JPH066066B2 - 遺伝子組換体の産生する生理活性物質の熱処理法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、遺伝子組換体より生産される生理活性物質の
精製方法に関するものである。詳しくは、遺伝子組換操
作によって人工的につくられた微生物（細菌、酵母な
ど）の培養液、もしくは該培養微生物の破砕抽出液より
本発明の生理活性物質を単離精製する工程において、粗
精製状態、または精製が進んだ状態で、該生理活性物質
の水溶液を加熱処理することを特徴とする精製方法に関
する。

さらに、該熱処理済み水溶液を適当な分子量分画能力を
有するゲルろ過の担体カラムにかけて、ゲルろ過を行な
うことを特徴とする精製方法に関する。

本発明における生理活性物質とは、遺伝子組換体より得
られる蛋白質であって、後述のようにＬ−Ｍ細胞に対し
て細胞障害活性を有し、マウスMeth Ａ sarcoma癌細
胞を移植したBALB/cマウスに投与した場合、腫瘍部位に
出血性の壊死反応を起こさせる性質を有する。また、上
記の性質の外に、in vitroで正常細胞にはほとんど有害
な作用をおよぼさないという特徴をもつ。さらに、本文
中で示されるように該生理活性物質は、ヒト遺伝子に由
来するものである。詳しくはウサギの腫瘍壊死因子（以
下ＴＮＦと略す。）のアミノ酸配列構造をもとにヒト染
色体遺伝子より、通常の遺伝子組換操作の手法を使って
取り出したＤＮＡを用いて、人工的に新規のＤＮＡを構
築し、該ＤＮＡを組み込んで作成した遺伝子組換体より
産生される蛋白質である。ヒトＴＮＦ様物質と考えられ
る該生理活性物質は、本来ヒトが備えている蛋白質であ
ることから考えて、安全性があり効果も高い制癌剤とし
て期待のもてる物質である。

近年、生化学の研究の進歩は目ざましいものであり、遺
伝子組換の技術を利用して、天然界に存在する種々の有
用な微量蛋白質を大量に作り出すことが可能となった。
（高木康敬著、「遺伝子操作マニュアル」、講談社、同
著、「遺伝子操作実験法」、講談社、参照） 現在工業的には、遺伝子組換体として、大腸菌などの微
生物が最も一般的に用いられている。しかしながら、こ
れらの微生物を遺伝子組換体として用いる場合には、い
くつかの問題が今でも残されている。その一つとして
は、微生物由来の蛋白質分解酵素があげられる。また、
微生物菌体壁由来のパイロジエン（発熱性因子）も問題
となる。すなわち、本来微生物にとって異物と見なされ
る人工の蛋白質は、高効率で組換体微生物内には生産さ
れているにもかかわらず、精製工程を進めるにしたが
い、微生物の排除機構である強力な蛋白分解酵素によっ
て分解をうける。その結果、目的とする蛋白質を高収率
で純度良く得ることは、極めて難しいのが実状であっ
た。

The Journal of Biological Chemistry２５６巻 No.１８9750-9740頁、１９８１年には、遺伝子組換体大
腸菌を用いて人工的にインターフェロンを生産し精製す
る際に、菌体由来の蛋白質分解酵素による該インターフ
ェロンの分解を防止する目的で、各種の蛋白分解酵素阻
害剤の使用についての報告がある。しかし、一般に良く
知られている蛋白分解酵素阻害剤はそれ自体、ヒトに対
しても毒性が強い。その為、本発明の目的である医薬品
の製造工程中に用いることは、完全な除去が難しいこと
もあって安全性の点で実用的でなかった。

本発明者らは、以上の実情にかんがみ、鋭意研究を行な
った結果、実に驚くべきことに、適当な加熱処理を精製
工程に行なうことにより、菌体由来の蛋白分解酵素の不
活性化が、極めて容易に、しかも安全に達成できること
をみいだした。

更に、驚くべきことに、加熱処理によって菌体由来の核
酸、脂質、蛋白質が不溶性沈澱物となって析出したり、
凝集して高分子化することが起こる為、次にゲルろ過工
程を行なうと飛躍的に精製度が向上することがわかっ
た。同時に、驚くべきことにリポ多糖であるパイロジェ
ンも除去が容易にできることがわかり、本発明を完成す
るに至った。

本発明は、遺伝子組換体より生産され、下記性質を有す
る生理活性物質を精製するに際し、加熱処理を行なうこ
とを特徴とする精製方法に関するものである。すなわち
その性質とは、本文記載の方法により測定する場合、Ｌ
−Ｍ細胞に対して細胞障害活性を有する。また、本文記
載の方法によりMeth Ａ sarcoma癌細胞を移植したBAL
B/cマウスに投与した場合、その腫瘍部位に出血性壊死
反応を起こさせる。

本発明に用いられる生理活性物質は少なくとも下記のア
ミノ酸配列を含む蛋白質である。

Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Arg Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly Gin Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu なお、上記配列は下記の略号のＬ−アミノ酸からなり、
配列の左から右への方向はＮ末端からＣ末端への方向を
示すものである。

Cys：システィン残基 Gln：グルタミン残基 Asp：アスパラギン酸残基 Pro：プロリン残基 Tyr：チロシン残基 Val：バリン残基 Glu：グルタミン酸残基 Ala：アラニン残基 Asn：アスパラギン残基 Leu：ロイシン残基 Phe：フェニルアラニン残基 Gly：グリシン残基 His：ヒスチジン残基 Ser：セリン残基 Thr：スレオニン残基 Ile：イソロイシン残基 Trp：トリプトファン残基 Arg：アルギニン残基 本発明に用いられる遺伝子組換体は少なくとも下記のDN
A配列を含むものである。

TCA TCT TCT CGA ACC CCG AGT GAC AAG CCT GTA GCC CAT GTT GTA GCA AAC CCT CAA GCT GAG GGG CAG CTC CAG TGG CTG AAC CGC CGG GCC AAT GCC CTC CTG GCC AAT GGC GTG GAG CTG AGA GAT AAC CAG CTG GTG GTG CCA TCA GAG GGC CTG TAC CTC ATC TAC TCC CAG GTC CTC TTC AAG GGC CAA GGC TGC CCC TCC ACC CAT GTG CTC CTC ACC CAC ACC ATC AGC CGC ATC GCC GTC TCC TAC CAG ACC AAG GTC AAC CTC CTC TCT GCC ATC AAG AGC CCC TGC CAG AGG GAG ACC CCA GAG GGG GCT GAG GCC AAG CCC TGG TAT GAG CCC ATC TAT CTG GGA GGG GTC TTC CAG CTG GAG AAG GGT GAC CGA CTC AGC GCT GAG ATC AAT CGG CCC GAC TAT CTC GAC TTT GCC GAG TCT GGG CAG GTC TAC TTT GGG ATC ATT GCC CTG なお、上記DNA配列は下記の略号を使用し、配列の左か
ら右への方向は５′から３′への方向を示すものであ
る。

Ａ：2′−デオキシアデニル酸残基 Ｃ：2′−デオキシシチジル酸残基 Ｇ：2′−デオキシグアニル酸残基 Ｔ：チミジル酸残基 次に、該生理活性物質は以下のようにして得ることがで
きる。

1.バクテリオファージλ／ウサギ染色体遺伝子ライブラ
リーとバクテリオファージλ／ヒト染色体遺伝子ライブ
ラリーは、ハーバード大学生化学および分子生物学部
（７Divinity Avenue,Cambridge,Massachusetts ０２
１３８，Ｕ．Ｓ．Ａ．）のT.Maniatis教授より得ること
ができる。これらのライブラリーは次の方法によって作
ることができる。〔Cell，１５，p.678（１９７８）参
照〕 (1)ウサギあるいはヒトの組織、たとえばウサギあるい
はヒトのすい臓、を凍結粉末にし、RNAと蛋白成分を分
解処理し、沈澱によってウサギあるいはヒトの高分子DN
Aを得る。

(2)この高分子DNAは遺伝子座位をランダムに切るため
に、部分的に分解する。

(3)得られたDNA断片から分子量分画によって、１５〜２
０キロ塩基対(kb)の大きさの断片を得る。

(4)得られたDNA断片をλCharon３０ファージペクターを
用いてクローン化する。

(5)得られたベクターを、rDNAを含み感染性のファージ
粒子にin vitroで組み入れ、上記のウサギあるいはヒト
の染色体遺伝子ライブラリーを得る。

2.参考例１で得られたウサギTNFのcDNAは、P.W.J.Rigby
らのニックトランスレーション法〔J.Mol.Biol.113,p.2
37（１９７７）参照〕 によって、^３２Ｐでラベル化する。

3バクテリオファージλ／ウサギ染色体遺伝子ライブラ
リーとバクテリオファージλ／ヒト染色体遺伝子ライブ
ラリーのそれぞれを、バクテリアの均一層の上に密にプ
ラークができるように植えつけ、^３２Ｐでラベルしたウ
サギTNFのcDNAとハイブリダイスさせてスクリーニング
した。

4適当なクローンより、対応するDNAを単離し、制限酸素
地図を作り、Southernハイブリダイズ法〔E.M.Souther
n,J.Mol.Biol.,98,P.５０３（１９５７）参照〕によっ
て解析する。

ウサギTNFと該生理活性物質の遺伝子を含む制限酵素分
解された断片を、プラスミドベクター中に導入し塩基配
列を解析する。

5.ウサギTNFのcDNAとウサギTNF遺伝子の塩基配列を比較
して、ウサギTNF遺伝子のエクソン（ウサギTNFのアミノ
酸配列をコードしない塩基配列）を決定する。

6.そして、ウサギTNF遺伝子と該生理活性物質の遺伝子
を比較して、該生理活性物質のエクソンとイントロンを
決定する。

7.ウサギTNF遺伝子のイントロンを削除したエクソンを
結合することによって得られた塩基配列により決められ
るウサギTNFのアミノ酸配列は、ウサギTNFのcDNAの塩基
配列より決められる同アミノ酸配列と一致することで確
認される。

8.次に、該生理活性物質遺伝子のイントロンを削除しエ
クソンを結合することによって得られた塩基配列より該
生理活性物質のアミノ酸配列が決められる。該生理活性
物質のアミノ酸配列とは、ウサギTNFのアミノ酸配列部
分的に一致することで確認される。

9.その後、該生理活性物質をコードするDNAをin vitro
で修飾し、適当な表現ベヒクルに導入し、そのDNAを含
む組換DNAを作成する。

10.このようにして得られた該生理活性物質はその成熟
型で、セリンから始まる１５５個のアミノ酸残基を持
つ。一方、その前配列としてシグナルペプチドを持つ。

各アミノ酸に対応するコドン（遺伝暗号）の使用頻度が
異る等の理由により、アミノ酸配列を変えることなく、
塩基配列の一部または全部を、有機化学的に合成された
人工のDNAに置換えることも可能である。

該生理活性物質はまた、細胞内で未成熟形態（プレまた
はプレプロペプチド）で産生され成熟過程（プロセシン
グ）により中間体を経由して成熟した該生理活性物質と
なることが推定される。該生理活性物質のこのような未
成熟形態は、該生理活性物質遺伝子の塩基配列から推定
することができる。未成熟形態及び中間体の該生理活性
物質をコードする遺伝子を含む該生理活性物質遺伝子も
また、天然のまたは人工的DNAを用いて組換を行うこと
ができる。

