JPH0648986B2 - アセテート・カイネース遺伝子 - Google Patents
アセテート・カイネース遺伝子Info
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- JPH0648986B2 JPH0648986B2 JP7315688A JP7315688A JPH0648986B2 JP H0648986 B2 JPH0648986 B2 JP H0648986B2 JP 7315688 A JP7315688 A JP 7315688A JP 7315688 A JP7315688 A JP 7315688A JP H0648986 B2 JPH0648986 B2 JP H0648986B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- dna
- acetate kinase
- gene
- kinase gene
- escherichia coli
- Prior art date
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
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- Zoology (AREA)
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- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、アセテート・カイネース(acetatekinase)の
製造に有用なアセテート・カイネースをコードする遺伝
子（以下，アセテート・カイネース遺伝子という）に関
する。
製造に有用なアセテート・カイネースをコードする遺伝
子（以下，アセテート・カイネース遺伝子という）に関
する。
アセテート・カイネースは、下記の反応式で示される反
応を触媒する酵素である。
応を触媒する酵素である。
そして、アセテート・カイネースは、ＡＴＰの製造等に
極めて有用なものである。
極めて有用なものである。
従来、アセテート・カイネースは、例えば、エッシェリ
シア・コリ(Escherichia coli)を培養し、菌体よりアセ
テート・カイネースを分離、精製することにより製造さ
れている〔ジェイ．バイオル．ケム．(J.Biol.Chem.)、
第261巻、第29号、第13487〜13497頁(1986)〕。
シア・コリ(Escherichia coli)を培養し、菌体よりアセ
テート・カイネースを分離、精製することにより製造さ
れている〔ジェイ．バイオル．ケム．(J.Biol.Chem.)、
第261巻、第29号、第13487〜13497頁(1986)〕。
しかしながら、上記のアセテート・カイネースの製造法
によるときには、該酵素の収率が著しく低い等の難点が
あった。
によるときには、該酵素の収率が著しく低い等の難点が
あった。
そこで、本発明者等は、上記難点を解決すべく種々検討
した結果、アセテート・カイネース遺伝子を含有するＤ
ＮＡをベクターＤＮＡに挿入した組み換え体ＤＮＡを
得、この組み換え体をエッシェリシア(Escherichia)属
に属する菌株に含ませたアセテート・カイネース生産能
を有する菌株を培地に培養すると高収率でアセテート・
カイネースが生産されること等の知見を得、特許出願を
行なった（特願昭62-273146及び62-273147号明細書）。
した結果、アセテート・カイネース遺伝子を含有するＤ
ＮＡをベクターＤＮＡに挿入した組み換え体ＤＮＡを
得、この組み換え体をエッシェリシア(Escherichia)属
に属する菌株に含ませたアセテート・カイネース生産能
を有する菌株を培地に培養すると高収率でアセテート・
カイネースが生産されること等の知見を得、特許出願を
行なった（特願昭62-273146及び62-273147号明細書）。
その後、本発明者等は、エッシェリシア・コリ(Escheri
chiacoli)由来のアセテート・カイネース遺伝子につい
て更に検討した結果、エッシェリシア・コリ由来のアセ
テート・カイネース遺伝子を初めて単離及び構造決定す
ることに成功し、本発明を完成した。
chiacoli)由来のアセテート・カイネース遺伝子につい
て更に検討した結果、エッシェリシア・コリ由来のアセ
テート・カイネース遺伝子を初めて単離及び構造決定す
ることに成功し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は、特許請求の範囲に示されるアミノ
酸配列をコードするアセテート・カイネース遺伝子であ
る。
酸配列をコードするアセテート・カイネース遺伝子であ
る。
以下、本発明について詳細に説明する。
先ず、アセテート・カイネース遺伝子を含有するＤＮＡ
の調製について述べる。
の調製について述べる。
例えば、大腸菌好ましくは大腸菌(E.coli)1100(Max-Pla
nk-Institut西独、ハイデルベルグより入手）を培養し
て培養物を得る。
nk-Institut西独、ハイデルベルグより入手）を培養し
て培養物を得る。
上記微生物を培養するには、通常の固体培養法で培養し
てもよいが、なるべく液体培養法を採用して培養するの
が好ましい。
てもよいが、なるべく液体培養法を採用して培養するの
が好ましい。
また、上記微生物を培養する培地としては、例えば酵母
エキス、ペプトン、肉エキス、コーンスィープリカーあ
るいは大豆もしくは小麦▲麩▼の浸出液等の１種以上の
窒素源に、リン酸第１カリウム、リン酸第２カリウム、
硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、塩化マグネシウ
ム、塩化第２鉄、硫酸第２鉄あるいは硫酸マンガン等の
無機塩類の１種以上を添加し、更に必要により糖質原
料、ビタミン等を適宜添加したものが用いられる。
エキス、ペプトン、肉エキス、コーンスィープリカーあ
るいは大豆もしくは小麦▲麩▼の浸出液等の１種以上の
窒素源に、リン酸第１カリウム、リン酸第２カリウム、
硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、塩化マグネシウ
ム、塩化第２鉄、硫酸第２鉄あるいは硫酸マンガン等の
無機塩類の１種以上を添加し、更に必要により糖質原
料、ビタミン等を適宜添加したものが用いられる。
なお、培地の初発ｐＨは、７〜９に調整するのが適当で
ある。また培養は30〜42℃、好ましくは37℃前後で４〜
24時間、好ましくは６〜24時間、通気撹拌深部培養、振
盪培養、静置培養等により実施するのが好ましい。
ある。また培養は30〜42℃、好ましくは37℃前後で４〜
24時間、好ましくは６〜24時間、通気撹拌深部培養、振
盪培養、静置培養等により実施するのが好ましい。
このようにして得られる培養物を、例えば3,000r.p.m.
以上、好ましくは8,000〜10,000r.p.m.で５分以上、好
ましくは10〜15分間遠心分離して大腸菌1100の菌体を得
る。
以上、好ましくは8,000〜10,000r.p.m.で５分以上、好
ましくは10〜15分間遠心分離して大腸菌1100の菌体を得
る。
この菌体より、例えば斎藤、三浦の方法〔バイオケム．
バイオフィズ．アクタ．(Biochem.Biophys.Acta.)、第7
2巻、第619頁（1963年）］、ケー・エス・カービー(K.
S.Kirby)の方法［バイオケム．ジェイ．(Biochem.J.)、
第64巻、第405頁（1956年）］等の方法により染色体Ｄ
ＮＡを得ることができる。
バイオフィズ．アクタ．(Biochem.Biophys.Acta.)、第7
2巻、第619頁（1963年）］、ケー・エス・カービー(K.
