JPH0650993B2 - 歯周疾患検査剤 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は歯周疾患検査剤、さらに詳しくは、検体中のあ
る種の歯周疾患原因菌を特異的に、かつ、簡便、迅速、
高感度に検出し、歯周疾患の罹患や進行を診断あるいは
予測することのできる検査剤に関する。

従来の技術および問題点 近年、歯周疾患に関する細菌学的研究が進み、歯周疾患
病巣部に多くのスピロヘータが検出されており、種々の
臨床的指標との間に高い相関性を有することが判明して
いる。また、嫌気性のグラム陰性桿菌が主要な歯周疾患
の原因菌であることも判明しており、その中でも特に、
バクテロイデス・ジンジバリス（Bacteroides gingival
is）が注目され、その病原性について多数の報告がなさ
れている。そこで、口腔内におけるこれらの原因菌の存
在を検知し、歯周疾患の罹患や進行を診断あるいは予測
し、歯周疾患の治療、予防に、臨床的に応用する試みが
なされている。

しかしながら、細菌学的方法によるこれらの原因菌の検
知には、暗視野顕微鏡の使用、嫌気性菌の取扱という高
度な技術、特殊な設備等を必要とし、操作が煩雑で、培
養や結果の判断にも長い時間や熟練を要するという欠点
があり、臨床的な実用化には困難な点が多い。また、免
疫学的な面から、これらの原因菌に対する液性免疫であ
る血中の抗体価を測定したり、細胞性免疫であるリンパ
球幼若化反応を測定し、原因菌の存在を検知する試みも
なされているが、検体試料の調製に煩雑な操作を必要と
する問題があり、やはり、実用化はなかなか困難であ
る。

このような事情に鑑み、本発明者らは、臨床的に実用化
可能な歯周疾患原因菌の検知を行うべく、鋭意研究を重
ねた。その結果、口腔内スピロヘータが非常に特異的な
アミノペプチターゼ様酵素活性を有し、また、バクテロ
イデス・ジンジバリス、バクテロイデス・インターミー
ディアス、バクテロイデス・コーポリス、バクテロイデ
ス・メラニノジェニカス、バクテロイデス・デンティコ
ーラなどの黒色色素産生バクテロイデスも同様な活性を
有しており、ある種の基質を用いることにより、この酵
素活性を特異的に、かつ、簡便、迅速に検出でき、しか
も、歯周疾患の症状が正確に反映されることを見い出
し、先に出願を行った（特願昭６１−１７９７１６号、
特願昭６１−２３３８４８号および特願昭６２−１１３
１２２号）。本発明者らは、さらに研究を重ねた結果、
検体を培養した後、前記基質を含有する担体にレプリカ
することにより、さらに簡便かつ高感度に酵素活性が検
出できることを見い出し本発明を完成するに至った。

問題点を解決するための手段 本発明は、検体中のアミノペプチターゼ様酵素活性を測
定することにより、歯周疾患の罹患や進行を診断あるい
は予測するための検査剤であって、該酵素の基質とし
て、下記式〔Ｉ〕および式〔II〕で示される１種又は２
種の化合物を含有する基質担持体からなることを特徴と
する歯周疾患検査剤を提供するものである。

式：Ｘ−Ｔ−Pro−Ｓ 〔Ｉ〕 ［式中、Proはプロリン残基、Ｘは水素またはアミノ基
保護基、Ｓはプロリン残基のＣ末端に結合する発色基、
ＴはそのＣ末端がプロリン残基のＮ末端と結合する０〜
４個のアミノ酸またはその保護誘導体からなるアミノ酸
またはペプチドの残基を意味する］ 式：Ｘ−Ｚ−Arg−Ｙ 〔II〕 ［式中、Argはアルギニン残基、Ｘは水素またはアミノ
基保護基、Ｙはアルギニン残基のＣ末端に結合する発色
基、ＺはそのＣ末端がアルギニン残基のＮ末端と結合す
る１〜４個のアミノ酸またはその保護誘導体からなるア
ミノ酸またはペプチドの残基を意味する］ 本発明の検査剤を用いれば、唾液、歯垢、歯肉溝浸出液
などのような検体を、好ましくは、中性条件下（ｐＨ6.
0〜8.5）、担体に含有された式〔Ｉ〕および／または式
〔II〕で示される基質と反応させ、その水解活性の強弱
を発色反応により測定することにより、簡便かつ迅速に
特異活性を有する歯周疾患原因菌を検出同定することが
でき、歯周疾患の罹患や進行を診断、予測することが可
能となる。