これらの方法の応用形態の１つは、メチオニンコドン(A
TG)を成熟あるいは未成熟あるいは中間体TNF遺伝子の
5′端に導入することである。このようにすることによ
り、適当なプロモータによって合成されるmRNAから成熟
あるいは未成熟あるいは中間体の該生理活性物質が産生
される。この様にＮ末端に付加されたメチオニン残基は
宿主によっては自然に除去される。

また別の形態としては、シグナル配列と呼ばれる疎水性
に富んだ配列を付加することにより、宿主細胞の外また
はグラム陰性細菌においては、ペリプラズマと呼ばれる
部分へ、分泌させることも可能である。

また、開始コドンを組込んであるペクターの場合は、ペ
クターから由来するペプチドと該生理活性物質との融合
ペプチドを形成するが、この場合は化学的または酸素的
に切断するか、もしくは該生理活性物質の主たる活性に
変化がなければ、そのまま用いることができる。

このように得られた該生理活性物質遺伝子を、正しく転
写、翻訳が行われるような配列においてプロモーター等
の5′領域の遺伝子配列に接続し、細菌または高等生物
細胞中で複製可能なペクターと接続した組換遺伝子を
得、この組換遺伝子によって細菌または高等生物細胞を
形質転換し、この形質転換体を増殖せしめ、該生理活性
物質遺伝子を発現せしめることにより該生理活性物質を
得ることができる。

宿主として大腸菌を用いる場合は好適にはE.coli K12株
の種々の変異株、例えばHB101（ATCC33694）、C600K(AT
CC339955)、D1210、RRI(ATCC3I343)、MC1061、LE392(AT
CC33572)、JM101(ATCC33876)、JM83、JM103、χ1776(AT
CC31244)などが用いられる。

大腸菌を宿主とする場合のペクターとしては、pBR322、
pBR325、pBR327、pUC8、pUC9、pMB9(ATCC37019)、pJB8
(ATCC37074)、pKC7(ATCC37084)等のプラミスドあるいは
λgt、λB、シャロン４Ａのようなλファージ、Ｍ／３
ファージなどが用いられる。

大腸菌の菌体中に該生理活性物質を産生させるために、
大腸菌の遺伝子またはファージ 遺伝子のプロモーター
が使用される。このようなプロモーターとして、好適に
はラクトース分解酵素（ＬＡＣ）のプロモーター及びそ
のＵＶ５変異、ペニシリナーゼ(BLA)、トリプトファン
合成酵素(TRP)のプロモーター、λファージのP_Lプロモ
ーターあるいはトリプトファン合成酵素と、ラクトース
分解酵素の融合プロモーターであるTACプロモーター等
が用いられる。

枯草菌を宿主とする場合にはBD170株(ATCC33608)、BR15
1株(ATCC33677)、MI112株(ATCC33712)などが用いられ、
ペクターとしてはpC194(ATCC37034)、pUB110(ATCC3701
5)、pSA2100(ATCC37014)、pE194などのプラスミドなど
が用いられる。

枯草菌を宿主とする場合のプロモーターとしては、クロ
ラムフェニコールアセチル化酵素(CAT)やペニシリナー
ゼ、エリスロマイシン耐性等の遺伝子のプロモーターが
用いられる。

酵母を宿主とする場合は、サッカロマイセス・セルビシ
エ（Saccharomyces cereviseae）のRH218株(ATCC4407
6)、SHY1株(ATCC44769)、SHY3株(ATCC44771)、D131A
株、483株、830株などが用いられ、そのベクターとして
はYEp13(ATCC37115)、YEp6、YRp7、XIp5などのプラスミ
ドが用いられる。

酵母を宿主とする場合、プロモーターとしては酸性ホス
ファターゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ(ADHI)、トリ
プトファン合成酵素(TRP)、ホスホグリセレートキナー
ゼ(PGK)、チトクロームＢ(COB)、アクチン等の遺伝子の
プロモーターが用いられる。

以上のようにして作成した遺伝子組換体微生物を通常の
方法で大量に培養した後、目的とする該生理活性物質を
産生させ、次いで目的とする該生理活性物質を抽出単離
精製する。微生物菌体除去後の培養液、もしくは菌体の
破砕抽出液を粗製原液として本発明の精製方法に供す
る。本発明の加熱の時期としては、粗製原液の状態で、
そのまま、またはpH.、イオン強度などを合わせる為に
適当な希釈緩衝液で希釈した後に、または限外濃縮を用
いて適当に濃縮を行なった後、また、上記粗製原液を硫
安などで塩析処理した後、更には、イオン交換樹脂など
を用いて粗く精製を行なった後、ゲルろ過などを行なっ
て精製度を高めた後、以上いずれの段階で行なうことも
可能であるが、菌体の蛋白分解酵素の影響を速い時期に
無くす為には、出来るかぎり早い段階で処理することが
望まれる。

粗原液の段階、もしくは粗く精製を一段した後が、好ま
しい。

加熱処理時の該生理活性物質を含む水溶液のpH.は４−
１１であり、好ましくは中性領域の６−８である。

加熱処理の温度としては、５０°−６５℃である。５０
℃以下の温度では、分解酵素の不活性化が不十分であ
り、６５℃以上の温度では、該生理活性物質が失活し始
めるので好ましくない。より好ましい温度としては５５
°−６５℃であり、更に好ましくは、５８°−６２℃で
ある。

次に、加熱処理の時間としては、５分−１８０分であ
る。この場合も、短すぎると分解酵素の不活性化が不十
分であり、長すぎると該生理活性物質が失活し始めるの
で好ましくない。より好ましくは１０分−１２０分、更
に好ましくは、３０分−６０分である。

次に、上記の加熱処理後の溶液は遠心処理または、フィ
ルターろ過などにより加熱処理によって生じた不溶性の
物質を除去した後、分子量の分画範囲で30,000−70,000
である担体のゲルろ過カラムに付す。ゲルろ過用の担体
として具体的には、セファデックスG75，G100，G150，G
200，セフアクリルS200，S300、（ファルマシア社、ス
ウエーデン）Biogel P30，60，100，200、（バイオラッ
ド社、アメリカ）、トヨパールHW65、HW55（東洋ソーダ
社）、セルロファイン GC-700-m，GC-200-m（生化学工
業社）が挙げられるが、強度の点から考えて、セフアク
リル S200，S300、トヨパール HW55，HW65、セルロフ
ァイン GC-700-mが好ましい。

加熱処理後に、この工程を行なうことにより、未加熱処
理で、この工程を行なった場合に比較して、精製度およ
びパイロジェン除去率ともに高い結果が、得られた。

なお、この工程で用いる溶離液としてえは緩衝液を用い
るが、リン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液など一般的な緩
衝液であれば、特に限定されるものでない。ただし、pH
６−９の範囲で用いる。また、各種塩の添加も考えられ
るが、その濃度としては、0.1−2.0Ｍがこのましい。

以上のごとく本発明は、加熱処理を特徴とする、遺伝子
組換体の生産生理活性物質の精製方法についてであり、
更には、加熱処理、適当なゲルろ過を行なうことを特徴
とする精製方法に関するものである。本発明の精製方法
は、従来の方法に比べて安全性が極めて高く、しかも容
易に、かつ安価に大量に、遺伝子組換体より目的とする
該生理活性物質を精製することができるという、優れた
特徴を有している。

尚、本発明の精製方法によって得られた精製生理活性物
質の約３００単位は、後述のMeth Ａ sarcoma坦癌マ
ウスを用いる生理活性評価において(+)の活性を示し
た。更に、マウス結腸癌Colon２６で坦癌させたBALB/c
マウスに本生理活性物質の精製物を投与した場合、対照
群（生理食塩水投与群）に比して有意の差を持って、癌
増殖抑制および退縮効果が認められた。また培養を３７
℃で７２時間で行なう以外は、後述のＬ−Ｍ細胞に対す
る細胞障害活性評価と同様な実験方法で、各種ヒト癌細
胞に対する活性の評価をおこなった。用いた細胞は、Ｋ
Ｂ細胞（鼻咽喉癌）、ＰＣ−８細胞（肺癌）、比較対照
細胞として正常細胞（ヒト胎児腎細胞、ヒト胎児包皮細
胞）であった。その結果、正常細胞には、ほとんど細胞
障害活性が認められなかったにもかかわらず、癌細胞に
は強い細胞障害活性が認められた。

すなわち本発明の生理活性物質の精製物は、極めて優れ
た制癌活性を持ち、しかも、ヒト由来の蛋白質であるこ
とから、今後有用な制癌剤として期待できるものであ
る。

次に、本発明を実施するにあたって、行なう評価方法に
ついて以下に詳細を述べる。

1)in vivo活性測定（Meth Ａ sarcoma坦癌マウスを用
いる活性測定） in vivo法としは、たとえば、Carswellらの方法、Proc.
Nat.Acad.Sci.USA，７２(1975)3666があげられる。

本発明者らが用いている方法は、これを改良したもので
あり、移植したMeth Ａ sarcomaによる腫瘍を該生理
活性物質が壊死させる効果を測定するものである。すな
わち、BALB/cマウスの下部皮内に２×１0⁵）個のMeth
Ａ sarcoma細胞を移植する。７日後、移植した腫瘍の
大きさが直径７〜８mmとなり、出血性壊死などがなく良
好な血行状態にあるマウスを選び、尾静脈より生理食塩
水で希釈した0.5ｍの該生理活性物質試料を注射し、
２４時間後に次の判定基準により判定を行なう。

(-)：変化なし (+)：かすかな出血性壊死 （）：中程度の出血性壊死（移植ガン表面の真 中から５０％以上にわたって壊死） （）：顕著な出血性壊死（移植ガンの中央部が 重度に壊死し、周囲のガン組織がわずかに残った
状態） 2)in vivo活性測定（Ｌ−Ｍ細胞を用いる活性測定） in vitro法による該生理活性物質活性測定は、たとえ
ば、Ruff〔Lymphokines Vol.11,ed.by E.Pick,Academic
Press,N.Y.(1980)235〕、あるいは〔J.Immunol.,126(1
981)1279〕の方法があげられる。

本発明者らが用いている方法は、これらを改良したもの
であり、該生理活性物質がＬ−Ｍ細胞（アメリカン・タ
イプ・カルチャー・コレクション、CCL1.20）を殺す効
果を測定するものである。すなわち、順次培地で希釈し
た該生理活性物質試料0.1mと１0⁵個／mの濃度のＬ
−Ｍ細胞の培地懸濁液0.1mを９６穴の組織培養用マイ
クロプレート（フロー・ラボラトリー社）に加える。培
地は１０V/V％のウシ胎児血清を含むイーグルのミニマ
ム・エッセンシャル培地（その組成は、たとえば、「組
織培養」中井順之助他編修、朝倉書店、１９６７年に記
載されている）を用いる。マイクロプレートを５％の炭
酸ガスを含む空気中３７℃で４８時間培養する。培養終
了後、２０％グルタルアルデヒド水溶液２０μを加え
細胞を固定する。固定後、マイクロプレートを洗浄、乾
燥して、0.０５％メチレンブルー溶液を0.１m加え、
生き残った細胞を染色する。余分なメチレンブルーを洗
い流し乾燥した後、残ったメチレンブルーを３％塩酸溶
液で抽出し、その６５５nmにおける吸光度をタイターテ
ック・マルチスキヤン（フロー・ラボラトリー社）で測
定する。この吸光度は、生き残った細胞数に比例する。
該生理活性物質試料を加えない対照の吸光度の５０％の
値に相当する該生理活性物質の希釈率を、グラフあるい
は計算によって求め、その希釈率を単位(U)/mと定義
する。以下、本発明における該生理活性物質のin vitro
活性は、参考例１と２を除いては、すべてこの単位で表
示される。