S.Kirby)の方法［バイオケム．ジェイ．(Biochem.J.)、
第64巻、第405頁（1956年）］等の方法により染色体Ｄ
ＮＡを得ることができる。
ついで、この染色体ＤＮＡに、突出末端を生じさせる制
限酵素、例えばSau3AI（東洋紡績社製）を、温度30℃以
上、好ましくは37℃、酵素濃度１〜10ユニット／mlで20
分以上、好ましくは30分〜２時間作用させて消化し、種
々の染色ＤＮＡ断片混合物を得る。
限酵素、例えばSau3AI（東洋紡績社製）を、温度30℃以
上、好ましくは37℃、酵素濃度１〜10ユニット／mlで20
分以上、好ましくは30分〜２時間作用させて消化し、種
々の染色ＤＮＡ断片混合物を得る。
そして、アセテート・カイネース遺伝子は、リンケージ
・マップ(Linkage map)〔マイクロバイオロジカル・レ
ビュウズ(Microbiological Reviews)、第47巻、第２
号、第180〜230頁（1983年）〕上、purF（グルタミン．
フォスフォリボシルパイロフォスフェイト・アミドトラ
ンスフェラーゼ(Glutamine Phosphoribosyl-pyrophosph
ate amidotransferase)遺伝子の近傍に位置づけられて
いるので、前記染色体ＤＮＡ断片混合物からクロモゾー
マル・ウォーキング(Chromosomal Walking)法〔ネイチ
ャー(Nature)、第300巻、第４号、第35〜42頁（1982
年）〕によりpurF遺伝子の近傍に存在するアセテート・
カイネース遺伝子を含有するＤＮＡ断片を検索すること
ができる。
・マップ(Linkage map)〔マイクロバイオロジカル・レ
ビュウズ(Microbiological Reviews)、第47巻、第２
号、第180〜230頁（1983年）〕上、purF（グルタミン．
フォスフォリボシルパイロフォスフェイト・アミドトラ
ンスフェラーゼ(Glutamine Phosphoribosyl-pyrophosph
ate amidotransferase)遺伝子の近傍に位置づけられて
いるので、前記染色体ＤＮＡ断片混合物からクロモゾー
マル・ウォーキング(Chromosomal Walking)法〔ネイチ
ャー(Nature)、第300巻、第４号、第35〜42頁（1982
年）〕によりpurF遺伝子の近傍に存在するアセテート・
カイネース遺伝子を含有するＤＮＡ断片を検索すること
ができる。
このようにして得たＤＮＡ断片混合物から、例えば通常
のアガロースゲル電気泳動法によりＤＮＡ断片混合物を
得、更に例えばフェノール抽出等の精製手段により精製
し、また更に例えばエタノール沈澱法等の濃縮手段によ
り濃縮し、純化されたＤＮＡ断片混合物（この中にアセ
テート・カイネース遺伝子を含有するＤＮＡ断片が含ま
れる）を得る。
のアガロースゲル電気泳動法によりＤＮＡ断片混合物を
得、更に例えばフェノール抽出等の精製手段により精製
し、また更に例えばエタノール沈澱法等の濃縮手段によ
り濃縮し、純化されたＤＮＡ断片混合物（この中にアセ
テート・カイネース遺伝子を含有するＤＮＡ断片が含ま
れる）を得る。
一方、本発明において用いることのできるベクターＤＮ
Ａとしては、如何なるものでもよく、例えばプラスミド
ベクターＤＮＡ、バクテリオファージベクターＤＮＡ等
が挙げられるが、具体的には例えばプラスミドpUC19Ｄ
ＮＡ（宝酒造社製）などが好ましい。
Ａとしては、如何なるものでもよく、例えばプラスミド
ベクターＤＮＡ、バクテリオファージベクターＤＮＡ等
が挙げられるが、具体的には例えばプラスミドpUC19Ｄ
ＮＡ（宝酒造社製）などが好ましい。
上記ベクターＤＮＡに、突出末端を生じさせる制限酵
素、例えばEcoRI及びBamHI（いずれも宝酒造社製）を、
温度30℃以上、好ましくは37℃、酵素濃度10〜1000ユニ
ット／mlで１時間以上、好ましくは１〜３時間作用させ
て消化し、切断されたベクターＤＮＡを得る。
素、例えばEcoRI及びBamHI（いずれも宝酒造社製）を、
温度30℃以上、好ましくは37℃、酵素濃度10〜1000ユニ
ット／mlで１時間以上、好ましくは１〜３時間作用させ
て消化し、切断されたベクターＤＮＡを得る。
次いで、上記のようにして得た大腸菌1100由来で、アセ
テート・カイネース遺伝子を含有するＤＮＡ断片混合物
と、切断されたベクターＤＮＡを混合し、これに例えば
大腸菌ＤＮＡリガーゼ（ニュー・イングランド・バイオ
・ラブス社製）、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（ベーリンガ・マ
ンハイム社製）など、好ましくはＴ４ＤＮＡリガーゼ
を、温度４〜37℃、好ましくは４〜16℃、酵素濃度１〜
100ユニットで１時間以上、好ましくは６〜24時間作用
させて組み換え体ＤＮＡを得る。
テート・カイネース遺伝子を含有するＤＮＡ断片混合物
と、切断されたベクターＤＮＡを混合し、これに例えば
大腸菌ＤＮＡリガーゼ（ニュー・イングランド・バイオ
・ラブス社製）、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（ベーリンガ・マ
ンハイム社製）など、好ましくはＴ４ＤＮＡリガーゼ
を、温度４〜37℃、好ましくは４〜16℃、酵素濃度１〜
100ユニットで１時間以上、好ましくは６〜24時間作用
させて組み換え体ＤＮＡを得る。
この組み換え体ＤＮＡを用いて、例えば大腸菌Ｋ−12、
好ましくは大腸菌ＪＭ101(ATCC33876)、大腸菌ＨＢ101
(ATCC33694)、大腸菌ＤＨＩ(ATCC33849)、大腸菌ｘ−17
76(ATCC31244)、などを形質転換あるいは形質導入して
それぞれの菌株を得る。この形質転換はディー・エム・
モーリソン(D.M.Morrison)の方法〔メソヅ・イン・エン
ザイモロジー(Methods in Enzymology)、第68巻、第326
〜331頁（1979年）〕により行なうことができる。また
形質導入はビー・ホーン(B.Hohn)の方法〔メソヅ・イン
・エンザイモロジー第68巻、第299〜309頁（1979年）〕
によって行なうことができる。
好ましくは大腸菌ＪＭ101(ATCC33876)、大腸菌ＨＢ101
(ATCC33694)、大腸菌ＤＨＩ(ATCC33849)、大腸菌ｘ−17
76(ATCC31244)、などを形質転換あるいは形質導入して
それぞれの菌株を得る。この形質転換はディー・エム・
モーリソン(D.M.Morrison)の方法〔メソヅ・イン・エン
ザイモロジー(Methods in Enzymology)、第68巻、第326
〜331頁（1979年）〕により行なうことができる。また
形質導入はビー・ホーン(B.Hohn)の方法〔メソヅ・イン
・エンザイモロジー第68巻、第299〜309頁（1979年）〕
によって行なうことができる。
そして、上記菌株よりアセテート・カイネース生産能を
有する菌株をスクリーニングすることにより、アセテー
ト・カイネース遺伝子を含有するＤＮＡをベクターＤＮ
Ａに挿入した組み換え体ＤＮＡを含み、アセテート・カ
イネース生産能を有するエッシェリシア属に属する菌株
を得ることができる。
有する菌株をスクリーニングすることにより、アセテー
ト・カイネース遺伝子を含有するＤＮＡをベクターＤＮ
Ａに挿入した組み換え体ＤＮＡを含み、アセテート・カ
イネース生産能を有するエッシェリシア属に属する菌株
を得ることができる。
このようにして得られた菌株より純化された新規な組み
換え体ＤＮＡを得るには、例えばピー・グーリー(P.Gue
rry)等の方法〔ジェイ．バクテリオロジー(J.Bacteriol
ogy)第116巻、第1064〜1066頁（1973年）〕、デー・ビ
ー・クレウェル(D.B.Clewell)の方法〔ジェー・バクテ
リオロジー第110巻、第667〜676（197年）〕などにより
