）プロツト
により本酵素のＬ−フコースに対するKm値を求めたとこ
ろ、1.3×１０-3Ｍであつた。
により本酵素のＬ−フコースに対するKm値を求めたとこ
ろ、1.3×１０-3Ｍであつた。
(9)酵素活性測定法： Ｌ−フコース・デヒドロゲナーゼ活性の測定は次のよう
にして求めた。即ち、３０mMＬ−フコース１．０ml、２
００mMグリシン−水酸化ナトリウム、緩衝液（pH８．
０）１．８ml、１５mM NAD0.1mlおよび適当に希釈した
酵素液０．１ml、反応液量３．０mlで３７℃、１０分間
反応させたのち、３４０nmにおける吸光度を、測定する
（ODサンプル）。別に対照として酵素溶液の代りに蒸留水
０．１mlを加え、同様の操作によつて吸光度を測定し
（ODブランク）、△OD340（ODサンプル−ODブランク）を求めた。Ｌ
−フコース・デヒドロゲナーゼ活性は下記の計算式によ
つて求められる。
にして求めた。即ち、３０mMＬ−フコース１．０ml、２
００mMグリシン−水酸化ナトリウム、緩衝液（pH８．
０）１．８ml、１５mM NAD0.1mlおよび適当に希釈した
酵素液０．１ml、反応液量３．０mlで３７℃、１０分間
反応させたのち、３４０nmにおける吸光度を、測定する
（ODサンプル）。別に対照として酵素溶液の代りに蒸留水
０．１mlを加え、同様の操作によつて吸光度を測定し
（ODブランク）、△OD340（ODサンプル−ODブランク）を求めた。Ｌ
−フコース・デヒドロゲナーゼ活性は下記の計算式によ
つて求められる。
６．２２：３４０nmにおけるNADHのミリモル分子吸光係
数 ｄ：光路長（cm） df：希釈率 〔作用〕 被検液中のＬ−フコースはNADの存在下、Ｌ−フコース
・デヒドロゲナーゼの作用により、Ｌ−フコノ−δ−ラ
クトンとNADHを生成する。生成したNADHの定量には公知
の方法を用いることができる。例えば、NADHそのものの
３４０nmにおける分子吸光係数から定量するかNADHにニ
トロブルーテトラゾリウムあるいはインドニトロテトラ
ゾリウムなどのテトラゾリウム塩（酸化型）およびジア
ホラーゼまたはフエナジンメトサルフエイト（酸化型）
またはメトキシフエナジンメトサルフエイト（酸化型）
を作用させて、生成するホルマザン色素の可視部の吸収
（例えばニトロブルーテトラゾリウム（酸化型）の場
合、５４０〜５８０nm）を測定することによつて定量す
ることができる。
数 ｄ：光路長（cm） df：希釈率 〔作用〕 被検液中のＬ−フコースはNADの存在下、Ｌ−フコース
・デヒドロゲナーゼの作用により、Ｌ−フコノ−δ−ラ
クトンとNADHを生成する。生成したNADHの定量には公知
の方法を用いることができる。例えば、NADHそのものの
３４０nmにおける分子吸光係数から定量するかNADHにニ
トロブルーテトラゾリウムあるいはインドニトロテトラ
ゾリウムなどのテトラゾリウム塩（酸化型）およびジア
ホラーゼまたはフエナジンメトサルフエイト（酸化型）
またはメトキシフエナジンメトサルフエイト（酸化型）
を作用させて、生成するホルマザン色素の可視部の吸収
（例えばニトロブルーテトラゾリウム（酸化型）の場
合、５４０〜５８０nm）を測定することによつて定量す
ることができる。
上記定量方法は公知であり、例えばメトキシフエナジン
メトサルフエイト（酸化型）を用いる方法は、クリニカ
・キミカ・アクタ（Clinica Chimica Acta）第１０１
巻、第３２１頁〜第３２６頁（１９８０年）に記載され
ている。
メトサルフエイト（酸化型）を用いる方法は、クリニカ
・キミカ・アクタ（Clinica Chimica Acta）第１０１
巻、第３２１頁〜第３２６頁（１９８０年）に記載され
ている。
また、被検液中のＬ−フコースが生体成分に結合したＬ