基質として用いる式〔Ｉ〕の化合物は公知であるか、少
なくとも、公知のペプチド合成法によって容易に製造で
きるものであり、式〔Ｉ〕中のＸ基で示されるアミノ基
保護基はペプチド合成に用いられる公知のアミノ基保護
基のいずれのものでもよく、例えば、ホルミル基、アセ
チル基、スクシニル基、ｔ−ブトキシカルボニル基、ベ
ンゾイル基、カルボベンゾキシ基、ｐ−トルエンスルホ
ニル基などが挙げられる。

また式〔Ｉ〕中のＳ基の発色基は、発色による酵素活性
の測定（紫外部、可視部、赤外部の吸収、蛍光の測定に
よるものを含有する）に用いられるものいずれでもよ
く、例えば、β−ナフチルアミン、４−メトキシ−２−
ナフチルアミン、ｐ−ニトロアニリン、ｐ−ニトロフェ
ノール、７−アミノ−４−メトキシクマリン、５−アミ
ノイソフタル酸ジメチルエステル、７−アミノ−４−ト
リフルオロメチルクマリンなどに由来する基が挙げられ
る。特に、適当な発色試薬により、肉眼的に判定可能な
発色を示すβ−ナフチルアミン、４−メトキシ−２−ナ
フチルアミン、ｐ−ニトロアニリン、ｐ−ニトロフェノ
ール由来の基が好ましい。

また、Ｔ基はそのＣ末端がプロリン残基のＮ末端と結合
する０〜４個のアミノ酸またはその保護誘導体からなる
アミノ酸またはペプチドであればいずれでもよいが、Ｔ
基中のＣ末端アミノ酸残基がグリシン、リジン、アルギ
ニン、フェニルアラニンまたはこれらの保護誘導体残基
であることが好ましい。該保護誘導体には、セリンのＯ
Ｈ基、システインのＳＨ基、アスパラギン酸やグルタミ
ン酸のβ−あるいは−ＣＯＯＨ基が保護基、例えば、
ベンジル基などで保護されたものが包含される。式
〔Ｉ〕の化合物における各アミノ酸残基の立体配置は、
アミノペプチターゼ様酵素の基質となりうる限り、特に
限定されるものではない。

つぎに、他の基質として用いられる式〔II〕で示される
化合物も式〔Ｉ〕のものと同様に公知であるか、少なく
とも、公知のペプチド合成法によって容易に製造し得
る。該化合物中、Ｘ基は前記と同様のアミノ基保護基を
意味し、またＹ基は前記Ｓ基と同様の発色基を意味す
る。

さらに、式〔II〕においてＺ基はそのＣ末端がアルギニ
ン残基のＮ末端と結合する１〜４個のアミノ酸またはそ
の保護誘導体からなるアミノ酸またはペプチドであれば
いずれでもよいが、Ｚ基中のＣ末端アミノ酸残基がグリ
シン、リジン、アルギニン、フェニルアラニンまたはこ
れらの保護誘導体残基であることが好ましい。また、該
保護誘導体には、前記式〔Ｉ〕と同様、セリンのＯＨ
基、システインのＳＨ基、アスパラギン酸やグルタミン
酸のβ−あるいはγ−ＣＯＯＨ基が保護基、例えば、ベ
ンジル基などで保護されたものが包含される。式〔II〕
の化合物においても各アミノ酸残基の立体配置は、アミ
ノペプチターゼ様酵素の基質となりうる限り、特に限定
されるのではない。

本発明検査剤に含有される検査薬は、式〔Ｉ〕、式〔I
I〕の化合物が検体由来のアミノペプチターゼ様酵素の
基質として反応できる形態のものであればいずれでもよ
く、もっとも基本的には、式〔Ｉ〕、式〔II〕の化合物
の水溶液でよく、好ましくは、測定時、ｐＨ6.0〜8.5と
なるように緩衝剤を含有させる。用いる緩衝剤は通常用
いられるものいずれでもよく、例えば、トリス塩酸緩衝
剤、リン酸緩衝剤、ホウ酸緩衝剤、ベロナール緩衝剤、
ＨＥＰＥＳ緩衝剤などを用いることができる。該水溶液
は、式〔Ｉ〕、式〔II〕の化合物および、所望により、
緩衝剤を蒸留水に溶解するような公知の方法で製造する
ことができ、要すれば、さらに、防腐剤、抗生物質など
の他の添加物を適宜添加することができる。

本発明の検査剤は、式〔Ｉ〕、式〔II〕の化合物の最終
濃度１０ｎＭ〜１００ｍＭ、また、緩衝剤の最終濃度１
ｍＭ〜１Ｍとして、液状の形態で濾紙、ペーパーディス
ク、スポンジ、吸水性ポリマー、ポリエチレン膜などの
担体に含有させて得られ、なかでも担体としては、セル
ロースアセテート膜、あるいはニトロセルロース膜が最
も好適である。また、本発明の検査剤は、担体に含浸さ
せた化合物の溶液を乾燥させることにより、輸送、保管
等がより便利になる。