得ることができる。
換え体ＤＮＡを得るには、例えばピー・グーリー(P.Gue
rry)等の方法〔ジェイ．バクテリオロジー(J.Bacteriol
ogy)第116巻、第1064〜1066頁（1973年）〕、デー・ビ
ー・クレウェル(D.B.Clewell)の方法〔ジェー・バクテ
リオロジー第110巻、第667〜676（197年）〕などにより
得ることができる。
次いで、上記の純化された新規な組み換え体ＤＮＡに、
例えば、制限酵素MluI及びPstI（いずれも宝酒造社製）
を温度30℃以上、好ましくは37℃、酵素濃度５〜20ユニ
ット／mlで0.5〜２時間、好ましくは約１時間作用させ
て消化し、ＤＮＡ断片混合物を得る。
例えば、制限酵素MluI及びPstI（いずれも宝酒造社製）
を温度30℃以上、好ましくは37℃、酵素濃度５〜20ユニ
ット／mlで0.5〜２時間、好ましくは約１時間作用させ
て消化し、ＤＮＡ断片混合物を得る。
上記ＤＮＡ断片混合物よりアセテート・カイネース遺伝
子を含有するＤＮＡを単離するには、ティー・マニアテ
ィス(T.Maniatis)等の方法〔モレキュラー・クローニン
グ(Molecular Cloning)、コールド・スプリング・ハー
バー・ラボラトリィ(Cold Spring Harbof Laborator
y)、第173頁〜第178頁（1982年）〕により得ることがで
きる。
子を含有するＤＮＡを単離するには、ティー・マニアテ
ィス(T.Maniatis)等の方法〔モレキュラー・クローニン
グ(Molecular Cloning)、コールド・スプリング・ハー
バー・ラボラトリィ(Cold Spring Harbof Laborator
y)、第173頁〜第178頁（1982年）〕により得ることがで
きる。
上記アセテート・カイネース遺伝子を含有するＤＮＡを
用いて、実施例の項目(7)に示すような方法によって、
アセテート・カイネース遺伝子のみの全塩基配列の解析
を行い（第４図参照）、次いで前記塩基配列を有する遺
伝子によって翻訳されるポリペプタイドのアミノ酸配列
を確定する（第５図参照）。
用いて、実施例の項目(7)に示すような方法によって、
アセテート・カイネース遺伝子のみの全塩基配列の解析
を行い（第４図参照）、次いで前記塩基配列を有する遺
伝子によって翻訳されるポリペプタイドのアミノ酸配列
を確定する（第５図参照）。
このようにして確定されたアミノ酸配列をコードする遺
伝子が本発明のアセテート・カイネース遺伝子である。
伝子が本発明のアセテート・カイネース遺伝子である。
次に、上記のようにして得られたアセテート・カイネー
ス遺伝子を含有するＤＮＡをベクターＤＮＡに挿入した
組み換え体ＤＮＡを含み、アセテート・カイネース生産
能を有するエッシェリシア属に属する菌株を用いてアセ
テート・カイネースを生産するには、前記大腸菌1100の
培養法と全く同様にして培養し、培養物を得る。
ス遺伝子を含有するＤＮＡをベクターＤＮＡに挿入した
組み換え体ＤＮＡを含み、アセテート・カイネース生産
能を有するエッシェリシア属に属する菌株を用いてアセ
テート・カイネースを生産するには、前記大腸菌1100の
培養法と全く同様にして培養し、培養物を得る。
培養終了後、該培養物よりアセテート・カイネースを採
取するには、通常の酵素採取手段を用いて得ることがで
きる。
取するには、通常の酵素採取手段を用いて得ることがで
きる。
例えば、常法により菌体を、超音波破壊処理、磨砕処理
などするか、または、リゾチーム等の溶菌酵素を用いて
本酵素を抽出するか、またはトルエン等の存在下で振盪
もしくは放置して自己消化を行なわせ本酵素を菌体外に
排出させる。この溶液を濾過、遠心分離などして固形部
分を除去し、必要によりストレプトマイシン硫酸塩、プ
ロタミン硫酸塩あるいは硫酸マンガンにより除核酸した
のち、これに硫安、アルコール、アセトン等を添加して
分画し、沈澱物を採取し、これを水に対し透析したのち
真空乾燥して粗酵素標品を得る。
などするか、または、リゾチーム等の溶菌酵素を用いて
本酵素を抽出するか、またはトルエン等の存在下で振盪
もしくは放置して自己消化を行なわせ本酵素を菌体外に
排出させる。この溶液を濾過、遠心分離などして固形部
分を除去し、必要によりストレプトマイシン硫酸塩、プ
ロタミン硫酸塩あるいは硫酸マンガンにより除核酸した
のち、これに硫安、アルコール、アセトン等を添加して
分画し、沈澱物を採取し、これを水に対し透析したのち
真空乾燥して粗酵素標品を得る。
更に、アセテート・カイネースの精製品を得るには、例
えばＤＥＡＥ−セルロース（ジ・エチル・アミン・エチ
ル・セルロース、米国ブラウン社製）、ＤＥＡＥ−セフ
ァデックス（ジ・エチル・アミン・エチル・セファデッ
クス、スウェーデン国ファルマシア社製）、ＱＡＥ−セ
ファデックス（スウェーデン国、ファルマシア社製）等
のイオン交換物質を用いる吸着溶出法にて精製するか、
またセファデックスＧ−200（スウェーデン国、ファル
マシア社製）、セファロース６Ｂ（スウェーデン国、フ
ァルマシア社製）等を用いるゲル濾過法、ハイドロキシ
ルアパタイト（米国バイオラッド社製、バイオゲルHT）
を用いる吸着溶出法、ポリアクリルアミドゲル等を用い
る電気泳動等を適宜選択、組み合わせて実施することに
より、高度に精製されたアセテート・カイネース標品を
得ることができる。
えばＤＥＡＥ−セルロース（ジ・エチル・アミン・エチ
ル・セルロース、米国ブラウン社製）、ＤＥＡＥ−セフ
ァデックス（ジ・エチル・アミン・エチル・セファデッ
クス、スウェーデン国ファルマシア社製）、ＱＡＥ−セ
ファデックス（スウェーデン国、ファルマシア社製）等
のイオン交換物質を用いる吸着溶出法にて精製するか、
またセファデックスＧ−200（スウェーデン国、ファル
マシア社製）、セファロース６Ｂ（スウェーデン国、フ
ァルマシア社製）等を用いるゲル濾過法、ハイドロキシ
ルアパタイト（米国バイオラッド社製、バイオゲルHT）
を用いる吸着溶出法、ポリアクリルアミドゲル等を用い
る電気泳動等を適宜選択、組み合わせて実施することに
より、高度に精製されたアセテート・カイネース標品を
得ることができる。
上記精製手段により得られる精製アセテート・カイネー
スの理化学的性質は、〔ジェイ．バイオル．ケム．(J.B
iol.Chem.)、第261巻、第29号、第13487〜13497号（198
6年）〕記載のアセテート・カイネースの理化学的性質
と全く同様である。
スの理化学的性質は、〔ジェイ．バイオル．ケム．(J.B
iol.Chem.)、第261巻、第29号、第13487〜13497号（198
6年）〕記載のアセテート・カイネースの理化学的性質
と全く同様である。
上述したことから明らかな如く、本発明のアセテート・
カイネース遺伝子を含有するＤＮＡをベクターＤＮＡに
挿入した組み換え体ＤＮＡを含むエッシェリシア属に属
する菌株を培地に培養することにより、アセテート・カ
イネースを高収率で得ることができるので、本発明は産
業上極めて有用なものである。
カイネース遺伝子を含有するＤＮＡをベクターＤＮＡに
挿入した組み換え体ＤＮＡを含むエッシェリシア属に属
する菌株を培地に培養することにより、アセテート・カ
イネースを高収率で得ることができるので、本発明は産
業上極めて有用なものである。
以下、実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明す
る。
る。
実施例 (1) 大腸菌1100株ＤＮＡの調製 大腸菌1100(Max-Plank-Institut西独、ハイデルベルグ
より入手）株を、Ｔ−Ｙ培地［１％(W/V)バクトートリ
プトン(Bacto-trypton)〔ディフコ(Difco)社製〕、0.5
％(W/V)バクトーイーストエキストラクト(Bacto-yeast
extract)〔ディフコ(Difco)社製〕及び0.5％(W/V)NaCl