なお、参考例１と２におけるＬ細胞障害活性の測定法
は、上記の方法と次の点で異なる。すなわち、Ｌ−Ｍ細
胞のかわりにＬ−929細胞を用いること、培地に１V/V％
のウシ胎児血清と５μｇ／ｍのアクチノマイシン Ｄ
を含むイーグルのミニマム・エッセンシャル培地を用い
ること、培養時間を４８時間のかわりに２１時間とする
こと、が異なる。

3)PYRODICを用いるパイロジェンの測定市販のパイロ
ジェン測定キットであるPYRO-DIC（生化学工業社製）
を用いて、添付の操作基準書に従って測定をおこなっ
た。

4)蛋白質定量 蛋白質はLowryら(J.Biol.Chem.,193p265(1951))の方法
に従い測定し算出した。

5)蛋白質分解酵素の測定 市販の合成基質S-2222（第一化学薬品社）を用い、本発
明者らが改良した方法によって測定をおこなう。

試薬 1) ４mM S-2222 １００μ 2) １Ｍ Tris-HCl(pH8.3) １００μ 3)サンプル １０００μ 方法 反応容器（２cc）内に試薬１、２、３を入れ、３７℃
で、反応を行なった後に、0.6Ｍ酢酸水溶液７００μ
を入れて固定した後、４０５nmの吸光度を測定する。

なお、3)のサンプルの代わりに各種濃度のトリプシン(B
oivine Pancreas Type／ SIGMA NO.T-800)を用いて標
準曲線を求める。上記の方法を用いて各工程中に含まれ
る蛋白質分解酵素の濃度をトリプトシン濃度換算で求め
る。

以下に参考例および実施例によって本発明を詳細に記
す。

本発明の実施にあたり、組換DNAの作製、組換体の微生
物への導入は、特に断らない限り下記の実験書に従って
実施した。

(1) 高木康敬編著 遺伝子操作マニュアル、講談 社 (2) 高木康敬編著 遺伝子操作実験法、講談社 (3) T.Maniatis,E,F,Fritsch,J.Sambrook Molecular Cloning,Cold Spring Harbor Laboratory刊（米国） (4) Ray Wuら、Method in Enzymology１０１巻 Academic Press（米国）刊 参考例および実施例中で用いられる略号 ＭＯＰＳ： モルフォリノプロパン硫酸 ＬＢ培地： ルリアーベルタニ培地 ＤＭＳＯ： ジメチルスルフォキシド ＰＦＵ ： プラーク・フォーミング単位 ＥＤＴＡ： エチレンジアミン四酢酸 ＳＤＳ ： ドデシル硫酸ナトリウム ＢＲＬ ： ベセスダ・リサーチ・ラボラトリー ＤＭＴ ： ジメトキシトリチル ｌａｃ ： ラクトース Ｔｒｉｓ： トリス（ヒドロキシメチル）アミノ メタン XAR-5： Ｘ線フィルム（イーストマン・コダ ック社、米国） 1×SSC： 0.１５Ｍ塩化ナトリウム＋0.０１５ Ｍクエン酸ナトリウム、pH７ 2×SSC： 0.３０Ｍ塩化ナトリウム＋0.０３０ Ｍクエン酸ナトリウム、pH７ 3×SSC： 0.４５Ｍ塩化ナトリウム＋0.０４５ Ｍクエン酸ナトリウム、pH７ 5×SSC： 0.７５Ｍ塩化ナトリウム＋0.０７５ Ｍクエン酸ナトリウム、pH７ 6×SSC： 0.９０Ｍ塩化ナトリウム＋0.０９０ Ｍクエン酸ナトリウム、pH７ ＦＤＳＳ：５０％脱イオン化フィルムアミド＋ ５×Denhardt′S＋５×SSPE＋0.1 ％SDS＋１００μｇ／ｍ変性ウシ胸 腺DNA デンハルト溶液： １中にフィコール(Ficoll)２００ mg、ポリビニルピロリドン２００mg とウシ血清アルブミン２００mgを含 む水溶液 ＳＳＰＥ： 0.１８Ｍ塩化ナトリウム＋１０mM リン酸二水素ナトリウム＋１mM ＥＤＴＡ、pH7.4 ＳＭ ： １中に塩化ナトリウム5.8ｇ、硫 酸マグネシウム・７水和物２ｇ、 １Ｍ Tris・HCl(pH7.5)50mと ２％ゼラチン5mを含むファージ保 存培地 ＮＺブロス： １中にＮＺアミン（フムコ・シエ フィールド・ケミカル・デビイジョ ン・オブ・クラフト社、米国）１０ ｇ、塩化ナトリウム５ｇと硫酸マグ ネシウム・７水和物２ｇを含む培地 ＩＰＴＧ： イソプロピルチオガラクトシド x-gal： ５−ジブロモ−４−クロロ−３−イ ンドリルガラクトシド ＴＡＥ ： 0.04ＭTris−酢酸(pH8.0)− 0.002ＭEDTA ｂｐ ： 塩基対 参考例１ 工程１（ウサギ血清TNFの取得） 雌ウサギ（体重2.5〜3.0kg）にホルマリンにて死菌処理
したPropionibacterium acnes (Corynebacterium parvum,ウエルカム社、英国)５０mgを耳静
脈より注射した。該ウサギに８日後再度１００μgのエ
ンドトキシン（大腸菌O26：Ｂ６由来のリポポリサッカ
ライド、デイフコ社、米国）を耳静脈より注射し、２時
間後に心臓より全採血した。採取した血液に１００m
当り１００単位のヘパリンナトリウムを加えた後、5,０
００rpmで３０分間遠心操作を行ない、血球および不溶
固型物を除去冷却した。４０羽のウサギより、血清TNF
３×１0⁴単位／mの力価を有する血漿2.4が得られ
た。

工程２（血清THFの部分精製） 工程１で得た血漿2.４にセライト２４ｇを加え、１時
間攪拌した後過した。液に1.2の0.０４Ｍトリス
−塩酸緩衝液（pH7.8）を加えた後、0.１Ｍ塩化ナトリ
ウムを含む0.04Mトリス−塩酸緩衝液（pH7.8）で充分に
平衡化したDEAEセファロースＣＬ−６Ｂ（ファルマシア
社、スウェーデン）のカラムに添加した。0.04Ｍトリス
−塩酸緩衝液で洗滌後、0.１８Ｍ塩化ナトリウムを含む
0.０４Ｍトリス−塩酸緩衝液（pH 7.2）を用いて流出
した。Ｌ細胞障害活性を示す画分を、限外過により濃
縮した。次いで0.１５Ｍ塩化ナトリウムを含む５mMリン
酸緩衝液（pH7.4）で平衡化したセフアクリルS-200（フ
ァルマシア社、スウェーデン）のカラムに該濃縮液を添
加し、同緩衝液にてゲル過を行った。活性区分は限外
過により濃縮し3.5×１0⁶単位を回収した。蛋白定量
に基く比活性は１８×１0⁶単位/mgであった。

工程３（抗THF抗体） 血清より得たTNFを工程２の如く部分精製しフロイント
の完全アジュバンドを１：１で混合し１２週令の雄BALB
/cマウスの背部皮下に注射した。２週後、及び４週後に
この操作を繰返し、更に１週後に全採血し、その血清を
取得した。

この血清をＬ細胞障害活性を測定する培地中に終濃度５
００倍希釈となるように添加し、ウサギ血清から得たTN
FのＬ細胞障害活性を測定したところ、Ｌ細胞障害活性
は認められなかった。ここに得たマウス血清は、ウサギ
血清TNFに対する抗体（抗TNF抗体と称する）を含むもの
と結論できた。

工程４（TNF産生細胞取得） 雌ウサギにホルマリンにて死菌処理したPropionibacter
ium scnes(Corynebactriium parvum,ウエルカム社、英
国）を静脈内投与し、７日後に気管切開し、肺を生理食
塩水で洗滌することにより浮遊性細胞を得た。この細胞
を生理食塩水で洗滌後、１０％牛胎児血清〔フロー・ラ
ポラトリー社、米国）を含むRPMI１６４０（フロー・ラ
ボラトリー社、米国）を培地とし、炭酸ガス５％含有空
気を雰囲気とする炭酸ガスインキュベーターにて、３７
℃で培養した。培養器を２コに分け、一方には大腸菌由
来のエンドトキシン（大腸菌Ｏ２６：Ｂ６由来のリポポ
リサッカライド、デイフコ社、米国）を１０μｇ／ｍ
となるように添加し、一方には同量の滅菌水を添加し
た。エンドトキシンを添加した培養上清にＬ細胞障害活
性が出現した７時間で最高値に達した。この活性は、抗
TNF抗体で消去されたが、正常マウス血清では消去され
なかった。

一方、エンドトキシンを添加しなかった細胞培養上清に
はＬ細胞障害活性は認められたなかった。

工程５（TNFの分子量） 工程４における細胞培養においてエンドトキシンと共に
放射性Ｌ−〔^３５Ｓ〕メチオニン（１３００Ci/mmo、
アマーシャム社、英国）を１mCi/mとなるように添加
して培養を行った。培養上清をLaemmliの方法〔Laemml
i,U.K.（１９７０年）Nature(London)２２７巻６８０〜
６８５頁〕に従ってSDSポリアクリルアミドゲル電気泳
動により解析した。ゲル濃度は１2.５％となるように調
製した。泳動後エンハンス（ニュー・イングランド・ヌ
クレアー社、米国）により処理し、乾燥後、Ｘ線フィル
ム（フジＲＸ、富士写真フィルム）に密着露光せしめ
た。エンドトキシン存在下に培養した培養上清に、分子
量約17500の物質の生成が認められた。

また工程４における細胞培養の上清を、上記と同様にSD
Sポリアクリルアミドゲル電気泳動に付した後、2.５％
ＮＰ４０（カルビオケム社、米国）で１時間、水中で２
時間振とう後、各泳動レーンを切断分離し、泳動方法に
直角に２mm巾にスライスした。各スライス断片をＬ細胞
と共に培養することにより、Ｌ細胞障害性を調べた。エ
ンドトキシン存在下に培養上清を展開したレーンの分子
量約17500の位置にＬ細胞障害性が認められ、その他の
位置には活性は認められなかった。

工程６（mRNA）の取得） 工程４と同様な細胞培養においてエンドトキシンを添加
後２時間培養したのち、遠心分離にて細胞（ウサギ肺洗
滌細胞）を集めた。細胞質RNAおよびその中からのmRNA
の抽出は下記の如くChirgwinらの条件〔Chirgwin,J,M.e
t al.,Biochemistry１８巻5294頁（１９７９年）〕に従
って行った。細胞３×１0⁸個に対し、４mの４Ｍグア
ニジンチオシアネート溶液を加え、ホモジナイザー（Ａ
Ｍ−７、日本精機製作所）にて破砕した。残渣を遠心除
去後、2.４ｇの塩化セシウムを溶解し、あらかじめ2.５
mの5.７Ｍ塩化セシウム、0.１ＭEDTA溶液（pH7.5）を
入れてあるポリアロマーチューブへ静かに重層した。

ベックマンＳＷ４１ローター（ベックマン社、米国）を
用いて２０℃30000回転にて１２時間、超遠心分離を行
った後、上清を除き、ペレットを１０mMトリス−塩酸緩
衝液（５mM EDTA、１％SDSを含有する）１mにて溶解
した。この溶液を１mのクロロホルム−１−ブタノー
ル（４：１）混液で抽出し、水層に0.０５容積の２Ｍ酢
酸ナトリウムと、2.５容積のエタノールを加え、−２０
℃で２時間以上放置してRNAを沈澱させた。遠心にて沈
澱を集め、乾燥させたのち滅菌水５００μに溶解し
て、細胞質RNA溶液を得た。

上記細胞質RNA溶液６８℃、２分間加熱後急冷し、５０
０μの２倍濃度の１０mMトリス EDTA緩衝液pH7.4
（１mM EDTA、0.1％SDS及び0.５Ｍ塩化リチウムを含
む）を加え、２００mgのオリゴ(dT)−セルロース(BRL) カラムに展開、１倍濃度の上記バッファー１０mで洗
浄、溶出緩衝液（１０mMトリス−塩酸pH7.4、１mM EDT
A、0.１％SDSを含む）２mで溶出した。溶出後に0.０
５容積の酢酸ナトリウム、2.５容積のエタノールを加え
て−２０℃冷却にて沈澱せしめた。沈澱を遠心にて集
め、再度同様にオリゴ(dT)セルロースカラムに吸着する
画分を集めた。紫外吸収スペクトル分析により、８５μ
ｇのmRNAを回収した。

工程７（mRNAのサイズ分画） 工程６と同様にして得たnRNA８８０μｇを２５０μの
水に溶解し、５−２５％直線ショ糖密度勾配１０mに
重層した。ショ糖密度勾配は、５および２５％のショ糖
を各々含むトリス緩衝液（２５mMトリス塩酸pH7.２pH、
２mM EDTA、１％ SDSを含有する）を用い、ISCO570グ
ラジェンター（イスコ社、米国）により作製した。

ベックマンSW41Tiを用い、４℃40000回転、１２時間の
超遠心を行ったのち、分画回収装置（ベックマン社、米
国）により各４００μの分価を回収した。各分画はエ
タノール沈澱し、遠心後滅菌水に溶解した。

工程８（mRNAの翻訳実験） アフリカツメガエル卵母細胞によるmRNAの翻訳は、実験
書（例えば寺岡宏、五木幹男、田中康太郎、蛋白質、核
酸、酵素、臨時増刊、遺伝子操作、６０２頁１９８１
年）に依った。アフリカツメガエルは、浜松生物教材よ
り得た。実施例５で得た分画mRNAを１μｇ／μになる
ように滅菌水に溶解し、卵母細胞１個あたり、５０n
ずつを微量注入し、１mg/mの牛血清アルブミンを含有
するBarth溶液（7.5mMトリス塩酸pH7.6、８８mM食塩、
１mM塩化カリ、0.３３mM硝酸カルシウム、0.４１mM塩化
カルシウム、0.８２mM硫酸マグネシウム、2.mM重炭酸ナ
トリウム、１８U/mペニシリンＧ、１８μｇ／ｍス
トレプトマイシンを含有する）中で２４時間培養した。
培養液のまま卵母細胞をつぶし、遠心後、上清のＬ細胞
障害性を測定した。沈降定数１６Ｓ付近において、Ｌ細
胞障害活性が最高値を与えた。またこの活性は工程３で
得た抗TNF抗体により消去されたが正常マウス血清では
消去されなかった。

工程９（形質転換の取得） 工程５で得た分画mRNAを５μg用い、実験書(1)９７頁以
降に従って、二重鎖DNAを調整した。逆転写酵素はライ
フサイエンス社（米国）のものを使用した。二重鎖DNA
を、3.5％ゲル濃度のポリアクリルアミドゲル電気泳動
にて分画し、長さ約１０００〜２０００塩基対（以下塩
基対をbpと略す）の画分３３０ngを得た。この画分７ng
を用い同上の実験書に従い、ターミナルデオキシヌクレ
オチジルトランスフェラーゼ（BRL社）を用いてデオキ
シＣ鎖をつなぎ、同様にPst 1部位にデオキシＧ鎖をつ
ないだプラスミドpBR322５６ngとアニールせしめた。ア
リール後の混合物を用いて大腸菌E.coli K−１２株（HB
101、ATCC33694）を形質転換し、12000株を形質転換体
を得た。

工程１０（TNFの部分のアミノ酸配列） 工程２で部分精製したTNFを、工程５におけると同様にS
DSポリアクリルアミドゲル電気泳動により精製した。一
部をクマシー・プリリアント・ブルー染色し、分子量約
17000の位置にあるバンドをゲルから切出し、１％重炭
酸アンモニウムにより抽出した。５×１0⁷単位のTNFを
使用し、蛋白として約１８０μｇを回収した。

このうち１５０μｇを１％重炭酸アンモニウム７５μｇ
に溶解、TPCKトリプシン（ワーシントン・バイオケミカ
ル社、米国）を３μｇを添加し、３７℃、４時間インキ
ュベートした。反応液をコスモシール５Ｃ８（半井化
学）を担体とする高速液体クロマトグラフィーにより分
画し、トリプシン消化断片を得た。

上記の如く高純度に精製したＴＮＦおよびそのトリプシ
ン消化断片は、次に、セファデックスG25のカラムで脱
塩し、凍結乾燥後、アミノ酸シークエンスアナライザー
・モデル４７０Ａ（アプライドバイオシステム社、米
国）を用いR.M.Hewickらの方法（J.Biol.Chem.256巻799
0-7997頁、１９８１年）に準じて、Ｎ末端よりエンドマ
ン分解を行った。各ステップにおいて遊離してくるフェ
ニルチオヒダントインアミノ酸は、高速液体クロマトグ
ラフィーモデルSP8100（スペクトラフイジックス社、米
国）を用い、ゾルバックスODS（デュ・ポン社、米国）
をカラムとして、常法により分析した。この結果、TNF
のＮ末端側からのアミノ酸配列は下記の通りであった。

Ser Ala Ser Arg Ala Leu Ser Asp Lys Pro Leu Ala His Val Val Ala Asn Pro Gln Val Glu Gly Gln Leu Gln またトリプシン消化断片のうちの１つは、そのＮ末端よ
り下記のアミノ酸配列であった。

Glu Thr Pro Glu Glu Ala Glu Pro Met Ala 工程１１（オリゴDNAプロープの合成） 工程１０で得たTNFのアミノ酸配列から推定されるmRNA
の塩基配列に対し、相補的な、オリゴDNAを合成した。
合成方法は、Itoらが既に発表している改良リン酸トリ
エステル法（H.Ito et al.Nueleic Acids Acids Res.１
０巻1775〜1769頁、１９８２年）により行った。

アミノ酸配列から推定される１２８種類のオリゴDNAを
５グループに別け、各々１６、１６、３２、３２、３２
種類の混合物として合成した。

第１に本発明の新規生理活性物質のアミノ酸配列の一部
と、これに基く５種類の合成オリゴDNAのプローブの塩
基配列を示す。各々を常法に従って脱保護し、Ｇ−５０
（ファルマシア社、スウェーデン）を用いるカラムクロ
マトグラフイー、７Ｍ尿素を含む２０％ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動及び、DE52（ワットマン社、米国）カ
ラムクロマトグラフィーにより精製し、0.１mMトリスED
TA緩衝液に対し、透析した。

各々の精製オリゴDNAを常法によりＴ４ポリヌクレオチ
ドキナーゼ（バイオラットラポラトリーズ社、米国）お
よびγ−３２ｐ−アデノシントリリン酸を用いて放射性
ラベルし、ＤＥ５２カラムにより精製した。各々、約３
×１0⁸ｃｐｍ／μｇの放射能が導入された。

工程１２（オリゴヌクレオチドの検定） 工程６に従って得たTNF産生細胞のmRNAをグリオキザー
ル及びジメチルスルフォキシドの存在下に５０℃６０分
間処理したのち、1.1％アガロースゲル電気泳動により
分画した。分画されたmRNAを、電気泳動式トランスファ
ーブロッテリング装置（バイオラッドラボラトリーズ
社、米国）を用いて、メーカーのマニュアルに従い、移
動せしめた。次いで、この膜上のmRNAと、５×ＳＳＣ及
び１５０μｇ／ｍの変性サケ精子DNAを含む５×デン
ハルト溶液で６５℃、２時間処理したのち、放射性標識
したオリゴDNAを１×１0⁷cpm/m、５×ＳＳＣ溶液を含
む５×デンハルト溶液で５０℃、 ２時間処理した。次いでこの膜を６×SSCで室温、４０
℃、５０℃、６０℃で順次洗滌し、Ｘ線フィルムXAR-5
に対し露光せしめた。この結果、mRNAと最も強くハイブ
リダイズするオリゴDNAは、ＭＪであって、ＭＪ混合物
中にmRNAと完全に相補的な配列を有するオリゴDNAが含
まれていることが判明した。

工程１３（TNF遺伝子のクローニング） 工程９で得た形質転換体を実験書(2)１６２頁の方法に
従ってセルロースフィルター上に移し、そのDNAと、工
程１２で選択された放射性標識オリゴDNA(MJ)とを工程
１２と同様の条件でハイブリダイズせしめた（コロニー
・ハイブリダイゼーション）。強くハイブリダイズする
株４９個を選び更にフィルター上に固定して再度コロニ
ーハイブリダイゼーションを実施し、９個を選んだ。

この９個の株から、実験書(1)６頁の迅速プラスミド分
離法に従って各々約５μｇのプラスミドを取得した。こ
のプラスミドを制限酵素PstＩ、TaqＩ、RsaＩ、PvuII
（いずれもBRL社）を用い、メーカーのマニュアルに従
って切断し、１％アガロースゲル電気泳動で、各々の酵
素による切断片の長さを比較した。

この結果、９株すべてが、約５０bpのRvuIIとRsaＩによ
る断片を有し、８株がRsaＩによる約２００bpの断片を
有し、共通の配列を有することが示唆された。第１図に
制限酵素による解析結果を図示する。

また、このうち７株を１０μｇ／ｍのテトラサイクリ
ンを含む２mのＬ培地中で培養し、遠心にて集めた菌
体を２mの生理食塩水中で超音波により破砕し、遠心
上清のＬ細胞障害活性を測定したところ、表２に示す如
く、Ｌ細胞障害活性を示した。

またこの活性は抗TNF抗体により消去され、正常マウス
血清では消去されなかった。従ってこの９株すべてがTN
F遺伝子を含むプラスミドを有していることが行され
た。

工程１４（TNF遺伝子の塩基配列の決定） プラスミドpB2-7、およびpR18を含有する大腸菌株を、
１０μｇ／ｍのテトラサイクリンを含有するＭ９培地
〔実験書(3)４４０頁〕１中で培養した後、実験書(3)
９０頁の方法に従ってプラスミドを単離し、各々約１５
０μｇを得た。

各々の塩基配列をマキサム−ギルバート法 （Maxam et.al.Method in Enzymology,55巻４９０頁、
１９８０年、Academic Press）に従って決定した。ま
た、この塩基配列と工程９で決定された部分アミノ酸配
列の一致により、TNF蛋白の全構造が解明された。

工程１５ プラスミドpR/2の組み変え体を用いてE.coli内でlacを
プロモーターとしてTNFを発現させることを目的にプラ
スミドの構築を行った。第２図に示す様に１０μｇのプ
ラスミドpR/2を１０ユニットのApaＩ（BRL社）で３７℃
で２時間消化し、４％のポリアクリルアミドゲル上の電
気泳動で約６３０bp断片を単離した。約１μｇの断片が
ゲルから電気泳動溶出した。工程１０と同様の方法によ
って図示の２個のデオキシオリゴヌクレオチド即ち、
5′−GATCCATGTCAGCTTCTCGGGCC−3′と5′−CGAGAAGCTG
ACATG−3′（第２図）とを合成し、実験書(3)１２２頁
に従って約１００pmoleの各デオキシオリゴヌクレオチ
ドの5′末端をT₄ポリヌクレオチドキナーゼを用いてリ
ン酸化した。反応終了液をフエノールを用いて抽出し、
さらにクロロフォルム抽出した後、オリゴマーを0.5μ
ｇの約６３０塩基対のApa１断片と合せてエタノール沈
澱した。実験書(1)３７頁に従がって１０ユニットのT₄D
NAリガーゼで前記の断片を４℃で１夜反応させ結合し
た。反応終了液をエタノール沈澱後、２０ユニットのBa
mHIで３７℃３時間消化し、４％のポリアクリルアミド
上の電気泳動にかけ、約６７０bpの断片を電気泳動溶出
により回収した。市販のプラスミドpUC-8(P-Lバイオケ
ミカル社、カタログ番号４９１６、米国）１μｇをBamH
Iで消化してフエノール抽出、クロロフォルム抽出、エ
タノール沈澱をして調製したベクター0.5μｇに約６７
０bpのTNFの全構造遺伝子を含む両端がBamHIサイトを持
った断片をT₄DNAリガーゼを用いて結合した。実験書
(4)、２０頁に従がって、E.coli JM101(ATCC33876)を形
質転換してIPTC及びx-galを含む寒天培地が約２００個
の白色コロニーを得た。これらのトランスフォーマント
１００個からプラスミドDNAを調製し、BamHIで消化した
ところ、１５個が目的の約６７０bpのBamHIの断片を含
んでいた。さらに、挿入の方向を調べるために、上記１
５個のプラスミドをそれぞれ１ケ所しか認識部位がない
EcoRI(pUS-8上に認識部位がある）とPvuII（約６７０bp
の断片上に認識部位がある）を用いて消化し、６％ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動を用いて調べたところ、７
個のプラスミドから目的の約１４０bpの断片が確認さ
れ、pUC-８上のlacプロモーターから順方向であること
が判明した。

塩基配列の解析により、この７個のプラスミドは同一
で、lacプロモーター、合成DNA及びcDNA間の結合部に所
望のヌクレオチド配列を有することが確認された。

工程１６ プラスミドpR17を用いて、E.coli内でlac UV5プロモー
ターとしてTNFを直接発現させることを目的にプラスミ
ドの構築を行った。第３図に示す様に１０μｇのプラス
ミドpR17１０ユニットのApa１（BRL社）で３７℃２時間
消化し、４％のポリアクリルアミドゲル電気泳動で約６
３０bpの断片を単離した。約１μｇの断片がゲルから電
気泳動溶出した。工程１０と同様の方法によって図示の
２個のデオキシオリゴヌクレオチド即ち、5′−AATTCAT
GTCAGCTTCTCGGGCC−3′と5′−CGAGAAGCTGACATG−3′と
を合成し、実験書(3)１２２頁に従って約１００pmoleの
上記２種のデオキシオリゴヌクレオチドの5′末端をT₄
ポリヌクレオチドキナーゼを用いてリン酸化した。反応
終了液をフェノールを用いて抽出し、さらにクロロフォ
ルム抽出した後、先に得たpR17のApa１消化断片（約６
３０bp)0.５μｇと合わせてエタノール沈澱した。実験
書(1)３７頁に従って１０ユニットのT₄リガーゼで４℃
１夜反応させ、結合せしめた。反応後、反応液をエタノ
ール沈澱し、２０ユニットのEcpr１で３７℃３時間消化
し、４％のポリアクリルアミドゲル上の電気泳動により
約６７０bpの断片を電気泳動により回収した。

プラスミドpOP95-15は、フラーの方法(F.Fuller,Gene,1
9巻42頁〜54頁，１９８２年）に従って調製した。

pOP95-15の１μｇをEcoRlで消化してフエノール抽出、
クロロホルム抽出、エタノール沈澱をして調製したベク
ター0.5μｇと、上記の如く合成デオキシオリゴヌクレ
オチドと、TNF遺伝子を結合して得た約６７−bpの断片
を、T₄DNAリガーゼを用いて結合した。実験書(4)、２０
頁に従って、E.coli JM101(ATCC33876)を形質転換してI
PTG及びx-galを含む寒天培地上に約１５０個の白色コロ
ニーを得た。

これらのコロニー１００個かプラスミドDNAを調製し、E
coR １で消化したところ１２個が、目的の約６７０bpの
EcoR 1断片を有していた。さらに挿入の方向を調べるた
めに上記１２個のプラスミドをPvuIIとPst １を用いて
消化し、1.5％アガロースゲル電気泳動を用いて調べた
ところ、４個のプラスミドから目的の約１２８０bp及び
２６００bpの断片が確認され、lacUV₅プロモーターから
順方向にTNF遺伝子が接続されていることが判明した。

塩基配列の解析により、この４個のプラスミドは同一
で、lacUV₅プロモーター、合成デオキシオリゴヌクレオ
チド、及びcDNAが正しく結合されていることが確認され
た（pTNF-lacUV₅-１と命名する。） 工程１７（大腸菌の生産するTNFの精製） 工程１６で得られたプラスミドを含有する大腸菌株を１
００μｇ／ｍのアンピシリンを含有するＬ培地５０m
で１夜培養し、５の同上の培地に移して更に３時間
培養した。イソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシ
ド(Sigma Chemical Co.米国）を終濃度１mMになる様に
添加し、更に６時間培養を続けたのち冷却し、遠心分離
により菌株を集めた。工程１３におけると同様に菌体を
0.04Ｍトリス−塩酸緩衝液（pH7.8）５中で超音波破
砕し、菌体蛋白溶液を得た。この溶液は５×１0⁷単位／
のＬ細胞障害活性を示した。

この溶液を工程２と同様に精製を行った結果1.2×１0⁶
単位のTNFを得た。このものの比活性は6.8×１0⁷単位／
mgであった。

工程１８(Meth Ａ sarcoma坦癌マウスを用いる活性評
価） 工程１７で得られたTNFを、本文中記載のin vivo法によ
ってその活性を評価した。

また、試料投与後２０日目に癌が完全に退縮したかどう
かを観察し完治率を求めた。

以上の方法により測定した。大腸菌の生産するTNFの活
性を第３に示す。

参考例２ 工程１（プラスミドpR18、pB2-7、pB2-2のE.coli K12，
MC1061株への形質転換） 参考例１で得た、上記３種のプラスミドを常法に従って
E.coli K12，MC1061株のコロニーをＬＢ培地を用いて、
550nmの吸光度が0.3になるまで培養した。該培養液５０
mを集菌した後、２５mの１０mM Rbclを含む１０mM
MOPS(pH7.0)溶液で洗浄し、次いで５０mM CaCl₂、１０m
M Rbclを含む0.1ＭＭＯＰＳ（pH6.5）に再び懸濁した。

該懸濁液を３０分間氷冷し、遠心した後、上清を除去
し、３０mのDMSOおよび５０mMCacl₂と１０mMRbclを含
む0.1MMOPS(pH6.5）の混合液中に懸濁させた。該懸濁液
を２０３μずつ分注し、前述のプラスミドDNA溶液１
０μをそれぞれに加えた。

該混合液をそれぞれ３０分間氷冷した後、４４℃で６０
秒ヒートショックを与え、ただちに、あらかじめ３７℃
に温めておいた５mのＬＢ培地を加えた。この溶液を
３７℃で１時間培養した後、それぞれの溶液を遠心し、
上清を除去し、細胞ペレットを得た。該細胞ペレットに
ＬＢ培地を加え、攪拌した後、懸濁液とした。該懸濁液
を、３０μｇ／ｍのテトラサイクリンを含むＬＢ寒天
プレートにまき、３７℃で１夜培養を行なった。その結
果、プラスミドpR18、pB2-7とpB2-2からそれぞれテトラ
サイクリン耐性形質転換菌のコロニーが得られた。

工程２（pB2-7とpR18プラスミドDNAの調整） 工程１で得られプラスミドpB2-7とpR18の形質転換体
を、下記の報文の方法に従って培養し、プラスミド増幅
させた。次いで得られた形質転換体を集菌し、破砕した
のち、プラスミドDNAを精製した。〔実験３、８８−９
６頁〕 すなわち、ＬＢ培地に、それぞれ形質転換体を植菌し、
激しく振とうしながら３７℃で培養した。

次いで、この工程をくりかえしてトランスフオーマント
を増殖させ、更にプラスミドを増殖させた。次に得られ
た形質転換体の培養液を４℃に冷却しながら、4,０００
Ｇで１０分間遠心を行ない、上清を除去した。

氷冷STE〔0.1Ｍ塩化ナトリウム、１０mMトリス−塩酸緩
衝液（pH8.0）と１mM.EDTA〕の１００mを洗浄し、続
いて１０mMトリス−塩酸緩衝液〔pH8.0〕中に２０mg/m
のリゾチームを含む水溶液を用いて細胞を破壊した。
得られた粘性液体を超遠心チューブに移し入れ25,000rp
m３０分間４℃で遠心を行なってDNA溶液を得た。

該DNA溶液の容量を測った後、該溶液１m当りに、固体
の塩化セシウム１ｇを加え、塩化セシウムが完全に溶け
るまで、ゆっくりと注意深く攪拌した。該塩化セシウム
水溶液の１０m毎に、１０mg/mのエチジウムブロマ
イド水溶液0.8mを加えた。この結果、該溶液の最終比
重は1.５５g/m、エチジウムブロマイドの最終濃度の
約６００μｇ／ｍとなった。

該塩化セシウム水溶液を適当な遠心チューブに移し、空
隙に軽パラフィンオイルを加え、２０℃で３６時間、4
5,000rpmの遠心を続けると上層に線状の微生物由来DNA
と環状プラスミドDNAの開環したもの、下層に閉環状の
プラスミドDNAがくる。下部のDNAのバンドをチューブの
横に注射針をさしこんで採取しガラスチューブに移し
た。エチジウムブロマイドを除去し、水槽をＴＥ緩衝液
に透析した。プラスミドDNA溶液をRNase処理し、等量の
飽和フェノール溶液で抽出した。水層をあらかじめ0.1
％SDSを含むＴＥ緩衝液（pH8.0）で平衡化したバイオゲ
ル(Biogel)A-150（バイオラッド社、米国）に付した。D
NAを洗い込み、活性区分を取得する為に0.1%SDSを含む
ＴＥ緩衝液で溶出した。分画液をエタノールで沈澱さ
せ、精製したプラスミドDNAを得た。

上記の方法により、精製pB2-7プラスミドDNAが２５０μ
g、pB18プラスミドDNAが１３４μg得られた。

工程３（精製pB2-7とpB18プラスミドDNAのニックトラス
スレーション） 工程２で得られた精製プラスミドDNA４０μｇを制限酵
素Pst 1で消化分解し、次いで４％アクリルアミドゲル
を用いる電気泳動にかけた。

電気泳動後、染色を行ない2.６μｇ（計算値６μｇの４
３％）の目的とするバンドを切出した。2.５μｇの中の
５００ngの該切出断片を用いて、T.Maniatisらの方法
〔Proc.Natl.Acad.Sci.USA,721184(1974)〕に従ってニ
ックトランスレーションを行なった。ニックトランスレ
ーションは市販キット（BRL社、米国）を用いた。２５
μの反応で放射化したdCTPを８０pmole用いた（４０
０Ci/m moleの場合）。

まず下記混合溶液を調整した。

2.５μ 溶液Ａ （αNTP溶液） 2.５μ 溶液Ｂ（500ngのDNA、すなわち Pst １インサ
ート） ５ μ α−^３２Ｐ−ｄＣＴＰ（３２００
Ci/m mole） 1.３μ dCTP(65pmole、50pmolｅ／μｇ dCTP） １1.２μ 溶液Ｅ（H₂O） 計２2.５μ この２2.５μの溶液に、2.５μの溶液Ｃ（DNase l、
DNAポリメラーゼ１）を加え、１５℃６０分反応させ
た。

次いで、溶液Ｄ（停止緩衝液９を加え反応を停止させ
た。更に、キャリアーtRNAを加えエタノール沈澱を２回
行ない、次いで５００μの水に溶解した。

比活性は、9.３×１0⁷ｃｐｍ／μｇＤＮＡであった。

工程２で得られた精製pR18を用いて、同様に上記の方法
に従ってニックトランスレーションを行なった。比活性
は７×10⁷ｃｐｍ／μgDNAであった。

工程４（pR18のRsa 1断片取得） ８０μｇのpR18プラスミドDNAを制限酵素Rsa 1で消化
し、４％のアクリルアミド電気泳動に付した。下記の目
的とするインサートバンドを切出しBNDカラムを用いて
精製した。

約６４０bp 3.７７μｇ（回収率５２％） 約１７５bp 1.７７μｇ（回収率５０％） この約６４０bpのインサートをpR18の3′断片（pR18の
3′側の翻訳されない部分を意味する）、約１７５bpの
インサートをpR18cfr（pR18のコード部分）と命名し
た。

更に上記方法に於いてRsa １の代わりにPst １とMstII
を用いて消化したところ、約４５０bp3.６５μｇ（回収
率６０％）を得た。このインサートはpR18の5′断片と
命名した。

工程５（染色体該生理活性物質遺伝子の単離） 工程３で得られた^３２Ｐラベル化プラスミドpB2-7イン
サートをハイブリダイズ用プローブとして用いて、Char
on 4AのEcoRl切断サイト〔Blattnerらの方法Science196
161 (1977)〕にヒトDNAをEcoR 1で切断した断片〔Mani
atis et.cl.Cell15 687(1978)〕を組込んで作成したバ
クテリオファージCharon4A／ヒト染色体遺伝子ライブラ
リーの１0⁶コのプラークをスクリーニングした。その方
法としてBenton and Davisらのプラーくハイブリダイズ
法〔Benton and Davis,Science196 180(1977)〕を用い
た。

出発培養液中のバクテリオファージの総てが、該生理活
性物質を作成する為に必要な遺伝子材料を含んでいると
は限らないので、ウサギTNFの遺伝子に相補的な配列を
持つブローブを用いた。

目的とする遺伝子を含むファージプラークは、放射活性
を有するプロークとハイブリダイズすることにより、そ
の放射性活性を測定することによって見つけることが出
来る。このようにして９つのハイブリダイズプラーク
が、該ライブラリーから得られた。

方法と条件は次の通り 1)プラーク数：〜１×１0⁶プラーク（〜４×１0⁴プラー
ク／φ１５０mmプレート×２５） 2)ニトロセルロースフィルターへの転写：〔Benton and
Davis,Science,196,180(1977)参照〕 3)ハイブリダイズ：1.２５×１0⁵cpm/mの参考例１工
程３で得たpB2-7インサートプローブを加え、４２℃、
１9.５時間 4)洗い：２×SSC−0.1%SDSを用いて室温で１０分間洗い
を４回、続いて１×SSC−0.1%SDSを用いて５０℃で３０
分間洗いを２回 5)露光：XAR-5、−８０℃、２枚の増感紙、３９時間 上記スクリーニングで１２の候補株が得られた。二次ス
クリーニングを行なった結果、９個がポジテイブのクロ
ーンを含み、１個はまだポジティブの可能性があった。
二次スクリーニングプレートからポジティブピラークお
よび可能性のあるプラークをひろい、三次スクリーニン
グを行った結果、９個がポジティブであった。この９個
のプラークについて４次スクリーニングを行ない、目的
の断片を含む９つのバクテリオファージ９つを、それぞ
れＨＧ１〜ＨＧ９と命名した。

工程６（ウサギ染色体TNF遺伝子の単離） 本質的には、工程５に述べた方法と同様に行なった。す
なわちEcoRlで切断したDNAを用いて作成した１0⁶のChar
on4A／ウサギ染色体遺伝子ライブラリーバクテリオファ
ージのプラークを検索した。

ウサギ染色体遺伝子を含む２つのバクテリオファージ株
（RG-1、RG-2）が得られた。

工程７（ヒトクローンのサザンブロット解析） 工程５で得られたHG-3、HG-6、HG-7のバクテリオファー
ジを用いて、それぞれDNAを次の方法に従って得た。

６×１0¹⁰個のE.coli LE392を18mのＳＭ中に懸濁し、
そこにバクテリオファージＨＧ−３の３×１0⁹PFUを加
え、３７℃で２０分間吸着を行なった。次いで得られた
混合液を３のＮＺブロスに加え、３７℃、２３時間攪
拌培養した。次いで６０mのクロロホルムを該混合液
に加えて、３０分間攪拌した。最終濃度１Ｍとなるよう
に混合液中に塩化ナトリウムを加えた後１５分間放置し
た。次いで遠心操作を行なった。次いで、分子量約６０
００のポリエチレングリコールをポリエチレングリコー
ルの濃度１０％(W/V)になるように加えて、４℃、２２
時間放置した。次いでバクテリオファージは遠心操作を
行なって採取した。得られたバクテリオファージをＳＭ
の２８mに懸濁し、次いでクロロホルムを等量加え
た。ポルテックスミキサーで３０秒間混合した後、遠心
して水層を集め、その全量をＳＭで３０mにした。こ
れに２6.４ｇの塩化セシウムを加え、静かに溶解した
後、超遠心（45000rpm、２０時間）でファージのバンド
を採取した。１０mM塩化ナトリウムと塩化マグネシウム
１０mMを含む５０mMトリス緩衝液（pH8.0）に透析した
後、それぞれの最終濃度が２０mM、５０μｇ／ｍ、0.
５％となるようにEDTA、プロティナーゼＫ、SDS、を加
え、６５℃で１時間処理した。次にフエノール、フエノ
ール：クロロホルム＝１：１、クロロホルムで各１回ず
つ抽出し、得られた水層を１mM EDTAを含む１０mMトリ
ス緩衝液（pH8.0）で透析した。この溶液の紫外線吸光
度測定した結果、バクテリオファージＨＧ−３の純粋な
DNAが得られたことが確認された。

バクテリオファージＨＧ−３のDNAを調製するために用
いられた方法と本質的に同じ方法を応用することによ
り、バクテリオファージＨＧ−６とＨＧ−７のDNAを得
た。

このようにしてＨＧ−３、ＨＧ−６，ＨＧ−７のDNAを
各々２９２０μｇ、１１００μｇ、８１９μｇを得た。
次いでサザン法〔E.M.Southern.J.Mol.Biol.,98 503(19
75)〕に従って、以下の実験条件でこれらのDNAのサザン
ブロッッティングを行なった。

1) DNA： ＨＧ−３ ８２５ng ＨＧ−６ ９３５ng ＨＧ−７ ６８５ng 2)各種制限酵素による分解： BamHI １０単位、EcoRI １０単位、 BamHI １０単位、EcoRI １０単位 HindpIII １０単位 HindpIII １０単位＋EcoRI １０単位 RvuII １０単位、３７℃ ３時間 3)電気泳動： 0.8%アガロースゲル TAE ２８Ｖ、１5.５時間 4)ニトロセルロースフィルターへの転写： 〔E.M.Southern.J.Mol.Biol.,９８５０３（１９７５）
参照〕 5)プレハイブリダイズ： ３０m FDSS ４２℃ ６時間 6)ハイブリダイズ： pR18の5′断片（１×１0⁵cpm/m、工程 ４にて調製したもの）を含む３０mFDSS ４２℃、１４時間 7)洗い： ２×SSC−0.1％SDSを用いて室温で１０ 分間洗いを４回、続いて１×SSC−0.1% ＳＤＳを用いて５０℃で３０分間洗いを２回 8)露光： XAR-5 −８０℃、２枚の増感紙、１４時間 ハイブリダイズの結果は、表４に示す。

工程８（ウサギクローンのサザンブロット解析） 工程７において、ＨＧ−３、ＨＧ−６、ＨＧ−７のかわ
りにＲＧ−１、ＲＧ−２のバクテリオファージのそれぞ
れを用いる以外は、同様の操作によってサザンブロット
解析を行なった。その結果、ＲＧ−１およびＲＧ−２を
BamHI、EcoRl、BglII、HindIIIおよびBamHI＋EcoRlのそ
れぞれで分解して得られた断片と、pR18の5′断片およ
びpB2-７インサートとはいずれも単一バンドにハイブリ
ダイズした。これは、pR18の5′断片およびpB2-７イン
サートとはいずれも単一バンドにハイブリダイズした。
これは、pR18の5′断片およびpB2-７インサートとハイ
ブリダイズしたどちらの断片もTNFをコードする全塩基
配列を含むことを示す。

工程９（ヒト染色体の該生理活性物質を含むバクテリア
クローンの構築） 工程５において得られたＨＧ−３のDNAを、Landyらの方
法〔Biochemistry,13,p.２１３４（１９７４）〕によっ
て得た。このＨＧ−３のDNA３３μｇをEcoRlの８０単位
によって３７℃で３時間分解した。分解物は１％低融点
アガロマースゲル（条件：１×TAE、２０Ｖ、14.5時
間）にて電気泳動した。2.9kbのバンドをアガロースゲ
ルより、T.Maniatis〔Molecular Cloning,Cold Spring
Harbor Laboratory,p.377(1982)〕の方法で単離した。
詳しくは、2.9kbのバンド部位を切り出したゲルを６５
℃で１５分間加熱した。さらに、この2.9kbの長さを持
つEcoRl分解ＨＧ−３断片（以後、これを「ＨＧ−３／E
coRl 2.9kb断片」と略することが多い）を、とけたゲル
よりフェノールで３回、エーテルで３回抽出、酢酸アン
モニウムを含むエタノールで沈殿し回収する。このよう
にして、６３７μg（収率３０％）のＨＧ−３／EcoRl2.
9kb断片を得た。

上記断片２５５ngとEcoRl分解pUC13〔Ｊ．Ｍｅｓｓｉｎ
ｇ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１
０１，ｐ．２０ （１９８３）〕を2.5単位のＴ_４リガ
ーゼを用いて結合した。

E.coli K12ＪＭ８３株に上で得られた結合DNAを形質転
換した。詳しくは、E.coli K12のＪＭ８３株をＬＢ培地
中で、培養プロスの５５０nmにおける吸光度が0.3にな
るまで培養した。５０mの増殖したE.coli K12のＪＭ
８３株を集め、２５mの１０mM MOPS(pH7.0)−１０mM
RbClで洗い、２５mの0.1ＭＭＯＰＳ（pH6.5）−５０m
M CaCl₂−１０mMRbCl中に懸濁した。この懸濁液２０３
μに、１０ngの上記結合DNAを含む１０μの水溶液
を加えた。この混合物を氷中にて３０分間冷やし、４０
℃で６０分間加熱した。その後すぐに、あらかじめ３７
℃にしておいたＬＢブロスの５mに、加熱した混合物
を加え、３７℃で１時間培養した。得られた培養ブロス
を遠心し上清を除去した。遠沈した細胞にＬＢ培地を加
えてほぐし、３０μg/mのアンピシリンと40μg/mのＸ−ga
lを含むＬＢプレートに植菌した。インサートを含むプ
ラスミドが導入されたE.coli K12のＪＭ８３株のコロニ
ーは白色であるが、プラスミドのみが導入された株のコ
ロニーは緑色であった。得られた白色コロニーは再び、
３０μｇ／ｍのアンピシリンと４０μｇ／ｍのＸ−
galを含むＬＢプレートに確認のため植菌した。

上で得られた白色コロニーより、１０個のコロニーを選
び、HolmesとQuigleyの迅速解析法〔Anal.Biochem.,11
4,p.193(1981)〕を用いてスクリーニングした。

詳しくは、それぞれのコロニーを３０μｇ／ｍのアン
シピリンを含むＬＢ培地で一晩培養する。増殖した細胞
を集め、２mg/mリゾチーム５０mMグルコース−１０mM
EDTA-25mM TrisHCl（pH8.0）中に懸濁した。この懸濁
液を室温で５分間おき、２００μの0.2NNaOH−１％
SDSを加えた。ゆっくり攪拌したのち、この懸濁液を２
分間室温においた。続いて、１５０μの３Ｍ酢酸ナト
リウム（pH5.2）を加え、１０分間−２０℃におき、１
５分間遠心してその上清を得た。この上清に９００m
の冷たいエタノールを加え、５分間遠心してその沈殿を
得た。得られた沈殿を７０％エタノールで洗い、乾燥し
てプラスミドDNAを得た。この方法を用いて、１０種の
プラスミドを得た。

それぞれのプラスミドDNAは、１０mM Tris−0.1mM EDTA
(pH8.0)に溶かし、EcoRlで分解し、制限酵素解析のため
に電気泳動に供した。制限酵素分解と電気泳動の条件は
以下の通りである。

制限酵素分解：プラスミドDNA溶液＝上で得られたもの
の５分の１量、３単位のEcoRl、３７℃、1.5時間 電気泳動：１％アガロースゲル、１×TAE、120Ｖ、２時
間 上記の制限酵素解析によって、１０種のクローンのうち
８種が目的のものであることが示された。すなわち、こ
の８種のクローンは2.9kbの断片を持っていた。８種の
目的のクローンのうち、１つを選びE.coliＫ１２Ｊ８３
（pHGE)株(ATCC39656)と名づけた。

続いて、工程２と同じ操作（ただしpB2-7とpR18のかわ
りにE.coliＫ１２のＪＭ８３(pHGE)株を用いた）によっ
て、1.89mgのpHGE DNAを得た。

工程１０（EcoRl分解ＲＧ−１のサブクローニング） 工程６において得られた３０μｇのＲＧ−１をEcoRlに
よって分解した。得られた各種断片の混合物より、工程
９と同じ操作（ただし上記各種断片の混合物と0.8％の
低融点アガロースゲルを用いた）によって、約3.5kbの
長さを待つ断片を調製した。この断片とEcoRlで分解し
たpUS13を、。工程９と同じ操作（ただしEcoRl分解ＨＧ
−３断片（2.9kb）のかわりに上記EcoRl分解断片（3.5k
b）を用いた）によって、供給した。

E.coliＫ１２のＪＭ８３株への形質転換、バクテリアク
ローンのスクリーニング、クローンDNAの分解と電気泳
動は、工程９と同じ操作（ただし上記結合DNA断片を用
いた）によって行った。得られたクローンはE.coliＫ１
２のＪＭ８３(pRGE)株（ATCC39655）と名づけた。

続いて、工程２と同じ操作（ただしE.coli K12ＪＭ８３
(pRGE)株をpB2-7とpR-18のかわりに用いた）によって、
RGE DNAを1.７０mg調製した。

工程１１（pHGEプラスミドDNAの制限酵素地図） 工程９で得られたpHGE DNAの制限酵素地図を、Maniatis
の方法〔Molecular Cloning,Cold Spring Harbor Labor
atory,98(1982)〕によって行った。

その方法と条件は以下の通りである。

1)EcoRlによるpHGE DNAの分解：１8.６μｇのpHGE、６
４単位のEcoRl、３７℃、２時間 2)エタノール沈殿 3)溶解：EcoRl分解pHGEが１μｇ／ｍの溶液によるよ
うに蒸留水を加える。

4)各種制限酵素による分解：１μgの上記EcoRl分解pHG
E、制限酵素：５単位のRvuII、５単位のRvuII＋１０単
位のRsal、１０単位のRsa 1、４単位のMstII、３単位の
Aval、９単位のPst1、３６℃、２時間 5)電気泳動：２％アガロースゲル、１xTAE、２８Ｖ、1
4.5時間 6)ニトロセルロースフィルターへの転写：E.M.Souther
n,J.Mol.Biol.,98,p.503(1975)参照 7)第一回プレハイブリダイズ：３０mＥＤＳＳ、４２
℃、６時間 8)第一回ハイブリダイズ：pR18（工程４で得られたも
の）の5′断片（５×１0⁴cpm/m）を含む３０mＥＤ
ＳＳ、４２℃、６時間 9)洗い：２×SSC-0.1％SDSを用いて室温で１０分間洗い
を４回、続いて１×SSC−0.1％SDSを用いて５０℃で３
０分間洗いを２回 10)露光：XAR-5、−８０℃、２枚の増感紙、１7.５時間 11)洗い：0.5M NaOH−1.5M NaClで１分間、0.5M Tris−
1.5M NaClで１分間、３×SSCで１分間 12)露光：露光時間を１９時間とした以外は、上記10)と
同じ操作 13)第２回プレハイブリダイズ：７）と同じ 14)第２回ハイブリダイズ：pB2-7インサート（工程３で
得られたもの）、４２℃、１6.５時間 15)洗い：9)と同じ 16)露光：露光時間を１9.５時間とした以外は、上記10)
と同じ操作 17)洗い：11)と同じ 18)露光：露光時間を２０時間とした以外は、上記10)と
同じ操作 19)第３回プレハイブリダイズ：７）と同じ 20)第３回ハイブリダイズ：pR18（工程４で得られたも
の）の3′断片（4.５×１0⁵cpm/m）、４２℃、１５時
間 21)洗い：9)と同じ 22)露光：10)と同じ 更に第４図に示したような制限酵素で切断し、制限酵素
地図を作成した。

制限酵素地図解析の結果を第４図に示した。

工程１２（pRGEプラスミドDNAの制限酵素地図） 工程１１と同じ方法をpHGEプラスミドDNAのかわりにpRG
EプラスミドDNAを用いて、工程１１で得られたpRGEの制
限酵素解析を行った。得られたpHGE DNAの制限酵素地図
を第５図に示した。

工程１３（ウサギTNF遺伝子と該生理活性物質遺伝子の
塩基配列の決定） 工程９で得られたE.coli K12JM83(pRGE)株と工程１０で
得られたE.coli K12JM83(pRGE)株に工程２と同様と操作
を行なった。そして、それぞれ１５０μｇのpRGEプラス
ミドDNAとpHGEプラスミドDNAを得た。

pHGEとpRGEプラスミドDNAを得た。

pRGEとpHGEの塩基配列はMaxam-Gilbert法〔Maxam et.a
l.,Methods in Enzymology,55,p.490(1980)Academic Pr
ess〕によって決定した。

参考例１で決定したpR-18の塩基配列と、上で決したpRG
Eの塩基配列を比較して、ウサギTNF遺伝子の構造（エク
ソンとイントロン等）を解明した。pHGE DNAインサート
の構造は第５図に示した。続いて、pHGEとpRGEの塩基配
列を比較して、相同性とイントロン・エクソン境界付近
の配列の相同性と類似性を調べた。その結果該生理活性
物質遺伝子の構造（エクソンとイントロン等）を解明し
た。該生理活性物質遺伝子の構造を第４図に示した。

このようにして得られた、ウサギTNFと該生理活性物質
をコードする塩基配列を下に示す。この塩基配列におい
て、上の行はウサギTNFをコードする塩基配列(R)を、下
の行は該生理活性物質をコ-ドする塩基配列(H)を示す。

工程１４（オリゴデオキンヌクレチドの合成） コハク酸残基を介して（約２μＭの）デオキシオリゴヌ
クレオチドが結合しているポリスチレン樹脂２０mgを、
上下にステンレススチール製のフィルターのついた５０
０μ容量の反応容器に装填した。樹脂は１Ｍ臭化亜鉛
ジクロルメタン−イソプロパノール溶液（８５：１５）
で処理してジメトキシトリチル(DMT)保護基を除き、ジ
クロルメタン−イソプロパノール（８５：１５）、次い
でジメチルフォルムアミド、ピリジン、更にアセトニト
リルで洗浄し、窒素気流で乾燥した。次いで保護スクレ
オチドジエステル（２０uM）および、メシチレンスルフ
ォニルニトロトリアゾール（６０uM）の乾燥ピリジン溶
液２００μを加えた。４５℃で２０分間反応せしめた
後、反応液を除去し、乾燥ピリジンで樹脂を洗浄後、ピ
リジン中の無水酢酸で未反応の残基を保護した。この、
脱保護及び縮合のサイクルを繰り返して、所望のオリゴ
デオキシヌクレチドを合成した。合成終了後、樹脂をと
り出し、保護基除去および樹脂からの切断反応、樹脂と
の分離処理をしたのち、精製を行った。上記のオリゴデ
オキシヌクレチドの合成および精製は伊藤ら〔Nuc.Ac.R
es.10巻、1755頁(1982)〕の方法に従って実施した。

このようにして下記の如きオリゴデオシヌクレオチドが
得られた。

1) 5′ -ATTCATGTCATCTTCTCGAACCCCGAGTGACAA−3′ 2) 3′ -GTACAGTAGAAGAGCTTGGGGCTCACTGTTCGG−5′ 3) 5′ -GCCTGTAGCCCATGTTGTAGCAAACCCTCAAAG−3′ 4) 3′ -ACATCGGGTACAACATCGTTTGGGAGTTCGACT−5′ 工程１５（該生理活性物質の遺伝子を含むＭ１３mp9−H
GEの調製） プラスミドpHGE（１０μg）をEcoRl（２０u)で消化し、
１％の低融点アガロースゲル電気泳動の後、2.９kbのフ
ラグメントを切出し溶出した。このフラグメントはＭ１
３mp9ファージの複製型(replicative from)のEcoRlフラ
グメント中へ挿入した。EcoRlフラグメントを挿入され
たDNAはBRL社の手引書（User Manual/M13mp7Cloning/'D
idesxy'sequenucing,1980)に従いE.coli ＪＭ１０３を
形質転換した。生成物をM13mp9-HGEと命名した。

工程１６（M13mp9-HGE−重鎖DNAとデーターＥ３−４を
用いる、イントロン３の除去） M13mp9-HGE−重鎖DNAはBRL社使用者の手引書(User Manu
al/M13mp7 Cloning/'Didesxy'sequenucing,1980)に従っ
て調製された。

工程１４で調製されたオリゴデオキシヌクレオシド4)
3′ -ACATCGGGTACAACATCGTTTGGGAGTTCGACT−5′がイン
トロン３のデリーターとして用いられた。イントロン３
のデリーターはＥ−３−４と命名された。

デリーターＥ３−４は、除去されるべきイントロン３の
前方（則ちエキソン３）、及び後方（則ちエキソン４）
に対し相補的な配列を有している。イントロン３の除去
はWallaceらの方法〔Science209,1396(1980)〕に従い、
次の如く行った。

Ｅ３−４（１０４ng、１５pmole）は、Ｔ_４キナーゼ
（１０８単位）及びATP(3mM)を用いてリン酸化され、鋳
型M13mp-HGE(1.65μg、0.5pmole)に加えられた。反応混
合物は６５℃、６５分間加熱し、５分間室温に冷却し、
更に氷水中で冷却した。各0.4mMのdATP、dCTP、dGTP、d
TTPおよびATP溶液に対し、クレノーフラブメント(Kleno
W flagment)５単位、T₄リガーゼ１０単位を含むHin緩衝
液〔Wallaceら、Nuc.Ac.Res,９巻 3647頁(1981年)〕、
１０mMトリスー塩酸（pH7.2）、２mM MgCl₂及び１mMメ
ルカプトエタノールを含む液を加えた。反応混合物（最
終溶量５０μ）は４℃で３０分間及び室温で３０分
間、インキュベートした。オリゴヌクレオチドをプライ
マーとして二重鎖合成されたDNAはBRL社の使用社の手引
(User Manual/M13mp7 Cloning/'Dideoxy' sequencing,1
980)に従って、E.coliＪＭ１０３に感染せしめた。この
ようにして得られたプラークは、ＹＴプレート〔J.H.Mi
ller,Experiments in Molceular Genetics,Cold Spring
Habor Laboratory(1972年)433頁〕に移した。得られた
コロニーは、^３２ＰラベルされたＥ３−４と５５℃２時
間の条件でハイブリダイズさせた。イントロン除去工程
の結果得られる各種生成物の内から、所望の配列を有す
るDNAを得るためプロープとして、ここでは、デリータ
ーＥ３−４それ自身を利用した。かくしてデリータ−Ｅ
３−４がハイブリダイズするコロニーを得、更にファー
ジを取得した。

得られたファージをプレートにまき、得られたプラーク
をＹＴプレートに移した。ここで再び^３２Ｐで放射ラベ
ルしたＥ３−４と５５℃２時間ハイブリダイズせしめ
た。強くハイブリダイズするクローンから、ファージDN
Aを取得し、塩基配列を解析し、イントロン３が完全に
除去されているファージを選択した。このようなファー
ジの１つをmp9-HGEΔ3-1と命名した。

工程１７(pHTNF-lacUV5-2の構築） mp9-HGEΔ3-1の複製型(rekplicativ form)をEcoRlで切
断し、電気泳動により単離した。この断片をEcoRlで切
断したpBR327に挿入し、プラスミドpHGEΔ3-1を得た。

以下いプラスミドpHGEΔ3-1を用い、lacUV5をプロモー
ターとして該生理活性物質を大腸菌中で、直接発現させ
ることのできるプラスミドの構築を示す。この構築方法
は第７図に示される。

まず１０μgのプラスミドpHGEΔ３−１単位のAvalとEco
Rl（BRL社、米国）と３７℃２時間切断し、ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動で目的フラグメントを単離した。
約１μｇの断片がゲルより回収された。工程１４と同じ
ように第７図に示される２種のオリゴデオキシヌクレオ
チド即ち5′-AATTCATGTCATCTTCTCGAACC−3′及び5-TCGG
GGTTCGAGAAGATGACATG−3′及び合成した。次いで文献
(3)１２２頁の方法に従いこの２本のオリゴヌクレオチ
ド（約１００pmole）の5′端をリン酸化した。反応後、
フェノール・クロロホルムで抽出した。かくして得られ
た合成オリゴマーと、上記で取られたpHGEΔ3-1のAval-
EcoRl断片とを混合し、エタノールを沈殿した後、文献
(1)３７頁の方法に従って１０単位のT₄リガーゼを用い
４℃１夜で結合せしめた。反応終了後、混合物はエタノ
ール沈殿し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動により目
的断片を単離した。

プラスミドpOP95-15はF.Fullerの方法〔Gene１９巻、４
２−５４頁（１９８２年）〕により調製した。

pPP95-15の１μｇをEcoRlで消化してフエノール抽出、
クロロホルム抽出、エタノール沈殿をして調製したペク
ター0.5μｇと、上記の如く得た断片を、T₄DNAリガーゼ
を用いて結合した。実験書(4)、２０頁に従って、E.col
i JM101(ATCC33876)を形質転換して、１mM IPTG及び0.
００４％(W/V)x-galを含む寒天培養上に約１００個の白
色コロニーを得た。

これらの形質転換体からプラスミドDNAを調整し、EcoRl
で消化し、目的のEcoRl断片を有するプラスミドを固定
した。更にこれらのプラスミドをRvuIIとPst1で消化し
て1.5%アガロースゲル電気EcoRlを行った結果約１０７
０bp及び約２６００bpの断片を有し、lac UV5プロモー
ターの下流に正しく該生理活性物質遺伝子が接続されて
いるプラスミドを選択した。

塩基配列を決定したところ、２コのプラスミドにおい
て、合成オリゴヌクレオチド及び染色体由来のDNAが正
しく接続されていることが示された。得られたプラスミ
ドをpHTNF-lacUV5-2と命名した。

pHTNF-lacUV5-2を含有する大腸菌を、通常の培地で培養
した。生成物の該生理活性物質の活性を測定したとこ
ろ、pTHF−lacUV5-1（ウサギTNFを発現する）を含有す
る大腸菌の生産物と同様の活性を示すことが判明した。

参考例３ 参考例２における工程１から１４に従って調整されたプ
ラスミドpTHFとオリゴヌクレオチド１−４を用いて、pH
TNF-lacUV5-1を調整する方法を第６図に示した。

実施例１ 参考例３で調製した遺伝子組立体pHTNF-lacUV5-1を含有
する大腸菌を、通常の方法で培養した。次いで目的とす
る該生理活性物質が生産されるよう誘導操作を行ない、
さらに培養を行なって該生理活性物質を含有する大腸菌
を得た。遠心分離により菌体を集め、該菌体を0.０４Ｍ
トリス−塩酸緩衝液(pH7.8)１中で超音波破砕し、該
生理活性物質を含む菌体抽出溶液(A)を得た。

この溶液は、４．５×１0⁵U/mの活性を示し、比活性
は3.０×１0⁴であった。

次いで該抽出溶液を、0.０４Ｍトリス−塩基緩衝液(pH
8.0)で十分平衡化したDEAE−セファロースCL-6B（ファ
ルマシア社、スウェーデン）のカラムに、添加した。0.
０４Ｍトリス−塩酸緩衝液(pH8.0)を用いて溶出した。
活性画分をゲルろ過により濃縮して、比活性4.０×１0⁵
U/mgの粗精製溶液(B)を得た。

上記抽出溶液(A)を、0.15M塩化ナトリウムを含む２０mM
リン酸緩衝液(pH7.4)で２５倍に希釈し、６０℃で６０
分まで湯浴中で加熱した。加熱処置後６０００rpmで３
０分間遠心を行なった後、その上清の活性、蛋白質分解
酵素濃度、蛋白質量を測定した。その結果を第５表に示
す。

同様に粗精製溶液(B)について、６０℃で２４０分まで
加熱処理した結果を表６に示す。

また粗精製溶液(B)について、４から８０℃で３０分間
加熱処理した結果を表７に示す。

実施例２ 実施例１で得た粗精製溶液(B)を、0.１５Ｍ塩化ナトリ
ウムを含む５mMリン酸緩衝液(pH7.4)で平衡化したセフ
アクリルＳ−２００（ファルマシア社、スウェーデン）
のカラムに添加し、同緩衝液にてゲルろ過を行なった。
活性画分を限外ろ過より濃縮して精製溶液（未処理）を
得た。

一方、上記粗精製溶液(B)を６０℃で３０分間加熱し
た。加熱処置後６０００rpmで３０分間遠心を行ない不
溶物を除去した液を得た。この液を、0.１５Ｍ塩化ナト
リウムを含む５mMリン酸緩衝液(pH7.4)で平衡化したセ
フアクリルＳ−２００（ファルマシア社、スウェーデ
ン）のカラムに添加し、同緩衝液にてゲルろ過を行なっ
た。活性画分を限外ろ過により濃縮して精製溶液（処
理）を得た。

以上の結果は表８にまとめて示す。

【図面の簡単な説明】

第１図は、ウサギTNFの遺伝子を含有するプラスミドの
制限酵素切断地図を示す。第２図は、pTNF−lac−１１
の調製方法を示すフローシートであり、第３図は、pTNF
−lac UV5−１１の調製方法を示すフローシートであ
る。第４図は、本発明の生理活性物質遺伝子の構造を示
す。第５図は、ウサギTNF遺伝子の構造を示す。第６図
は、pTNF−lac UV5-1の調製方法を示すフローシートで
あり、第７図は、pTNF−lac UV5−２の調製方法を示す
フローシートである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｂ 8214−4Ｂ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】遺伝子組み換え体により生産され、Ｌ−Ｍ
   細胞に対して細胞障害活性を有し、かつMeth Ａ sarc
   oma癌細胞を移植したＢＡＬＢ／ｃマウスに投与した場
   合にその腫瘍部位に出血性壊死反応を起こさせる性質を
   有する生理活性物質を精製するに際し、加熱処理を行な
   うことを特徴とする精製方法。