さらに、本発明の検査剤には、緩衝剤、発色試薬などの
他の試薬を組合せてなるキットも包含される。

発色試薬は、式〔Ｉ〕、式〔II〕の化合物におけるＳ基
およびＹ基に応じて適宜選択でき、ＳおよびＹがβ−ナ
フチルアミン、４−メトキシ−２−ナフチルアミン、ｐ
−ニトロアニリン、ｐ−ニトロフェノール由来の基の場
合、例えば、ファーストガーネットＧＢＣやファースト
ブルーＢＢあるいはこれらのジアゾニウム塩や塩化亜鉛
との塩のごとき塩などを、水、エタノール、酢酸緩衝
液、２−メトキシエタノールあるいはこれらの混合溶媒
などに0.01〜５重量％の濃度で溶解した溶液や、0.5〜
５Ｍの水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、酢酸などの
水溶液が用いられる。これらの溶液またはその濃厚液、
さらには固形化物を式〔Ｉ〕、式〔II〕の化合物を含有
する検査剤と組合せてキットとして用いることができ
る。

本発明の検査剤を用いて検査を行うには、まず、検体を
採取する。検体の採取は公知の方法で行ってもよく、例
えば、歯肉溝浸出液や唾液は濾紙、キャビラリー、ペー
パーポイントなどで採取でき、歯垢は綿棒、キュレッ
ト、スケーラーなどで採取できる。

ついで、該サンプルを希釈して血液寒天培地に塗抹し培
養する。血液寒天培地上に菌が集落を形成した後、基質
を含有し乾燥させたフィルターなどからなる基質担持体
を静かに履せるか、あるいは基質担持体をかぶせコロニ
ーをレプリカ後、これに基質を含む溶液を含浸させる。
反応は通常、３７℃、１５〜３０分程度が好ましい。反
応終了後、発色液を加えて呈色させる。陽性のコロニー
数のカウントを行い、これにより、検体中のアミノペプ
チターゼ様酵素活性を有する菌の有無、割合を判断し、
歯周疾患の罹患や進行を診断あるいは予測する。

なお、従来法により培地上のコロニーを同定するには各
々のコロニーを別々に採取し、純培養を行い、それぞれ
について生化学試験等を実施する必要があったが、本発
明においてはこれが極めて簡単な操作で一挙に可能とな
った。

実施例 つぎに、実験および実施例を挙げて、本発明をさらに詳
しく説明する。

実験１ 各種口腔内嫌気性細菌のレプリカ法によるアミノペプチ
ターゼ様活性の検出 口腔内嫌気性細菌であるバクテロイデス・ジンジバリス
４株、バクテロイデス・インターミーディアス（Bacter
oides intermedius）３株、バクテロイデス・メラニノ
ジェニカス（Bacteroides melaninogenicus）３株、バ
クテロイデス・デンティコーラ（Bacteroides denticol
a）２株、ストレプトコッカス・ミュータンス（Strepto
coccus mutans）２株、ストレプトコッカス・ミティス
（Streptococcus mitis）２株、ストレプトコッカス・
サリバリウス（Streptococcus salivalius）２株のアミ
ノペプチターゼ様酵素基質に対する水解活性をコロニー
レプリカ法によりつぎの通り測定した。

上記細菌をブレイン・ハート、インフュージョン・ブロ
スを用い、３７℃で２４〜４８時間嫌気的に培養し、そ
の培養液を希釈してビタミン・ヘミン添加、５％ヒツジ
血液添加トリプチケース・ソイ・アガー・プレートに塗
抹培養を行った。

それぞれの菌につき、プレート上に３０〜３００のコロ
ニーが生育したプレートを選び出した。一方、β−ナフ
チルアミン由来の発色基を有するアミノペプチターゼ様
酵素の基質化合物を0.1Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ7.0）
に溶解し、濃度２０ｍＭの基質溶液を加え、これをニト
ロ・セルロース・フィルターに含浸させる。該フィルタ
ーを前記プレート上に静かに置き、フィルター上に菌を
レプリカする。

このようにして、菌体と基質とをフィルター上で接触さ
せ３７℃にて６０分間反応させた。

反応終了後、発色試薬（１０％ツィーン２０を含有する
１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ4.2）にジアゾニウム塩ガーネッ
トＧＢＣを0.5ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解して調製）をフ
ィルターに充分に浸ませ、直後から５分の間にコロニー
の周囲が明瞭な赤色を呈するが否かで判定を行い、つぎ
のとおり表示した。

＋：フィルター上の全コロニーが明瞭な赤色を呈する −：フィルター上の全コロニーにおいて赤色を認めな
い。

結果を第１表に示す。第１表中、基質化合物は次の通り
である。

(イ)Ｎ−ＣＢＺ−Gly−Gly−Arg−βＮＡ (ロ)Ｎ−Ｂｚ−Arg−Gly−Phe−Pro−βＮＡ 第１表に示すごとく、フィルターレプリカ法において特
定の基質を使用することにより、限られた歯周病原菌に
ついてのみ陽性反応が得られる。

実施例１ Ｎ−カルボベンゾキシ−グリシル−グリシル−アルギニ
ン−β−ナフチルアミドを２０ｍＭ溶液（0.1Ｍトリス
塩酸緩衝液（ｐＨ7.0））を調製して基質溶液とし、ニ
トロセルロース・フィルターに含浸させた。

これを用いてつぎのように歯周疾患の診断予防を行なっ
た。歯周疾患患者１名の縁下プラークを採取し、希釈
後、ビタミン・ヘミン添加５％ヒツジ血液添加トリプチ
ケース・ソイ・アガー・プレートに２枚ずつ塗抹培養を
行なった。コロニー形成後、前記の基質を含浸したニト
ロセルロース・フィルターに菌をレプリカした。これを
用いて基質の水解活性を試験した。発色液としてファー
ストブルーＢＢ１ｍｇ／ｍｌを用いた。フィルター上で
赤色を呈したコロニーについては、これを釣菌し、同定
試験により菌種を確認した。結果を第２表に示す。

実施例２ Ｎ−ベンゾイル−アルギニル−グリシル−フェニルアラ
ニループロリン−β−ナフチルアミドを２０ｍＭ溶液
（0.1Ｍトリス塩酸緩衝液）を調製して基質溶液とし、
ニトロセルロース・フィルターに含浸させた。

これを用いて実施例１と同様に歯周疾患の診断予防を行
なった。結果を第２表に示す。

第２表より明らかなごとく、フィルターレプリカ法と基
質の組み合せを変化させることにより、歯周病原菌のみ
が陽性反応である赤色を呈した。このように本発明の検
査剤を用いることによりプレート上から特定の歯周病原
菌のみを迅速に計測することができる。

発明の効果 本発明の検査剤によれば、特殊な設備、高度の技術を必
要とせずに、極めて簡便かつ迅速に多数の菌についての
酵素活性が測定できる。したがって、歯周疾患の罹患や
進行を客観的に診断あるいは予測することができ、適切
な歯周疾患の治療や予防を行なることができる。

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】検体中のアミノペプチターゼ様酵素活性を
   測定することにより、歯周疾患の罹患や進行を診断ある
   いは予測するための検査剤であって、該酵素の基質とし
   て、下記式〔Ｉ〕および式〔II〕で示される１種又は２
   種の化合物を含有する基質担持体からなることを特徴と
   する歯周疾患検査剤。 式：Ｘ−Ｔ−Pro−Ｓ 〔Ｉ〕 ［式中、Proはプロリン残基、Ｘは水素またはアミノ基
   保護基、Ｓはプロリン残基のＣ末端に結合する発色基、
   ＴはそのＣ末端がプロリン残基のＮ末端と結合する０〜
   ４個のアミノ酸またはその保護誘導体からなるアミノ酸
   またはペプチドの残基を意味する］ 式：Ｘ−Ｚ−Arg−Ｙ 〔II〕 ［式中、Argはアルギニン残基、Ｘは水素またはアミノ
   基保護基、Ｙはアルギニン残基のＣ末端に結合する発色
   基、ＺはそのＣ末端がアルギニン残基のＮ末端と結合す
   る１〜４個のアミノ酸またはその保護誘導体からなるア
   ミノ酸またはペプチドの残基を意味する］
2. 【請求項２】Ｔ基中のＣ末端アミノ酸残基がグリシン、
   リジン、アルギニン、フェニルアラニンまたはこれらの
   保護誘導体残基である前記第（１）項の歯周疾患検査
   剤。
3. 【請求項３】Ｚ基中のＣ末端アミノ酸残基がグリシン、
   リジン、アルギニン、フェニルアラニンまたはこれらの
   保護誘導体残基である前記第（１）項の歯周疾患検査
   剤。
4. 【請求項４】基質がＮ−カルボベンゾキシ−グリシル−
   グリシル−アルギニン−β−ナフチルアミド、Ｎ−カル
   ボベンゾキシ−バリル−グリシル−アルギニン−β−ナ
   フチルアミド、またはＮ−ベンゾイル−グリシル−アル
   ギニン−β−ナフチルアミドである前記第（１）項の歯
   周疾患検査剤。
5. 【請求項５】基質が、Ｎ−カルボベンゾキシ−プロリル
   −アラニル−グリシル−プロリン−β−ナフチルアミ
   ド、またはＮ−ベンゾイル−アルギニル−グリシル−フ
   ェニルアラニル−プロリン−β−ナフチルアミドである
   前記第（１）項の歯周疾患検査剤。