（ｐＨ7.2）］100mlに接種し、温度37℃で８時間振盪培
養し、培養物を得た。
より入手）株を、Ｔ−Ｙ培地［１％(W/V)バクトートリ
プトン(Bacto-trypton)〔ディフコ(Difco)社製〕、0.5
％(W/V)バクトーイーストエキストラクト(Bacto-yeast
extract)〔ディフコ(Difco)社製〕及び0.5％(W/V)NaCl
（ｐＨ7.2）］100mlに接種し、温度37℃で８時間振盪培
養し、培養物を得た。
この培養物を10,000r.p.m.で15分間、常法により遠心分
離処理し、湿潤菌体0.5gを得たのち、該菌体から斎藤、
三浦の方法〔バイオケム．バイオフィズ．アクタ．(Bio
chrm.Biophys.Acta.)、第72巻、第619頁（1963年）〕に
より染色体ＤＮＡを得た。
離処理し、湿潤菌体0.5gを得たのち、該菌体から斎藤、
三浦の方法〔バイオケム．バイオフィズ．アクタ．(Bio
chrm.Biophys.Acta.)、第72巻、第619頁（1963年）〕に
より染色体ＤＮＡを得た。
次いで、この染色体ＤＮＡ60μｇ及び制限酵素Sau 3AI
（東洋紡績社製）３ユニットを、10mMトリス−塩酸緩衝
液(50mM NaCl、10mM MgSO4及び１mMジチオスレイトール
含有）（ｐＨ7.4)に夫々混合し、温度37℃で30分間反応
させた。反応終了液を常法により、フェノール抽出処理
し、エタノール沈澱処理した後、このSau3AIで消化され
たＤＮＡ断片が再結合することを防止するために、モレ
キュラー・クローニング(Molecular Cloning)、第133〜
134頁の方法でバクテリアル・アルカリフォスファター
ゼ(Bacterial Alkaline Phosphatase)処理により、ＤＮ
Ａ断片の脱リン酸化を行ない、常法によりフェノール抽
出処理し、更にエタノール沈澱処理して、Sau3AIで消化
された大腸菌1100株の染色体ＤＮＡ断片50μｇを得た。
（東洋紡績社製）３ユニットを、10mMトリス−塩酸緩衝
液(50mM NaCl、10mM MgSO4及び１mMジチオスレイトール
含有）（ｐＨ7.4)に夫々混合し、温度37℃で30分間反応
させた。反応終了液を常法により、フェノール抽出処理
し、エタノール沈澱処理した後、このSau3AIで消化され
たＤＮＡ断片が再結合することを防止するために、モレ
キュラー・クローニング(Molecular Cloning)、第133〜
134頁の方法でバクテリアル・アルカリフォスファター
ゼ(Bacterial Alkaline Phosphatase)処理により、ＤＮ
Ａ断片の脱リン酸化を行ない、常法によりフェノール抽
出処理し、更にエタノール沈澱処理して、Sau3AIで消化
された大腸菌1100株の染色体ＤＮＡ断片50μｇを得た。
(2) バクテリオファージベクターＤＮＡ(EMBL4)を利用
した大腸菌染色体ＤＮＡライブラリーの作製 バクテリオファージベクターＤＮＡ(EMBL4)〔プロメガ
・バイオテク(Promega Biotec)社製〕20μｇ及び制限酵
素BamHI（宝酒造社製）200ユニットを50mMトリス−塩酸
緩衝液(100mM NaCl及び10mM MgSO4含有）（ｐＨ7.4)に
混合し、温度37℃で２時間反応させて消化液を得、該液
を常法によりフェノール抽出及びエタノール沈澱処理し
た後、バクテリオファージ・ベクター由来の中間ＤＮＡ
フラグメントが再結合することによりバクテリオファー
ジができることを防止するために、エタノール沈澱物20
μｇ及び制限酵素SalI 100ユニットを50mMトリス−塩酸
緩衝液(100mM NaCl及び10mM MgSO4含有）（ｐＨ7.4）に
混合し、温度37℃で２時間反応させて消化液を得、該液
を常法によりフェノール抽出及びエタノール沈澱処理し
て、BamHIで消化されたバクテリオファージＥＭＢＬ４
ＤＮＡを得た。
した大腸菌染色体ＤＮＡライブラリーの作製 バクテリオファージベクターＤＮＡ(EMBL4)〔プロメガ
・バイオテク(Promega Biotec)社製〕20μｇ及び制限酵
素BamHI（宝酒造社製）200ユニットを50mMトリス−塩酸
緩衝液(100mM NaCl及び10mM MgSO4含有）（ｐＨ7.4)に
混合し、温度37℃で２時間反応させて消化液を得、該液
を常法によりフェノール抽出及びエタノール沈澱処理し
た後、バクテリオファージ・ベクター由来の中間ＤＮＡ
フラグメントが再結合することによりバクテリオファー
ジができることを防止するために、エタノール沈澱物20
μｇ及び制限酵素SalI 100ユニットを50mMトリス−塩酸
緩衝液(100mM NaCl及び10mM MgSO4含有）（ｐＨ7.4）に
混合し、温度37℃で２時間反応させて消化液を得、該液
を常法によりフェノール抽出及びエタノール沈澱処理し
て、BamHIで消化されたバクテリオファージＥＭＢＬ４
ＤＮＡを得た。
次いで、このBamHIで消化されたバクテリオファージＥ
ＭＢＬ４ＤＮＡ１μｇ、上記項目(1)で得られたSau3AI
で消化された大腸菌1100株の染色体ＤＮＡ断片１μｇ及
び２ユニットのＴ４ＤＮＡリガーゼ〔ベーリンガー・マ
ンハイム(Boeringer Manheim)社製〕を、66mM MgCl2、10
mMジチオスレイトール及び10mMＡＴＰを含有する66mMト
リスー塩酸緩衝液（ｐＨ7.5）に添加し、温度16℃で16
時間反応し、ＤＮＡを連結させた。
ＭＢＬ４ＤＮＡ１μｇ、上記項目(1)で得られたSau3AI
で消化された大腸菌1100株の染色体ＤＮＡ断片１μｇ及
び２ユニットのＴ４ＤＮＡリガーゼ〔ベーリンガー・マ
ンハイム(Boeringer Manheim)社製〕を、66mM MgCl2、10
mMジチオスレイトール及び10mMＡＴＰを含有する66mMト
リスー塩酸緩衝液（ｐＨ7.5）に添加し、温度16℃で16
時間反応し、ＤＮＡを連結させた。
次いで、該ＤＮＡ混合物を、イン・ビトロ・パッケージ
ング(in vitro packaging)法〔メソズ・イン・エンザイ
モロジー(Methods in Enzymology)、第68巻、第281〜29
8頁（1979年）〕により、バクテリオファージの被膜蛋
白質で包み、バクテリオファージ粒子を調製した。
ング(in vitro packaging)法〔メソズ・イン・エンザイ
モロジー(Methods in Enzymology)、第68巻、第281〜29
8頁（1979年）〕により、バクテリオファージの被膜蛋
白質で包み、バクテリオファージ粒子を調製した。
次いで、このようにして得たバクテリオファージ粒子を
大腸菌ＮＭ539〔プロメガ・バイオテク(Promega Biote
c)社より入手）を指示菌として、トリプトン寒天培地
［トリプトン〔Difco（社）製〕１％、NaCl0.25％、寒
天1.2％で、加圧滅菌したのち、30mlずつ直径９cmのシ
ャーレに分注したものである。］上に撒き、温度37℃で
16時間静置培養したのち、約5,000個の溶菌斑を得、こ
れをライブラリーとして使用した。
大腸菌ＮＭ539〔プロメガ・バイオテク(Promega Biote
c)社より入手）を指示菌として、トリプトン寒天培地
［トリプトン〔Difco（社）製〕１％、NaCl0.25％、寒
天1.2％で、加圧滅菌したのち、30mlずつ直径９cmのシ
ャーレに分注したものである。］上に撒き、温度37℃で
16時間静置培養したのち、約5,000個の溶菌斑を得、こ
れをライブラリーとして使用した。
(3) purF遺伝子を含むＤＮＡの調製 大腸菌アセテート・カイネース発現に関与する遺伝子ac
kAは、前述した如く、purF遺伝子の近傍に位置づけられ
ている。purF遺伝子の塩基配列は、ジェイ・ヤン・ツオ
ー(J.Yun.Tso)等の報告〔ジャーナル・オブ・バイオロ