−フコースである場合には、被検液中にα−Ｌ−フコシ
ダーゼを作用させて、あるいは化学的方法により、例え
ば０．１Ｎトリクロロ酢酸存在下で、１００℃、１時間
処理することにより、Ｌ−フコースを遊離させ、これに
NADの存在下、Ｌ−フコース・デヒドロゲナーゼを作用
させ、生成したNADHを上記の方法で定量すればよい。
−フコースである場合には、被検液中にα−Ｌ−フコシ
ダーゼを作用させて、あるいは化学的方法により、例え
ば０．１Ｎトリクロロ酢酸存在下で、１００℃、１時間
処理することにより、Ｌ−フコースを遊離させ、これに
NADの存在下、Ｌ−フコース・デヒドロゲナーゼを作用
させ、生成したNADHを上記の方法で定量すればよい。
α−Ｌ−フコシダーゼとしてはアスペルギルス属、クロ
ストリデイウム属、フサリウム属などの微生物起源およ
びサザエ、ボウシユウボラの如き魚貝類の酵素が使用可
能であるが、これらの酵素はいずれも至適pHが酸性乃至
弱酸性にあることから、中性付近に至適pHを有するコリ
ネバクテリウム属由来の酵素（このα−Ｌ−フコシダー
ゼについては本願出願人により昭和60年１２月２６日付
で発明の名称「α−Ｌ−フコシダーゼの製造法」として
日本特許出願済である）を用いるのが有利である。
ストリデイウム属、フサリウム属などの微生物起源およ
びサザエ、ボウシユウボラの如き魚貝類の酵素が使用可
能であるが、これらの酵素はいずれも至適pHが酸性乃至
弱酸性にあることから、中性付近に至適pHを有するコリ
ネバクテリウム属由来の酵素（このα−Ｌ−フコシダー
ゼについては本願出願人により昭和60年１２月２６日付
で発明の名称「α−Ｌ−フコシダーゼの製造法」として
日本特許出願済である）を用いるのが有利である。
反応に用いられる緩衝液は、特に限定されず、リン酸緩
衝液、トリス緩衝液、グリシン緩衝液、グツト緩衝液な
どが好適であり、pH６〜１０、好ましくはpH７．５〜
８．５の緩衝液が用いられる。Ｌ−フコース・テヒドロ
ゲナーゼは通常０．２〜２０単位、好ましくは１〜５単
位、ジアホラーゼは０．５〜２０単位、好ましくは１〜
５単位が望ましい。本発明方法によりＬ−フコースを定
量する場合はテトラゾリウム塩（酸化型）およびNADは
少なくとも被検液中のＬ−フコースのモル量以上用いれ
ばよい。また、Ｌ−フコースが生体成分に結合した被検
液で、α−Ｌ−フコシダーゼを用いる場合には、通常１
〜５０単位、好ましくは５単位加えて、Ｌ−フコースを
遊離させる必要がある。反応温度は２０〜４０℃、反応
時間は２〜２０分間が望ましい。また、Ｌ−フコース・
デヒドロゲナーゼ、テトラゾリウム塩（酸化型）および
ジアホラーゼあるいはフエナジンメトサルフエイト（酸
化型）またはメトキシフエナジンメトサルフエイト（酸
化型）は検液中に同時に存在させてもよい。
衝液、トリス緩衝液、グリシン緩衝液、グツト緩衝液な
どが好適であり、pH６〜１０、好ましくはpH７．５〜
８．５の緩衝液が用いられる。Ｌ−フコース・テヒドロ
ゲナーゼは通常０．２〜２０単位、好ましくは１〜５単
位、ジアホラーゼは０．５〜２０単位、好ましくは１〜
５単位が望ましい。本発明方法によりＬ−フコースを定
量する場合はテトラゾリウム塩（酸化型）およびNADは
少なくとも被検液中のＬ−フコースのモル量以上用いれ
ばよい。また、Ｌ−フコースが生体成分に結合した被検
液で、α−Ｌ−フコシダーゼを用いる場合には、通常１
〜５０単位、好ましくは５単位加えて、Ｌ−フコースを
遊離させる必要がある。反応温度は２０〜４０℃、反応
時間は２〜２０分間が望ましい。また、Ｌ−フコース・
デヒドロゲナーゼ、テトラゾリウム塩（酸化型）および
ジアホラーゼあるいはフエナジンメトサルフエイト（酸
化型）またはメトキシフエナジンメトサルフエイト（酸
化型）は検液中に同時に存在させてもよい。
