JPH0644875B2 - 組換え遺伝子産物の製造方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は組換え遺伝子産物の製法に関する。

〔従来技術〕

組換え遺伝子産物の生産性を向上させる事を目的とした
培地、培養法の改良に関する報告は少なく、わずかに菌
の高濃度培養を主眼におきデービス培地を改変させた培
地を用いて、pHコントロールしながらグルコースを分割
して添加する培養法が報告されている。(H.Merietal.,
Journal of Chemical Engineering of Japan１２．３
１３−３１９（１９７９）、T.Kobayashi etal.Proc.−
Pac.Chem.Eng.Conger.,３rd４１４７−５０（１９８
３））しかし、これらでは、菌の高濃度培養は達成され
ているが、大腸菌全菌体蛋白に対する目的産物の割合が
明記されていない。

〔発明が解決すべき問題点〕

前記培養法では本発明者らの実験によると確かに菌濃度
は上昇するが、全大腸菌蛋白当りの目的産物の量は通常
の培養法に比し逆に著しく低下し、その生産性は何ら改
善されないことが判明した。

〔問題点を解決するための手段〕

そこで本発明者らは組換え遺伝子産物の生産性を向上さ
せる方法につき種々検討した結果、カゼイン加水分解
物、酵母エキス、無機塩及び大腸菌資化性炭素源を必須
成分とする培地中にチオ硫酸塩を添加し、組換え遺伝子
をもつ大腸菌を培養すると遺伝子産物の生産性が大巾に
向上することを見い出した。

本発明は上記知見に基づいて完成されたものである。

即ち本発明は、カゼイン加水分解物、酵母エキス、無機
塩及び大腸菌資化性炭素源を必須成分とする培地中にチ
オ硫酸塩を添加し、組換え遺伝子を持つ大腸菌を培養
し、その培養物より組換え遺伝子産物を採取する事を特
徴とする組換え遺伝子産物の製法に関する。

本発明で使用するガゼイン加水分解物はカゼインを加水
分解したものなら特に制限ないが、カゼインをトリプシ
ン、ペプシン、パパイン等のプロテアーゼで加水分解し
たものが好ましく例えばバクトートリプトン（ディフコ
社製）やペプトンなどが好ましい。この使用量は培地１
当り１〜１００ｇ好ましくは５〜５０ｇ、さらに好ま
しくは１０〜３０ｇ程度である。

酵母エキスの使用量は培地１当り１〜１００ｇ、好ま
しくは２〜３０ｇ、さらに好ましく５〜１５ｇ程度であ
る。

無機塩としては例えばNaCl,KCl,Na₂SO₄,CaCl₂,CaCO₃,Mg
SO₄,CuSO₄,FeSO₄,ZnSO₄,MnCl₂,リン酸塩などが好ましく
はNaClがあげられ、それらの使用量は培地１当り０．
１〜５０ｇ、好ましくは１〜３０ｇ、さらに好ましくは
２〜１０ｇ程度である。

又、大腸菌資化性の炭素源としては例えば、グリセロー
ル、グルコース、アラビノース、マンニトール、マルト
ース、トレハロース、ソルビトールなどがあげられ、グ
リセロール、ソルビトール、トレハロースが好ましい。
その使用量は培地１当り５％以下、好ましくは0.001
〜３％、さらに好ましくは０．０１〜２．５％程度であ
る。

本発明で使用する培地には他の成分も添加することがで
きる。他の成分としては例えば炭酸カルシウムなどのpH
調節剤や産生される遺伝子産物に取り込まれる微量元素
の供給源例えば遺伝子産物がCu−Zn−スーパーオキシド
ディスムターゼ（SOD）の場合における硫酸銅や硫酸亜
鉛などがあげられる。

又、チオ硫酸塩としては特に制限はなく、例えばチオ硫
酸ソーダ(Na₂S₂O₃)、チオ硫酸カリウム(K₂S₂O₃)、チオ
硫酸アンモニウム(NH₄)₂S₂O₃、チオ硫酸カルシウム(CaS
₂O₃)などがあげられ、なるべく特級試薬のものが好まし
い、この使用濃度は、０．０１％〜１％、好ましくは、
０．０５％〜０．３５％、さらに好ましくは、０．２〜
０．３％程度である。

本発明で使用する培地は固体培地でもよいが上記培地成
分を蒸留水に溶解した液体培地の方が実用的で好まし
い。

本発明の製法を実施するには、上記培地中で組換え遺伝
子を持つ大腸菌を培養し、その培養物より組換え遺伝子
産物を採取すればよい。

組換え遺伝子としては大腸菌にその遺伝子産物を産生さ
せるものであれば特に制限なく、例えば、ヒトSOD遺伝
子、牛SOD遺伝子、酵母SOD遺伝子などに適用できる。

培養は常法によりおこなうことができ、例えば空気を吹
き込みながら２０〜５０℃好ましくは２５〜４０℃で３
〜１２０時間好ましくは１０〜３６時間程度振盪培養な
どの方法でおこなえばよい。

培養物よりの組換え遺伝子産物の採取は常法によりおこ
なうことができ、例えば培養物を遠心処理して集菌し、
遺伝子産物がその上清中に存在する場合は、その上清液
をクロマトグラフィー処理などの処理によりおこなうこ
とができる。又、遺伝子産物が菌体中に存在する場合
は、集菌した菌体を緩衝液に懸濁した後例えば超音波処
理などで破菌し、次いで遠心処理して得られる上清をク
ロマトグラフィーなどで処理することによりその遺伝子
産物を得ることができる。

〔効 果〕

次に本発明の効果を実施例により説明する。

実験例1. (1) 実験方法 Ｌ培地（培地１中バクトトリプトン１０ｇ、酵母エキ
ス５ｇ、食塩５ｇ含有）に０．１mMCu SO₄,０．１mMZnS
O₄,２０μｇ／mlアンピシリン及び下記表１の成分を添
加した培地を用い、後記実施例１記載の形質転換した大
腸菌を実施例１と同様に培養して培養物を得、集菌、破
菌した後遠心分離し、上清を得た。この上清につきSOD
の産生量をFridoviclr法で測定し、又総蛋白量をLowry
−Foline法（O.H.Lowry,etal.J.Biol.Chem.１９３，２
６５（１９５１））で測定し、全菌体蛋白に対するSOD
蛋白の比を算出した。

(2) 結 果 結果を表１に示す。

この表から明らかなようにチオ硫酸塩を添加するとSOD
の産生量は増大し、又、全菌体蛋白あたりのSOD蛋白の
割合も増大する。

実施例1. 後記参考例の７）で得られたpRTac SOD８〜１３を大腸
菌Ｗ３１１０株(ATCC27325)にHaniatisらの方法(Molecu
lar Cloning；cold spring harbor laboratory２５４−
２５５（１９８２）)で挿入し、形質転換した大腸菌を
２０μｇ／mlのアンピシリンと０．１mMCuSO₄及び０．
１mMZnSO₄、５ｇ／のグリセロールを含みかつ、別殺
菌したチオ硫酸ソーダを終濃度０．２％となる様に添加
したＬ培地（他に培地１中バクトトリプトン１０ｇ、
酵母エキス５ｇ、食塩５ｇ含有）に接種し、３０℃で振
盪培養し、５５０nmにおける吸光度が０．２となったと
ころで培養温度を３７℃に上昇した。更に振盪培養を約
２４時間続けた。

こうして得た培養液１９を６０００rpm１０分間の遠
心沈降にかけ集菌した。菌は培養液の１／１０容の５０
mMTris−HCl（７．５）−mMCuSO₄−１mMZnSO₄緩衝液に
懸濁した。これを氷冷下で超音波処理し、菌を破砕し
た。処理液の５５０nmにおける吸光度が、処理前の１／
10にまで減少したところで処理を終了した。

最後に、この処理液を３００００rpm３０分間超遠心沈
降し、上清を得た。この上清には、SODが抽出されてい
る。

得られた溶菌上清液７１５ml（総活性：５８１５Ku、比
活性１８８．２ｕ／mg・ｐ）を用いてSODの精製を行っ
た。

ＨＰ−２０カラムクロマトグラフィー 予め５０mMの食塩水で平衡化したダイアイオンＨＰ−２
０を５．８φ×３９cm^Hのカラムに充填し充分平衡化す
る。溶菌上清液７１５mlに５０mMの食塩水５６０mlを加
えこの混合液をカラムに吸着後、直ちに５０mM酢酸ソー
ダ緩衝液、pH５でカラム容量の約９倍洗滌する。ついで
０．１Ｍグリシン−苛性ソーダ緩衝液の６０％メタノー
ル溶液、pH１０．０で溶出しSOD活性を示す画分を集め
た。（画分Ａ、３８２ml） この画分を約０．５Ｎの塩酸でpH７．０に調節後、４０
℃の水浴上でエバポレートにより濃縮乾涸する。乾涸物
を１００mlの水に溶解後、４０mM食塩を含む５mMリン酸
緩衝液、pH７．５に対し透析チューブを用いて透析を行
う。

DEAE−トヨパールカラムクロマトグラフィー 透析されたSODを含む溶液を予め４０mM食塩を含む５mM
リン酸緩衝液pH7.5 で平衡化されたDEAE−トヨパールの
充填されたカラム（３^φ×２８cm^H）に通導する。つい
で同じ緩衝液で溶出させてSODを吸着させずに通過液と
して得る。（画分Ｂ、１７６ml） セファデックスＧ−１００ゲルクロマトグラフィー 画分Ｂ１７６mlを限外過膜（ＹＭ−５）を用いて８ml
に濃縮した液を予め１％食塩を含んだ５mMリン酸緩衝
液、pH７．０で平衡化したセファデックスＧ−１００
（２^φ×１５９cm^H）カラムに吸着させ、平衡化緩衝液
で溶出しSOD活性を示す画分を得た（画分Ｃ、８０ml） これを、ミリフォアフィルターでろ過した後、限外過
で濃縮し、次いで凍結乾燥した。この結果、比活性３８
１０Unit／mg・pのSOD粉末１．０７ｇ力価を得た。

参考例 (1) ヒト胎盤からのmRNAの分離とSOD mRNAの同定： 新生児誕生より１時間以内の新鮮な胎盤約３００ｇをリ
ン酸生理食塩水(PBS溶液)で洗い、グラニジン・チオシ
アネート法〔Chirgwins.Biochem,１８，５２９４−５２
９９（１９７９）〕によって細胞質の全RNAを抽出し
た。この抽出した全RNAを高塩濃度の緩衝液（Tris,0.5M
NaClを含む、pH7.4）に溶かし、これをオリゴ（dT）セ
ルロース（ファルマシア社製）カラムに通し、ポリＡRN
A（mRNA）を吸着させた後、低塩濃度の緩衝液（Tris,Na
Clを含まず、pH7.4）で溶出してエタノール沈澱させ
た。全RNA１５０mgより１．７mgのmRNAを得た。沈澱を
２００μの減菌水に溶かし、８０℃２分間加温後急冷
して、５〜２０％ショ糖密度勾配遠心法により分子量の
大きさの順に分離した。

実際には日立RPN４０Ｔローターを用い、35Ｋrpm、１７
時間０℃で遠心した。

次いで分離した各画分（０．５ml）の一部を、ウサギ網
状赤血球ライセート（アマシャム社製）の系で翻訳さ
せ、合成された蛋白質を免疫学的方法（エンザイム・イ
ムノアッセイ法）（J.Pharm.Dyn.,５ ３９４−４０２
（１９８２））で調べた。このようにしてmRNAの１０〜
１２Ｓ画分にSOD mRNAの存在が認められた。

(2) mRNAのアニーリングとcDNAの合成： (1)で得られた分画を用い、岡山−Bergの方法〔Mol.Cel
l.Biol.,２，161−170（1982）〕に従って以下のように
合成した。

あらかじめ５０mM Tris（pH８．３），３０mMKC，０．
３mMジチオスイトール(DTT)、8mMMgCl₂、４０μｇ／ml
アクチノマイシンＤ、各２mMのdATP、dCTP、dGTP、TT
P、30μCl〔α−³²Ｐ〕dCTP（６００Ci／mmol）（NEN社
製）、280単位のリボヌクレアーゼインヒビター（和光
純薬社製）、および２．８μｇのプラスミドプライマー
〔大腸菌プラスミドpSV７１８６(ファルマシア社製)を
用い、岡山−Berg法に順じて合成したＴ−テーリング約
６０塩基のプライマー〕を含む溶液１０μを調製し、
３７℃に保つ。次に１０mM Tris（pH８）、１mM EDTAと
３μｇのmRNAを含む溶液１０μを調製し、６５℃で５
分間加温後直ちに３７℃に移した後、上記溶液１０μ
と混合して、さらに５分間加温した。つづいて５単位の
逆転写酵素（ライフサイエンス社製）を加え、３７℃で
２０分間加温した。２μの２５０mM EDTA（pH８．
０）と１μの１０％SDS溶液を加えて反応を停止させ
た後、フェノール・クロロホルム抽出、エタノール沈澱
をそれぞれ２回経て次の段階へ進んだ。

(3) 式(1)の塩基配列を含有するプラスミドの合成： (2)で得られた沈澱物を１４０mMカコジル酸ナトリウム
−３０mMTris（pH６．８）、１mMCoCl₂、０．１mMDTT、
１mMdCTPおよび５０μCi〔α−³²Ｐ〕dCTPを含む溶液に
溶かし、３７℃で２〜３分間加温後、１８単位のターミ
ナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ファ
ルマシア社製）を加え、全体を１５μとした。３７℃
で３分間加温した後、逆転写反応と同様な後処理を行っ
てエタノール沈澱物を得た。

次に該沈澱物を５０mMNaCl、５０mMTris（pH８．０）、
１０mMMgCl₂、１００μｇウシ血清アルブミン(BSA)、お
よび１２単位のHindIII（ニッポンジーン社製）を含む
溶液に溶かして３７℃、２〜４時間加温した。フェノー
ル・クロロホルム抽出、エタノール沈澱後、これを１０
μの１０mMTris（pH７．３）、１mM EDTAを含む溶液
に溶かし、さらに３μのエタノールを加えて全体を１
３μとした。この溶液１μに０．０４pmolのオリゴ
（dG）リンカー〔大腸菌プラスミドpSV1932（ファルマ
シア社製）を用い、岡山−Berg法に順じて合成したdG−
テーリング約１２塩基のリンカー〕、１０mMTris(pH７
５)、０．１MNaCl、１mMEDTAの１０倍濃縮液１μと蒸
留水８μを加えて全体を１０μとし、該溶液を６５
℃５分間、４２℃３０分間と経時加温後０℃に保った。
これに２０mMTris（pH７．５）、４-mMMgCl₂、１０mM硫
酸アンモニウム、０．１MKCl、５０μｇ／mlBSA、０．
１mMβ−ニコチンアミドアデノシンジヌクレオチド（NA
D）および０．６μｇの大腸菌DNAリカーゼ（ファルマシ
ア社製）を含む濃縮液を加えて最終的に該濃度溶液１０
０μとし、１２℃で一液加温した。次いで、各２０mM
を含んだdATP、dCTP、dGTPおよびTTPを０．４μ、
１．５mMβ−NADを１μ、大腸菌DNAリガーゼを０．４
μｇ、大腸菌DNAポリメラーゼを０．３μｇ、そして大
腸菌リポヌクレアーゼＨを１単位それぞれ添加して（全
体として１０４μ）、さらに１２℃で１時間、２５℃
で１時間加温した。

(4) 大腸菌への形質転換： 大腸菌としてｘ1776(ATCC31244)を使用した。コンピテ
ントセルはManiatisら〔Molecular Cloning、cold spri
ng harbor laboratory、２５４−２５５（１９８２）〕
と全く同様の方法で調製し、０．２mlづつ分注した。該
DNA溶液を２０μづつ５本形質転換し、バクトトリプ
トン１０ｇ／、イーストエクストラクト５ｇ／、ジ
アミノピメリン酸０．０１％、チミジン０．００４％お
よびアンピシリン（Ap）５０μｇ／mlを含む１．５％寒
天培地上にコロニー約３万個を得た。

(5) コロニーハイブリダイゼーション： 得られたコロニーのうち約１万個を同組成の寒天培地上
に移し換え（５１２個／１４×１０cmプレート；２枚１
組とし、１枚をマスタープレートとして保存した。）、
直径約３mmに成長するまで培養した。これにワットマン
５４１ロ紙をゆっくりとのせ、コロニーを完全にロ紙に
移行させてから、クロラムフエニコール２５０μｇ／ml
を含む同組成寒天培地上に該ロ紙を密着させ一昼夜培養
した。ロ紙へのDNA固定は次のように行った。

培養後のロ紙を０．５ＭNaOHで５分間、２回処理し、
０．５ＭTris（pH７．４）で中性にもどし、２×SSC（p
H７）（１×SSC：０．１５ＭNaCl、０．０１５Ｍクエン
酸ナトリウム）処理を経、９５％エタノール水溶液で軽
く洗浄した後風乾した。プローブとして(A)１７ヌクレ
オチド：AA(Tor C)TT(Tor C)GA(Aor G)CA(Aor G)AA(Aor
G)GAの３２種類(B)１４ヌクレオチド：GA(Tor C)CA(To
r C)TG(Tor C)AT(T,Cor A)ATの２４種類をそれぞれトリ
エステル法で化学合成し、以下に述べるハイプリダイゼ
ーションに使用した。

(イ) プレハイブリダイゼーション ロ紙を６×SET（１×SET：０．１５ＭＢNaCl、０．０１
５ＭTris（pH７．５）、１mMEDTA）、０．５％ソニデッ
トＰ４０（半井化学社製）および１００μｇ／mlの変性
大腸菌DNA（ファルマシア社製の大腸菌DNAを５分間煮沸
後急冷したもの）を含む溶液で５５℃、２時間加温し
た。

(ロ) ハイプリダイゼーション 次に変性大腸菌DNAの代りに１００μｇ／mlの酵母tRNA
(BRL社製)と、〔γ−³²Ｐ〕ATP（５０００Ci／mmol NEN
社製）とポリヌクレオチドキナーゼ（NEB社製）を用い
て５′位を〔³²Ｐ〕標識したプローブ０．２ng／mlとを
用いて２９℃、２時間ハイブリダイゼーションを行っ
た。

(ハ) 式(1)の塩基配列を含むプラスミドの単離洗浄は各
々(A)３９℃で５分間(B)２９℃で２０分間、続いて室温
で１０分間の処理を６×SSC溶液を用いて各段階３回づ
つ繰返した。ロ紙を風乾後、Ｘ線フイルム（コダックXA
R₅）を用いてオートラジオグラフィーを行ない、(A)、
(B)両方にポジティブなコロニーを１個選別し、その菌
体よりプラスミドを取り出し、そのプラスミドをpHＳ３
２３７と命名した。

(6) 発現ベクターの構築 大腸菌プラスミドpUC₁₃（ファルマシア社製）上のラク
トース・プロモーターに最近接したHae II部位を切断
後、エキソヌクレアーゼBal３１（NEB社製）で両端を約
１００bp削除し、T₄DNAリカーゼ（宝酒造社製）で再閉
環させたプラスミドpΔUC₁₃を調製した（このプラスミ
ドはラクトース・プロモーターとしての機能を失ってい
る）。次いでこのプラスミドのHincII切断部位にTrpAタ
ーミネーター（ファルマシア社製）を挿入し、プラスミ
ドpΔUCT₁₃を得た。

(A) SODをコードするDNAの調製 前記(5)の(ハ)で得られたpH３２３７をPvu IIで消化し、
XbaＩリンカー（NEB社製）をT₄DNAリーガーゼで連結し
てXbaＩ部位を設けこのプラスミドをpHSX３２３７と命
名した。pHSX３２３７をPstＩで消化し、エキソヌクレ
アーゼBal 31で遂次消化した。さらにT₄DNAポリメラー
ゼで末端を平滑にそろえ、BamHIリンカー（宝酒造社
製）を連結してBamHIとXbaＩ（いずれもニッポン・ジー
ン社製）で消化後約６３０〜７００bpのDNAを２−１６
％グラジエントポリアクリルアミドゲルで回収した。

(B) Tac プロモーターおよびSOD DNAを挿入したプラス
ミドの調製 プラスミドpDR₅₄₀（ファルマシア社製）をEcoRI（ニッ
ポン・ジーン社製）とBamHIで消化しTac プロモーター
を含む１２１bpをポリアクリルアミドゲルで回収し、p
ΔUCT₁₃のEcoRI−BamHI間に挿入して得られた約３Kbの
プラスミドをpTacIと命名した（第３図）。pTacIのBamH
I−XbaＩ間に(7)(A)で得られた約６３０−７００bpのDN
Aを挿入して得られたプラスミドを大腸菌DHl（ATCC3384
9）に形質転換した。得られた種々のプラスミドの塩基
配列を決定し、SD配列（AGGA）から開始コドンATGまで
の距離が８〜１３ヌクレオチド長のプラスミドをpTac S
OD８〜１３と命名した。

(7) ランナウェイ型SOD発現ベクターの構築 ATCCより購入したランナウィイプラスミドpMOB４５（AT
CC37106）(M.Bitter and D.Vapnek,Gene１５，319-329,
(1981))をEcoRIとHindIII（宝酒造、以下すべて同社製
品）で切断し、ランナウェイ複製起点を含む６．７Kbの
DNA断片を切り出した。このDNAを精製し、Bal ３１酵素
で処理し、両端各々０．３Kbぐらい消化後、DNAポリメ
ラーゼで処理してDNA未満を平滑にした。一方、ATCCよ
り購入したpBR３２２をTth１１１IIで切断しアンピシリ
ン耐性遺伝子を含む１．３KbのDNAを切り出した。このD
NAも精製後、上記方法と同様にBal ３１酵素、DNAポリ
メラーゼで順次処理した。こうして得られた２本のDNA
断片を等モルで混合し、更にHindIIIリンカー及びEcoRI
リンカー（宝酒造）を１０倍モル量加えてから、Ｔ４DN
Aリガーゼで処理し、DNAを連結した。

次に、このDNA試料を大腸菌Ｗ３１１０(ATCC27325)株へ
Maniatisらの方法で（Molecular Cloning；cold spring
harbor laboratory２５４−２５５（１９８２）、形質
転換し、アンピシリン耐性株を選別した。任意に選んだ
１２株について、その保有するプラスミドの制限酵素解
析を行った。この結果、上記２本のDNA断片が連結し、
かつひとつの連結部にのみ２種のリンカー（Hind IIIと
EcoRI）が挿入されたプラスミドpR4が得られた。次にpR
4をEcoRIとHindIIIで切断して開裂し、この部位間にpΔ
UCT₁₃（前記(6)(A)参照）に由来し、マルチクローニン
グ部位と転写終結因子を含む０．４KbのEcoRI−HindIII
断片を挿入してpR3を構築した。更に、このpR３をEcoRI
とXbaＩで切断開裂し、この部位間にpTacSOD８〜１３
（前記(6)(B)参照）に由来しtacプロモーターとヒトSOD
遺伝子を含む約０．７KbのEcoRI−XbaＩDNA断片を挿入
し、pRTac SO₄８〜１３を構築した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 1/38 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】カゼイン加水分解物、酵母エキス、無機塩
   及び大腸菌資化性炭素源及びチオ硫酸塩を必須成分とす
   る培地中で組換え遺伝子を持つ大腸菌を培養し、その培
   養物より、組換え遺伝子産物を採取する事を特徴とする
   組換え遺伝子産物の製法