ジカル・ケミストリー(Journal of Biological Chemstr
y)、第257巻、第3525〜3531頁、1982年〕に記載されて
いる。このpurF遺伝子の塩基配列の一部である5′GTCGG
TATCGCCGGTG3′の16塩基のオリゴヌクレオチドをＤＮＡ
合成機（ベックマン(Beckmann)社製）を用いて、合成し
た。この20ngのオリゴヌクレオチドの５′未満を〔３２
Ｐ〕ＡＴＰ（アマシャム社製）を用いて、モレキュラー
・クローニング(Molecular Cloning)、第122〜126頁、
コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリィ(Cold
Spring Harbor Laboratory)(1982)記載の方法に従って
標識した。
kAは、前述した如く、purF遺伝子の近傍に位置づけられ
ている。purF遺伝子の塩基配列は、ジェイ・ヤン・ツオ
ー(J.Yun.Tso)等の報告〔ジャーナル・オブ・バイオロ
ジカル・ケミストリー(Journal of Biological Chemstr
y)、第257巻、第3525〜3531頁、1982年〕に記載されて
いる。このpurF遺伝子の塩基配列の一部である5′GTCGG
TATCGCCGGTG3′の16塩基のオリゴヌクレオチドをＤＮＡ
合成機（ベックマン(Beckmann)社製）を用いて、合成し
た。この20ngのオリゴヌクレオチドの５′未満を〔３２
Ｐ〕ＡＴＰ（アマシャム社製）を用いて、モレキュラー
・クローニング(Molecular Cloning)、第122〜126頁、
コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリィ(Cold
Spring Harbor Laboratory)(1982)記載の方法に従って
標識した。
上記の方法で調製した３２Ｐで標識したpurF遺伝子の一
部であるオリゴヌクレオチドをプローブとして用い、項
目(2)で作製した組み換え体バクテリオファージＥＭＢ
Ｌ４ＤＮＡをベクターとする大腸菌1100株染色体ＤＮＡ
ライブラリーを、プラーク・ハイブリダイゼージョン法
〔（モレキュラー・クローニング(Molecular Clonin
g)、第312〜328頁、コールド・スプリング・ハーバー・
ラボラトリィ(Cold Spring Harbor Laboratory)(198
2)〕で検索し、purF遺伝子を有するプラークを得た。該
プラークをモレキュラー・クローニング(Molecular Clo
ning)、第371〜372頁、コールド・スプリング・ハーバ
ー・ラボラトリィ(Cold Spring Harbor Laboratory)(19
82)記載の方法に従い、purF遺伝子を含むバクテリオフ
ァージＤＮＡを精製し、この組み換え体バクテリオファ
ージＤＮＡをhy102と命名した。
部であるオリゴヌクレオチドをプローブとして用い、項
目(2)で作製した組み換え体バクテリオファージＥＭＢ
Ｌ４ＤＮＡをベクターとする大腸菌1100株染色体ＤＮＡ
ライブラリーを、プラーク・ハイブリダイゼージョン法
〔（モレキュラー・クローニング(Molecular Clonin
g)、第312〜328頁、コールド・スプリング・ハーバー・
ラボラトリィ(Cold Spring Harbor Laboratory)(198
2)〕で検索し、purF遺伝子を有するプラークを得た。該
プラークをモレキュラー・クローニング(Molecular Clo
ning)、第371〜372頁、コールド・スプリング・ハーバ
ー・ラボラトリィ(Cold Spring Harbor Laboratory)(19
82)記載の方法に従い、purF遺伝子を含むバクテリオフ
ァージＤＮＡを精製し、この組み換え体バクテリオファ
ージＤＮＡをhy102と命名した。
該組み換え体バクテリオファージhy102ＤＮＡを制限酵
素HindIII,EcoRI,BamHI,BglII及びSalI（いずれも宝酒
造社製）を用い、単一消化及び二重消化して得られたＤ
ＮＡ断片をアガロース電気泳動法により、移動度パター
ンを分析し、得られた移動度パターンとバクテリオファ
ージＤＮＡ（宝酒造社製）をHindIIIにより消化して得
られたＤＮＡ断片の標準移動度パターンとを対比するこ
とにより得られた制限酵素地図は、第１図に示すとおり
であった。
素HindIII,EcoRI,BamHI,BglII及びSalI（いずれも宝酒
造社製）を用い、単一消化及び二重消化して得られたＤ
ＮＡ断片をアガロース電気泳動法により、移動度パター
ンを分析し、得られた移動度パターンとバクテリオファ
ージＤＮＡ（宝酒造社製）をHindIIIにより消化して得
られたＤＮＡ断片の標準移動度パターンとを対比するこ
とにより得られた制限酵素地図は、第１図に示すとおり
であった。
(4) アセテート・カイネース遺伝子の検索−−−プロ
ープＤＮＡの作製 組み換え体バクテリオファージhy102ＤＮＡ５μｇを、1
5μｌのＴＥ緩衝液〔１mMＥＤＴＡを含む10mMトリス−
塩酸緩衝液（ｐＨ7.5）〕に溶解し、これに２μｌのHig
h緩衝液〔50mMトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ7.5）／1000mM
NaCl／100mM MgCl2／10mMジチオスレイトール〕及び30
ユニットのEcoRIを添加し、温度37℃で２時間切断処理
した。
ープＤＮＡの作製 組み換え体バクテリオファージhy102ＤＮＡ５μｇを、1
5μｌのＴＥ緩衝液〔１mMＥＤＴＡを含む10mMトリス−
塩酸緩衝液（ｐＨ7.5）〕に溶解し、これに２μｌのHig
h緩衝液〔50mMトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ7.5）／1000mM
NaCl／100mM MgCl2／10mMジチオスレイトール〕及び30
ユニットのEcoRIを添加し、温度37℃で２時間切断処理
した。
このＤＮＡ全量を0.7％(W/V)アガロースゲルを用いた電
気泳動で分離した。アガロースゲル電気泳動は、ティ・
マニアティス(T.Maniatis)等の方法〔モレキュラー・ク
ローニング(Molecular Cloning)、第156〜161頁、コー
ルド・スプリング・ハーバー・ラボラトリィ(Cold Spri
ng Harbor Laboratory)(1982)〕に従って行なった。バ
クテリオファージhy102ＤＮＡ中の3.45Kbp EcoRI/EcoRI
ＤＮＡ断片を含むゲル部分をゲルより切りだして透明チ
ューブに入れ、２mlのＴＥ緩衝液を加えた後、透明チュ
ーブをシールし、電気泳動により、ゲル中から緩衝液中
にＤＮＡを溶出した。この溶液に等量の水飽和フェノー
ルを加え、撹拌したのち、水層を回収し、常法に従いエ
タノール沈澱によりＤＮＡを回収した。
気泳動で分離した。アガロースゲル電気泳動は、ティ・
マニアティス(T.Maniatis)等の方法〔モレキュラー・ク
ローニング(Molecular Cloning)、第156〜161頁、コー
ルド・スプリング・ハーバー・ラボラトリィ(Cold Spri
ng Harbor Laboratory)(1982)〕に従って行なった。バ
クテリオファージhy102ＤＮＡ中の3.45Kbp EcoRI/EcoRI
ＤＮＡ断片を含むゲル部分をゲルより切りだして透明チ
ューブに入れ、２mlのＴＥ緩衝液を加えた後、透明チュ
ーブをシールし、電気泳動により、ゲル中から緩衝液中
にＤＮＡを溶出した。この溶液に等量の水飽和フェノー
ルを加え、撹拌したのち、水層を回収し、常法に従いエ
タノール沈澱によりＤＮＡを回収した。
得られた3.45KbpＤＮＡ断片を、〔３２Ｐ〕ｄＣＴＰ
（アマシャム社製）を用いてニックトランスレーション
法により標識し、プローブを得た。ニックトランスレー
ションは、宝酒造社製のキットを用い、宝酒造社の指示
するジェイ・モル・バイオル・(J.Mol.Biol.)第113巻、
第237〜251頁(1977)及び、モレキュラー・クローニング
(Molecular Cloning)、第109〜112頁、コールド・スプ
リング・ハーバー・ラボラトリィ(Cold Spring Habor L
aboratory)(1982)記載の方法に従って行なった。
（アマシャム社製）を用いてニックトランスレーション
法により標識し、プローブを得た。ニックトランスレー
ションは、宝酒造社製のキットを用い、宝酒造社の指示
するジェイ・モル・バイオル・(J.Mol.Biol.)第113巻、
第237〜251頁(1977)及び、モレキュラー・クローニング
(Molecular Cloning)、第109〜112頁、コールド・スプ
リング・ハーバー・ラボラトリィ(Cold Spring Habor L
aboratory)(1982)記載の方法に従って行なった。
(5) アセテート・カイネース遺伝子の検索−−−クロ
モゾーマル・ウォーキング法によるアセテート・カイネ
ース遺伝子の検索 前述の方法で調製した３２Ｐで標識した3.45KbpＤＮＡ
断片をプローブとして用い、項目(2)で作製した組み換
え体バクテリオファージＥＭＢＬ４ＤＮＡをベクターと
する大腸菌1100株染色体ＤＮＡライブラリィを、項目
(3)と同様にプラーク・ハイブリダイゼーション法で検
索し、3.45KbpＤＮＡ断片を有するプラークを得た。該
プラークを夫々、モレキュラー・クローニング(Molecul
ar Cloning)、第371〜372頁、コールド・スプリング・
ハーバー・ラボラトリィ(Cold Spring Habor Laborator
y)(1982)記載の方法に従って処理し、バクテリオファー
ジＤＮＡを精製した。3,45KbpＤＮＡ断片を含む組み換
え体バクテリオファージＤＮＡをhy122と命名した。
モゾーマル・ウォーキング法によるアセテート・カイネ
ース遺伝子の検索 前述の方法で調製した３２Ｐで標識した3.45KbpＤＮＡ
断片をプローブとして用い、項目(2)で作製した組み換
え体バクテリオファージＥＭＢＬ４ＤＮＡをベクターと
する大腸菌1100株染色体ＤＮＡライブラリィを、項目
(3)と同様にプラーク・ハイブリダイゼーション法で検
索し、3.45KbpＤＮＡ断片を有するプラークを得た。該
プラークを夫々、モレキュラー・クローニング(Molecul
ar Cloning)、第371〜372頁、コールド・スプリング・
ハーバー・ラボラトリィ(Cold Spring Habor Laborator
y)(1982)記載の方法に従って処理し、バクテリオファー
ジＤＮＡを精製した。3,45KbpＤＮＡ断片を含む組み換
え体バクテリオファージＤＮＡをhy122と命名した。
該組み換え体バクテリオファージhy122ＤＮＡを、項目
(3)に記載の方法に従って、前記各種制限酵素を用い、
消化し、第２図に示す通り制限酵素地図を得た。
(3)に記載の方法に従って、前記各種制限酵素を用い、
消化し、第２図に示す通り制限酵素地図を得た。
該組み換え体バクテリオファージhy122ＤＮＡ10μｇ
を、15μｌのＴＥ緩衝液に溶解したものに、２μｌのHi
gh緩衝液、30ユニットの制限酵素EcoRI及び30ユニット
の制限酵素BamHIを夫々添加し、温度37℃で２時間反応
を行ない、ＤＮＡを切断した。切断した組み換え体バク
テリオファージhy122ＤＮＡより、4.5KbpのEcoRI/BamHI
ＤＮＡ断片を、前述のアガロースゲル電気泳動法を用い
る方法に従って単離し、６μｇのEcoRI/BamHIＤＮＡ断
片を得た。
を、15μｌのＴＥ緩衝液に溶解したものに、２μｌのHi
gh緩衝液、30ユニットの制限酵素EcoRI及び30ユニット
の制限酵素BamHIを夫々添加し、温度37℃で２時間反応
を行ない、ＤＮＡを切断した。切断した組み換え体バク
テリオファージhy122ＤＮＡより、4.5KbpのEcoRI/BamHI
ＤＮＡ断片を、前述のアガロースゲル電気泳動法を用い
る方法に従って単離し、６μｇのEcoRI/BamHIＤＮＡ断
片を得た。
一方、プラスミドpUC19ＤＮＡ（宝酒造社製）１μｇ
を、18μｌのＴＥ緩衝液に溶解したものに、３μｌのHi
gh緩衝液、５ユニットのBamHI及び５ユニットのEcoRIを
添加し、温度37℃で１時間消化したのち、常法によりフ
ェノール抽出及びエタノール沈澱処理を行ない、沈澱物
を得た。
を、18μｌのＴＥ緩衝液に溶解したものに、３μｌのHi
gh緩衝液、５ユニットのBamHI及び５ユニットのEcoRIを
添加し、温度37℃で１時間消化したのち、常法によりフ
ェノール抽出及びエタノール沈澱処理を行ない、沈澱物
を得た。
0.5μｇのEcoRI及びBamHIで消化したプラスミドpUC19Ｄ
ＮＡ及び、0.5μｇの上記hy122ＤＮＡ由来の4.5Kbp Eco
RI/BamHIＤＮＡ断片を、夫々７μｌの水に溶解し、13μ
ｌの混液〔77mMトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ7.4）／15mM
MgCl2/15mMジチオスレイトール／0.15mM ATP〕及び、１
ユニットのＴ４ＤＮＡリガーゼを添加し、温度８℃で18
時間連結反応を行なった。この反応液を用い、ジャーナ
ル・オブ・バクテリオロジー(Journal of Bac-teriolog
y)、第119巻、第1072〜1074頁（1974年）記載の形質転
換性により、大腸菌ＪＭ101株(ATCC 33876)を形質転換
し、薬剤耐性（アンピシリン耐性）及び、β−ガラクト
シダーゼ活性を検討し、形質転換株を得、その株の含有
するアセテート・カイネース遺伝子を含む組み換え体プ
ラスミドＤＮＡをpAK122と命名した。このようにして得
られた大腸菌ＪＭ101(pAK122)は、工業技術院微生物工
業技術研究所に微工研条寄第1534号(FERMBP-1534)とし
て寄託されている。
ＮＡ及び、0.5μｇの上記hy122ＤＮＡ由来の4.5Kbp Eco
RI/BamHIＤＮＡ断片を、夫々７μｌの水に溶解し、13μ
ｌの混液〔77mMトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ7.4）／15mM
MgCl2/15mMジチオスレイトール／0.15mM ATP〕及び、１
ユニットのＴ４ＤＮＡリガーゼを添加し、温度８℃で18
時間連結反応を行なった。この反応液を用い、ジャーナ
ル・オブ・バクテリオロジー(Journal of Bac-teriolog
y)、第119巻、第1072〜1074頁（1974年）記載の形質転
換性により、大腸菌ＪＭ101株(ATCC 33876)を形質転換
し、薬剤耐性（アンピシリン耐性）及び、β−ガラクト
シダーゼ活性を検討し、形質転換株を得、その株の含有
するアセテート・カイネース遺伝子を含む組み換え体プ
ラスミドＤＮＡをpAK122と命名した。このようにして得
られた大腸菌ＪＭ101(pAK122)は、工業技術院微生物工
業技術研究所に微工研条寄第1534号(FERMBP-1534)とし
て寄託されている。
(6) アセテート・カイネース遺伝子を含むプラスミドp
AK122ＤＮＡの調製 上記で得られたプラスミドpAK122ＤＮＡを含有する大腸
菌101株(FERM BP-1534)を、トリプトン１％(W/W)、酵母
エキス0.5(W/W)及びNaCl0.5%(W/V)からなる培地１
に、該培地を用い、温度37℃で24時間前培養して得られ
た大腸菌ＪＭ101(pAK122)の培養液20mlを接種し、温度3
7℃で３時間振盪培養したのち、0.2gのクロラムフェニ
コールを添加し、更に同一温度で20時間同培養を行な
い、培養液を得た。
AK122ＤＮＡの調製 上記で得られたプラスミドpAK122ＤＮＡを含有する大腸
菌101株(FERM BP-1534)を、トリプトン１％(W/W)、酵母
エキス0.5(W/W)及びNaCl0.5%(W/V)からなる培地１
に、該培地を用い、温度37℃で24時間前培養して得られ
た大腸菌ＪＭ101(pAK122)の培養液20mlを接種し、温度3
7℃で３時間振盪培養したのち、0.2gのクロラムフェニ
コールを添加し、更に同一温度で20時間同培養を行な
い、培養液を得た。
次いで、この培養液を、常法により6000r.p.m.で10分間
遠心分離処理して湿潤菌体２ｇを得、これを20mlの25%
(W/V)ショ糖を含有する350mMトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ
8.0）に懸濁した後、更に、これにリゾチーム（シグマ
社製）10mg、0.25MＥＤＴＡ溶液（ｐＨ8.0）８mlおよび
20%(W/V)ドデシル硫酸ナトリウム溶液８mlを夫々添加
し、温度60℃で30分間保温して溶菌し、溶菌液を得た。
この溶菌液に、５Ｍ NaCl溶液13mlを添加し、温度４℃
で16時間処理したものを常法により、15000r.p.m.で30
分間遠心分離して抽出液を、常法によりフェノール抽出
処理及びエタノール沈澱処理を行ない沈澱物を得た。
遠心分離処理して湿潤菌体２ｇを得、これを20mlの25%
(W/V)ショ糖を含有する350mMトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ
8.0）に懸濁した後、更に、これにリゾチーム（シグマ
社製）10mg、0.25MＥＤＴＡ溶液（ｐＨ8.0）８mlおよび
20%(W/V)ドデシル硫酸ナトリウム溶液８mlを夫々添加
し、温度60℃で30分間保温して溶菌し、溶菌液を得た。
この溶菌液に、５Ｍ NaCl溶液13mlを添加し、温度４℃
で16時間処理したものを常法により、15000r.p.m.で30
分間遠心分離して抽出液を、常法によりフェノール抽出
処理及びエタノール沈澱処理を行ない沈澱物を得た。
次いで、この沈澱物を通常の減圧乾燥処理したものを、
１mMＥＤＴＡを含有する10mMトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ
7.5）６mlに溶解し、さらに、これに塩化セシウム６ｇ
及びエチジウムブロマイド(19mg/ml)0.2mlを添加したも
のを、常法により39000r.p.m.で42時間超遠心分離機を
用いて平衡密度勾配遠心分離処理を行ない、組み換え体
プラスミドpAK122ＤＮＡを単離し、また更に、ｎ−ブタ
ノールを使用してエチジウムブロマイドを除去したの
ち、１mMＥＤＴＡを含有する10mMトリス−塩酸緩衝液
（ｐＨ7.5）に対して透析を行ない純化された組み換え
体プラスミドpAK122ＤＮＡ500μｇを得た。
１mMＥＤＴＡを含有する10mMトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ
7.5）６mlに溶解し、さらに、これに塩化セシウム６ｇ
及びエチジウムブロマイド(19mg/ml)0.2mlを添加したも
のを、常法により39000r.p.m.で42時間超遠心分離機を
用いて平衡密度勾配遠心分離処理を行ない、組み換え体
プラスミドpAK122ＤＮＡを単離し、また更に、ｎ−ブタ
ノールを使用してエチジウムブロマイドを除去したの
ち、１mMＥＤＴＡを含有する10mMトリス−塩酸緩衝液
（ｐＨ7.5）に対して透析を行ない純化された組み換え
体プラスミドpAK122ＤＮＡ500μｇを得た。
該組み換え体プラスミドpAK122ＤＮＡを項目(3)に記載
の方法に従って、各種制限酵素を用い消化し、第３図に
示す通り制限酵素地図を得た。
の方法に従って、各種制限酵素を用い消化し、第３図に
示す通り制限酵素地図を得た。
(7) アセテート・カイネース遺伝子を含有するＤＮＡ
の塩基配列の解析 項目(6)で得られた組み換え体プラスミドpAK122ＤＮＡ1
5μｇを、制限酵素MluI及びPstI（いずれも宝酒造社
製）で切断し、アセテート・カイネース遺伝子を含有す
る2.9KbＤＮＡ断片５μｇを得、このＤＮＡ断片をプラ
スミドpUC18及びpUC19ＤＮＡ（いずれも宝酒造社製）の
SmaI及びPstI部位にクローニングし、得られた組み換え
体プラスミドＤＮＡを用いて大腸菌ＪＭ101(ACTT33876)
を形質転換し、形質転換株、大腸菌ＪＭ101(pAK124-8)
及びＪＭ101(pAK124-9)を夫々得た。
の塩基配列の解析 項目(6)で得られた組み換え体プラスミドpAK122ＤＮＡ1
5μｇを、制限酵素MluI及びPstI（いずれも宝酒造社
製）で切断し、アセテート・カイネース遺伝子を含有す
る2.9KbＤＮＡ断片５μｇを得、このＤＮＡ断片をプラ
スミドpUC18及びpUC19ＤＮＡ（いずれも宝酒造社製）の
SmaI及びPstI部位にクローニングし、得られた組み換え
体プラスミドＤＮＡを用いて大腸菌ＪＭ101(ACTT33876)
を形質転換し、形質転換株、大腸菌ＪＭ101(pAK124-8)
及びＪＭ101(pAK124-9)を夫々得た。
なお、ＤＮＡの制限酵素による切断、Ｔ４ＤＮＡリガー
ゼによる連結及び形質転換方法は、前記項目(5)に記載
の方法に、また、ＤＮＡ断片のアガロースゲル電気泳動
による単離は、前記項目(4)に記載の方法に準拠した。
このようにして得られた形質転換株は、ベルパーファー
ジM13K07（宝酒造社製）を感染させ、メッシング(Messi
ng)の方法〔メソズ・イン・エンザイモロジー(Methods
in Enzymology)、第101巻、第20〜78頁(1983)〕に従い
一本鎖ＤＮＡを調製した。
ゼによる連結及び形質転換方法は、前記項目(5)に記載
の方法に、また、ＤＮＡ断片のアガロースゲル電気泳動
による単離は、前記項目(4)に記載の方法に準拠した。
このようにして得られた形質転換株は、ベルパーファー
ジM13K07（宝酒造社製）を感染させ、メッシング(Messi
ng)の方法〔メソズ・イン・エンザイモロジー(Methods
in Enzymology)、第101巻、第20〜78頁(1983)〕に従い
一本鎖ＤＮＡを調製した。
得られた１本鎖ＤＮＡによるシークエンシングは、７−
ＤＥＡＺＡシ−クエンスキット（宝酒造社製）を用い上
記メッシングの方法に従って行なった。また、プライマ
ーは、システム１プラスＤＮＡ合成機（ベックマン社
製）を用いて合成した。
ＤＥＡＺＡシ−クエンスキット（宝酒造社製）を用い上
記メッシングの方法に従って行なった。また、プライマ
ーは、システム１プラスＤＮＡ合成機（ベックマン社
製）を用いて合成した。
更に、塩基配列の解析のためのゲル電気泳動は、８％(W
/V)ポリアクリルアミドゲル（富士写真フィルム社製）
を用いて行なった。
/V)ポリアクリルアミドゲル（富士写真フィルム社製）
を用いて行なった。
得られたアセテート・カイネース遺伝子のみの全塩基配
列を第４図に、また、該遺伝子から翻訳されるポリペプ
チドのアミノ酸配列を第５図に夫々示した。
列を第４図に、また、該遺伝子から翻訳されるポリペプ
チドのアミノ酸配列を第５図に夫々示した。
(8) 大腸菌ＪＭ101(pAK122)の培養及び粗酵素液の調整 大腸菌ＪＭ101(pAK122)(FERM BP-1534)を、ＬＢ−amp培
地〔バクトトリプトン１％(W/W)、酵母エキス0.5%(W/
W)、NaCl0.5%(W/W)及びアンピシリン50μｇ／ml〕３ml
にて温度37℃で18時間振盪培養を行なった。この培養液
0.5mlを、10mlの上記ＬＢ−amp培地に接種し、温度37℃
で６時間振盪培養したのち、3500r.p.m.で10分間遠心分
離処理して湿潤菌体を得、該菌体を10mM MgCl2及び１mM
ＥＤＴＡを含有する10mMリン酸緩衝液（ｐＨ7.5）２ml
に懸濁し、常法により超音波破壊処理し、粗酵素液を得
た。このようにして得られた粗酵素液中のアセテート・
カイネース活性の測定は、下記の方法により行い、その
結果を下表に示した。
地〔バクトトリプトン１％(W/W)、酵母エキス0.5%(W/
W)、NaCl0.5%(W/W)及びアンピシリン50μｇ／ml〕３ml
にて温度37℃で18時間振盪培養を行なった。この培養液
0.5mlを、10mlの上記ＬＢ−amp培地に接種し、温度37℃
で６時間振盪培養したのち、3500r.p.m.で10分間遠心分
離処理して湿潤菌体を得、該菌体を10mM MgCl2及び１mM
ＥＤＴＡを含有する10mMリン酸緩衝液（ｐＨ7.5）２ml
に懸濁し、常法により超音波破壊処理し、粗酵素液を得
た。このようにして得られた粗酵素液中のアセテート・
カイネース活性の測定は、下記の方法により行い、その
結果を下表に示した。
得られた粗酵素液中のアセテート・カイネース活性の測
定は、トーマス(Thomas)等の方法〔ジャーナル・オブ・
バクテリオロジー(Journal of Bacteriology)、第144
巻、第672〜682頁(1980)年）〕を改良して、生成するＮ
ＡＤＰＨのモル数を算出することにより行なった。
定は、トーマス(Thomas)等の方法〔ジャーナル・オブ・
バクテリオロジー(Journal of Bacteriology)、第144
巻、第672〜682頁(1980)年）〕を改良して、生成するＮ
ＡＤＰＨのモル数を算出することにより行なった。
すなわち、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、10mMグルコース、0.5m
MＮＡＤＰ、５mMＡＤＰ及び５mMアセチルリン酸を含有
する0.1mMＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ7.0）中に、５ユニッ
ト／mlのグルコース６リン酸デハイドロゲナーゼ（ベー
リンガー・マンハイム社製）及び21ユニットのヘキソキ
ナーゼ（ベーリンガー・マンハイム社製）を添加し、こ
の溶液2.4mlに50倍希釈した粗酵素液0.1mlを混合したの
ち、340nmの吸収の変化より、生成したＮＡＤＰＨの量
を算出した値を下表に示した。
MＮＡＤＰ、５mMＡＤＰ及び５mMアセチルリン酸を含有
する0.1mMＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ7.0）中に、５ユニッ
ト／mlのグルコース６リン酸デハイドロゲナーゼ（ベー
リンガー・マンハイム社製）及び21ユニットのヘキソキ
ナーゼ（ベーリンガー・マンハイム社製）を添加し、こ
の溶液2.4mlに50倍希釈した粗酵素液0.1mlを混合したの
ち、340nmの吸収の変化より、生成したＮＡＤＰＨの量
を算出した値を下表に示した。
また、比較のため、プラスミドpUC19ＤＮＡを有する大
腸菌ＪＭ101株〔大腸菌101(pUC19)〕についても同様に
アセテート・カイネース活性を測定した。結果を下表に
示した。
腸菌ＪＭ101株〔大腸菌101(pUC19)〕についても同様に
アセテート・カイネース活性を測定した。結果を下表に
示した。
上表より明らかな如く、本発明のアセテート・カイネー
ス遺伝子によって形質転換された大腸菌JM101(pAK122)
を用いたものは、対照の大腸菌JM101(pUC19)を用いたも
のに比しＮＡＤＰＨ生成量が著しく増加しており、アセ
テート・カイネースが発現されていることが判る。
ス遺伝子によって形質転換された大腸菌JM101(pAK122)
を用いたものは、対照の大腸菌JM101(pUC19)を用いたも
のに比しＮＡＤＰＨ生成量が著しく増加しており、アセ
テート・カイネースが発現されていることが判る。
第１図は、組み換え体バクテリオファージhy102ＤＮＡ
の制限酵素地図であり、第２図は、組み換え体バクテリ
オファージhy122ＤＮＡの制限酵素地図であり、第３図
は、組み換え体プラスミドpAK122ＤＮＡの制限酵素地図
であり、第４図は、実施例のアセテート・カイネース遺
伝子のみの全塩基配列を示す図であり、また、第５図
は、第４図に示す塩基配列を有する遺伝子から翻訳され
るポリペプチドのアミノ酸配列を示す図である。
の制限酵素地図であり、第２図は、組み換え体バクテリ
オファージhy122ＤＮＡの制限酵素地図であり、第３図
は、組み換え体プラスミドpAK122ＤＮＡの制限酵素地図
であり、第４図は、実施例のアセテート・カイネース遺
伝子のみの全塩基配列を示す図であり、また、第５図
は、第４図に示す塩基配列を有する遺伝子から翻訳され
るポリペプチドのアミノ酸配列を示す図である。
フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 9/12 Ｃ１２Ｒ 1:19）
Claims (1)
- 【請求項１】下記に示されるアミノ酸配列をコードする
アセテート・カイネース遺伝子。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7315688A JPH0648986B2 (ja) | 1988-03-29 | 1988-03-29 | アセテート・カイネース遺伝子 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7315688A JPH0648986B2 (ja) | 1988-03-29 | 1988-03-29 | アセテート・カイネース遺伝子 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH01247093A JPH01247093A (ja) | 1989-10-02 |
| JPH0648986B2 true JPH0648986B2 (ja) | 1994-06-29 |
Family
ID=13510033
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP7315688A Expired - Fee Related JPH0648986B2 (ja) | 1988-03-29 | 1988-03-29 | アセテート・カイネース遺伝子 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0648986B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1321185C (zh) * | 2005-12-20 | 2007-06-13 | 哈尔滨工业大学 | 乙酸激酶基因 |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20040031866A (ko) * | 2002-10-07 | 2004-04-14 | 주식회사 진켐 | 데옥시당의 중간체인티디피-4-케토-6-데옥시-디-글루코즈의 생합성 방법, 이를위한 재조합 효소들, 재조합 벡터들 및 형질전환체들 |
-
1988
- 1988-03-29 JP JP7315688A patent/JPH0648986B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1321185C (zh) * | 2005-12-20 | 2007-06-13 | 哈尔滨工业大学 | 乙酸激酶基因 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH01247093A (ja) | 1989-10-02 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |