JPH0640838B2 - 酵素活性または基質の測定法 - Google Patents
酵素活性または基質の測定法Info
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- JPH0640838B2 JPH0640838B2 JP61074564A JP7456486A JPH0640838B2 JP H0640838 B2 JPH0640838 B2 JP H0640838B2 JP 61074564 A JP61074564 A JP 61074564A JP 7456486 A JP7456486 A JP 7456486A JP H0640838 B2 JPH0640838 B2 JP H0640838B2
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- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 〔発明の目的〕 産業上の利用分野 本発明は酵素活性または基質の測定法に関する。さらに
詳細には、オルニチン−ケト酸アミノトランスフエラー
ゼ（EC 2.6.1.13、以下「ＯＫＡＴ」という）、α−ケ
トグルタル酸（以下「α−ＫＧ」という）、ピロリン５
−カルボン酸デヒドロゲナーゼ（EC 1.5.1.12、以下
「Ｐ５ＣＤＨ」という）および酸化型ピリジンヌクレオ
チド補酵素（以下「ＮＡＤ（Ｐ）」という）を必須の成
分として含む試薬組成物用いることによるオルニチンカ
ルバモイルトランスフエラーゼ（EC 2.1.3.3、以下「Ｏ
ＣＴ」という）、オルニチンまたはシトルリンの測定法
に関する。
詳細には、オルニチン−ケト酸アミノトランスフエラー
ゼ（EC 2.6.1.13、以下「ＯＫＡＴ」という）、α−ケ
トグルタル酸（以下「α−ＫＧ」という）、ピロリン５
−カルボン酸デヒドロゲナーゼ（EC 1.5.1.12、以下
「Ｐ５ＣＤＨ」という）および酸化型ピリジンヌクレオ
チド補酵素（以下「ＮＡＤ（Ｐ）」という）を必須の成
分として含む試薬組成物用いることによるオルニチンカ
ルバモイルトランスフエラーゼ（EC 2.1.3.3、以下「Ｏ
ＣＴ」という）、オルニチンまたはシトルリンの測定法
に関する。
従来の技術 従来ＯＣＴまたはシトルリンの測定は以下に述べる方法
で行われてきた。Reichardらは、ＯＣＴがヒ酸塩存在下
でシトルリンよりカルバモイルヒ酸とオルニチンを生成
する反応を利用して、放射能ラベルした基質を用いる方
法、またはカルバミルヒ酸の非酵素的分解で生じたアン
モニアを測定する方法を報告している（J.Lab.Clin.Me
d.,第52巻，709-717頁，1958年）。Brown らおよび浜中
らは、オルニチンにＯＣＴが作用して生成したシトルリ
ンをジアセチルモノオキシムで比色定量する方法を報告
している（J.Lab.Clin.Med.,第54巻，617-620頁，1959
年；特公昭56-36919）。
で行われてきた。Reichardらは、ＯＣＴがヒ酸塩存在下
でシトルリンよりカルバモイルヒ酸とオルニチンを生成
する反応を利用して、放射能ラベルした基質を用いる方
法、またはカルバミルヒ酸の非酵素的分解で生じたアン
モニアを測定する方法を報告している（J.Lab.Clin.Me
d.,第52巻，709-717頁，1958年）。Brown らおよび浜中
らは、オルニチンにＯＣＴが作用して生成したシトルリ
ンをジアセチルモノオキシムで比色定量する方法を報告
している（J.Lab.Clin.Med.,第54巻，617-620頁，1959
年；特公昭56-36919）。
オルニチンの測定に関して、松沢らはオルニチンにα−
ＫＧ、還元型ピリジンヌクレオチド補酵素、ピロリン５
−カルボン酸リダクターゼおよびＯＫＡＴを作用せし
め、還元型ピリジンヌクレオチド補酵素の減少を測定す
る方法を報告している（Anal.Biochem.,第 106巻，1-6
頁，1980年；特公昭59-15639）。
ＫＧ、還元型ピリジンヌクレオチド補酵素、ピロリン５
−カルボン酸リダクターゼおよびＯＫＡＴを作用せし
め、還元型ピリジンヌクレオチド補酵素の減少を測定す
る方法を報告している（Anal.Biochem.,第 106巻，1-6
頁，1980年；特公昭59-15639）。
上記の各々の先行技術は、放射性元素を用いるため安全
性に問題がある、測定時間が長くかかる、除蛋白の操作
が必要、用いる試薬が不安定、血清試料中に共存する尿
素による妨害うける、強酸性下における加熱反応を伴う
ため操作が繁雑・危険である、還元型ピリジンヌクレオ
チド補酵素の減少を測定する方法はブランク反応を行わ
なければならず、また測定範囲が狭い、測定精度が低
い、などの欠点がある。
性に問題がある、測定時間が長くかかる、除蛋白の操作
が必要、用いる試薬が不安定、血清試料中に共存する尿
素による妨害うける、強酸性下における加熱反応を伴う
ため操作が繁雑・危険である、還元型ピリジンヌクレオ
チド補酵素の減少を測定する方法はブランク反応を行わ
なければならず、また測定範囲が狭い、測定精度が低
い、などの欠点がある。
発明が解決しようとする問題点 本発明は全酵素法によるＯＣＴ、オルニチンまたはシト
ルリンの測定法を提供することを目的とする。本発明の
別の目的は、前述の先行技術における問題点を解決する
こと、および高感度な測定法を提供することにある。
ルリンの測定法を提供することを目的とする。本発明の
別の目的は、前述の先行技術における問題点を解決する
こと、および高感度な測定法を提供することにある。
問題点を解決するための手段 本発明によれば、ＯＫＡＴ、α−ＫＧ、Ｐ５ＣＤＨ、お
よびＮＡＤ（Ｐ）を必須の成分として含む試薬組成物を
用いることによる酵素活性または基質の測定法が提供さ
れる。さらに詳細には、第一に、被検試料にＯＫＡＴ、
α−ＫＧ、Ｐ５ＣＤＨおよびＮＡＤ（Ｐ）から成る試薬
組成物を作用せしめ、生じた生成物を測定することによ
りオルニチンが測定される。第二に、上記の必須の試薬
組成物にさらにシトルリンとリン酸を加えることにより
ＯＣＴが測定される。第三に、上記の必須の試薬組成物
にさらにＯＣＴとリン酸を加えることによりシトルリン
が測定される。
よびＮＡＤ（Ｐ）を必須の成分として含む試薬組成物を
用いることによる酵素活性または基質の測定法が提供さ
れる。さらに詳細には、第一に、被検試料にＯＫＡＴ、
α−ＫＧ、Ｐ５ＣＤＨおよびＮＡＤ（Ｐ）から成る試薬
組成物を作用せしめ、生じた生成物を測定することによ
りオルニチンが測定される。第二に、上記の必須の試薬
組成物にさらにシトルリンとリン酸を加えることにより
ＯＣＴが測定される。第三に、上記の必須の試薬組成物
にさらにＯＣＴとリン酸を加えることによりシトルリン
が測定される。
本発明は上述した複数の酵素が触媒する反応の組み合わ
せを利用することを基礎としている。各反応のステツプ
は次のように表される。
せを利用することを基礎としている。各反応のステツプ
は次のように表される。
反応（Ａ）：リン酸の存在下シトルリンにＯＣＴを作用
せしめ、オルニチンとカルバモイルリン酸に変換する。
せしめ、オルニチンとカルバモイルリン酸に変換する。
反応（Ｂ）：α−ＫＧの存在下上記反応（Ａ）で生成し
た若しくは試料中に含まれるオルニチンにＯＫＡＴを作
用せしめ、ピロリン５−カルボン酸とグルタミン酸に変
換する。
た若しくは試料中に含まれるオルニチンにＯＫＡＴを作
用せしめ、ピロリン５−カルボン酸とグルタミン酸に変
換する。
反応（Ｃ）：ＮＡＤ（Ｐ）の存在下上記反応（Ｂ）で生
成したピロリン５−カルボン酸にＰ５ＣＤＨを作用せし
め、グルタミン酸と還元型ピリジンヌクレオチド補酵素
（以下「ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ」という）変換する。
成したピロリン５−カルボン酸にＰ５ＣＤＨを作用せし
め、グルタミン酸と還元型ピリジンヌクレオチド補酵素
（以下「ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ」という）変換する。
以上の反応式を次に示す。
本発明は、ＯＣＴの触媒する反応の平衡がオルニチンか
らシトルリンを生成する方向に傾いているところ、その
逆反応を利用するものであるが、本発明に開示した試薬
組成物を用いることにより反応の平衡が逆方向に移動す
ることは全く意想外なことであった。
らシトルリンを生成する方向に傾いているところ、その
逆反応を利用するものであるが、本発明に開示した試薬
組成物を用いることにより反応の平衡が逆方向に移動す
ることは全く意想外なことであった。
本発明においては、前記反応（Ａ）乃至（Ｃ）のいずれ
かで生じた生成物を定量することにより目的の酵素活性
または基質を測定することができる。測定する生成物は
ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ若しくはグルタミン酸が好ましい。ＮＡ
Ｄ（Ｐ）Ｈおよびグルタミン酸は公知の方法により定量
することができる。ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの定量は、それ自身
の有する紫外部における吸収または螢光の測定、ジアホ
ラーゼの存在下テトラゾリウム化合物などの酸化還元指
示薬を作用せしめてホルマザン色素に導き、その可視部
における吸収の測定、または触媒の存在下レサズリンを
作用せしめ生成したレゾルフインの螢光若しくは可視部
における吸収の測定により行われる。グルタミン酸の測
定は、ＮＡＤ（Ｐ）の存在下グルタミン酸デヒドロゲナ
ーゼ（以下「ＧＬＵＤＨ」という）を作用せしめ生成し
たＮＡＤ（Ｐ）Ｈを測定する方法、またはグルタミン酸
オキシダーゼ（以下「ＧＬＵＯＸ」という）を作用せし
め生成した過酸化水素を測定することにより行われる。
かで生じた生成物を定量することにより目的の酵素活性
または基質を測定することができる。測定する生成物は
ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ若しくはグルタミン酸が好ましい。ＮＡ
Ｄ（Ｐ）Ｈおよびグルタミン酸は公知の方法により定量
することができる。ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの定量は、それ自身
の有する紫外部における吸収または螢光の測定、ジアホ
ラーゼの存在下テトラゾリウム化合物などの酸化還元指
示薬を作用せしめてホルマザン色素に導き、その可視部
における吸収の測定、または触媒の存在下レサズリンを
作用せしめ生成したレゾルフインの螢光若しくは可視部
における吸収の測定により行われる。グルタミン酸の測
定は、ＮＡＤ（Ｐ）の存在下グルタミン酸デヒドロゲナ
ーゼ（以下「ＧＬＵＤＨ」という）を作用せしめ生成し
たＮＡＤ（Ｐ）Ｈを測定する方法、またはグルタミン酸
オキシダーゼ（以下「ＧＬＵＯＸ」という）を作用せし
め生成した過酸化水素を測定することにより行われる。
ＧＬＵＤＨの反応は次の式で表される。
本発明において、前述の（Ａ）乃至（Ｃ）の反応で生成
したグルタミン酸にＧＬＵＤＨを作用せしめて生じたＮ
ＡＤ（Ｐ）Ｈを測定する場合は、反応（Ｂ）および
（Ｃ）で各々生成したグルタミン酸とＮＡＤ（Ｐ）＋か
ら誘導されるＮＡＤ（Ｐ）Ｈおよび反応Ｃで生成したＮ
ＡＤ（Ｐ）Ｈの都合３当量のＮＡＤ（Ｐ）Ｈを測定する
ことになるため、感度が著しく向上するという意想外な
効果が得られた。また、生成グルタミン酸にＧＬＵＯＸ
を作用せしめて生じた過酸化水素を測定することにより
グルタミン酸を定量する場合は、反応（Ｂ）および
（Ｃ）で生成したグルタミン酸の都合２当量のグルタミ
ン酸を測定することになるためこれまた感度が著しく向
上するという効果が得られた。
したグルタミン酸にＧＬＵＤＨを作用せしめて生じたＮ
ＡＤ（Ｐ）Ｈを測定する場合は、反応（Ｂ）および
（Ｃ）で各々生成したグルタミン酸とＮＡＤ（Ｐ）＋か
ら誘導されるＮＡＤ（Ｐ）Ｈおよび反応Ｃで生成したＮ
ＡＤ（Ｐ）Ｈの都合３当量のＮＡＤ（Ｐ）Ｈを測定する
ことになるため、感度が著しく向上するという意想外な
効果が得られた。また、生成グルタミン酸にＧＬＵＯＸ
を作用せしめて生じた過酸化水素を測定することにより
グルタミン酸を定量する場合は、反応（Ｂ）および
（Ｃ）で生成したグルタミン酸の都合２当量のグルタミ
ン酸を測定することになるためこれまた感度が著しく向
上するという効果が得られた。
本発明において、反応の条件は幅広く変えて行うことが
できる。例えば、温度は25〜50℃、好ましくは30〜45
℃、pHは 6.5〜8.5 が好ましい。
できる。例えば、温度は25〜50℃、好ましくは30〜45
℃、pHは 6.5〜8.5 が好ましい。
被検試料としては全血、血清、血漿、尿および組織抽出
物などが用いられる。マススクリーニングの場合は、血
液を濾紙にしみこませて乾燥したのち血色素を固定化し
たいわゆる血液ろ紙を用いるのがよい。
物などが用いられる。マススクリーニングの場合は、血
液を濾紙にしみこませて乾燥したのち血色素を固定化し
たいわゆる血液ろ紙を用いるのがよい。
本発明において、ＯＣＴ、ＯＫＡＴ、Ｐ５ＣＤＨ、ＧＬ
ＵＤＨおよびＧＬＵＯＸの酵素活性は、37℃において１
分間あたり１μmol の基質を変化せしめる酵素量を１単
位とした。
ＵＤＨおよびＧＬＵＯＸの酵素活性は、37℃において１
分間あたり１μmol の基質を変化せしめる酵素量を１単
位とした。
上述したように、本発明のＯＫＡＴ、α−ＫＧ、Ｐ５Ｃ
ＤＨ、およびＮＡＤ（Ｐ）を必須の成分として含む試薬
組成物を用いることによる酵素活性または基質の測定法
を提供するものである。本発明は、ＯＣＴ、オルニチ
ン、シトルリンを始めとして前記の本発明が開示した反
応系にリンクすることのできる酵素活性または基質の測
定法をすべて包含する。
ＤＨ、およびＮＡＤ（Ｐ）を必須の成分として含む試薬
組成物を用いることによる酵素活性または基質の測定法
を提供するものである。本発明は、ＯＣＴ、オルニチ
ン、シトルリンを始めとして前記の本発明が開示した反
応系にリンクすることのできる酵素活性または基質の測
定法をすべて包含する。
以下実施例をもって本発明をさらに詳細に説明する。
実施例１ ＯＣＴ活性の測定 0.2 Ｍリン酸緩衝液（pH 7.5）0.685 ml、0.12Ｍ ＮＡ
ＤＰ＋0.05ml、25ｍＭα−ＫＧ 0.005ml、165 Ｕ／mlＯ
ＫＡＴ 0.05ml、190 Ｕ／mlＰ５ＣＤＨ 0.02ml、0.2 Ｍ
シトルリン 0.5ml、水 1.0ml、および血清試料 0.2mlを
混合し、37℃において20分間インキュベートした。反応
液の 340nmにおける吸収の増加を測定し、試料中のＯＣ
Ｔ活性を算出した。
ＤＰ＋0.05ml、25ｍＭα−ＫＧ 0.005ml、165 Ｕ／mlＯ
ＫＡＴ 0.05ml、190 Ｕ／mlＰ５ＣＤＨ 0.02ml、0.2 Ｍ
シトルリン 0.5ml、水 1.0ml、および血清試料 0.2mlを
混合し、37℃において20分間インキュベートした。反応
液の 340nmにおける吸収の増加を測定し、試料中のＯＣ
Ｔ活性を算出した。
参考のため、市販のＯＣＴ活性測定用の試薬組成物（商
標名：ＯＣＴ−ＴＥＳＴ wako ，和光純薬社製）により
同じ血清試料を測定した。
標名：ＯＣＴ−ＴＥＳＴ wako ，和光純薬社製）により
同じ血清試料を測定した。
本発明法と公知の市販の試薬組成物による測定値の相関
関係は 0.989で極めてよく一致した（第１図に示す）。
関係は 0.989で極めてよく一致した（第１図に示す）。
実施例２ オルニチンの測定 0.05％ＮＡＤＰ＋を含む0.2 Ｍリン酸緩衝液（pH 7.5）
2.0 ml、200 ｍＭα−ＫＧ 0.1ml、90Ｕ／mlＯＫＡＴ
0.05 ml、30Ｕ／mlＰ５ＣＤＨ 0.05ml水 0.1ml、および
0.25〜２ｍＭの既知濃度のオルニチンを含む試料 0.2ml
を混合し、37℃において15分間インキュベートした。反
応液の 340nmにおける吸収の減少を測定し、オルニチン
濃度と吸光度の関係をプロツトしたところ、第２図に示
すとおり良い直線性が得られた。
2.0 ml、200 ｍＭα−ＫＧ 0.1ml、90Ｕ／mlＯＫＡＴ
0.05 ml、30Ｕ／mlＰ５ＣＤＨ 0.05ml水 0.1ml、および
0.25〜２ｍＭの既知濃度のオルニチンを含む試料 0.2ml
を混合し、37℃において15分間インキュベートした。反
応液の 340nmにおける吸収の減少を測定し、オルニチン
濃度と吸光度の関係をプロツトしたところ、第２図に示
すとおり良い直線性が得られた。
実施例３ オルニチンの測定 0.1 mlにＮＡＤＰ＋100 nmol、α−ＫＧ 50 nmol、ＯＫ
ＡＴ 0.5単位、およびＰ５ＣＤＨ 0.5単位を添加した
0.1ｍＭジチオスレイトール、 0.2ｍＭエチレンジアミ
ン四酢酸並びに0.01％アジ化ナトリウムを含む0.2 Ｍ
ＰＩＰＥＳ−水酸化カリウム緩衝液（pH 7.5）と既知濃
度のオルニチンを含む固定化ろ紙（径３mm）を混合し、
37℃において20分間インキュベートした。反応液に水を
2.5ml加え螢光強度を測定した。オルニチン濃度と螢光
強度の関係をプロツトしたところ、第３図に示すとおり
良い直線性が得られた。
ＡＴ 0.5単位、およびＰ５ＣＤＨ 0.5単位を添加した
0.1ｍＭジチオスレイトール、 0.2ｍＭエチレンジアミ
ン四酢酸並びに0.01％アジ化ナトリウムを含む0.2 Ｍ
ＰＩＰＥＳ−水酸化カリウム緩衝液（pH 7.5）と既知濃
度のオルニチンを含む固定化ろ紙（径３mm）を混合し、
37℃において20分間インキュベートした。反応液に水を
2.5ml加え螢光強度を測定した。オルニチン濃度と螢光
強度の関係をプロツトしたところ、第３図に示すとおり
良い直線性が得られた。
実施例４ シトルリンの測定 0.1 ml中にＮＡＤＰ＋100 nmol、α−ＫＧ 50 nmol、Ｏ
ＫＡＴ 0.5単位、ＯＣＴ 30単位、およびＰ５ＣＤＨ
0.5単位を添加した 0.1ｍＭジチオスレイトール、 0.2
ｍＭエチレンジアミン四酢酸並びに0.01％アジ化ナトリ
ウムを含む0.2 Ｍ ＰＩＰＥＳ−水酸化カリウム緩衝液
（pH 7.5）と既知濃度のシトルリンを含む被検試料液0.
01mlを混合し、37℃において20分間インキュベートし
た。反応液に水を2.5 ml加え螢光強度を測定した。シト
ルリン濃度と螢光強度の関係をプロツトしたところ、第
４図に示すとおり良い直線性が得られた。
ＫＡＴ 0.5単位、ＯＣＴ 30単位、およびＰ５ＣＤＨ
0.5単位を添加した 0.1ｍＭジチオスレイトール、 0.2
ｍＭエチレンジアミン四酢酸並びに0.01％アジ化ナトリ
ウムを含む0.2 Ｍ ＰＩＰＥＳ−水酸化カリウム緩衝液
（pH 7.5）と既知濃度のシトルリンを含む被検試料液0.
01mlを混合し、37℃において20分間インキュベートし
た。反応液に水を2.5 ml加え螢光強度を測定した。シト
ルリン濃度と螢光強度の関係をプロツトしたところ、第
４図に示すとおり良い直線性が得られた。
実施例５ ＯＣＴ活性の測定 0.2 Ｍリン酸緩衝液（pH 7.5）0.685 ml、0.12Ｍ ＮＡ
ＤＰ＋0.05ml、25ｍＭα−ＫＧ 0.005ml、160 Ｕ／mlＰ
５ＣＤＨ 0.02ml、165 Ｕ／mlＯＫＡＴ 0.05ml、水0.99
ml、および血清試料 0.2mlを混合し、37℃において10分
間インキュベートした。反応液に0.2 Ｍシトルリン 0.5
mlを添加し37℃で20分間インキュベートしたとろ反応液
の 340nmにおける吸光度の増加は0.016 であり、試料中
のＯＣＴ活性は 1.6Ｕ／と算出された。
ＤＰ＋0.05ml、25ｍＭα−ＫＧ 0.005ml、160 Ｕ／mlＰ
５ＣＤＨ 0.02ml、165 Ｕ／mlＯＫＡＴ 0.05ml、水0.99
ml、および血清試料 0.2mlを混合し、37℃において10分
間インキュベートした。反応液に0.2 Ｍシトルリン 0.5
mlを添加し37℃で20分間インキュベートしたとろ反応液
の 340nmにおける吸光度の増加は0.016 であり、試料中
のＯＣＴ活性は 1.6Ｕ／と算出された。
上記の反応において、試薬組成物にさらに90Ｕ／mlＧＬ
ＵＤＨ 0.1mlを添加し、水を0.89mlとした以外は同様に
操作したところ、吸光度は上記の約３倍であった。
ＵＤＨ 0.1mlを添加し、水を0.89mlとした以外は同様に
操作したところ、吸光度は上記の約３倍であった。
実施例６ ＯＣＴ活性の測定 ４−アミノアンチピリン 0.1mg、またはＴＯＯＳ〔N-エ
チル-N-（2-ヒドロキシ-3-スルホプロピル-m-トルイジ
ン）〕0.5 mgとペルオキシダーゼ５単位、アスコルビン
酸オキシダーゼ 14.3単位、アジ化ナトリウム 0.34 mg
およびシトルリン17.5mgを含む0.2 Ｍリン酸緩衝液（pH
7.5）0.685 ml、0.12Ｍ ＮＡＤＰ＋0.05ml、25ｍＭα
−ＫＧ 0.005ml、165 Ｕ／mlＯＫＡＴ 0.05 ml、17Ｕ／
mlＧＬＵＯＸ 0.02 ml、水0.99ml、および血清試料 0.2
mlを混合し、37℃において10分間インキュベートした。
反応液にＴＯＯＳ 0.5mgまたは４−アミノアンチピリン
0.1 mgを含有する溶液0.5 mlを添加し、37℃において５
分間インキュベートしたところ、555 nmにおける吸光度
の増加は 0.017であった。
チル-N-（2-ヒドロキシ-3-スルホプロピル-m-トルイジ
ン）〕0.5 mgとペルオキシダーゼ５単位、アスコルビン
酸オキシダーゼ 14.3単位、アジ化ナトリウム 0.34 mg
およびシトルリン17.5mgを含む0.2 Ｍリン酸緩衝液（pH
7.5）0.685 ml、0.12Ｍ ＮＡＤＰ＋0.05ml、25ｍＭα
−ＫＧ 0.005ml、165 Ｕ／mlＯＫＡＴ 0.05 ml、17Ｕ／
mlＧＬＵＯＸ 0.02 ml、水0.99ml、および血清試料 0.2
mlを混合し、37℃において10分間インキュベートした。
反応液にＴＯＯＳ 0.5mgまたは４−アミノアンチピリン
0.1 mgを含有する溶液0.5 mlを添加し、37℃において５
分間インキュベートしたところ、555 nmにおける吸光度
の増加は 0.017であった。
上記の反応において、試薬組成物にさらに 160Ｕ／mlＰ
５ＣＤＨ0.02mlを添加し、水を0.97mlとした以外は同様
に操作したところ、吸光度は上記の約２倍であった。
５ＣＤＨ0.02mlを添加し、水を0.97mlとした以外は同様
に操作したところ、吸光度は上記の約２倍であった。
実施例７ ＯＣＴ活性の測定 ＮＴＢ（ニトロテトラゾリウムブルー）0.8 mgおよびジ
アホラーゼ５単位を含む0.2 Ｍリン酸緩衝液（pH 7.5）
0.685 ml、0.12Ｍ ＮＡＤＰ＋0.05ml、25ｍＭα−ＫＧ
0.005ml、160 Ｕ／mlＰ５ＣＤＨ 0.02ml、165 Ｕ／ml
ＯＫＡＴ 0.05ml、90Ｕ／mlＧＬＵＤＨ 0.1ml、水0.89m
l、および実施例５と同じ血清試料 0.2mlを混合し、37
℃において10分間インキュベートした。反応液に 0.2Ｍ
シトルリン 0.5mlを添加し、37において20分間インキュ
ベートしたところ、560 nmにおける吸光度の増加は 0.0
90であった。
アホラーゼ５単位を含む0.2 Ｍリン酸緩衝液（pH 7.5）
0.685 ml、0.12Ｍ ＮＡＤＰ＋0.05ml、25ｍＭα−ＫＧ
0.005ml、160 Ｕ／mlＰ５ＣＤＨ 0.02ml、165 Ｕ／ml
ＯＫＡＴ 0.05ml、90Ｕ／mlＧＬＵＤＨ 0.1ml、水0.89m
l、および実施例５と同じ血清試料 0.2mlを混合し、37
℃において10分間インキュベートした。反応液に 0.2Ｍ
シトルリン 0.5mlを添加し、37において20分間インキュ
ベートしたところ、560 nmにおける吸光度の増加は 0.0
90であった。
本発明はＯＫＡＴ、α−ＫＧ、Ｐ５ＣＤＨ、およびＮＡ
Ｄ（Ｐ）を必須の成分として含む試薬組成物を用いるこ
とによる酵素活性または基質の測定法を提供するもので
ある。本発明によれば、酵素活性または基質の高感度な
測定が可能になった。
Ｄ（Ｐ）を必須の成分として含む試薬組成物を用いるこ
とによる酵素活性または基質の測定法を提供するもので
ある。本発明によれば、酵素活性または基質の高感度な
測定が可能になった。
第１図は、本発明法と公知法により血清試料のＯＣＴ活
性を測定したときの相関関係を表す図である。 第２図は、本発明法によるオルニチンの測定における試
料中のオルニチン濃度と 340nmにおける吸光度の関係を
表す図である。 第３図は、本発明法によるオルニチンの測定における試
料中のオルニチン濃度と螢光強度の関係を表す図であ
る。 第４図は、本発明法によるシトルリンの測定における試
料中のシトルリン濃度と螢光強度の関係を表す図であ
る。
性を測定したときの相関関係を表す図である。 第２図は、本発明法によるオルニチンの測定における試
料中のオルニチン濃度と 340nmにおける吸光度の関係を
表す図である。 第３図は、本発明法によるオルニチンの測定における試
料中のオルニチン濃度と螢光強度の関係を表す図であ
る。 第４図は、本発明法によるシトルリンの測定における試
料中のシトルリン濃度と螢光強度の関係を表す図であ
る。
Claims (9)
- 【請求項１】被検試料にオルニチン−ケト酸アミノトラ
ンスフエラーゼ、α−ケトグルタル酸、ピロリン５−カ
ルボン酸デヒドロゲナーゼおよび酸化型ピリジンヌクレ
オチド補酵素を含む試薬組成物を作用せしめ、生じた生
成物を測定することを特徴とする被検試料中の酵素活性
または基質の測定法。 - 【請求項２】試薬組成物がさらにシトルリンおよびリン
酸を含み、測定対象の酵素活性がオルニチンカルバモイ
ルトランスフエラーゼである特許請求の範囲第１項記載
の測定法。 - 【請求項３】測定対象の基質がオルニチンである特許請
求の範囲第１項記載の測定法。 - 【請求項４】試薬組成物がさらにオルニチンカルバモイ
ルトランスフエラーゼおよびリン酸を含み、測定対象の
基質がシトルリンである特許請求の範囲第１項記載の測
定法。 - 【請求項５】生成物が還元型ピリジンヌクレオチド補酵
素である特許請求の範囲第１項乃至第４項のいずれかに
記載の測定法。 - 【請求項６】還元型ピリジンヌクレオチド補酵素を紫外
部における吸収、螢光強度若しくは酸化還元指示薬の存
在下における生成色素の吸収により測定する特許請求の
範囲第５項記載の測定法。 - 【請求項７】生成物がグルタミン酸である特許請求の範
囲第１項乃至第４項のいずれかに記載の測定法。 - 【請求項８】生成したグルタミン酸にグルタミン酸デヒ
ドロゲナーゼおよび酸化型ピリジンヌクレオチド補酵素
を作用せしめ、生成した還元型ピリジンヌクレオチド補
酵素を測定する特許請求の範囲第７項記載の測定法。 - 【請求項９】生成したグルタミン酸にグルタミン酸オキ
シダーゼを作用せしめ、生成した過酸化水素を測定する
特許請求の範囲第７項記載の測定法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61074564A JPH0640838B2 (ja) | 1986-04-01 | 1986-04-01 | 酵素活性または基質の測定法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61074564A JPH0640838B2 (ja) | 1986-04-01 | 1986-04-01 | 酵素活性または基質の測定法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS62232398A JPS62232398A (ja) | 1987-10-12 |
| JPH0640838B2 true JPH0640838B2 (ja) | 1994-06-01 |
Family
ID=13550837
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61074564A Expired - Lifetime JPH0640838B2 (ja) | 1986-04-01 | 1986-04-01 | 酵素活性または基質の測定法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0640838B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110426514B (zh) * | 2019-08-28 | 2023-05-12 | 苏州新格诺康生物技术有限公司 | 肽酰基精氨酸脱亚胺酶(pad)的测活法 |
-
1986
- 1986-04-01 JP JP61074564A patent/JPH0640838B2/ja not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| ＴｏｈｏｋｕＪＥｘｐＭｅｄ，１４１（３），Ｐ．２５７−２６１，１９８３ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS62232398A (ja) | 1987-10-12 |
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