上記の定量方法は次の反応式によつて要約される。
B.NADH＋H+＋（メトキシ）フエナジンメトサルフエイト（酸化型） →NAD+＋（メトキシ）フエナジンメトサルフエイト（還元型） （メトキシ）フエナジンメトサルフエイト（還元型）＋テトラゾリウム塩（酸化
型） →（メトキシ）フエナジンメトサルフエイト（酸化型）＋ホルマザン色素 (a)α−Ｌ−フコシダーゼ (b)Ｌ−フコース・デヒドロゲナーゼ (c)ジアホラーゼ 以上のことより、本発明は非常に簡便であり、高感度か
つ特異的であること、比色定量が可能であること、優れ
た性質をもつＬ−フコース・デヒドロゲナーゼが微生物
より安価かつ大量に調製可能であることなどの特徴を有
しており、臨床検査分野に有利なＬ−フコースの定量法
を提供する。
型） →（メトキシ）フエナジンメトサルフエイト（酸化型）＋ホルマザン色素 (a)α−Ｌ−フコシダーゼ (b)Ｌ−フコース・デヒドロゲナーゼ (c)ジアホラーゼ 以上のことより、本発明は非常に簡便であり、高感度か
つ特異的であること、比色定量が可能であること、優れ
た性質をもつＬ−フコース・デヒドロゲナーゼが微生物
より安価かつ大量に調製可能であることなどの特徴を有
しており、臨床検査分野に有利なＬ−フコースの定量法
を提供する。
以下に本発明を、実施例をもつて説明するが本発明が以
下の実施例の範囲のみに限定されるものではない。
下の実施例の範囲のみに限定されるものではない。
実施例１ Ｌ−フコースの定量 ２００mM グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（pH
８．５） 0.8ml １５mM NAD+
0.1ml ２０単位／ml Ｌ−フコース・デヒドロゲナーゼ
0.1ml ２０単位／ml ジアホラーゼ 〔クロストリデイウム由来、 0.1ml 東洋紡(株)製〕 １．２mMニトロブルーテトラゾリウム（酸化型）
0.1ml 水
０．２ml 上記混合溶液１．４mlに０，０．０２５，０．０５，
０．０７５，０．１，０．１２５および０．１５mMのＬ
−フコース溶液の0.1mlをそれぞれ添加し、３７℃で１
０分間反応させた後、５６０nmにおける吸光度を測定し
た。その結果は第１図に示すように添加したＬ−フコー
ス量と５６０nmの吸光度の増加量には良好な直線関係が
得られた。
８．５） 0.8ml １５mM NAD+
0.1ml ２０単位／ml Ｌ−フコース・デヒドロゲナーゼ
0.1ml ２０単位／ml ジアホラーゼ 〔クロストリデイウム由来、 0.1ml 東洋紡(株)製〕 １．２mMニトロブルーテトラゾリウム（酸化型）
0.1ml 水
０．２ml 上記混合溶液１．４mlに０，０．０２５，０．０５，
０．０７５，０．１，０．１２５および０．１５mMのＬ
−フコース溶液の0.1mlをそれぞれ添加し、３７℃で１
０分間反応させた後、５６０nmにおける吸光度を測定し
た。その結果は第１図に示すように添加したＬ−フコー
ス量と５６０nmの吸光度の増加量には良好な直線関係が
得られた。
実施例 ２ Ｌ−フコースの定量 １００mM リン酸緩衝液（pH８．５） 1.0m
l １５mM NAD+ 0.
1ml ２０単位／ml Ｌ−フコース・デヒドロゲナーゼ 0.
1ml ３０μＭ フエナジンメトサルフエイト
0.1ml １．２mM ニトロブルーテトラゾリウム 0.1m
l （酸化型） 上記混合液１．４mlに０，０．０２５，０．０５，０．
０７５，０．１，０．１２５および０．１５mMのＬ−フ
コース溶液０．１mlをそれぞれ添加し、３７℃で１０分
間反応した。第２図に示すように添加したＬ−フコース
量と５６０nmの吸光度の増加量には良好な直線関係が得
られた。
l １５mM NAD+ 0.
1ml ２０単位／ml Ｌ−フコース・デヒドロゲナーゼ 0.
1ml ３０μＭ フエナジンメトサルフエイト
0.1ml １．２mM ニトロブルーテトラゾリウム 0.1m
l （酸化型） 上記混合液１．４mlに０，０．０２５，０．０５，０．
０７５，０．１，０．１２５および０．１５mMのＬ−フ
コース溶液０．１mlをそれぞれ添加し、３７℃で１０分
間反応した。第２図に示すように添加したＬ−フコース
量と５６０nmの吸光度の増加量には良好な直線関係が得
られた。
実施例３ ２′−フコシルラクトース中のＬ−フコ
ースの定量 １００mM リン酸緩衝液（pH８．５） 1.0m
l １５mM NAD+ 0.1m
l ２０単位／ml Ｌ−フコース・デヒドロゲナーゼ 0.1m
l ５０単位／ml α−Ｌ−フコシダーゼ 0.1m
l 〔コリネバクテリウム由来、 宝酒造(株)製〕 上記混合液１．４mlに０，０．０５，０．１，０．２
０．３，０．４および０．５mMの人乳由来の２′−フコ
シルラクトース溶液０．１mlをそれぞれ添加し、３７℃
で１０分間反応した。第３図に示すように添加した２′
−フコシルラクトース量と３４０nmの吸光度の増加量に
は良好な直線関係が得られた。
ースの定量 １００mM リン酸緩衝液（pH８．５） 1.0m
l １５mM NAD+ 0.1m
l ２０単位／ml Ｌ−フコース・デヒドロゲナーゼ 0.1m
l ５０単位／ml α−Ｌ−フコシダーゼ 0.1m
l 〔コリネバクテリウム由来、 宝酒造(株)製〕 上記混合液１．４mlに０，０．０５，０．１，０．２
０．３，０．４および０．５mMの人乳由来の２′−フコ
シルラクトース溶液０．１mlをそれぞれ添加し、３７℃
で１０分間反応した。第３図に示すように添加した２′
−フコシルラクトース量と３４０nmの吸光度の増加量に
は良好な直線関係が得られた。
実施例４ ２′−フコシルラクトース中のＬ−フコ
ースの定量 １００mM リン酸緩衝液（pH８．５）
０．９ml ５０単位／ml α−Ｌ−フコシダーゼ ０．
１ml 〔コリネバクテリウム由来、 宝酒造(株)製〕 ２０単位／ml Ｌ−フコース・デヒドロゲナーゼ ０．
１ml １５mM NAD+ ０．
１ml ２０単位／ml ジアホラーゼ ０．
１ml 〔クロストリデイウム由来、 東洋紡(株)製〕 １．２mM ニトロブルーテトラゾリウム ０．
１ml （酸化型） 上記混合溶液１．４mlに０，０．０５，０．１，０．
２，０．３，０．４および０．５mMの人乳由来の２′−
フコシルラクトース溶液0.1mlをそれぞれ添加し、３７
℃で１０分間反応した。第４図に示すように添加した
２′−フコシルラクトース量と５６０nmの吸光度の増加
量には良好な直線関係が得られた。
ースの定量 １００mM リン酸緩衝液（pH８．５）
０．９ml ５０単位／ml α−Ｌ−フコシダーゼ ０．
１ml 〔コリネバクテリウム由来、 宝酒造(株)製〕 ２０単位／ml Ｌ−フコース・デヒドロゲナーゼ ０．
１ml １５mM NAD+ ０．
１ml ２０単位／ml ジアホラーゼ ０．
１ml 〔クロストリデイウム由来、 東洋紡(株)製〕 １．２mM ニトロブルーテトラゾリウム ０．
１ml （酸化型） 上記混合溶液１．４mlに０，０．０５，０．１，０．
２，０．３，０．４および０．５mMの人乳由来の２′−
フコシルラクトース溶液0.1mlをそれぞれ添加し、３７
℃で１０分間反応した。第４図に示すように添加した
２′−フコシルラクトース量と５６０nmの吸光度の増加
量には良好な直線関係が得られた。
以上詳細に説明したように、本発明の定量法によれば従
来法と比べＬ−フコースを迅速・簡便かつ安価に定量す
ることが可能であり、臨床検査試薬として優れた効果を
有する。
来法と比べＬ−フコースを迅速・簡便かつ安価に定量す
ることが可能であり、臨床検査試薬として優れた効果を
有する。
第１図は実施例１における検量線をＬ−フコース量と５
６０nmの吸光度差との関係で示したグラフであり、第２
図は実施例２における検量線をＬ−フコース量と５６０
nmの吸光度差との関係で示したグラフであり、第３図は
実施例３における検量線を２′−フコシルラクトース量
と３４０nmの吸光度差との関係で示したグラフであり、
第４図は実施例４における検量線を２′−フコシルラク
トース量と５６０nmの吸光度差との関係で示したグラフ
である。
６０nmの吸光度差との関係で示したグラフであり、第２
図は実施例２における検量線をＬ−フコース量と５６０
nmの吸光度差との関係で示したグラフであり、第３図は
実施例３における検量線を２′−フコシルラクトース量
と３４０nmの吸光度差との関係で示したグラフであり、
第４図は実施例４における検量線を２′−フコシルラク
トース量と５６０nmの吸光度差との関係で示したグラフ
である。
Claims (7)
- 【請求項１】被検液中のＬ−フコースを定量するに際
し、α−Ｌ−フコシダーゼの存在下または不存在下、被
検液に至適pHが中性付近であるＬ−フコース・デヒドロ
ゲナーゼを作用させ、生成する還元型ニコチンアミドア
デニンジヌクレオチドを測定することを特徴とするＬ−
フコースの定量方法。 - 【請求項２】被検液中のＬ−フコースが遊離Ｌ−フコー
スおよび／または生体成分に結合したＬ−フコースであ
る特許請求の範囲第１項記載の定量方法。 - 【請求項３】Ｌ−フコース・デヒドロゲナーゼがコリネ
バクテリウム属細菌由来である特許請求の範囲第１項記
載の定量方法。 - 【請求項４】α−Ｌ−フコシダーゼがコリネバクテリウ
ム属細菌由来である特許請求の範囲第１項記載の定量方
法。 - 【請求項５】Ｌ−フコース・デヒドロゲナーゼを用いる
Ｌ−フコースの定量が、還元型ニコチンアミドアデニン
ジヌクレオチドの紫外部の吸収を測定することによって
行われる特許請求の範囲第１項記載の方法。 - 【請求項６】Ｌ−フコース・デヒドロゲナーゼを用いる
Ｌ−フコースの定量が、Ｌ−フコース・デヒドロゲナー
ゼの作用により生成する還元型ニコチンアミドアデニン
ジヌクレオチド（NADH）と、テトラゾリウム塩（酸化
型）、ジアホラーゼまたはフェナジンメトサルフェイト
（酸化型）またはメトキシフェナジンメトサルフェイト
（酸化型）を反応せしめ、生成するホルマザン色素を測
定することによって行われる特許請求の範囲第１項記載
の方法。 - 【請求項７】下記の(A)，(B)，(C)および(D)の各成分： (A)至適pHが中性付近であるＬ−フコース・デヒドロゲ
ナーゼ (B)ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（酸化型） (C)テトラゾリウム塩（酸化型） (D)ジアホラーゼまたはフェナジンメトサルフェイト
（酸化型）またはメトキシフェナジンメトサルフェイト
（酸化型） を含有することを特徴とするＬ−フコース定量用組成
物。
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61017435A JPH064038B2 (ja) | 1986-01-29 | 1986-01-29 | Ｌ−フコ−スの定量方法 |
| US07/003,283 US4927753A (en) | 1986-01-29 | 1987-01-14 | Quantitative determination of L-fucose |
| DE19873702159 DE3702159A1 (de) | 1986-01-29 | 1987-01-26 | Quantitative bestimmung von l-fucose |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61017435A JPH064038B2 (ja) | 1986-01-29 | 1986-01-29 | Ｌ−フコ−スの定量方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS62175197A JPS62175197A (ja) | 1987-07-31 |
| JPH064038B2 true JPH064038B2 (ja) | 1994-01-19 |
Family
ID=11943943
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61017435A Expired - Fee Related JPH064038B2 (ja) | 1986-01-29 | 1986-01-29 | Ｌ−フコ−スの定量方法 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4927753A (ja) |
| JP (1) | JPH064038B2 (ja) |
| DE (1) | DE3702159A1 (ja) |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2613085B2 (ja) * | 1987-11-19 | 1997-05-21 | 寳酒造 株式会社 | Ｌ−フコース代謝異常を伴う疾病の検出方法 |
| JPH0667316B2 (ja) * | 1988-09-21 | 1994-08-31 | 財団法人野田産業科学研究所 | Ｌ―フコースデヒドロゲナーゼ |
| JP3107847B2 (ja) * | 1991-03-29 | 2000-11-13 | 寳酒造株式会社 | ポリペプチド |
| US5902731A (en) * | 1998-09-28 | 1999-05-11 | Lifescan, Inc. | Diagnostics based on tetrazolium compounds |
| CN115452740A (zh) * | 2022-07-22 | 2022-12-09 | 上海青瑞食品科技有限公司 | 一种2′-岩藻糖基乳糖的快速检测试剂盒及其应用 |
| CN118755797B (zh) * | 2024-08-12 | 2025-05-02 | 北京国科星联科技有限公司 | 一种基于岩藻糖脱氢酶检测岩藻糖含量的方法 |
-
1986
- 1986-01-29 JP JP61017435A patent/JPH064038B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
1987
- 1987-01-14 US US07/003,283 patent/US4927753A/en not_active Expired - Lifetime
- 1987-01-26 DE DE19873702159 patent/DE3702159A1/de active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US4927753A (en) | 1990-05-22 |
| DE3702159A1 (de) | 1987-08-06 |
| DE3702159C2 (ja) | 1989-09-14 |
| JPS62175197A (ja) | 1987-07-31 |
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| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |