JPH0644866B2 - ヒト表皮細胞増殖因子生産用形質転換体 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、ヒト表皮細胞増殖因子（ｈＥＧＦと略記）製
造のための組換えＤＮＡ技術に関する。より具体的には
ｈＥＧＦに対応する新規な合成遺伝子を含むＤＮＡで形
質転換した細菌あるいは動物細胞に関する。

従来の技術 ｈＥＧＦは主として十二脂腸や顎下線から分泌される５
３個のアミノ酸から成るポリペプチド・ホルモンであ
り、胃酸分泌抑制ならびに表皮細胞増殖促進作用を有す
る。ｈＥＧＦの胃酸抑制作用はお二指腸腫瘍の治療薬と
しての可能性を示すものである。さらにｈＥＧＦは細胞
の膜表面に存在するＥＧＦ受容体に結合して、多方面的
な生体反応を惹起せしめることが知られている〔Ｄ．Ｇ
ｏｓｐｏｄａｒｏｗｉｃｚ，「アニュアル レビュー
オブ フィジオロジー（Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈｙｓｉｏ
ｌ．）」，４３ ２５１（１９８１）〕。ＥＧＦによつ
て誘起される反応は腫瘍ウイルスの発癌遺伝子産物によ
つて誘発される反応と同一で、ＥＧＦの生体内での役割
や細胞増殖調節機構を解明することは発癌機構を探る上
からも興味あることと考えられている。しかし、天然に
存在するｈＥＧＦは極めて微量であるため、組換えＤＮ
Ａ技術による生産が注目されるようになった。ｈＥＧＦ
遺伝子をヒトの組織から得る試みは種々の制約によつて
極めて困難なため、未だにｈＥＧＦのＤＮＡ配列は決定
されていない。

一方、既に決定されているｈＥＧＦのアミノ酸配列
〔Ｈ．Ｇｒｅｇｏｒｙ，「ネイチャー（Ｎａｔｕｒ
ｅ）」、２５７，３２５（’７５）〕を基にして、化学
的に合成した構造遺伝子を微生物において発現させる例
は知られている。しかし、ＥＧＦは比較的低分子のペプ
チドであり、菌体内で異物として認識され、酵素分解さ
れ易い点を考慮して、融合ペプチドとして発現させてい
る〔Ｊ．Ｓｍｉｔｈら，「ヌクレイック アシッズ リ
サーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃ
ｈ）」，１０ ４４６７（’８２）〕。また融合ペプチ
ドから不要部分を除去する方法も提示されているが、極
めて不確実なものにすぎない（スチーブン・ジェームス
・ブルウアーら、特開昭５８−２１６６９７）。ｈＥＧ
Ｆそのものを発現させた例は酵母の系において知られて
いるが〔Ｍ．Ｓ．Ｕｒｄｅａら、「プロシージング オ
ブ ナショナル アカデミー オブ サイエンス（Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ｓｃｉ．ＵＳＡ）」，８
０’７４６１（’８３）〕、その発現量は非常に低く、
酵母の増殖速度が遅いことと相まって大量生産には適し
ていない。

発明が解決しようとする問題点 上記のようにｈＥＧＦ遺伝子のＤＮＡ配列は未だ解明さ
れておらず、またｈＥＧＦのアミノ酸配列を基にして合
成した対応遺伝子を種々の系で発現させる試みもある
が、融合ペプチドとして発現させる方法ではその操作上
の煩雑さ、不要部分の除去の困難さ等があるし、また融
合ペプチドとせず直接、上記合成遺伝子を発現させた例
では、その生産量は極めて低く、実用的なものではなか
った。

問題点を解決するための手段 本発明者らはｈＥＧＦを効率よく生産させる方法を提供
すべく鋭意研究を重ねた結果、この目的に適したｈＥＧ
ＦのＤＮＡ配列を見出し、更に該遺伝子の製法、該遺伝
子を含む組換えＤＮＡ、該ＤＮＡで形質転換した宿主を
確立し、本発明を完成したものである。

ｈＥＧＦのＤＮＡ配列として従来採用されていたもの
は、大腸菌、酵母等の発現系に適したコドンからなるも
のであったが、このたび本発明者等はこのような人間と
はかなりかけ離れている発現系に適したコドンとは全く
異なった、人間により近いマウスのＥＧＦ（ｍＥＧＦ）
の遺伝子に注目して本発明を完成したものである。

ｈＥＧＦはマウスのそれ〔Ｊ．Ｓｃｏｔｔら、「サイエ
ンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）」，２２１ ２３６（’８
３）〕と比較すると、アミノ酸配列において７０％の相
同性があり、アミノ酸の異なっている部分も、その大部
分はコドンのｏｎｅ ｐｏｉｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎに
よつて導びかれるものである。すなわち、ｈＥＧＦ遺伝
子のＤＮＡ配列はマウスのそれと極めて良く似ているも
のと推定される。一般にアミノ酸配列からＤＮＡ配列を
導くと、コドンの縮重によって多数のＤＮＡ配列が可能
となる。そこで合成遺伝子の配列を決定する基準とし
て、発現系の細胞において最も容認されたコドンを採用
するのが通例となっている〔Ｉｔａｋｕｒａら「サイエ
ンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）」，１９８，１０５６（１９７
７）〕。

しかし最近の知見によると、原核生物において真核生物
の遺伝子を発現させても何ら支障はなく、ある場合には
発現系に適合させた遺伝子より効率がよい〔Ｍ．Ｈ．Ｃ
ａｒｕｔｈｅｒｓ，「ヌクレイック アシッズ リサー
チ，シンポジウム シリーズ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉ
ｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒ
ｉｅｓ）」１１，１９７（’８２）〕。遺伝子の発現を
高めるための因子としては多くのものが挙げられるが、
構造遺伝子に対応するｍＲＮＡの安定性ならびに翻訳効
率も重視される。この場合ｍＲＮＡの塩基配列が決定す
る高次構造が重要な意味を持つと推定される。これらの
点を考慮するとｈＥＧＦ遺伝子のＤＮＡ配列をアミノ酸
配列を変えない範囲でマウスのＥＧＦ遺伝子に類似させ
るべきであろう。実際にこの考え方でｈＥＧＦ遺伝子を
デザインしたところ、マウスのそれに対して９０％近い
相同性を持たせることが可能であった。しかし、目的と
する遺伝子を正確に構築するためには、さらにＤＮＡ鎖
上における比較的長い自己相補性の存在あるいは二重鎖
ＤＮＡ間での正常でない相補性を最小限にすべきであ
る。これらの条件を満足させるためにコンピューターを
利用して若干の修正を施し、第１図に示すような、ｈＥ
ＧＦの製造に最も適した新規なＤＮＡ配列を見出した。
第１図にはＤＮＡ配列に加えてアミノ酸配列を示す。

該遺伝子は融合ペプチドとして発現させることもできる
し、融合ペプチドとせず、直接ｈＥＧＦとして発現する
こともできる。

前者の場合は、ｈＥＧＦの合成遺伝子の５′末端側に開
始コドンＡＴＧから始まるｈＥＧＦ以外の蛋白質をコー
ドするＤＮＡを配し、停止コドン（例えばＴＡＧ）で終
るか、または開始コドンＡＴＧから始まるｈＥＧＦ合成
遺伝子の３′末端側にｈＥＧＦ以外の蛋白質をコードす
るＤＮＡを配し、停止コドン（例えばＴＡＧ）で終って
もよい。

後者の直接発現に用いるには第２図に示すように、ｈＥ
ＧＦのポリペプチドをコードする配列に加えて開始コド
ンＡＴＧ，停止コドン例えばＴＡＧを各々５′側と３′
側に直接配し、また５′末端側と３′末端側はベクター
への挿入のために各々Ｅｃｏ ＲＩ，Ｂａｍ ＨＩ付着
末端とし、それ以外にも遺伝子操作上の多様性を持たせ
るために構造遺伝子の後半部にＢｇｌIIの認識部位を設
ける。また３′末端の下流にはＰｓｔ Ｉの認識部位を
設けることもできる。以上の修正を施すと、マウスのＥ
ＧＦ（ｍＥＧＦ）遺伝子に対して８０％の相同性とな
る。

本発明で用いるｈＥＧＦ遺伝子の合成に当っては、例え
ば第２図に示すように最終的にはｈＥＧＦ遺伝子を２２
個のフラグメントに分割したが、ここでフラグメントの
自己会合を避けるために、５′あるいは３′末端に自己
相補的配列が出現しないよう注意した。第３図に各ＤＮ
Ａフラグメントを示す。このフラグメントへの分割の仕
方は上記自己会合を避ける等の注意をすれば、上記のも
のに限定される必要はなく、種々の分け方が可能であ
る。

各ＤＮＡフラグメント（＃１〜＃２２）は既知の合成法
に従って製造し得る。各フラグメントは必要に応じて
５′末端をポリヌクレオチドキナーゼでリン酸化し、２
乃至３群に分けてハイブリダイズさせＤＮＡガーゼによ
って二重鎖ＤＮＡとする。さらに各群を再びＤＮＡリガ
ーゼで連結させることによって完全なｈＥＧＦ遺伝子が
得られた（第４図参照）。

これをｐＢＲ３２２のＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩによ
る消化物と結合させ、新規プラスミドｐＴＢ３６１を
得、大腸菌ＤＨ１を形質転換する。単離したプラスミド
についてＤＮＡフラグメントの一部をプライマーとして
Ｓａｎｇｅｒ法によって塩基配列を決定し、目的とする
ｈＥＧＦ遺伝子の存在を確認する。

本発明の合成遺伝子を発現するに際しては、プラスミ
ド、バクテリオファージなどのベクターに挿入した組換
えＤＮＡとして用いることが好ましい。

上記組換えＤＮＡは前記した開始コドンＡＴＧの上流に
プロモーターを有しているのが好ましく、該プロモータ
ーは、形質転換体の構造に用いる宿主に対応して適切な
プロモーターであればいかなるものでもよい。

たとえば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌ
ｉ；例、２９４，Ｗ３１１０，ＤＨ１，Ｎ４８３０な
ど）ではｔｒｐプロモーター，ｌａｃプロモーター，ｒ
ｅｃ Ａプロモーター，λＰプロモーター，ｌｐｐプロ
モーター，など、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔ
ｉｌｉｓ；例、ＭＩ １１４など）ではＳＰ０１プロモ
ーター，ＳＰ０２プロモーター，ｐｅｎＰプロモーター
など、酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖ
ｉｓｉａｅ；例、ＡＨ２２など）ではＰＨ０５プロモー
ター，ＰＧＫプロモーター，ＧＡＰプロモーター，ＡＤ
Ｈプロモーターなど、動物細胞（例、サル細胞ＣＯＳ−
７，チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯなど）ではＳＶ
４０由来のプロモーターやマウス白血病ウィルス（Ｍｕ
ＬＶ）由来のＬＴＲ領域のプロモーターなどが挙げられ
る。とりわけ宿主が大腸菌の場合はプロモーターがｔｒ
ｐプロモーターまたはλＰ_Ｌプロモーターであることが
好ましく、宿主が動物細胞の場合は、上記プロモーター
に加え、エンハンサーを有することが好ましい。

ｈＥＧＦ合成遺伝子の発現の一例を次に述べる（第５図
参照）。

ｐＴＢ３６１からＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩで切り出される
１７２塩基対のＤＮＡを発現用ベクターｐｔｒｐ７８１
のＥｃｏＲＩ，ＰｓｔＩ部位に組込み、Ｐｔｒｐ支配下
の発現用ベクターｐＴＢ３７０を得た。

一方、ｐＴＢ３６１のＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ消化によ
って得られる１７９塩基対のＤＮＡを発現用ベクターｐ
ＴＢ２８１のＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ部位に組込みＰ_Ｌ
支配下の発現用ベクターｐＴＢ３７２とした。

ｐＴＢ３７０を用いて大腸菌ＤＨ１を形質転換し、生育
するコロニーをアンピシリン感受性を指標にして選別
し、目的ｈＥＧＦ遺伝子を含む株を得た。

ｐＴＢ３７２の場合には、温度感受性大腸菌Ｎ４８３０
を用いて形質転換し、テトラサイクリン感受性を指標と
して選別し、クローニングしたｐＴＢ３７２で大腸菌Ｄ
Ｈ１を形質転換して合成遺伝子の発現を行った。

また、ｐＴＢ３６１からＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩで切り
出されるＥＧＦ遺伝子を、動物細胞発現用ベクターｐＴ
Ｂ３９６に組込み、さらにそのＳＶ−４０プロモーター
の上流に、マウス白血病ウィルス由来のＬＴＲ領域（Ｍ
ｕＬＶ ＬＴＲ）を含むＤＮＡ断片をＣｌａＩ−Ｈｉｎ
ｄIIIで切り出して挿入し、動物細胞発現用ベクターｐ
ＴＢ５０６とした。

ｐＴＢ５０６で、マウスＬＡ９細胞を共形質転換し、ク
ローニングを行い形質転換体マウスＬＡ９−ＥＧＦ−３
細胞とした。

これら形質転換株を培養し、菌体を７Ｍグアニジン処理
した液中に含まれるｈＥＧＦを〔¹²⁵Ｉ〕で標識された
ｍＥＧＦとの競合反応によるヒト胎児包皮細胞ＥＧＦ受
容体結合アッセイにより定量したところ、大腸菌ＤＨ１
／ｐＴＢ３７０によって約２ｍｇ／ｌ以上の産生量を示
した（第１表参照）。この発現量は大腸菌におけるｈＥ
ＧＦの直接発現としては注目すべきものである。

作用 本発明ではｈＥＧＦ遺伝子のＤＮＡ配列として、発現系
の細胞において最も容認されたコドンを採用するのでな
く、むしろｈＥＧＦとそのアミノ酸配列において類似し
たｍＥＧＦの遺伝子のＤＮＡ配列と高い相同性を有する
合成ＤＮＡ配列を採用することによって、ｍＲＮＡの安
定性、翻訳効率、ｍＲＮＡの塩基配列が決定する高次構
造の影響が良好なものとなって、ｈＥＧＦが効率よく生
産される。また本発明で用いるｈＥＧＦ発現のための合
成遺伝子では構造遺伝子の後半部にＢｇｌII、３′末端
近くにＰｓｔ Ｉの認識部位を有することによって、遺
伝子挿入の成否、挿入方向の確認を容易にしたり、数種
類のベクターに乗せることができる等、遺伝子操作上の
有利さ、多様性の発揮し得るものである。

そして本発明で用いるｈＥＧＦ発現用合成遺伝子は新規
なＤＮＡ配列を有し、しかも微生物より大巾に人間に近
いマウスのＥＧＦ遺伝子のＤＮＡ配列と高い相同性を有
するもので、ｈＥＧＦの高い発現率が期待され、また本
発明の新規ｈＥＧＦ遺伝子を有するＤＮＡで形質転換し
た細菌または哺乳動物細胞により初めてｈＥＧＦを効率
よく発現させることが可能となり、また大腸菌を宿主と
した系での直接発現が可能となった。更に本発明のｈＥ
ＧＦに対応する合成遺伝子を用いた組換えＤＮＡ技術に
より、ｈＥＧＦをより効率よく製造することができ、治
療薬としてのｈＥＧＦの生産や、ｈＥＧＦの生体内での
役割や細胞増殖調節機構の解明、ひいては発癌機構の解
明に役立つものである。

実施例および効果 次に本発明を実施例により説明する。

なお以下に開示する形質転換体 エシェリヒアコリ（Ｅ
ｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＤＨ１／ｐＴＢ３７
０およびエシェリヒアコリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
ｃｏｌｉ）ＤＨ１／ｐＴＢ３７２，ｐＲＫ２４８ｃＩｔ
ｓは、財団法人発酵研究所（ＩＦＯ）にそれぞれＩＦＯ
−１４３７９およびＩＦＯ−１４３８０として、また昭
和５９年１０月５日から通商産業省工業技術院微生物工
業技術研究所（ＦＲＩ）にそれぞれＦＥＲＭ ＢＰ−８
４３およびＦＥＲＭ ＢＰ−８４４として寄託されてい
る。またＭｏｕｓｅ ＬＡ９−ＥＧＦ−３は財団法人発
酵研究所にＩＦＯ−５００５５として寄託されている。

参考例１．ＤＮＡフラグメントの合成 ＤＮＡフラグメントはフォスフォトリエステル法による
固相合成〔Ｉｔｏ，Ｈ．ら,「ヌクレイック アシッズ
リサーチ（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．）」,１０，
１７５５（１９８２）〕で、各々合成した。また、原料
となるダイマーブロックは、Ｂｒｏｋａらの方法〔Ｂｒ
ｏｋａ，Ｃ．ら，「ヌクレイック アシッズ リサーチ
（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．）」，８，５４６１
（１９８０）〕に従い合成したもの、あるいは市販品
（和光純薬工業）の完全保護ダイマーを、ピリジン（Ｐ
ｙ），トリエチルアミン（ＴＥＡ），水（３：１：１，
ｖ／ｖ）の混液に溶解させ、シアノエチル基を除去後、
ペンタン，エーテル（１：１，ｖ／ｖ）の混液中で、粉
末としたものを用いた。ＤＮＡフラグメントの合成手順
は次の通りである。

ジメトキシトリチルヌクレオシドを付着させた２５ｍｇ
の１％ポリスチレン（バッケム社）を、次の試薬で順次
処理した。

(１)ジクロルメタン中３％（ｗ／ｖ）トリクロロ酢酸
（ＴＣＡ）〔Ｔａｎａｋａ，Ｔ，ら,「ヌクレイック ア
シッズ リサーチ（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅ
ｓ．）」,１０，３２４９（１９８２）」で１分×２（２
回同じ操作を行ったことを示す） (２)ジクロルメタン ×４ (３)ピリジン ×３ (４)２０ｍｇのジヌクレオチドブロック又は３０ｍｇの
モノマーブロックを含む０．３ｍｌの乾燥ピリジン (５)上記溶液を減圧下濃縮（ピリジン共沸） (６)２５ｍｇのメシチレンスルホニルニトロトリアゾリ
ッド（ＭＳＮＴ）および５ｍｇのニトロトリアゾールを
含む０．３ｍｌの乾燥ピリジンで４０℃、２０分間 (７)ピリジン ×２ (８)１０％（ｖ／ｖ）無水酢酸および０．１Ｍジメチル
アミノピリジン（ＤＭＡＰ）を含有するピリジン２ｍｌ
で２分間 (９)ピリジン ×２ (１０)ジクロルメタン ×３ 適当なジヌクレオチドあるいはモノヌクレオチドブロッ
クを用いて、この約４０分のサイクルを反復し、目的と
するオリゴヌクレオチド鎖を完結させた。合成完了後、
０．５Ｍの１，１，３，３−テトラメチルグアニジウム
−ピリジン−２−アルドキシム〔Ｒｅｅｓｅ，Ｃ．Ｂ．
ら,「テトラヘドロン レターズ（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏ
ｎ Ｌｅｔｔ．）」，２７２７（１９７８）〕で４０
℃、１４時間処理し、重合体担体より目的物を取り出
し、次に濃アンモニア水で６０℃、４時間処理して、ジ
メトキシトリチル基以外の保護基をすべて除いた。この
試料を逆相のＣ_８シリカゲル（リクロプレップＲＰ−
８，メルク社）のカラム（φ３．０×２．０ｃｍ）にか
け、３０％アセトニトリルで溶出した分画を、８０％酢
酸で室温、１５分間処理した。エーテル洗浄後、さらに
イオン交換高速液体クロマトグラフィー（パーティジル
１０ＳＡＸ，ワットマン社）で精製〔Ｇａｉｔ，Ｍ．
Ｊ．ら Ｊ．Ｃ．Ｓ．，「ケミカル コミニュケーショ
ンズ（Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．）」，３７（１９８
２）〕を行ない、純粋なＤＮＡフラグメントを得た。こ
の様して合成した２２種のＤＮＡフラグメントは第３図
に示した通りである。

参考例２ オリゴＤＮＡのリン酸化 各々のＤＮＡフラグメントを２５μｌのリン酸化反応液
〔オリゴＤＮＡ２．５μｇ，５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｌ，ｐＨ７．６，１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２，１０ｍＭ ２
−メルカプトエタノール，１ｍＭ ＡＴＰ，２．５ユニ
ットＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（宝酒造）〕中で、
３７℃、１時間反応させ、５′末端をリン酸化した。こ
の反応液をこのまま凍結し、溶解後、次の反応に用い
た。

参考例３ ＤＮＡフラグメントの連結 ｈＥＧＦ遺伝子の２重鎖構成の１連の段階は第４図に示
した通りである(図中−印は５′末端水酸基がリン酸化
されていることを示す)。たとえばブロックＩの連結は
次の様にした。１２種（ＤＮＡフラグメント１から１２
に各々対応する）の参考例２の操作で得たＤＮＡフラグ
メントのリン酸化反応液を５μｌずつ加え、６０μｌと
した。これに１．４ユニットのＴ４ＤＮＡリガーゼ（宝
酒造）を加え、１４℃で２５時間インキュベートした
後、６５℃で１０分間処理し、反応をとめた。ここで主
生成物となったブロックＩの２量体を、制限エンドヌク
レアーゼＥｃｏＲＩ（宝酒造）で消化するために、この
反応液に次の３成分を50ｍＭ ＮａＣｌ，０．０１％牛
血清アルブミン（ＢＳＡ），７ｍＭＭｇＣｌ_２になるよ
うに加え、１２０ユニットのＥｃｏ ＲＩで３７℃、
１．５時間反応させ、６％含有アクリルアミドゲルを用
いて、緩衝液（ｐＨ８．３）〔１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−
ＨＣｌ，１００ｍＭホウ酸，２ｍＭ ＥＤＴＡ〕中、２
５ｍＡで１．５時間電気泳動にかけた。泳動後、０．６
ｍｇ／ｌのエチジウムブロマイド（ＥｔＢｒ）でゲルを
染色し、１０１ｂｐのＤＮＡ断片を含むゲル片を透析チ
ューブ内に封入し、泳動用衝撃液内に沈め、ＤＮＡ断片
をゲルから電気的に溶出した〔（ジャーナル オブ モ
レキュラー バイオロジー（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ
ｌ．）」，１１０，１１９（１９７７）〕。この透析チ
ューブ内液を０．０１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，（ｐＨ
７．６），０．１ＭＮａＣｌおよび０．００１Ｍ ＥＤ
ＴＡで飽和したフェノールで３回抽出し、さらにエーテ
ル抽出した後、ＮａＣｌを０．２Ｍとなるように加え
た。続いて２倍量の冷エタノールを加えて、−２０℃で
ＤＮＡを沈澱させた。以上と同様の操作によってさらに
ブロックII（＃１３から＃２２を含む）を調製した。

実施例１ ｈＥＧＦ遺伝子のクローニング（第５図） クローニングベクターには大腸菌のプラスミドｐＢＲ３
２２を使用した。ｐＢＲ３２２ＤＮＡを２０μｌの反応
液〔１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０，７ｍＭ
ＭｇＣｌ_２，１００ｍＭ ＮａＣｌ，２ｍＭ ２−メ
ルカプトエタノール，０．０１％ウシ血清アルブミン
（ＢＳＡ），１９ユニットのＥｃｏＲＩ（宝酒造），５
ユニットのＢａｍ ＨＩ（宝酒造）〕中、３７℃、１時
間反応させた後、水で３倍稀釈し、６５℃で１０分間処
理し、酵素を失活させた。この反応液０．５μｌと約２
０当量のＤＮＡフラグメントブロックＩおよびIIとを混
合し、６６ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），６．
６ｍＭ ＭｇＣｌ_２，１０ｍＭ ジチオスレイトール
(ＤＤＴ)および１ｍＭＡＴＰ存在下、１０μｌの反応液
として、１４℃、２時間Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（ニューイ
ングランド・バイオラボ社製）を作用させて、ｈＥＧＦ
遺伝子をプラスミドに結合させた。

この反応液を用い、既知の方法に従い、大腸菌ＤＨ１株
〔Ｓｅｌｓｏｎ，Ｍ．Ｅ．ら,「ネイチャー（Ｎａｔｕｒ
ｅ）」,２１７，１１１０−１１１４（１９６８）〕を形
質転換させた。すなわち、−７０℃で保存していた５０
μｌのコンピテントセル〔Ｈａｎａｈａｎ，Ｄ．，「ジ
ャーナル オブ モレキュラー バイオロジー（Ｊ．Ｍ
ｏｌ．Ｂｉｏｌ．）」，１６６，５５７（１９８３）〕
を０℃、１５分間インキュベートした後、４μｌの上記
反応液を添加した。さらに０℃、３０分間インキュベー
トした後、４２℃、１．５分間おき、さらに０℃で５分
間おいた。この反応液に２００μｌのＬＢ培地（１リッ
トル当りバクトトリプトン１０ｇ，バクトイースト抽出
物５ｇ，ＮａＣｌ ８ｇを含む）を加え、３７℃、５０
分間インキュベートした。この大腸菌を３５μｇ／ｍｌ
のアンピシリンを含むＬＢ寒天培地上にまき、３７℃で
１晩培養した。生じたアンピシリン耐性コロニー中、６
０株を選び、さらに７μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを
含むＬＢ寒天培地に接種したが、５９株ははえなかっ
た。次にこの５９株中１６株を選択し、この転換株のプ
ラスミドＤＮＡをアルカリ法〔Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．
ら,「モレキュラー クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ(Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ
ｏｕｒ)）」，３６８−３６９（１９８２）〕により粗精
製し、ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩ消化、さらにＥｃｏ
ＲＩおよびＢｇｌII消化，ＰｓｔＩ消化した。これら消
化物の２％アガロースゲルでの泳動パターンから、１４
株が正しくｈＥＧＦ遺伝子の挿入されている転換株であ
ることがわかった。この様にして得たクローニングベク
ターをｐＴＢ３６１と名付けた。このプラスミドｐＴＢ
３６１を持つ大腸菌ＤＨ１組み換え体の１白金耳を、３
５μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地１．５ｍｌ
に接種し、３７℃で一夜、振盪培養した。この培養液
０．３ｍｌを２００ｍｌフラスコに分注した２５ｍｌの
同じ培地に加え、３７℃、６．５時間振盪培養した後、
この培養液を５００ｍｌフラスコに分注した同培地１２
５ｍｌに加え、さらに４５分間振盪培養した。次にクロ
ラムフェニコールを１７０μｇ／ｍｌになるように添加
し、さらに一夜培養をつづけ、プラスミドＤＮＡの増幅
をはかった。この培養液１５０ｍｌを、６０００ｒｐ
ｍ，４℃，９分間遠心分離し、得られた菌体を生理食塩
水で洗浄し、４ｍｌの反応液〔２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ，ｐＨ８．０，５０ｍＭグルコース，１０ｍＭ Ｅ
ＤＴＡ，１ｍｇ／ｍｌリゾチーム〕を加え、懸濁した。
氷中で２０分間おいた後、８ｍｌのアルカリ溶液〔１％
（ｗ／ｖ）ＳＤＳ，０．２Ｎ ＮａＯＨ〕を添加し、氷
中で５分間したら、６ｍｌの５Ｍ酢酸カリウム緩衝液
（ｐＨ４．８）を加え、１０分間氷中でおき、１０，０
００ｒｐｍで４℃、２０分間遠心分離した。得られた上
澄液に２倍量のエタノールを加え、振盪した後、−２０
℃で１０分間おき、１０，０００ｒｐｍで４℃、２０分
間遠心分離した。沈殿物を風乾後、４ｍｌの緩衝液〔１
ｍＭ Ｎａ_２ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０），１０ｍＭ Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣｌ(ｐＨ８．０)〕に溶かし、塩化セシウム
（ＣｓＣｌ）を３．９ｇ、ＥｔＢｒを３ｍｇ加え、Ｂｅ
ｃｋｍａｎ５０Ｔｉローターで３５，０００ｒｐｍ，１
５℃，６４時間ＣｓＣｌ−ＥｔＢｒ平衡密度勾配遠心分
離にかけた。プラスミドＤＮＡのバンドを集め、２倍量
の緩衝液〔１ｍＭ Ｎａ_２ＥＤＴＡ，ｐＨ８．０，１０
ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０〕を加え、等量の
クロロホルム−フェノール（１：１，ｖ／ｖ）を加えて
２回洗浄し、ＥｔＢｒを除去後、エタノール沈殿を行な
った。さらに沈殿物を０．６ｍｌの緩衝液〔１ｍＭ Ｅ
ＤＴＡ，１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０，
０．３Ｍ ＮａＣｌ〕に溶かし、もう一度エタノール沈
殿を行なった。

ここで単離したプラスミドｐＴＢ３６１に組み込まれて
いるｈＥＧＦ遺伝子の塩基配列はＷａｌｌａｃｅらの方
法〔Ｗａｌｌａｃｅ，Ｒ．Ｂ．ら，「ジーン(Ｇｅｎ
ｅ)」，１６，２１−２６(１９８１)〕に従った。すなわ
ち、ｐＴＢ３６１ＤＮＡを１０μｌの反応液〔７ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５，７ｍＭ ＭｇＣｌ_２，
５０ｍＭ ＮａＣｌ，４ユニットのＰｖｕII（宝酒
造）〕中、３７℃、１時間反応させた。この反応液にプ
ライマーとしてＤＮＡフラグメント＃７の水溶液（１．
０Ａ260／ｍｌ）１μｌを加え、１００℃で５分加熱
後、氷浴で急冷した。以後の操作はジデオキシ法の一般
法どおりで行なった。同様にして、プライマーにＤＮＡ
フラグメント＃１４、＃１８を用いてｈＥＧＦ遺伝子の
塩基配列が正しいことを確認した。

実施例２ ｈＥＧＦの発現用プラスミドの構築ならびに
形質転換体の製造（第５図） ｉ）上記実施例１で得られた１０μｇのｐＴＢ３６１を
反応液〔５０ｍＭ ＮａＣｌ，６ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｌ（ｐＨ７．６），６ｍＭ ＭｇＣｌ_２，６ｍＭ ２−
メルカプトエタノール，０．０１％ＢＳＡ，５０ユニッ
トＥｃｏＲＩ，１０ユニットＰｓｔＩ（宝酒造）〕中、
３７℃、１．５時間反応させた後、２％アガロースゲル
電気泳動により１７２ｂｐＤＮＡ断片を常法（前述）に
従って精製した。一方、発現用ベクターにはｐｔｒｐ７
８１〔Ｋｕｒｏｋａｗａ，Ｔ．ら,「ヌクレイック アシ
ッズ リサーチ（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅ
ｓ．）」，１１，３０７７−３０８５（１９８３）〕を
使用した。ｐｔｒｐ７８１ＤＮＡを上記と同様にして、
ＥｃｏＲＩおよびＰｓｔＩ消化し、この反応液に２倍量
の水を加え、６５℃で１０分間おき、酵素を失活させ
た。

この様にして得た１７２ｂｐＤＮＡおよびプラスミドＤ
ＮＡは各々、両端にＥｃｏＲＩ消化およびＰｓｔＩ消化
により生じた単鎖の付着端を有する。

これら両者を混合し、６６ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐ
Ｈ７．５，６．６ｍＭ ＭｇＣｌ_２，１０ｍＭ ＤＴＴ
および１ｍＭ ＡＴＰ存在下、１４℃、５．５時間Ｔ４
ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ社）を作用させてＤＮＡを結合
し、前出と同様な方法で大腸菌ＤＨ１株を形質転換させ
た。次にこの大腸菌を７μｇ／ｍｌのテトラサイクリン
を含むＬＢ寒天培地上にまき、３７℃で１日培養した。
生じたテトラサイクリン耐性コロニーを、次に３５μｇ
／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に接種し、は
えない転換株を選び出した。さらに前出と同様な方法
で、転換株のプラスミドＤＮＡをＥｃｏＲＩおよびＰｓ
ｔＩで消化し、さらにＢｇｌIIおよびＨｉｎｄIIIで消
化して、ｈＥＧＦ遺伝子が正しく挿入された転換株を選
択した。この様にして得た発現用プラスミドをｐＴＢ３
７０と、また形質転換体をエシェリヒア コリ ＤＨ１
／ｐＴＢ３７０と名づけた。

ii）λＰ_Ｌプロモーター遺伝子を持つ発現用ベクターは
次の様にして構築した（第６図） プラスミドｐｔｒｐ６０１〔Ｙ．Ｆｕｊｉｓａｗａら,
「ヌクレイック アシッズ リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．）」，１１，３５８１（１９８
３）〕を制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＣｌａＩで切断した
後、生じた単鎖の付着端をＤＮＡポリメラーゼＩ（Ｋｌ
ｅｎｏｗ ｆｒａｇｍｅｎｔ）でうめ、フェノール処理
し、エタノール沈殿を行なった。この直鎖状ＤＮＡを１
４℃でＴ４ＤＮＡリガーゼを作用させて環状ＤＮＡと
し、前出と同様な方法で大腸菌を形質転換させ、これよ
りｔｒｐプロモーター下流がＥｃｏＲＩとなったプラス
ミドを単離し、ｐＴＢ５６と名付けた。

次にこのプラスミドｐＴＢ５６をＰｖｕIIで消化し直鎖
状ＤＮＡとした後、合成オリゴヌクレオチド（ＥｃｏＲ
Ｉリンカー）と混ぜ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ反応を行なっ
た。この反応物をＥｃｏＲＩで消化した後、２％アガロ
ースゲル電気泳動によりｔｒｐプロモーター遺伝子を含
む約０．２８ｋｂｐＤＮＡ断片を定法に従って精製し
た。

一方、ｐＢＲ３２２ＤＮＡをＥｃｏＲＩ消化して直鎖状
ＤＮＡとした後、５′末端のリン酸基をアルカリ性フォ
スファターゼ処理により除去し、前記０．２８ｋｂｐＤ
ＮＡＥｃｏＲＩ断片と混合し、１４℃でＴ４ＤＮＡリガ
ーゼを作用させ、ＤＮＡを結合し、大腸菌を形質転換さ
せ、これよりｔｒｐプロモーターがｐＢＲ３２２のＥｃ
ｏＲＩ部位にクローニングされたプラスミドを単離し、
ｐＴＢ５７と名付けた。

次にこのプラスミドｐＴＢ５７をＥｃｏＲＩで部分消化
して得られる直鎖状ＤＮＡを前出と同様の操作で処理
し、片方のＥｃｏＲＩ認識部位をつぶし、環状ＤＮＡと
した後、大腸菌を形質転換させ、得られたコロニーより
プラスミドを得、制限酵素の切断でのパターンよりｔｒ
ｐプロモーターの上流側にあるＥｃｏＲＩ認識部位がな
くなったプラスミドをｐＴＢ９１と名付けた。

さらにプラスミドｐＴＢ９１をＥｃｏＲＩで消化後、単
鎖の付着端をＤＮＡポリメラーゼＩでうめ、合成オリゴ
ヌクレオチド(ＢｇｌIIリンカー)と混ぜ、Ｔ４ＤＮＡリ
ガーゼを用いて結合し、ｔｒｐプロモーター遺伝子の下
流にＢｇｌII認識部位を導入し、このプラスミドをｐＴ
Ｂ３３４と名づけた。

この様にして得たｐＴＢ５７とｐＴＢ３３４を用い、ｔ
ｒｐプロモーターの上流にＥｃｏ ＲＩ認識部位、およ
び下流にＢｇｌII認識部位を持つプラスミドを構築し
た。まずｐＴＢ３４４を制限酵素Ｈｐａ ＩおよびＰｓ
ｔ Ｉで切断した後、２％アガロースゲル電気泳動によ
り約０．７８ｋｂｐＤＮＡ断片を溶出精製した。

またｐＴＢ５７も同様の制限酵素で切断した後、１％ア
ガロースゲル電気泳動により、３．８５ｋｂｐＤＮＡ断
片を溶出精製した。これら両者を混合しＴ４ＤＮＡリガ
ーゼを用いて結合した後、大腸菌を形質転換させ、得ら
れたコロニーよりプラスミドを得、制限酵素の切断での
パターンより目的のプラスミドを持つ転換株を選択し
た。これより単離したプラスミドをｐＴＢ３４０と名付
けた。

次にλＰ_Ｌプロモーターを持つプラスミドｐＡＤ３２９
〔Ａｄｈｙａ，Ｓ．ら，「セル（Ｃｅｌｌ）」，２９，
９３９−９４４（１９８２）〕より、λＰ_Ｌプロモータ
ー遺伝子を持つ０．３５ｋｂｐのＤＮＡ断片を単離し
た。まずプラスミドｐＡＤ３２９を制限酵素ＢｇｌIIお
よびＨｐａＩで消化後、２％アガロースゲル電気泳動に
かけ、約０．４５ｋｂｐのＤＮＡ断片を溶出精製した。
次いでこの０．４５ｋｂｐのＤＮＡ断片をＨｉｎｆＩに
より部分消化した後、２％アガロースゲル電気泳動にか
け、約０．３５ｋｂｐのＤＮＡ断片を溶出精製した。こ
の様にして得た０．３５ｋｂｐのＤＮＡ断片は両端にＢ
ｇｌII消化およびＨｉｎｆ Ｉ消化により生じた付着端
を有する。

一方、プラスミドｐＴＢ３４０を制限酵素ＢｇｌIIおよ
びＥｃｏＲＩで消化した後、１％アガロースゲル電気泳
動にかけ、約４．３５ｋｂｐＤＮＡを溶出し、精製し
た。ここで得られたＤＮＡは両端にＢｇｌII消化および
ＥｃｏＲＩ消化により生じた付着端を有する。この様に
して得られたλＰ プロモーター遺伝子を含む０．３５ｋｂｐＤＮＡ断片と
約４．３５ｋｂｐのＤＮＡとを混ぜ、Ｔ４ＤＮＡリガー
ゼで環状ＤＮＡとした後、大腸菌を形質転換させ、これ
よりλＰ プロモーターを持ち、その上流にＢｇｌII認
識部位、下流にＥｃｏ ＲＩ認識部位を有するプラスミ
ドを単離し、これをｐＴＢ２８１と名付けた。

これを用いてｈＥＧＦの発現用プラスミドを構築した
（第５図）。まず実施例１で前述したプラスミドｐＴＢ
３６１ １０μｇを反応液〔１００ｍＭ ＮａＣｌ，１
０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０，７ｍＭ Ｍｇ
Ｃｌ_２，２ｍＭ ２−メルカプトエタノール，０．０１
％ＢＳＡ，５０ユニットＥｃｏＲＩ，２０ユニットＢａ
ｍＨＩ（宝酒造）〕中、３７℃、１．５時間反応させた
後、２％アガロースゲル電気泳動により、ｈＥＧＦ遺伝
子を含む１７９ｂｐのＤＮＡ断片を溶出し、精製した。
一方、プラスミドｐＴＢ２８１も上記と同様にしてＥｃ
ｏＲＩおよびＢａｍＨＩ消化し、２倍量の水を加えて６
５℃、１０分間おき、酵素を失活させた。これら両端を
混合し、１４℃でＴ４ＤＮＡリガーゼを作用させ、ＤＮ
Ａを結合した。

大腸菌の形質転換は次の様に行なった。大腸菌Ｎ４８３
０株（ファルマシア・ジャパン社市販）の一晩培養液に
ＬＢ培地を加え、１００倍に稀釈した。３７℃で２時間
振盪培養した後３，３００ｒｐｍ，４℃，８分間遠心分
離し、得られた菌体を１０ｍＭ ＮａＣｌで洗浄した。
これに５０ｍＭ ＣａＣｌ_２溶液を添加し、氷中で１５
分間おき、３，３００ｒｐｍで４℃、４分間遠心分離
し、もう一度５０ｍＭ ＣａＣｌ_２に懸濁した。この１
００μｌに懸濁した大腸菌Ｎ４８３０に上記で得た反応
液７μｌを添加し、０℃、４５分間インキュベートし
た。次いで３７℃、２分間インキュベートし、９００μ
ｌのＬＢ培地を加えた後、３０℃で１時間インキュベー
トした。この大腸菌を３５μｇ／ｍｌのアンピシリンを
含むＬＢ寒天培地上にまき、３０℃で一晩培養した。生
じたアンピシリン耐性コロニーは、すべて７μｇ／ｍｌ
のテトラサイクリンに対する耐性能をなくしていた。次
に、この転換株の一部からプラスミドＤＮＡをとり、Ｅ
ｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩによる消化、さらにＢｇｌII
消化により、ｈＥＧＦ遺伝子の正しく挿入された転換株
を選択した。この様にして得たプラスミドをｐＴＢ３７
２と名づけた。

上記で得られたｐＴＢ３７２を次に前述同様の操作によ
りｐＲＫ２４８ｃＩｔｓ（レプレッサー）〔Ｂｅｒｎａ
ｒｄ，Ｈ．ら，「メソッズ イン エンザイモロジー
（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）」，
６８，４８２−４９２（１９７９）〕を含有する大腸菌
ＤＨ１株の形質転換に用い、得られた形質転換体を３５
μｇ／ｍｌのアンピシリンおよび７μｇ／ｍｌのテトラ
サイクリンを含有するＬＢ寒天培地上にまき、３０℃で
一晩培様した。生じたコロニーから前述同様に得たプラ
スミドＤＮＡを制限酵素で消化し、そのパターンよりｈ
ＥＧＦ遺伝子を含む形質転換株を選び、これをエシェリ
ヒア コリ ＤＨ１／ｐＴＢ３７２，ｐＲＫ２４８ｃＩ
ｔｓと名づけた。

実施例３ ｈＥＧＦの製造法 ｉ）エシェリヒア コリ ＤＨ１／ｐＴＢ３７０を７μ
ｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含むＬＢ培地中、３７℃
で一晩振盪培養した。この培養液０．５ｍｌに７μｇ／
ｍｌのテトラサイクリンを含む１０ｍｌのＭ９培地
〔０．４％カザミノ酸、１％グルコースを含む〕を加
え、３７℃、４時間振盪培養した後、３β−インドール
アクリル酸（ＩＡＡ）を加えて３０μｇ／ｍｌとなるよ
うにした。このまま、さらに４時間培養を続けた後、こ
の培養液１０．５ｍｌを７，０００ｒｐｍ、４℃、１０
分間遠心分離し、得られた菌体を−７０℃で凍結した。
これを溶解後、１ｍｌの反応液〔７Ｍグアニジン塩酸
塩，２ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオライド(Ｐ
ＭＳＦ)，０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．０〕
中、０℃、１時間インキュベートした。この反応液を２
０，０００ｒｐｍ、４℃、３０分間遠心分離し、得られ
た上澄液をＴＥＮ〔２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ
８．０，１ｍＭ ＥＤＴＡ，０．２Ｍ ＮａＣｌ〕１１
に対して４℃で２回透析し、析出した不溶物を２０，０
００ｒｐｍ、４℃、３０分間の遠心分離で除去した。こ
の様にして得られた溶液は−２０℃で保存した。

ii）エシェリヒア コリ ＤＨ１／ｐＴＢ３７２，ｐＲ
Ｋ２４８ｃＩｔｓを３５μｇ／ｍｌのアンピシリンおよ
び７μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含むＭ９培地中、
２９℃で一晩振盪培養した。この培養液０．５ｍｌに３
５μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む１０ｍｌのＭ９培地
を加え、２９℃で４時間振盪培養し、続いて４２℃で２
時間振盪培養を続けた後、前述と同様な処理を行ない、
得られた溶液は−２０℃で保存した。

上記ｉ）、ii）で得られた各生産物をラジオレセプター
アッセイ法（ＲＲＡ法）〔Ｃｏｈｅｎ，Ｓ．ら，「プロ
シージング オブ ナショナルアカデミー オブ サイ
エンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ）」，７２，１３１７−１３２１（１９７５）〕で分
析した。

ＥＧＦ活性は、同じ活性を示す精製マウスＥＧＦ標準の
重量で表わした。まずヒト胎児包皮細胞Ｆｌｏｗ７００
０（ｆｌｏｗ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．市
販）を１０％の牛胎児血清を含むダルベッコ・ミニマル
・エセンシャル（ＤＭＥＭ）培地を用いて、直径１．６
ｃｍの細胞培養用ディッシュ（Ｌｉｎｂｒｏ，Ｆｌｏｗ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．市販）で培養し
た。この培地を捨て、０．１％ＢＳＡを含むＤＭＥＭ培
地で細胞を洗浄後、０．２ｍｌの同培地と、クロラミン
Ｔ法により¹²⁵ＩでラベルしたマウスＥＧＦ（Ｃｏｌｌ
ａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．市
販）５ｎｇ、および上記で得た各生産物を適量加え、３
７℃で１時間培養した。

次に同培地で洗浄後、０．２Ｎ ＮａＯＨで処理し、チ
ューブへ移し、γ線カウンターで、とりこまれた ¹²⁵
Ｉを測定した。同様の操作で重量既知のマウスＥＧＦと
の競合反応により得られた検量曲線より、生産物中のヒ
トＥＧＦ量を算出した。結果は第１表に示した。

またエシェリヒア コリ ＤＨ１／ｐＴＢ３７０株を培
養し、ＩＡＡで誘導後、すでに記載した方法で溶解物中
のＥＧＦ活性を発育とあわせて測定した。その結果を第
７図に示した。図中、破線は菌株の発育を、実線はＥＧ
Ｆ活性を示す。

実施例４ ｈＥＧＦの動物細胞での産生 （ｉ）プラスミドｐＴＢ５０６の構築 ＳＶ４０プロモーターおよびＩＬ−２遺伝子を有するｐ
ＴＢ１０６〔特開昭６１−６３２８２号公報実施例１
（ｉ）〕を原料に、そのＩＬ−２遺伝子領域の５′末端
に存在するＰｓｔＩ切断部位をＥｃｏＲＩ切断部位に変
換し、また同遺伝子領域の３′末端に存在するＢａｍＨ
Ｉ切断部位の直前にＢｇｌII切断部位を挿入したプラス
ミドｐＴＢ３９６を構築した。

このｐＴＢ３９６をＥｃｏＲＩおよびＢｇｌIIで切断し
てＩＬ−２遺伝子領域を除いたプラスミドＤＮＡを製造
した。一方、ｐＴＢ３６１をＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨ
Ｉ切断してＥＧＦ遺伝子を切り出し、これを上記プラス
ミドＤＮＡとＴ４ＤＮＡリガーゼで結合させたｐＴＢ４
１３を構築した。

次にｐＴＢ３１４〔特開昭６１−６３２８２号公報実施
例１(iii)〕より、ＣｌａＩおよびＨｉｎｄIII切断によ
りエーベルソンマウス白血病ウィルス（Ａ−ＭｕＬＶ）
〔Ｇｏｆｆ，Ｓ．Ｐ．ら「セル（Ｃｅｌｌ）」，２２：
７７７−７８５（１９８０）〕のＬＴＲ領域を含むＤＮ
Ａ断片を切り出し、ＣｌａＩおよびＨｉｎｄIII切断し
たｐＴＢ４１３のＣｌａＩおよびＨｉｎｄIII切断部位
に挿入してｐＴＢ５０６を構築した（第８図）。

（ii）動物細胞の形質転換 ファルコンシャーレ（直径６ｃｍ）に１０％牛胎児血清
を含むダルベッコ改変イーグルＭＥＭ培地を入れ、マウ
スＨＰＲＴ（ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈ
ｏｒｉｂｏｓｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）欠損Ｌ細
胞（ＬＡ９細胞）〔Ｌｉｔｔｌｅｆｉｅｌｄ．Ｊ．Ｗ.,
「エクスペリメンタル セル リサーチ（Ｅｘｐ．Ｃｅ
ｌｌ Ｒｅｓ．」４１：１９０−１９６（１９６６）〕
を３７℃で一晩培養した。培養後、この細胞（７×１０
^５個／ディシユ）に対して、プラスミドｐ４ａＡ８｛ヒ
トＨＰＲＴｃＤＮＡを含むプラスミド）〔Ｊｏｌｌｙ．
Ｄ，Ｊ．ら，「プロシージング オブ ナショナル ア
カデミー オブ サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）」，８０：４７７−４８１
（１９８３）〕０．５μｇと１０μｇのｐＴＢ５０６Ｄ
ＮＡとをグラハムらの方法〔「ウィロロジー（Ｖｉｒｏ
ｌｏｇｙ）」，５２：４５６−４６７（１９７３）〕に
従って混合、接種し、共形質転換を行った。４時間３７
℃で培養後、新たな培地に替えて一夜培養し、翌日１０
％牛胎児血清を含むＨＡＴ培地（１５μｇ／ｍｌヒポキ
サンチン、１μｇ／ｍｌアミノプテリン、５μｇ／ｍｌ
チミジンを含むダルベッコ改変イーグルＭＥＭ培地）に
替えて、３７℃で培養を続けた。

３〜４日に一度培養液の交換を行って培養を続けると、
約２〜３週間後ＨＰＲＴ となった細胞が増殖してコロ
ニーを形成した。

(iii)形質転換体のクローニングおよびＥＧＦの定量 上記(ii)で得た形質転換細胞のクローニングを、リミテ
ッド ダイリューション法に従って行なった。クローニ
ング終了後クローン細胞は１０％牛胎児血清を含むイー
グル改変ＭＥＭ培地にて培養した。分離されたクローン
細胞はファルコンシャーレ（直径６ｃｍ）にまき、細胞
がコンフルエントになった時、細胞をラバーポリスマン
を用いてはがし、遠心（２０００ｒｐｍ×５分間）にて
集めた。次に集めた細胞に２００μｌのＮＥＴを加え、
超音波処理（５秒間×２）にて細胞を破壊し、遠心（２
００００ｒｐｍ、４℃、３０分間）した後、得られた上
澄液中のＥＧＦ活性を実施例６の方法に従い測定した。
形質転換細胞クローンのうちマウスＬＡ９−ＥＧＦ−３
細胞は１．４ｎｇ／１０^７細胞のＥＧＦを産生している
ことが判明した。結果を第２表に示す。

【図面の簡単な説明】

第１図はｈＥＧＦに対応する本発明で用いている合成遺
伝子のＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を示した図であ
り、第２図は本発明で用いているｈＥＧＦ遺伝子合成の
際のＤＮＡフラグメントへの分割の一例を示した図であ
り、第３図は本発明で用いているｈＥＧＦ対応合成遺伝
子製造用ＤＮＡフラグメントの一例を示す図であり、第
４図は第３図の各ＤＮＡフラグメントを連結してｈＥＧ
Ｆ合成遺伝子を製造する模式図である。 第５図は本発明のｈＥＧＦ対応合成遺伝子を組込んだ発
現用プラスミドの構築図であり、第６図はプラスミドｐ
ＴＢ２８１の構築図である。第７図は本発明の形質転換
細菌を用いてＥＧＦを製造した際の菌体の発育とＥＧＦ
活性を示すグラフである。第８図は実施例７（ｉ）にお
ける動物細胞形質転換用プラスミドｐＴＢ５０６の構築
図を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 // Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｈ 8214−4Ｂ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (56)参考文献 Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．ＵＳＡ．，1983〔80〕Ｐ．7461−7465 Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅ ａｒｃｈ，1982〔10〕Ｐ．4467−4482 Ｎａｔｕｒｅ，1983〔303〕Ｐ．722− 725

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】ＤＮＡ配列 ＡＡＣＡＧＴＧＡＴＴＣＡＧＡＡＴＧＴＣＣＴＣＴＣＴ
   ＣＡＣＡＣＧＡＴＧＧＡＴＡＣＴＧＣＣＴＣＣＡＴＧＡ
   ＣＧＧＣＧＴＧＴＧＴＡＴＧＴＡＴＡＴＴＧＡＡＧＣＡ
   ＣＴＡＧＡＣＡＡＡＴＡＣＧＣＡＴＧＣＡＡＣＴＧＴＧ
   ＴＡＧＴＴＧＧＣＴＡＴＡＴＴＧＧＴＧＡＡＣＧＡＴＧ
   ＣＣＡＧＴＡＣＣＧＡＧＡＴＣＴＧＡＡＡＴＧＧＴＧＧ
   ＧＡＡＣＴＧＣＧＡ で示されるヒト表皮細胞増殖因子発現のための合成遺伝
   子を有するＤＮＡによって形質転換した細菌または哺乳
   動物細胞。